CN108047313B

CN108047313B - 鸡血球抗氧化肽及其发酵制备方法

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Publication number: CN108047313B
Application number: CN201711481066.7A
Authority: CN
Inventors: 张日俊; 郑召君; 黄燕; 李仲玄
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2017-12-29
Filing date: 2017-12-29
Publication date: 2020-09-15
Anticipated expiration: 2037-12-29
Also published as: CN108047313A

Abstract

本发明提供一种鸡血球抗氧化肽及其发酵制备方法。该方法包括以下步骤：(1)菌种活化；(2)血球培养基制备；(3)接种发酵；(4)发酵液的分离纯化。所述抗氧化肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明提供的抗氧化肽具有强自由基清除活性，对DPPH自由基、羟自由基等具有较强的清除作用，并具有较高的还原能力，在抗氧化活性开发和应用方面具有重要价值。

Description

鸡血球抗氧化肽及其发酵制备方法

技术领域

本发明涉及动物源性抗氧化肽技术领域，具体地说，涉及一种鸡血球抗氧化肽及其发酵制备方法。

背景技术

在需氧代谢过程中，氧气发生系列还原反应以调节信号转导和内环境稳态，同时伴随着活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)的形成。正常状态下，ROS产量与抗氧化防御系统处于动态平衡状态。一旦平衡被打破，过量的ROS等高活性分子则会导致蛋白质损伤、DNA突变、细胞膜磷脂氧化以及低密度脂蛋白改性，导致多种器官和系统的氧化性损伤，从而刺激产生危害机体健康的疾病，如肉鸡腹水综合征、动脉粥样硬化、糖尿病、白内障、神经退行性疾病、癌症等。

而补充外源性抗氧化剂如抗氧化肽等，有助于维持自由基与抗氧化防御系统的稳态平衡，防止、延缓或抑制脂质过氧化，减缓氧化损伤并帮助机体抵御疾病，具有重要的生理意义。抗氧化肽(antioxidative/antioxidant peptide)是指生物体内源性的或由生物体内蛋白质降解后生成的且具有抗氧化活性的肽类物质。因其分子量较小(通常由2～20个氨基酸组成)、结构简单而较易被吸收，因此抗氧化肽具有营养和功能的双重作用。与具有毒副作用而限量添加的化学合成抗氧化剂(叔丁基对苯二酚、丁基羟基茴香醚、没食子酸丙酯、二丁基羟基甲苯等)相比，该类活性物质具有稳定性高、活性强、高营养、易吸收、安全低毒等优点。因此，从自然资源中获取抗氧化活性肽已成为当前营养、医药等领域的研究焦点。

家禽血液蛋白质含量高(20％左右)，必需氨基酸(Lys、Leu等)含量丰富，是提取抗氧化肽的优质蛋白源。目前，国内外对家禽血液的研究甚少，从新鲜鸡血中制备高活性抗氧化肽的技术和产品更是未见报道。因此，充分开发我国丰富的家禽血液资源，深入并系统挖掘其抗氧化活性，为高效利用家禽血球提供渠道和技术依据，也为家禽血球蛋白发酵开发成抗氧化的功能性饲料和食品奠定理论基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种从鸡血中提取活性抗氧化肽的方法并制备得到氧化肽。

为了实现本发明目的，本发明提供的鸡血球抗氧化肽的发酵制备方法，包括以下步骤：(1)菌种活化；(2)血球培养基制备；(3)接种发酵；(4)发酵液的分离纯化。

步骤(3)接种发酵所用菌种为纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)。

本发明的鸡血球抗氧化肽的发酵制备方法，具体包括以下步骤：

(1)菌种活化：将发酵所用的菌株接种到液体种子培养基中，进行摇瓶培养；

(2)血球培养基制备：采集鸡血，加入占血液总重量0.4％-0.8％的抗凝剂，采用连续离心法将鸡血分离为血浆和血球；将血球配制成血球培养基；

(3)接种发酵：向血球培养基中接入适量活化的菌种进行发酵培养；发酵结束后，离心，收集上清，过滤，收集滤液，检测抗氧化活性；

(4)发酵液的分离纯化：将滤液上样于离子交换色谱柱，用洗脱液进行洗脱，收集具有抗氧化活性的洗脱峰，并透析除盐；利用反相高效液相色谱进一步分离，乙腈洗脱，收集抗氧化活性最强的洗脱峰，冷冻干燥即得鸡血球抗氧化肽。

本发明中，鸡血可以为新鲜采集的鸡血，也可以是经过冷冻融化后的鸡血。冷冻的鸡血在使用前需进行低温解冻，尽量减少冷冻解冻过程对蛋白的破坏。

前述的方法，步骤(1)中所述液体种子培养基的配方为：0.1-5％葡萄糖，1-3％酵母浸提物，0.1％ K₂HPO₄·3H₂O，0.05％ MgSO₄·7H₂O，pH 7.0-7.2；摇瓶培养条件为：28-40℃转速100-200rpm摇床培养8-16h(优选37℃转速170rpm摇床培养12h)。

本发明所用抗凝剂为柠檬酸钠。

前述的方法，步骤(2)中所述血球培养基的配方为：血球0.1-5％，葡萄糖0.1-5％，K₂HPO₄·3H₂O 0.1％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，以水配制。110-125℃灭菌15～30min(优选121℃灭菌15min)，冷却待用。

前述的方法，步骤(3)中向血球培养基中接入菌种于28-40℃恒温摇床中100-200rpm(优选37℃恒温摇床中170rpm)发酵培养至对数期；发酵结束后，4000-7000×g离心5-20min(优选5000×g离心10min)，上清液用0.22μm滤膜过滤，检测滤液的抗氧化活性。

优选地，本发明所述离子交换色谱柱内径和长度之比为1:23；填充料为DOWEX 1×8，洗脱液为含0-1M NaCl的20mM Tris缓冲液，流速为1.0ml/min。

优选地，进行反相高效液相色谱所用RP-HPLC柱为Zorbax SB-C18柱，洗脱液为含0.1％三氟乙酸的乙腈，流速为0.5ml/min。

本发明还提供按照上述方法制备的鸡血球抗氧化肽，其为氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示的活性肽。

本发明进一步提供所述鸡血球抗氧化肽在制备食品、药品、保健品、化妆品和饲料中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(一)本发明提供的抗氧化肽具有强自由基清除活性，对DPPH自由基、超氧阴离子、羟自由基等具有较强的清除作用，并具有较高的还原能力，其抗氧化能力可与谷胱甘肽相媲美，在抗氧化活性开发和应用方面具有重要价值。

(二)采用本发明方法制备的抗氧化肽，具有天然、无毒、无污染、无残留、无副作用且活性高的特点，还可有效耐受高温(100℃耐受1h)、强酸(耐受最低pH 1.0)和胃肠消化(完全耐受胃蛋白酶和胰酶消化)，具有良好的稳定性。

(三)本发明中，通过对鸡血球进行微生物发酵，并优化了发酵条件，充分利用血液蛋白，并将其转化为价值较高的抗氧化肽，实现家禽血液资源的高值化利用，具有成本优势，并为综合利用蛋白质资源提供了一条有效途径。

(四)本发明利用微生物发酵鸡血球，成本低，操作简单，适用于规模化生产。

附图说明

图1为本发明较佳实施例中不同血球蛋白浓度对发酵产物DPPH自由基清除能力的影响。

图2为本发明较佳实施例中不同接种量对发酵产物DPPH自由基清除能力的影响。

图3为本发明较佳实施例中不同葡萄糖浓度对发酵产物DPPH自由基清除能力的影响。

图4为本发明较佳实施例中离子交换色谱图。

图5为本发明较佳实施例中高效液相色谱(HPLC)图。其中，上图为离子交换层析中获得的组分A的高效液相层析图，下图为HPLC分离获得的组分3的纯化图谱。

图6为本发明鸡血球抗氧化肽(SEQ ID NO:1)的质谱图。其中，上图为一级质谱图(MS)，下图为二级质谱图(MS/MS)。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100mL溶液中含有溶质的克数。

以下实施例中所用纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)由中国农业大学饲料生物技术实验室(分属动物营养学国家重点实验室)张日俊教授提供。参见代文婷(导师张日俊).2012.高活性纳豆芽孢杆菌的筛选及特性研究(学士学文论文).北京:中国农业大学。

本发明中，DPPH自由基清除力、超氧阴离子清除能力、还原力和羟自由基清除能力的测定方法分别如下：

1、DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基清除能力测定

1.5mL样品液与等量的1mmol/L DPPH乙醇溶液混合，25℃避光反应30min，在517nm测定其吸光值Asample；以等量的无水乙醇替代DPPH乙醇溶液，与1.5mL样品混合反应，于517nm波长测其吸光值Asample blank；不加待测样品液，于517nm波长下测定1.5mL DPPH乙醇与1.5mL水混合液的吸光值Acontrol。

2、羟自由基清除能力测定

取50μl样品与50μl浓度为0.75mM的硫酸亚铁溶液和50μl邻二氮菲无水乙醇溶液混合。然后加入50μl浓度为0.01％(v/v)的双氧水溶液，混合均匀，37℃反应1h后，在536nm处测定反应液的吸光度。羟自由基清除能力的计算公式为:

其中，A_sample是加入样品溶液后的吸光度；A_{sample blank}是不加双氧水和样品溶液的吸光值；A_control是采用蒸馏水代替样品溶液后的吸光度。

3、还原力测定

1.0ml样品与1.0ml磷酸钠溶液(pH6.6)及1.0ml 1％铁氰化钾混合，50℃孵化20min。加入1.0ml 10％TCA溶液，5000×g离心10min。2.0ml上清液与2.0ml去离子水、0.4ml0.1％三氯化铁混合，室温静置10min，700nm测吸光值。

实施例鸡血球抗氧化肽的制备方法

包括以下步骤：

采集新鲜鸡血加入占血液总重量0.8％的柠檬酸钠，并采用转速为14000r/min的高速离心机离心10分钟，将鸡血分离为血浆和血球。

制备发酵上清液：利用上述分离得到的血球制备血球培养基(血球蛋白适量，葡萄糖适量，0.1％K₂HPO₄·3H₂O，0.05％MgSO₄·7H₂O，pH 7.0～7.2)，121℃灭菌15min。向冷却后的血球培养基中接入适量的活化后的纳豆芽孢杆菌，置于37℃恒温摇床中170rpm培养。发酵结束后，5000×g高速离心10min，上清液用0.22μm滤膜过滤即得发酵上清液。

为了提高发酵效率和质量，进一步对微生物发酵参数进行优化。具体如下：

(1)血球蛋白浓度的优化

血球蛋白浓度选择0％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％和4％，葡萄糖浓度1％，接种量0.5％，发酵温度37℃，分别在12h、24h、36h、48h、60h和72h取样。5000×g高速离心10min，用0.22μm滤膜过滤，滤过液为上清液，检测上清液DPPH自由基清除能力。结果如图1所示，血球蛋白浓度为4％时，DPPH自由基清除能力较佳。

(2)接种量的优化

分别接种发酵种子液0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％和5％，血球蛋白浓度4％，葡萄糖浓度1％，接种量0.5％，发酵温度37℃，分别在12h、24h、36h、48h、60h和72h取样。5000×g高速离心10min，用0.22μm滤膜过滤，滤过液为上清液，检测上清液DPPH自由基清除能力。结果如图2所示，发酵产物的DPPH自由基清除能力随发酵时间的延长而逐渐增加，接种量3～5％时其清除效果最好。

(3)葡萄糖浓度的优化

葡萄糖浓度选择0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％和5％，血球蛋白浓度4％，接种量3％，发酵温度37℃，分别在12h、24h、36h、48h、60h和72h取样。5000×g高速离心10min，用0.22μm滤膜过滤，滤过液为上清液，检测上清液DPPH自由基清除能力。结果如图3所示。葡萄糖浓度为3％时比较适宜。此外，发酵产物清除DPPH自由基能力在发酵36～60h时获得最高值，因此最适发酵时间为36～60h。

离子交换色谱层析：将冷冻干燥后的发酵上清液溶解于20mM Tris缓冲液(pH8.2)获得浓度为20mg/ml的样品，过滤后上样于阴离子交换色谱柱DOWEX 1×8(氯型)，用含有0-1M NaCl的20mM Tris缓冲液梯度洗脱并用自动部份收集器收集洗脱液，用500Da透析袋透析除盐，获得的组分冻干后分析抗氧化能力(洗脱曲线见图4)。

RP-HPLC：将活性最强的组分A配制成10mg/ml的溶液，上样于Zorbax SB-C18柱子并用含0.1％三氟乙酸的乙腈进行洗脱，流速为0.5ml/min，收集抗氧化最强的洗脱峰3，冷冻干燥即得本发明所述的抗氧化肽(洗脱曲线见图5)。

(6)氨基酸序列鉴定：高效液相色谱检验所得组分3纯度为95％以上，采用液相色谱与质谱联用技术(LC-MS/MS)方法测定氨基酸序列(图6)，得到本发明所述的抗氧化肽的氨基酸序列为Thr-Ser-Phe-Gly-Asp-Ala-Val-Lys-Asn-Leu-Asp-Asn-Ile-Lys(TSFGDAVKNLDNIK)，分子量为1521.7Da；目标肽在浓度为0.2mg/ml时，其DPPH自由基清除能力、羟自由基清除能力和还原力分别为58.98±4.72％、49.64±0.86％和0.67±0.01。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 鸡血球抗氧化肽及其发酵制备方法

<130> KHP171118199.8

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 14

<212> PRT

<213> 鸡(Gallus gallus)

<400> 1

Thr Ser Phe Gly Asp Ala Val Lys Asn Leu Asp Asn Ile Lys

1 5 10

Claims

1.鸡血球抗氧化肽，其特征在于，其为氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的活性肽。

2.权利要求1所述鸡血球抗氧化肽在制备食品、药品、保健品、化妆品和饲料中的应用。