CN101191139A - 海参多肽、多糖的综合提取工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了海参多肽、多糖的综合提取工艺，其特点是以鲜海参为原料，先胶体化，在复合胰蛋白酶作用下水解，离心分别收集沉淀和上清液，上清液加入乙醇沉淀离心，所得上清液为海参多肽的混合物，合并两次离心沉淀加入A.S1398精制中性蛋白酶进行水解，离心，上清液加入乙醇后沉淀离心，合并两次上清液为海参多肽混合物，沉淀为粗多糖；将海参多肽的混合物溶于水，用不同孔径超滤膜进行不同分子量的分段分离纯化，经脱苦脱色后冷冻干燥得不同分子量段的海参多肽粉末；将粗多糖配成5％的水溶液，离心、脱色、再离心，收集沉淀后洗涤，配制成水溶液后透析，加入乙醇至少重复沉淀三次得精制海参多糖；即在制备不同分子量段海参多肽的同时制备海参多糖，得率高、纯度高、安全性高，反应条件温和。
Description
技术领域
本发明涉及海洋生物的开发应用技术领域，具体地讲是海参多肽、多糖的综合提取工艺。
背景技术
近年来，随着国内外运用现代科学技术对海参品种鉴定与分类，海参的生理与生化，海参生物活性物质的分离、鉴定及其生物医学作用等研究的不断深入，人们发现海参含有许多具有重要生物学活性的物质，如多肽、海参多糖、海参皂苷、海参毒素等。现代营养学研究表明，低分子肽可不经胃消化直接被肠粘膜吸收。此外，海参肽还具有抗肿瘤、降血压、抗疲劳、延缓衰老、提高免疫力等功效。海参多糖具有提高免疫力、抑制肿瘤、抗凝血、保护神经组织等多种生理功能。从海参各类生物活性物质中寻找和开发新药，以及加工功能性食品已经成为海参深度开发利用的重要方向。目前，有采用化学法水解海参蛋白、也有采用酶解法，都是通过一步水解法进行单独海参多肽或者海参多糖的提取，上述方法只能得到一种海参活性物质(或海参多肽或海参多糖)，其它有效的海参活性物质在提取的同时被浪费掉，并且得到的海参多肽为多种分子量混合的物质，因为具有活性的海参肽通常为二肽、三肽等小分子肽，其中的大分子量的海参肽不利于吸收；另外化学法水解海参蛋白在提取海参活性物质的同时容易产生有毒物质。
发明内容
本发明的目的是克服上述已有技术的不足，而提供一种海参多肽、多糖的综合提取工艺，主要解决了现有的提取工艺只能获得单一的海参活性物质、且多肽中含有大分子量的多肽及化学法水解海参蛋白易产生有毒物质的问题。
为了达到上述目的，本发明是这样实现的：海参多肽、多糖的综合提取工艺，其特殊之处在于它包括如下步骤：
a选取鲜海参为原料，洗净除去泥沙及内脏，放入超低温冰箱速冻4-5小时，切成块状后放入绞肉机绞碎，然后放入胶体磨中研磨使成胶体化；
b将胶体化状态的海参50-60℃下加热20-30分钟；
c将经过上述前处理的海参加入全自动水解反应器，加入去离子水和复合胰蛋白酶，去离子水的量为清洗去内脏的鲜海参重量的5-7倍，进行水解；
d水解结束后高温灭菌灭酶；
e取出水解液离心去除沉淀及不溶物，加入乙醇至体系乙醇体积分数为60％，静止12h后离心，上清液为水溶性海参多肽的混合物；
f合并水解离心沉淀物和加入乙醇后离心沉淀物，加入去离子水混合配成水溶液，加入A.S1398精制中性蛋白酶进一步水解；
g取出上述步骤水解液离心去除沉淀及不溶物，加入乙醇至体系乙醇体积分数为60％，静止12h后离心，上清液为海参多肽的混合物并与e步骤水解离心上清液合并，沉淀为粗多糖；
h将合并的上清液——海参多肽的混合物利用旋转蒸发器浓缩，冷冻干燥得粉末多肽混合物；
i将上述粉末多肽混合物配制成5％的水溶液，用不同孔径超滤膜进行分级分离，脱苦脱色，真空浓缩后冷冻干燥得到溶解性良好的不同分子量段的海参多肽粉末；
j将g步骤的粗多糖配成质量百分比为5～7％的水溶液，离心除去不溶性杂质，上清液用双氧水氧化脱色，加入乙酸钾冷藏过夜，离心收集沉淀；
k沉淀经去离子水洗涤，配制成质量百分比为30％水溶液，经48小时透析，加入乙醇作为沉淀剂，乙醇与水体积比为8∶2，至少重复沉淀三次得精制海参多糖。
本发明的海参多肽、多糖的综合提取工艺，步骤a所述的超低温冰箱的温度为-70℃。
本发明的海参多肽、多糖的综合提取工艺，步骤c所述的复合胰蛋白酶的量(8000U/g)为清洗去内脏的鲜海参重量的1.0％，酶解温度50℃，水解时间2h。
本发明的海参多肽、多糖的综合提取工艺，步骤f所述的去离子水的量为合并的沉淀物重量的3倍，A.S1398精制中性蛋白的量(13万U/g)为合并的沉淀物重量的1.0％，温度为30℃，水解时间为3小时。
本发明的海参多肽、多糖的综合提取工艺，所述的乙醇为95％乙醇。
本发明所述的海参多肽、多糖的综合提取工艺与已有技术相比具有突出的实质性特点和显著进步，1、采用两步法水解，使复合胰蛋白酶和A.S1398精制中性蛋白酶水解海参蛋白的功能得到互补，从而使海参多肽的得率大大提高，另一方面也有利于在得到海参多肽的同时分离制备高得率及高纯度的海参多糖；2、多肽得率可以达到68.2％。将粗多糖分离纯化后，以鲜品海参的重量计，多糖得率为鲜重的0.42％，海参多肽中分子量小于1000Da的多肽占80％以上。3、由于很好地解决了综合提取制备技术难题，不仅有利于对海参多肽和海参多糖的进一步系统、深入研究，而且大大提高了得率和纯度降低了成本从而有利于产业化；4、克服了化学法水解海参蛋白容易产生有毒物质的缺点，安全性高，反应条件温和，水解反应在全自动水解反应器中进行，使水解过程容易控制，比较完整的保持了海参多糖，并且不破坏氨基酸结构和其它营养成分，保留了海参多肽的有效成分。
具体实施方式
为了更好地理解与实施，下面结合实施例详细说明本发明海参多肽、多糖的综合提取工艺。
实施例1，以产于山东烟台芝罘岛的鲜刺参为原料，洗净除去泥沙及内脏，放入-70℃超低温冰箱速冻4.5小时，切成块状后放入绞肉机绞碎，然后放入胶体磨中研磨使成胶体化，将胶体化状态的海参55℃下加热25分钟，然后加入全自动水解反应器，加入去离子水和复合胰蛋白酶，去离子水的量为清洗去内脏的鲜海参重量的6倍，进行水解，水解结束后高温灭菌灭酶，取出水解液离心去除沉淀及不溶物，加入95％乙醇至体系乙醇体积分数为60％，静止12h后离心，上清液为水溶性海参多肽的混合物；合并水解离心沉淀物和加入乙醇后离心沉淀物，加入去离子水混合配成水溶液，去离子水的量为合并的沉淀物重量的3倍，加入A.S1398精制中性蛋白的量(13万U/g)为合并的沉淀物重量的1.0％，温度为30℃，水解时间为3小时，上述水解液离心去除沉淀及不溶物，加入95％乙醇至体系乙醇体积分数为60％，静止12h后离心，上清液为海参多肽的混合物并与上述的水解离心上清液合并，沉淀为粗多糖；将合并的上清液混合物利用旋转蒸发器浓缩，冷冻干燥得粉末多肽混合物，然后配制成5％的水溶液，用不同孔径超滤膜进行分级分离，脱苦脱色，真空浓缩后冷冻干燥得到溶解性良好的不同分子量段的海参多肽粉末；
将粗多糖沉淀配成质量百分比为6％的水溶液，离心除去不溶性杂质，上清液用双氧水氧化脱色，加入乙酸钾冷藏过夜，离心收集沉淀，沉淀经去离子水洗涤，配制成质量百分比为30％水溶液，经48小时透析，加入乙醇作为沉淀剂，乙醇与水体积比为8∶2，至少重复沉淀三次得精制海参多糖。
实施例1得到的海参多肽和海参多糖采用下述方法进行测定：
1、总蛋白含量的测定
采用微量凯氏定氮法
2、多肽的纯化
磷钼酸沉淀法：利用磷钼酸可以沉淀分子量10000以上的含氮物质。取灭酶后的酶解液20mL置于50mL容量瓶中，加入15mL水及2mL钼酸钠溶液，摇匀，立即用滤纸重复过滤至滤清，将滤液稀释适当倍数后取1mL用福林酚法测定低肽的含量。上述根据是硫酸和钼酸钠作用生成钼酸，然后和试样中存在的磷酸盐作用生成磷钼酸。
3、海参多肽含量的测定
采用福林-酚法
低肽含量(％)＝低肽量/总蛋白含量×稀释倍数×100
4、多糖含量的测定
蒽酮比色法：多糖在硫酸的作用下水解成单糖分子并迅速脱水形成糖醛衍生物，再将其与蒽酮缩合形成有色化合物，在适当波长下和一定浓度范围内，吸收值与糖浓度成一定的线性关系，从而比色测定其含量。配制一系列不同浓度梯度的标准葡萄糖溶液，分别取1mL置于试管中浸于冰水浴中冷却，然后在冰浴条件下加入蒽酮试剂，同时将各管置于沸水浴中准确加热7分钟，立即取出置冰浴中冷却至室温，640nm下测吸光度绘制标准曲线。取粗多糖加水溶解稀释适当的倍数，按上述步骤操作，由回归方程得到对应的多糖的含量。
5、水解度的测定
TCA法：TCA是一种蛋白质沉淀剂，它可以沉淀蛋白质和肽段。随着反应的进行，蛋白质肽链被切成大小不等的片断，TCA溶解指数提高。可以被TCA沉淀的肽段所含的最少氨基酸残基数与底物的种类有关，就特定的底物而言，TCA溶解指数可以定性的反应蛋白的分解情况，溶解指数越高，表明较短肽断的含量越高。
取5mL酶解液加入5mL10％的TCA，混合振荡，4000r/min离心20min。取上清液做适当稀释，总蛋白含量和上清液可溶性蛋白的含量分别用微量凯氏定氮法和福林-酚法测定。
DH％＝(N2-N1)/(N0-N1)
N0为海参蛋白中的总蛋白，N1为酶解反应前海参蛋白中的TCA可溶性蛋白，N2为酶解液中的TCA可溶性蛋白。
由上述方法测得：海多肽得率可以达到68.2％。将粗多糖分离纯化后，以鲜品海参的重量计，多糖得率为0.42％。且经高效液相色谱监测表明海参多肽中分子量小于1000Da的多肽占80％以上。
实施例2，以产于山东烟台芝罘岛的鲜刺参为原料，洗净除去泥沙及内脏，放入-70℃超低温冰箱速冻4小时，切成块状后放入绞肉机绞碎，然后放入胶体磨中研磨使成胶体化，将胶体化状态的海参50℃下加热30分钟，然后加入全自动水解反应器，加入去离子水和复合胰蛋白酶，去离子水的量为清洗去内脏的鲜海参重量的5倍，进行水解，水解结束后高温灭菌灭酶，取出水解液离心去除沉淀及不溶物，加入95％乙醇至体系乙醇体积分数为60％，静止12h后离心，上清液为水溶性海参多肽的混合物；合并水解离心沉淀物和加入乙醇后离心沉淀物，加入去离子水混合配成水溶液，去离子水的量为合并的沉淀物重量的3倍，加入A.S1398精制中性蛋白的量(13万U/g)为合并的沉淀物重量的1.0％，温度为30℃，水解时间为3小时，上述水解液离心去除沉淀及不溶物，加入95％乙醇至体系乙醇体积分数为60％，静止12h后离心，上清液为海参多肽的混合物并与上述的水解离心上清液合并，沉淀为粗多糖；将合并的上清液混合物利用旋转蒸发器浓缩，冷冻干燥得粉末多肽混合物，然后配制成5％的水溶液，用不同孔径超滤膜进行分级分离，脱苦脱色，真空浓缩后冷冻干燥得到溶解性良好的不同分子量段的海参多肽粉末；
将粗多糖沉淀配成质量百分比为5％的水溶液，离心除去不溶性杂质，
上清液用双氧水氧化脱色，加入乙酸钾冷藏过夜，离心收集沉淀，沉淀经去离子水洗涤，配制成质量百分比为30％水溶液，经48小时透析，加入乙醇作为沉淀剂，乙醇与水体积比为8∶2，至少重复沉淀三次得精制海参多糖。
实施例3，以产于山东烟台芝罘岛的鲜刺参为原料，洗净除去泥沙及内脏，放入-70℃超低温冰箱速冻5小时，切成块状后放入绞肉机绞碎，然后放入胶体磨中研磨使成胶体化，将胶体化状态的海参70℃下加热20分钟，然后加入全自动水解反应器，加入去离子水和复合胰蛋白酶，去离子水的量为清洗去内脏的鲜海参重量的7倍，进行水解，水解结束后高温灭菌灭酶，取出水解液离心去除沉淀及不溶物，加入95％乙醇至体系乙醇体积分数为60％，静止12h后离心，上清液为水溶性海参多肽的混合物；合并水解离心沉淀物和加入乙醇后离心沉淀物，加入去离子水混合配成水溶液，去离子水的量为合并的沉淀物重量的3倍，加入A.S1398精制中性蛋白的量(13万U/g)为合并的沉淀物重量的1.0％，温度为30℃，水解时间为3小时，上述水解液离心去除沉淀及不溶物，加入95％乙醇至体系乙醇体积分数为60％，静止12h后离心，上清液为海参多肽的混合物并与上述的水解离心上清液合并，沉淀为粗多糖；将合并的上清液混合物利用旋转蒸发器浓缩，冷冻干燥得粉末多肽混合物，然后配制成5％的水溶液，用不同孔径超滤膜进行分级分离，脱苦脱色，真空浓缩后冷冻干燥得到溶解性良好的不同分子量段的海参多肽粉末；
将粗多糖沉淀配成质量百分比为7％的水溶液，离心除去不溶性杂质，上清液用双氧水氧化脱色，加入乙酸钾冷藏过夜，离心收集沉淀，沉淀经去离子水洗涤，配制成质量百分比为30％水溶液，经48小时透析，加入乙醇作为沉淀剂，乙醇与水体积比为8∶2，至少重复沉淀三次得精制海参多糖。
Claims (5)
1.海参多肽、多糖的综合提取工艺，其特征在于它包括如下步骤：
a选取鲜海参为原料，洗净除去泥沙及内脏，放入超低温冰箱速冻4-5小时，切成块状后放入绞肉机绞碎，然后放入胶体磨中研磨使成胶体化；
b将胶体化状态的海参50-60℃下加热20-30分钟；
c将经过上述前处理的海参加入全自动水解反应器，加入去离子水和复合胰蛋白酶，去离子水的量为清洗去内脏的鲜海参重量的5-7倍，进行水解；
d水解结束后高温灭菌灭酶；
e取出水解液离心去除沉淀及不溶物，加入乙醇至体系乙醇体积分数为60％，静止12h后离心，上清液为水溶性海参多肽的混合物；
f合并水解离心沉淀物和加入乙醇后离心沉淀物，加入去离子水混合配成水溶液，加入A.S1398精制中性蛋白酶进一步水解；
g取出上述步骤水解液离心去除沉淀及不溶物，加入乙醇至体系乙醇体积分数为60％，静止12h后离心，上清液为海参多肽的混合物并与e步骤水解离心上清液合并，沉淀为粗多糖；
h将合并的上清液——海参多肽的混合物利用旋转蒸发器浓缩，冷冻干燥得粉末多肽混合物；
i将上述粉末多肽混合物配制成5％的水溶液，用不同孔径超滤膜进行分级分离，脱苦脱色，真空浓缩后冷冻干燥得到溶解性良好的不同分子量段的海参多肽粉末；
j将g步骤的粗多糖配成质量百分比为5～7％的水溶液，离心除去不溶性杂质，上清液用双氧水氧化脱色，加入乙酸钾冷藏过夜，离心收集沉淀；
k沉淀经去离子水洗涤，配制成质量百分比为30％水溶液，经48小时透析，加入乙醇作为沉淀剂，乙醇与水体积比为8∶2，至少重复沉淀三次得精制海参多糖。
2.根据权利要求1所述的海参多肽、多糖的综合提取工艺，其特征在于步骤a所述的超低温冰箱的温度为-70℃。
3.根据权利要求1所述的海参多肽、多糖的综合提取工艺，其特征在于步骤c所述的复合胰蛋白酶的量(8000U/g)为清洗去内脏的鲜海参重量的1.0％，酶解温度50℃，水解时间2h。
4.根据权利要求1所述的海参多肽、多糖的综合提取工艺，其特征在于步骤f所述的去离子水的量为合并的沉淀物重量的3倍，A.S1398精制中性蛋白的量(13万U/g)为合并的沉淀物重量的1.0％，温度为30℃，水解时间为3小时。
5.根据权利要求1所述的海参多肽、多糖的综合提取工艺，其特征在于所述的乙醇为95％乙醇。
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