CN101514354A - 一种海参多肽及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种海参多肽，其制备方法如下：(1)取新鲜刺参，去除内脏，洗净破碎成小块，加入水匀浆；匀浆液经酶解后，离心取上清液；加入乙醇，静置，离心取上清，减压浓缩并干燥，得海参多肽粗品；(2)将海参多肽粗品用蒸馏水溶解，Sephadex LH－20凝胶过滤层析，双蒸水洗脱，取第二个峰，收集活性组分，浓缩并冷冻干燥；(3)将上述的活性组分用双蒸水溶解，Q Sepharose Fast Flow离子交换层析，NaCl溶液线性洗脱，然后脱盐，取第二个峰，收集活性组分，浓缩并冷冻干燥，即得海参多肽。海参多肽可用于制备提升白细胞数量的药物或保健品，还可用于制备用于机体化疗后骨髓细胞增殖的药物或保健品。

Description

一种海参多肽及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种海参多肽及其制备方法与应用。

背景技术

随着现代社会环境与食物污染的日益严重，癌症发病率越来越高，而治疗癌症主要采用放、化疗的手段，但其副作用很大，其中绝大多数会引起白细胞减少症。

海参的重要药用价值及其生物活性物质的研究工作已有许多报到。目前报道的有关活性物质主要有多糖、多肽及海参皂苷等；这些活性物质的功效主要有抗凝和止血作用，抗肿瘤作用，增强免疫力，延缓衰老，降血糖，抗辐射，抗炎等。但是从海参中逐级分离纯化出的多肽在提升白细胞数量和促进机体化疗后骨髓细胞增殖作用方面的研究尚未见报道，临床上也未见海参多肽用于提升白细胞数量和促进机体化疗后骨髓细胞增殖作用的治疗的报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种具有药用价值和保健价值的海参多肽。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种海参多肽的制备方法，包括以下步骤：

(1)海参多肽粗品的提取：取新鲜刺参，去除内脏，洗净，破碎成0.3～1.5cm³的小块，加入海参重量的8～10倍的水匀浆，得匀浆液；匀浆液依次经胃蛋白酶、胰蛋白酶酶解，酶解完毕后，煮沸灭酶活，离心，取上清液；向上清液中加入乙醇，至乙醇体积百分比达40～80％，静置4～12小时，离心取上清，对上清减压浓缩并干燥，既得海参多肽粗品；

(2)将上述海参多肽粗品用蒸馏水溶解，Sephadex LH-20凝胶过滤层析，双蒸水洗脱，最终会得到三个峰，取第二个峰，收集此处的活性组分，浓缩并冷冻干燥；

(3)将上述的活性组分用双蒸水溶解，Q Sepharose Fast Flow离子交换层析，NaCl溶液线性洗脱，最后会得到三个峰，然后用Sephadex G-15凝胶介质脱盐，取第二个峰，收集此处的活性组分，浓缩并冷冻干燥，即得海参多肽。

所述步骤(1)中胃蛋白酶的酶解条件为：酶量为海参湿重的0.1～1％，pH2.0～2.5，温度40～60℃，时间3～8h。

所述步骤(1)中胰蛋白酶的酶解条件为：酶量为海参湿重的0.0.1～1％，pH8.0～8.5，温度40～60℃，时间3～8h。

所述步骤(1)中第一次离心的转速为10000r/min，时间10min；第二次离心的转速为6000～10000r/min，时间5～15min；第二次离心的转速为2000～4000r/min，时间5～15min。

所述步骤(1)中的酶解也可以用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶来代替胃蛋白酶、胰蛋白酶。

所述步骤(3)中NaCl溶液的浓度为0.5～2mol/L。

一种采用上述制备方法制备的海参多肽，以凝胶过滤法测定其分子量小于3kDa。

所述海参多肽在制备提升白细胞数量的药物或保健品中的应用。

所述海参多肽在制备用于机体化疗后骨髓细胞增殖的药物或保健品中的应用。

本发明的发明人进行了海参多肽的体内和体外试验，药理实验及结果表明：本发明所述的海参多肽对于化疗后免疫缺陷小鼠模型有明显的提升白细胞数量的作用；对于化疗后小鼠的骨髓细胞有明显的增殖作用。这些发现从机理上表明，海参多肽对于化疗后机体具有良好的提升白细胞数量的作用，对骨髓细胞具有良好的促生长和促增殖作用。预示海参多肽在制备作为提升白细胞数量和促进机体化疗后骨髓细胞增殖作用的药物或保健品中有很大的开发应用前景。

附图说明

图1为海参多肽粗品Sephadex LH-20凝胶柱洗脱曲线(280nm)；

图2为HST-2组分Q Sepharose Fast Flow离子柱洗脱曲线(280nm)。

具体实施方式

下面结合实施例和试验对本发明作进一步的说明：

实施例1：从刺参中提取海参多肽，步骤如下：

(1)取新鲜刺参，去除内脏，洗净，破碎成1cm³的左右的小块，加入8-10倍水匀浆。

匀浆液分别经胃蛋白酶(酶量为海参湿重的0.4％，pH2.0-2.5，温度50℃，时间5h)、胰蛋白酶(酶量为海参湿重的0.45％，pH8.0-8.5，温度50℃，时间5h)酶解，酶解完毕，煮沸灭酶活，离心(10000r/min，10min)取上清液。

将上清液60％乙醇沉淀过夜，离心(4000r/min，15min)取上清，减压浓缩并冷冻干燥得海参多肽粗品，命名HST。

(2)将海参多肽粗品用蒸馏水溶解，Sephadex LH-20凝胶过滤层析，蒸馏水洗脱，280nm在线检测，洗脱结果如图1所示，最后得到3个峰，取第二个峰，收集活性组分，浓缩并冷冻干燥，命名HST-2。第一个峰、第三个峰的组分同样处理，分别命名HST-1，HST-3。

(3)将HST-2用蒸馏水溶解，Q Sepharose Fast Flow离子交换层析，2mol/L NaCl溶液线性洗脱，280nm在线检测，洗脱结果如图2所示(其中，棕色曲线表示氯化钠洗脱浓度)，最后得到3个峰，分别经Sephadex G-15凝胶介质脱盐，取第二个峰，收集活性组分，浓缩并冷冻干燥，命名HST-2-2，即为本发明的海参多肽。第一个峰、第三个峰的组分同样处理，分别命名HST-2-1，HST-2-3。

实施例2：海参多肽粗品对化疗后免疫缺陷小鼠的提升白细胞数量作用

选用昆明种小鼠(体重20±1.0g)50只，随机分为5组，每组10只，雌雄各半且分开培养。依次为空白对照组，模型对照组，HST低、中、高三个剂量组。

除空白对照组外，其他4组均用环磷酰胺造模，按30mg/kg.bw予每只小鼠作腹腔注射4次。

造模后次日起，各组每天灌胃一次，灌胃体积0.2ml/10g.bw，连续10天。空白对照组和模型对照组用生理盐水；海参多肽组用相对应的海参肽组分(根据小鼠与人的体表面积换算关系，中剂量组为海参粗肽200mg/kg.bw，低剂量组为中剂量组的1/5，高剂量组为中剂量组的5倍)。

末次灌胃24h后，小鼠摘眼球取血，用血常规检查EDTA-K₂采血管收集500μl血液，Sysmex XT-1800i血液细胞分析仪对血细胞记数，结果见表1。

表1海参肽各组分对小鼠白细胞数量的作用影响

注：与空白对照组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01；与模型对照组比较▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

从表1中可以看出，HST对化疗后免疫缺陷小鼠有明显的提升白细胞数量的作用。

实施例3：HST-2对化疗后免疫缺陷小鼠提升白细胞数量的作用

选用昆明种小鼠(体重20±1.0g)110只，随机分为11组，每组10只，雌雄各半且分开培养。依次为空白对照组，模型对照组，HST-1低、中、高三个剂量组，HST-2低、中、高三个剂量组，HST-3低、中、高三个剂量组。

除空白对照组外，其他10组均用环磷酰胺造模，按30mg/kg.bw予每只小鼠作腹腔注射4次。

造模后次日起，各组每天灌胃一次，灌胃体积0.2ml/10g.bw，连续10天。空白对照组和模型对照组用生理盐水；海参多肽组用相对应的海参肽组分(根据小鼠与人的体表面积换算关系，中剂量组为海参粗肽200mg×肽组分收率，低剂量组为中剂量组的1/5，高剂量组为中剂量组的5倍)。

末次灌胃24h后，小鼠摘眼球取血，用血常规检查EDTA-K₂采血管收集500μl血液，Sysmex XT-1800i血液细胞分析仪对血细胞记数，结果见表2。

表2海参肽各组分对小鼠白细胞数量的作用影响

注：与空白对照组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01；与模型对照组比较▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

从表2中可以看出，HST-2对化疗后免疫缺陷小鼠有明显的提升白细胞数量的作用，据统计分析，与其他各组相比，均有明显差异。

实施例4：HST-2-2对化疗后免疫缺陷小鼠提升白细胞数量的作用

选用昆明种小鼠(体重20±1.0g)110只，随机分为11组，每组10只，雌雄各半且分开培养。依次为空白对照组，模型对照组，HST-2-1低、中、高三个剂量组，HST-2-2低、中、高三个剂量组，HST-2-3低、中、高三个剂量组。

除空白对照组外，其他10组均用环磷酰胺造模，按30mg/kg.bw予每只小鼠作腹腔注射4次。

造模后次日起，各组每天灌胃一次，灌胃体积0.2ml/10g.bw，连续10天。空白对照组和模型对照组用生理盐水；海参多肽组用相对应的海参肽组分(根据小鼠与人的体表面积换算关系，中剂量组为海参粗肽200mg×肽组分收率，低剂量组为中剂量组的1/5，高剂量组为中剂量组的5倍)。

末次灌胃24h后，小鼠摘眼球取血，用血常规检查EDTA-K₂采血管收集500μl血液，Sysmex XT-1800i血液细胞分析仪对血细胞记数，结果见表3。

表3海参肽各组分对小鼠白细胞数量的作用影响

注：与空白对照组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01；与模型对照组比较▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

从表3中可以看出，HST-2-2对化疗后免疫缺陷小鼠有明显的提升白细胞的作用，据统计分析，与其他各组相比，均有明显差异。

实施例5：海参多肽对化疗后免疫缺陷小鼠骨髓细胞的增殖作用

免疫缺陷小鼠颈椎脱臼处死，在75％酒精中浸泡片刻，剪开大腿部皮肤、分离肌肉，暴露股骨及两端相连关节部。清除股骨上残留肌肉，游离两端关节或直接从两端关节头处剪下股骨，每只小鼠各取一根股骨(右侧)。

无菌条件下，剪掉股骨两端彭大的关头节，用PBS缓冲液通过针头冲出全部骨髓细胞，吹吸冲打后，制成骨髓单细胞悬液。置于二氧化碳培养箱中，37℃，5％二氧化碳饱和湿度培养48h后进行实验。

骨髓细胞在96孔板中培养48h后，分别加入2mg/ml海参多肽，使海参多肽的终浓度分别为100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml，设正常对照组，37℃，5％二氧化碳饱和湿度培养48h，后进行MTT测定，结果见表4。

表4海参多肽对骨髓细胞的作用

^*表示跟空白对照相比，P＜0.05

从表4中可以看出，海参多肽对化疗后免疫缺陷小鼠骨髓细胞具有明显的增殖作用。显微镜观察发现，加入海参多肽的骨髓细胞，其增殖效果明显，与未加入海参多肽的对照样本相比显著不同。

Claims (8)

1.一种海参多肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)海参多肽粗品的提取：取新鲜刺参，去除内脏，洗净，破碎成0.3～1.5cm³的小块，加入8～10倍水匀浆，得匀浆液；匀浆液依次经胃蛋白酶、胰蛋白酶酶解，酶解完毕后，煮沸灭酶活，离心，取上清液；向上清液中加入乙醇，至乙醇体积百分比达40～80％，静置4～12小时，离心取上清，对上清减压浓缩并干燥，既得海参多肽粗品；

(2)将上述海参多肽粗品用蒸馏水溶解，Sephadex LH-20凝胶过滤层析，双蒸水洗脱，最终会得到三个峰，取第二个峰，收集此处的活性组分，浓缩并冷冻干燥；

(3)将上述的活性组分用双蒸水溶解，Q Sepharose Fast Flow离子交换层析，NaCl溶液线性洗脱，最后会得到三个峰，然后用Sephadex G-15凝胶介质脱盐，取第二个峰，收集此处的活性组分，浓缩并冷冻干燥，即得海参多肽。

2.根据权利要求1所述的一种海参多肽的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中胃蛋白酶的酶解条件为：酶量为海参湿重的0.1～1％，pH2.0～2.5，温度40～60℃，时间3～8h。

3.根据权利要求1所述的一种海参多肽的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中胰蛋白酶的酶解条件为：酶量为海参湿重的0.0.1～1％，pH8.0～8.5，温度40～60℃，时间3～8h。

4.根据权利要求1所述的一种海参多肽的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中第一次离心的转速为6000～10000r/min，时间5～15min；第二次离心的转速为2000～4000r/min，时间5～15min。

5.根据权利要求1所述的一种海参多肽的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中NaCl溶液的浓度为0.5～2mol/L。

6.一种采用权利要求1所述的制备方法制备的海参多肽。

7.权利要求6所述的海参多肽在制备提升白细胞数量的药物或保健品中的应用。

8.权利要求6所述的海参多肽在制备用于机体化疗后骨髓细胞增殖的药物或保健品中的应用。

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