CN106916202A - 海参生物活性肽在制备抗氧化、延衰保健食品和化妆品中的应用 - Google Patents

海参生物活性肽在制备抗氧化、延衰保健食品和化妆品中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于海洋生物技术领域，具体涉及海参多肽及其制备方法与应用。本发明所述海参多肽具有SEQ ID NO:1～13之一所示的氨基酸序列。本发明所述海参多肽F2组分包括具有SEQ ID NO:1～11所示的氨基酸序列；本发明所述海参多肽F3组分包括具有SEQ ID NO:12～13所示的氨基酸序列。本发明所述制备方法能够充分利用海参丰富资源得到海参多肽F2、F3组分。实验结果表明本发明所述制备方法制得的具有SEQ ID NO:1～13之一所示的氨基酸序列的海参多肽以及海参多肽F2、F3组分均具有很好的抗氧化、抗衰老作用，可以用于制备抗氧化、抗衰老药物或保健品，具有良好的经济和社会效应。

Description

海参生物活性肽在制备抗氧化、延衰保健食品和化妆品中的应用
技术领域
本发明属于海洋生物技术领域，具体涉及海参多肽及其制备方法与应用。
背景技术
传统医学对延年益寿和神经保护有悠久的研究历史，而丰富的海洋生物资源种类则为之提供了庞大的资源库，包含肽类、蛋白质类、多糖类、生物碱类、萜类、大环聚酯类等数万种新型化合物已经被人们发现。其中，肽类是海洋生物活性物质中数量最庞大的一类化合物，达数万种之多，包括海洋肽类毒素与海洋生物活性肽等。
由于海洋生物生存的特定环境，海洋生物多肽的结构与陆生动植物肽(糖肽)有很大不同，多为小分子环肽，含有种类丰富的活性基团，使海洋生物活性肽除了分子量小无免疫原性的特点外，还具备优良的生物稳定性及生物利用度。研究表明生物活性肽具有多种药理活性，具有预防和治疗神经退行性疾病或延缓衰老的潜能，包括抑制脂质过氧化反应、诱导自噬抑制多种致病因子、减少阿尔茨海默病秀丽线虫Aβ沉积等。因此，发掘海洋生物资源中具有抗氧化、延缓衰老、神经保护作用的多肽类活性成分有助于促进海洋生物资源的综合开发与利用。
海参是棘皮动物门海参纲动物的总称，英文俗名为Sea Cucumber，是一种高蛋白低脂肪珍贵海味，同人参、燕窝、鱼翅齐名，也是世界八大珍品之一。海参营养丰富，具有补肾壮阳、益肾补肺、温阳利水的功效。海参体壁组织富含胶原蛋白，其中谷氨酸(Glu)含量高，Glu为谷胱甘肽的良好来源，可提高机体的抗氧化能力，在保健品和化妆品领域具有较好的开发应用价值。虽然海参多肽生物学活性显著，但目前关于其功效相关物质基础的研究却鲜有报道。因此，根据前期研究基础，鉴定具有抗氧化、延缓衰老功能的海参活性多肽成分，有利于推动活性肽在抗衰老及衰老相关疾病领域的应用，为开发基于海洋生物资源的抗氧化活性肽及探索其在食品、医学上的应用奠定基础。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供具有抗氧化、延缓衰老作用的海参多肽及其制备方法与应用。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案。
一种海参多肽，具有SEQ ID NO:1～13之一所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中本发明还提供了一种海参多肽F2组分包括下述序列：
(1)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
(2)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；
(3)具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；
(4)具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；
(5)具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；
(6)具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；
(7)具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；
(8)具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；
(9)具有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列；
(10)具有SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列；
(11)具有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
本发明还提供了一种海参多肽F3组分，包括下述序列：
(1)具有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列；
(2)具有SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
本发明还提供了所述海参多肽F2的制备方法，取海参体壁匀浆后依次经胰蛋白酶和木瓜蛋白酶水解后，加入乙醇沉淀多糖，离心取上清液，超滤收集截留分子量小于3kDa的组分，凝胶层析分离后收集70～90min内的洗脱组分。
本发明还提供了所述海参多肽F3的制备方法，取海参体壁匀浆后依次经胰蛋白酶和木瓜蛋白酶水解后，加入乙醇沉淀多糖，离心取上清液，超滤收集截留分子量小于3kDa的组分，凝胶层析分离后收集90～110min内的洗脱组分。
其中，所述海参体壁为新鲜的海参解刨，去内脏，体壁用水清洗3～4次得到。
在一些实施方案中，本发明所述海参多肽的制备方法中，所述胰蛋白酶水解前还包括将匀浆后得到的肉糜干燥后加水重溶的步骤。
其中，所述肉糜干燥后的重溶时水的加入量为干燥的肉糜的体积的20倍。
本领域技术人员可以按照公知的干燥的方法对海参体壁匀浆后得到的肉糜进行干燥。优选采用冷冻干燥。
在一些实施方案中，所述胰蛋白酶水解具体为调节pH至8.0，加入胰蛋白酶37～55℃水解2～10小时，灭酶。
进一步的，作为优选，所述胰蛋白酶的活力为2500U/mg，每克原料干粉中胰蛋白酶的加入量为3000U。
在一些实施方案中，所述木瓜蛋白酶水解具体为调节pH至5.5，加入木瓜蛋白酶50～80℃水解2～10小时，灭酶。
进一步的，作为优选，所述木瓜蛋白酶的活力为6000U/mg，每克原料干粉中木瓜蛋白酶的加入量为3000U。
在一些实施方案中，所述乙醇沉淀多糖具体为先加入乙醇初步沉淀，然后加入乙醇至乙醇终浓度为60～80v/v％，静置12～20小时。
进一步的，所述加入乙醇初步沉淀为按乙醇：酶解液体积比为3:5的比例加入乙醇。
其中，所述乙醇沉淀多糖时加入的乙醇优选为95％乙醇。
静置后离心收集上清液即获得本发明所述海参多肽。
其中，所述离心为5000～10000rpm的转速离心10～20min。
作为优选，所述离心为4℃条件下6000rpm离心15min。
在一些优选实施方案中，本发明所述制备方法还包括上清液超滤，收集截留分子量小于3kDa的组分的步骤。
进一步的，所述超滤具体为上清液加入截留分子量为3kDa超滤离心管，在6000rpm～8000rpm下离心。
本领域技术人员还可以按照公知的方法对乙醇沉淀多糖后离心收集的上清液以及超滤收集的组分进行干燥。优选采用冷冻干燥。
在一些实施方案中，本发明所述海参多肽的制备方法中，所述超滤前还包括对干燥后海参多肽加水重溶的步骤。
其中，所述干燥后海参多肽的重溶优选为配制成浓度为10mg/mL的溶液。
作为优选，所述的制备方法中，所述凝胶层析分离具体为于葡聚糖凝胶层析色谱柱对MW<3kDa海参多肽组分进行分离，以2mL的上样体积和20mg/mL的浓度进行进针加样，以水为流动相、1mL/min的速度进行洗脱，紫外检测器在280nm处检测多肽组分的特征峰。
百草枯是一种联吡啶阳离子类除草剂，在体内能诱导产生活性氧自由基，从分子水平上氧化多种生命物质，使机体处于氧化胁迫环境，进而出现早衰现象。本发明将所述海参多肽、分子量小于3kDa的海参多肽组分以及凝胶层析分离得到的F1～F5组分分别加入到成虫初期的野生型秀丽线虫中培养，加入百草枯对秀丽线虫进行氧化胁迫造模，定时统计秀丽线虫存活的比率，检测对百草枯诱导的氧化胁迫的影响，结果显示本发明所述海参多肽、分子量小于3kDa的海参多肽组分以及凝胶层析分离得到的F1～F5组分均可以显著延长秀丽线虫的氧化胁迫存活率，提高秀丽线虫耐氧化胁迫条件的能力，以F2组分和F3组分的效果更佳。
自由基是机体氧化反应中产生的有害化合物，具有强氧化性，可损害机体的组织和细胞，进而引起慢性疾病及衰老效应。因此，通过测定对自由基的清除率，可以反映以清除活性氧自由基为主的抗氧化能力。本发明分别将所述凝胶层析分离得到的F2组分、F3组分加水溶解配制成各受试浓度的多肽样品溶液，加入DPPH溶液，测定吸光度，计算DPPH自由基清除率。结果显示，本发明所述海参多肽F2组分、F3组分均能够有效地清除体外DPPH自由基，而且呈现浓度依赖性。表明本发明所述海参多肽F2组分、F3组分均有较好的体外抗氧化效果。
活性氧类(ROS)是生物有氧代谢过程中的一种副产品，具有较强的氧化活性，在体内主要包括超氧阴离子(O2-)、羟自由基(·OH)和过氧化氢(H2O2)等。过高的活性氧水平会损坏细胞和基因结构，在许多疾病及衰老的发生中起着重要作用。体内存在一道抗氧化防御系统，如超氧化物歧化酶(SOD)是机体内天然存在的超氧自由基清除因子，它通过上述反应可以把有害的超氧自由基转化为过氧化氢；过氧化氢酶(CAT)是一种酶类清除剂，又称为触酶，是以铁卟啉为辅基的结合酶，可促使H2O2分解为分子氧和水，清除体内的过氧化氢，从而使细胞免于遭受H2O2的毒害，是生物防御体系的关键酶之一；丙二醛(MDA)常用作膜脂过氧化程度的指标，能够间接测定膜系统受损程度及受试物的抗膜脂过氧化的能力。本发明利用相关的抗氧化检测试剂盒来测定体内抗氧化酶SOD、CAT的活力，以及膜脂过氧化产物MDA的含量，可评价海参多肽F2组分、F3组分的体内抗氧化能力。结果显示，海参多肽F2组分、F3组分均可增强秀丽线虫体内SOD、CAT酶活力，而使MDA含量显著降低。表明本发明所述海参多肽F2组分、F3组分可通过提高机体抗氧化防御系统的功能来达到抗氧化、延衰作用，从而缓解由氧化胁迫引起的衰老现象。
取海参多肽中超滤后凝胶层析所得主要功效组分F2、F3，利用LC-MS/MS技术检测多肽的氨基酸序列信息，获得具有SEQ ID NO:1～13所示的氨基酸序列的海参特征序列多肽。
将所述海参特征序列多肽各个序列按照2mM的终浓度分别加入到L4期的野生型秀丽线虫中培养，加入百草枯对秀丽线虫进行氧化胁迫造模，定时统计秀丽线虫存活的比率，检测对百草枯诱导的氧化胁迫的影响，结果显示所述海参特征序列多肽均能一定程度延长秀丽线虫在百草枯氧化胁迫条件下的生存时间，特别以SvP-106、SvP-130、SvP-131最为显著。
因此，本发明提供了具有SEQ ID NO:1～13之一所示的氨基酸序列的海参多肽以及海参多肽F2组分和海参多肽F3组分在制备抗氧化、抗衰老的药物中的应用。
本领域技术人员可将本发明所述具有SEQ ID NO:1～13之一所示的氨基酸序列的海参多肽以及海参多肽F2组分和海参多肽F3组分直接或间接加入制备不同剂型时所需的药学上可接受的各种常用辅料，如填充剂、崩解剂、润滑剂、粘合剂等，以常规药物制剂方法，制成常用制剂如片剂、胶囊剂、注射液、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂和滴丸剂等。其中，填充剂如淀粉，乳糖，蔗糖，葡萄糖，甘露醇和硅酸；崩解剂如琼脂，碳酸钙，土豆淀粉或木薯淀粉，海藻酸，某些硅酸盐和碳酸钠，低取代羟丙基纤维素；润滑剂如滑石粉，硬脂酸钙，硬脂酸镁，固体聚乙二醇，月桂硫酸钠；粘合剂如羧甲基纤维素，藻酸盐，明胶，聚乙烯吡咯酮，蔗糖和阿拉伯胶。
本发明所述具有SEQ ID NO:1～13之一所示的氨基酸序列的海参多肽以及海参多肽F2组分和海参多肽F3组分还可以制备成抗氧化、抗衰老的保健品或化妆品。
由上述技术方案可知，本发明提供了海参多肽及其制备方法与应用。本发明所述海参多肽具有SEQ ID NO:1～13之一所示的氨基酸序列。本发明所述海参多肽F2组分包括具有SEQ ID NO:1～11所示的氨基酸序列；本发明所述海参多肽F3组分包括具有SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。本发明所述制备方法，能够充分利用海参丰富资源得到具有抗氧化、抗衰老作用的海参多肽F2组分和海参多肽F3组分。实验结果表明本发明所述制备方法制得的具有SEQ ID NO:1～13之一所示的氨基酸序列的海参多肽以及海参多肽F2组分和海参多肽F3组分均具有很好的抗氧化、抗衰老作用，可以用于制备成抗氧化、抗衰老药物、保健品或化妆品，应用范围广泛，具有良好的经济和社会效应。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示实施例3分子量小于3kDa的海参多肽组分凝胶层析分离色谱图；
图2示实施例4抗百草枯诱导的氧化胁迫实验中实施例1制备的海参多肽对秀丽线虫存活率影响的生存曲线；
图3示实施例4抗百草枯诱导的氧化胁迫实验中实施例2制备的分子量小于3kDa的海参多肽组分对秀丽线虫存活率影响的生存曲线；
图4示实施例4抗百草枯诱导的氧化胁迫实验中实施例3凝胶层析分离得到的F1～F5组分对秀丽线虫存活率影响的生存曲线，其中图A-E分别表示凝胶层析分离得到的F1～F5组分对秀丽线虫存活率影响的生存曲线；
图5示实施例5DPPH自由基清除实验中不同浓度的实施例3凝胶层析分离得到的F2组分的DPPH自由基清除率；
图6示实施例5DPPH自由基清除实验中不同浓度的实施例3凝胶层析分离得到的F3组分的DPPH自由基清除率；
图7示实施例6体内抗氧化防御系统的检测实验中实施例3凝胶层析分离得到的F2组分对秀丽线虫匀浆液上清液中SOD、CAT活力和MDA含量影响的结果图；
图8示实施例6体内抗氧化防御系统的检测实验中实施例3凝胶层析分离得到的F3组分对秀丽线虫匀浆液上清液中SOD、CAT活力和MDA含量影响的结果图；
图9示实施例8海参特征序列多肽抗百草枯诱导的氧化胁迫实验中海参特征序列多肽对秀丽线虫存活率影响的生存曲线。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为了进一步理解本发明，下面结合具体实施例对本发明做详细阐述。
实施例1、
新鲜的海参解刨，去内脏，体壁用自来水和蒸馏水清洗3～4次，然后匀浆海参体壁组织材料，冷冻干燥后，称取5g于250mL烧杯中并加入80mL水浸润(1g干粉配20mL一级水，后期用酶液体积补足)，可用玻璃棒适当搅拌，然后于水浴锅中预热至45℃，用NaOH溶液调节pH值至8.0，以每克底物配3000U胰蛋白酶的量，加入酶活为2500U/mg的胰蛋白酶，于37～55℃，恒温水解2～10小时，100℃煮沸灭活；然后，待温度降至55℃左右，用0.1M HCl溶液将pH调至5.5，以每克底物配3000U木瓜蛋白酶的量，加入酶活为6000U/mg的木瓜蛋白酶，于50～80℃，恒温水解2～10小时，100℃煮沸灭活，得到海参蛋白酶解液。按乙醇：海参蛋白酶解液体积比为3:5的比例加入95％乙醇进行初步沉淀，然后边加入95％乙醇边搅拌，逐步调节乙醇含量为60％以使多糖逐步析出并形成沉淀，随后室温静置过夜(约为12h)以沉淀多糖，后经减压抽滤除去杂质，再于4℃条件下6000rpm离心15min获得含多肽的上清溶液，经真空冷冻干燥得海参多肽的粉末。
实施例2、
用一级水将海参多肽冻干粉配成浓度为10mg/mL的溶液，使用截留分子量为3kDa超滤离心管在6000～8000rpm下离心，收集分子量小于3kDa的多肽组分(MW<3kDa)，冻干后获得相应多肽样品。
实施例3、
将分子量小于3kDa的海参多肽组分，于葡聚糖凝胶层析色谱柱上进行分离纯化处理，以2mL的上样体积和20mg/mL的浓度进行进针加样，以水为流动相、1mL/min的速度进行洗脱，紫外检测器在280nm处检测多肽组分的特征峰。收集各主成分峰的洗脱液，分别经真空冷冻干燥机，得到5个峰对应的多肽组分命名为F1、F2、F3、F4和F5，如图1所示。
实施例4、抗百草枯诱导的氧化胁迫实验
将实施例1制备的海参多肽按照浓度为0.5mg/mL和2mg/mL加入到成虫初期的野生型秀丽线虫中，将实施例2制备的分子量小于3kDa的海参多肽组分按照浓度为1mg/mL和2mg/mL分别加入到成虫初期的野生型秀丽线虫中，将实施例3凝胶层析分离得到的F1～F5组分按照浓度为1mg/mL加入到成虫初期的野生型秀丽线虫中，对照组加入等体积的S Medium，置于20℃培养24h后，加入终浓度为70mM的百草枯对秀丽线虫进行氧化胁迫造模，并开始定时统计秀丽线虫存活的比率，直至全部虫子死亡。存活率以生存曲线表示，采用Kaplan-meier法分析比较实施例1和实施例2制备的海参多肽、实施例3凝胶层析分离得到的F1～F5组分与对照组的差异性。结果如图2-4所示。
结果显示，实施例1制备的海参多肽在0.5mg/mL和2mg/mL的浓度下，能够延长氧化胁迫条件下秀丽线虫的生存时间，提高存活率。而实施例2制备的海参多肽在1mg/mL和2mg/mL浓度时，也能够提高氧化胁迫条件下秀丽线虫的存活率。而实施例3凝胶层析法分离得到的F1～F5组分，在1mg/mL的浓度下抗氧化胁迫能力的比较，以F2、F3的效果更佳。
表明海参多肽凝胶层析分离组分F2和F3均能够提高秀丽线虫耐氧化胁迫条件的能力，缓解机体因氧化胁迫而产生早衰的问题。
实施例5、DPPH自由基清除试验
将实施例3凝胶层析分离得到的F2、F3组分按照浓度为1mg/mL和2mg/mL分别加入到成虫初期的野生型秀丽线虫中，分别加水溶解配制成各受试浓度的多肽样品溶液，对照组为等体积的水。加入DPPH溶液，空白对照组以加入等体积水，室温下置于黑暗处反应30分钟后，于520nm波长下测定吸光度，计算DPPH自由基清除率，自由基清除率以mean±SD表示，采用T检验比较多肽组和对照组的差异性。结果如图5和图6所示。
其中，DPPH自由基清除率计算公式如下：
DPPH清除率(％)＝[1-(Asample-A0sanple)/(Acontrol-A0control)]×100％
式中，Asample、Acontrol表示多肽组和对照组的吸光值，A0sample和A0control表示多肽组和对照组的空白对照吸光度。
结果显示，海参多肽凝胶层析分离组分F2在0.25～2.0mg/mL的浓度范围内均能够有效清除DPPH自由基。而海参多肽凝胶层析分离组分F3在0.5～4.0mg/mL的浓度范围内，均能够有效清除DPPH自由基。表明海参多肽凝胶层析分离组分F2和F3均有较好的体外抗氧化效果。
实施例6、体内抗氧化防御系统的检测
经同步化处理的野生型秀丽线虫(N2)培养至L4期，调节虫密度后加入产卵抑制剂5-FUdR(终浓度为75μg/mL)，放置20℃摇床培养至成虫初期后，分别加入终浓度为1mg/mL的海参多肽凝胶层析分离组分F2和F3，对照组为S Medium缓冲液。在20℃下继续培养48h后收集线虫，加IP细胞裂解液(P0013)，于冰水浴上超声破碎，将得到的匀浆液于13000×g，4℃下离心5分钟，收集上清液，利用碧云天检测试剂盒，分别测定匀浆上清液中SOD、CAT活力和MDA含量。
图7显示在经1mg/mL海参多肽凝胶层析分离组分F2喂食后，秀丽线虫体内的SOD酶活力、H2O2酶活力较对照组有显著的提升，而脂质过氧化的标记物MDA含量显著性降低。而图8显示，经1mg/mL海参多肽凝胶层析分离组分F3喂食后，同样可增强秀丽线虫体内SOD、CAT酶活力，而使MDA含量显著降低。因此，上述结果表明本发明所述海参多肽凝胶层析分离组分F2和F3，可通过提高机体抗氧化防御系统的功能来达到抗氧化、延衰作用，从而缓解由氧化胁迫引起的衰老现象。
实施例7、海参多肽凝胶层析分离组分F2和F3的序列检测
取海参多肽中超滤后凝胶层析所得主要功效组分F2、F3，利用LC-MS/MS技术检测多肽的氨基酸序列信息。具体方案如下：取海参多肽凝胶层析分离组分F2、F3样品溶解于含0.1％甲酸/2％乙腈/98％的水溶液中，取约2μg样品进行在线的纳升液相色谱质谱联用分析，纳升液相色谱为美国AB SCIEX公司的Eksigent nanoLC-UltraTM二维系统，质谱为TripleTOF 5600系统。将样品在纳升流量的捕集柱(3μm,)上进样，动力泵以A液(0.1％甲酸/2％乙腈/98％水溶液)流速为2.5μL/min进行脱盐10min，然后以B液(0.1％甲酸/2％水/98％乙腈溶液)溶液进行梯度洗脱，同时进行质谱扫描分析。经过质谱数据与海参蛋白质数据库比对，获得其中多肽段序列组成如下表1所示。
表1 海参多肽凝胶层析分离组分F2、F3多肽段序列组成
实施例8、海参特征序列多肽抗氧化胁迫实验
将海参特征序列多肽各个序列按照2mM的终浓度分别加入到L4期的野生型秀丽线虫中，对照组加入等体积的S Medium，阳性组加入等浓度的谷胱甘肽(GSH)，置于20℃培养24h后，加入终浓度为50mmol/L的百草枯对秀丽线虫进行氧化胁迫造模，并开始定时统计秀丽线虫存活的比率，直至全部虫子死亡。存活率以生存曲线表示，采用Kaplan-meier法分析比较多肽组和对照组的差异性。结果如图9所示。
结果显示，2mM的海参特征序列多肽均能一定程度延长秀丽线虫在百草枯氧化胁迫条件下的生存时间，特别以SvP-106、SvP-130、SvP-131最为显著。

Claims (10)

1.一种海参多肽，其特征在于，具有SEQ ID NO:1～13之一所示的氨基酸序列。
2.一种海参多肽，其特征在于，包括下述序列：
(1)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
(2)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；
(3)具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；
(4)具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；
(5)具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；
(6)具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；
(7)具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；
(8)具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；
(9)具有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列；
(10)具有SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列；
(11)具有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
3.一种海参多肽，其特征在于，包括下述序列：
(1)具有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列；
(2)具有SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
4.权利要求2所述海参多肽的制备方法，其特征在于，取海参体壁匀浆后依次经胰蛋白酶和木瓜蛋白酶水解后，加入乙醇沉淀多糖，离心取上清液，超滤收集截留分子量小于3kDa的组分，凝胶层析分离后收集70～90min内的洗脱组分。
5.权利要求3所述海参多肽的制备方法，其特征在于，取海参体壁匀浆后依次经胰蛋白酶和木瓜蛋白酶水解后，加入乙醇沉淀多糖，离心取上清液，超滤收集截留分子量小于3kDa的组分，凝胶层析分离后收集90～110min内的洗脱组分。
6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述胰蛋白酶水解具体为调节pH至8.0，加入胰蛋白酶37～55℃水解2～10小时，灭酶；所述木瓜蛋白酶水解具体为调节pH至5.5，加入木瓜蛋白酶50～80℃水解2～10小时，灭酶。
7.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述乙醇沉淀多糖具体为先加入乙醇初步沉淀，然后加入乙醇至乙醇终浓度为60～80v/v％，静置12～20小时。
8.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述离心为5000～10000rpm的转速离心10～20min；所述超滤具体为上清液加入截留分子量为3kDa超滤离心管，在6000～8000rpm下离心。
9.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述凝胶层析分离具体为于葡聚糖凝胶层析色谱柱对MW<3kDa海参多肽组分进行分离，以2mL的上样体积和20mg/mL的浓度进行进针加样，以水为流动相、1mL/min的速度进行洗脱，紫外检测器在280nm处检测多肽组分的特征峰。
10.权利要求1-3任意一项所述海参多肽在制备抗氧化、抗衰老的药物、保健品或化妆品中的应用。
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