CN108753893A - 海参肽及其酶解提取工艺 - Google Patents

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    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
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    • A23L33/18—Peptides; Protein hydrolysates

Abstract

本发明公开了海参肽及其酶解提取工艺。所述海参肽的酶解提取工艺包括匀浆、清洗、碱洗、酶解、脱色脱腥、超滤、冷冻干燥工艺步骤。本发明所述海参肽的酶解提取工艺，解决了现有技术海参蛋白的难溶性问题，脱除海参肽酶解液的腥味，得到的海参肽不仅可以加工成营养补充剂，而且也可以作为制备抗氧化、抗衰老的保健品或化妆品的原料，具备良好的开发利用潜力。

Description

海参肽及其酶解提取工艺
技术领域
本发明属于多肽制备技术领域，具体公开了一种海参肽及其酶解提取工艺。
背景技术
海参是一种高蛋白、低脂肪、低糖、高营养价值的海产品，含有18种以上的氨基酸和多种维生素及丰富的微量元素，已成为传统的美味佳肴和保健品。海参有生百脉血、补肾益精、壮阳疗痿、除劳祛、滋阴利水、补正软坚和通肠润燥等多种功能。早在《食物本草》中就有记载：海参味咸，性温补，入肾经，生百脉血，补肾益精。可见海参在中国自古以来就是补之佳品。
现代药理研究表明：海参体壁真皮结缔组织、体腔、内腺管及内脏均含有生物活性物质，如海参毒素、海参多糖、海参皂苷、脂肪酸、多肽、海参神经节苷酯等。其中海参肽具有良好的抗氧化活性，能增强小鼠单核巨噬细胞作用及体液免疫和细胞免疫功能，增强小鼠的抗疲劳能力，而且一定浓度的海参肽具有很强的血管紧张素转换酶抑制活性。除此之外，海参多肽具有良好的溶解性和稳定性，易消化吸收，食用安全，具有降血压、预防心脑血管疾病、提高免疫力、抗肿瘤、抗疲劳和抗氧化等生物活性。因此，肽制品已成为海参深度开发的重要方向。
目前多数采用酶解法制备海参肽，但是由于海洋生物本身盐分高且有腥味，工艺上去除会增加大量的成本，同时也使得收率降低。而且海参本身为棕色或者深褐色，其蛋白酶酶解液的颜色为深灰色，不仅影响了产品的外观，也有碍于对产品的深度开发。因此，有效去除海参肽的杂色和腥味，提供一种有效的海参肽酶解提取工艺，对海参肽的深度开发具有重要的意义。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明所要解决的技术问题之一是提供一种海参肽的酶解提取工艺。
根据本发明的一个方面，本发明公开了一种海参肽的酶解提取工艺，包括匀浆、清洗、碱洗、酶解、脱色脱腥、超滤、冷冻干燥，具体包括以下步骤：
步骤S1：取新鲜海参，去内脏和杂物后得到海参体壁，切碎，加水匀浆清洗；
步骤S2：重复步骤S1中加水匀浆清洗1-5次，获得清洗后的海参体壁：
步骤S3：向清洗后的海参体壁中加入Tris-HCl缓冲液，搅拌，离心，弃上清液；收集沉淀；向沉淀中加入氢氧化钠水溶液，搅拌，离心，弃上清液，收集沉淀；将沉淀用水洗涤，冷冻干燥，得到固体备用；
步骤S4：向固体中加入提取溶剂以及混合酶，酶解，随后终止酶反应；
步骤S5：将酶解液脱色脱腥处理，离心得到上清液；
步骤S6：将上清液通过中空纤维素膜超滤，得到多肽液；
步骤S7：将多肽液真空浓缩，冷冻干燥，得到所述海参肽。
所述海参肽的酶解提取工艺，包括以下步骤：
步骤S1：取新鲜海参，去内脏和杂物后，得到海参体壁；将海参体壁切碎，加入海参体壁质量1～2倍的0℃的水匀浆，获得匀浆液；将匀浆液离心，弃上清液；
步骤S2：重复步骤S1中加水匀浆清洗2～3次，得到清洗后的海参体壁；
步骤S3：向步骤S2得到的清洗后的海参体壁中加入0.1～0.2mol/L的pH8.0的Tris-HCl缓冲液，海参体壁和Tris-HCl缓冲液的固液比为1：(4～5)(g/mL)，搅拌8～12小时，离心，弃上清液，取沉淀A；向沉淀A中加入2～4℃、0.1～0.5mol/L的氢氧化钠水溶液，沉淀A和氢氧化钠水溶液的固液比为1：(10～20)(g/mL)，搅拌15～24小时，离心，弃上清液，收集沉淀B；将沉淀B用去离子水洗涤至洗液呈中性，冷冻干燥，得到固体备用；
步骤S4：向步骤S3所得固体中加入水以及固体质量1～3％的混合酶，固体和水的固液比是1：(4～10)(g/mL)，于50～60℃酶解12～24小时，酶解过程中保持pH在6.8～7.5；将酶解液于90～100℃水浴处理5～10分钟，终止酶反应；
步骤S5：将步骤S4所得酶解液使用活性炭或树脂脱色脱腥处理，离心，取上清液；
步骤S6：将步骤S5所得上清液通过截留相对分子质量为6000～10000的中空纤维素膜，在0.15～0.25MPa的压力下进行超滤，得到多肽液；
步骤S7：将步骤S6所得多肽液真空浓缩至固含量为25～30％，冷冻干燥，得到所述海参肽。
在本发明的一些实施例中，步骤S5使用活性炭脱色脱腥处理的具体工艺为：向酶解液中加入酶解液质量的2～5％的活性炭，充分搅拌后，采用0.1～1mol/L的盐酸调节pH至5～6，于50～60℃水浴放置30～60分钟。
在本发明的一些实施例中，步骤S5使用树脂脱色脱腥处理的具体工艺为：向酶解液中加入树脂，酶解液和树脂的体积比为(3～5)：1，于20～30℃搅拌2～5小时；
或者，将树脂填入层析柱中，然后把酶解液以1～3mL/min的流速泵入柱内，酶解液和树脂的体积比为(3～5)：1，收集从泵中流出的酶解液。
所述树脂为D301R、D280、D380中的一种。
所述混合酶由碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶按照质量比3：3：4组成。
作为本发明优选的技术方案，所述海参肽的酶解提取工艺，由以下步骤组成：
步骤S1：取新鲜海参，去内脏和杂物后，得到海参体壁；将海参体壁切碎，加入海参体壁质量1～2倍的0℃的水匀浆，获得匀浆液；将匀浆液离心，弃上清液；
步骤S2：重复步骤S1中加水匀浆清洗2～3次，得到清洗后的海参体壁；
步骤S3：向步骤S2得到的清洗后的海参体壁中加入0.1～0.2mol/L的pH8.0的Tris-HCl缓冲液，海参体壁和Tris-HCl缓冲液的固液比为1：(4～5)(g/mL)，搅拌8～12小时，离心，弃上清液，取沉淀A；向沉淀A中加入2～4℃、0.1～0.5mol/L的氢氧化钠水溶液，沉淀A和氢氧化钠水溶液的固液比为1：(10～20)(g/mL)，搅拌15～24小时，离心，弃上清液，收集沉淀B；将沉淀B用去离子水洗涤至洗液呈中性，冷冻干燥，得到固体Ⅰ备用；
步骤S4：向步骤S3所得固体Ⅰ中加入0.1～0.8mol/L的酸液，固体Ⅰ和酸液的固液比为1：(8～12)(g/mL)，混匀后，随后加入固体Ⅰ质量1～3％的胃蛋白酶，于2～4℃提取12～36小时；向提取液中加入氯化钠，使得氯化钠的浓度达到0.5～0.8moL/L，充分搅拌后，于2～4℃离心，取沉淀；将沉淀复溶于0.1～0.5moL/L的乙酸中，在2～4℃下用0.01～0.02moL/L的磷酸氢二钠水溶液透析48～72小时，每隔5～6小时更换一次；将透析液离心，取上清液，冷冻干燥，得到固体Ⅱ；
步骤S5：向步骤S4所得固体Ⅱ中加入水以及固体Ⅱ质量1～3％的混合酶，固体Ⅱ和水的固液比是1：(4～10)(g/mL)，于50～60℃酶解12～24小时，酶解过程中保持pH在6.8～7.5；将酶解液于90～100℃水浴处理5～10分钟，终止酶反应；
步骤S6：将步骤S5所得酶解液使用活性炭或树脂脱色脱腥处理，离心，取上清液；
步骤S7：将步骤S6所得上清液通过截留相对分子质量为6000～10000的中空纤维素膜，在0.15～0.25MPa的压力下进行超滤，得到多肽液；
步骤S8：将步骤S7所得多肽液真空浓缩至固含量为25～30％，冷冻干燥，得到所述海参肽。
所述酸液为酸的水溶液，所述酸为柠檬酸、乳酸、醋酸中的一种或几种的混合物。优选地，所述酸由柠檬酸和乳酸混合而成，其中柠檬酸和乳酸的摩尔比为1：1。
本发明所要解决的技术问题之二是提供一种海参肽。
所述海参肽，采用上述任一种海参肽的酶解提取工艺制备得到。
本发明所述海参肽的酶解提取工艺，解决了现有技术海参蛋白的难溶性问题，脱除海参肽酶解液的腥味，得到的海参肽不仅可以加工成营养补充剂，而且也可以作为制备抗氧化、抗衰老的保健品或化妆品的原料，具备良好的开发利用潜力。
具体实施方式
试验材料介绍：
实施例中海参具体采用新鲜刺参，购自大连长兴水产品市场。
实施例中0.1mol/L的pH8.0的Tris-HCl缓冲液，购于上海君瑞生物技术有限公司。
实施例中活性炭，购于江苏瑞辰炭业科技有限公司，食品级，粒径50目。
实施例中中空纤维素膜，截留相对分子质量为10000，购于杭州庆升净化技术有限公司。
实施例中树脂D301R，购于天津市西金纳环保材料科技有限公司。
实施例中树脂D280，购于上海一基实业有限公司。
实施例中树脂D380，购于天津市西金纳环保材料科技有限公司。
实施例中混合酶由碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶按照质量比3：3：4组成。
实施例中碱性蛋白酶，采用2709地衣芽孢杆菌丝氨酸型水解酶，购于南宁庞博生物工程有限公司，酶活力50万/g。
实施例中木瓜蛋白酶，食品级，购于湖南维兴生物科技有限公司，酶活力10万/g。
实施例中胰蛋白酶，食品级，购于浙江绿洲生物技术有限公司，酶活力4万/g。
实施例中胃蛋白酶，购于西安裕华生物科技有限公司，酶活力50万/g。
实施例中柠檬酸，购于上海翎颢生物科技有限公司。
实施例中乳酸，购于郑州诚旺添加剂产品有限公司。
在未具体说明的情况下，具体实施方式中冷冻干燥的具体工艺条件为：预冻温度-80℃，预冻时间3小时；然后置于-70℃冷肼中在真空度0.09MPa的条件下干燥48小时。
实施例1
海参肽的酶解提取工艺，包括以下步骤：
步骤S1：取新鲜海参，去内脏和杂物后，得到海参体壁；将海参体壁切碎，加入海参体壁质量2倍的0℃的去离子水，以3000转/分钟匀浆45秒，获得匀浆液；将匀浆液以14000转/分钟离心15分钟，弃上清液；
步骤S2：重复步骤S1中加水匀浆清洗过程3次，得到清洗后的海参体壁；
步骤S3：向步骤S2得到的清洗后的海参体壁中加入0.1mol/L的pH8.0的Tris-HCl缓冲液，海参体壁和Tris-HCl缓冲液的固液比为1：4(g/mL)，以100转/分钟搅拌8小时后，以14000转/分钟离心20分钟，弃上清液，取沉淀A；向沉淀A中加入4℃、0.1mol/L的氢氧化钠水溶液，沉淀A和氢氧化钠水溶液的固液比为1：10(g/mL)，以100转/分钟搅拌24小时，以14000转/分钟离心20分钟，弃上清液，收集沉淀B；将沉淀B用去离子水洗涤至洗液呈中性，冷冻干燥，得到固体备用；
步骤S4：向步骤S3所得固体中加入水以及固体质量3％的混合酶，固体和水的固液比是1：4(g/mL)，于55℃酶解12小时，酶解过程中用0.1mol/L氢氧化钠水溶液保持pH在7.5；将酶解液于90℃水浴处理5分钟，终止酶反应；
步骤S5：向步骤S4所得酶解液中加入酶解液质量2％的活性炭，以100转/分钟搅拌30分钟后，采用0.4mol/L的盐酸调节pH至5，于50℃水浴中放置60分钟；随后以4000转/分钟离心25分钟，取上清液；
步骤S6：将步骤S5所得上清液通过截留相对分子质量为10000的中空纤维素膜，在0.2MPa的压力下进行超滤，得到多肽液；
步骤S7：将步骤S6所得多肽液在50℃、真空度0.06MPa的条件下浓缩至固含量为25％，冷冻干燥，得到所述海参肽。
实施例2
海参肽的酶解提取工艺，包括以下步骤：
步骤S1：取新鲜海参，去内脏和杂物后，得到海参体壁；将海参体壁切碎，加入海参体壁质量2倍的0℃的去离子水，以3000转/分钟匀浆45秒，获得匀浆液；将匀浆液以14000转/分钟离心15分钟，弃上清液；
步骤S2：重复步骤S1中加水匀浆清洗过程3次，得到清洗后的海参体壁；
步骤S3：向步骤S2得到的清洗后的海参体壁中加入0.1mol/L的pH8.0的Tris-HCl缓冲液，海参体壁和Tris-HCl缓冲液的固液比为1：4(g/mL)，以100转/分钟搅拌8小时后，以14000转/分钟离心20分钟，弃上清液，取沉淀A；向沉淀A中加入4℃、0.1mol/L的氢氧化钠水溶液，沉淀A和氢氧化钠水溶液的固液比为1：10(g/mL)，以100转/分钟搅拌24小时，以14000转/分钟离心20分钟，弃上清液，收集沉淀B；将沉淀B用去离子水洗涤至洗液呈中性，冷冻干燥，得到固体备用；
步骤S4：向步骤S3所得固体中加入水以及固体质量3％的混合酶，固体和水的固液比是1：4(g/mL)，于55℃酶解12小时，酶解过程中用0.1mol/L氢氧化钠水溶液保持pH在7.5；将酶解液于90℃水浴处理5分钟，终止酶反应；
步骤S5：向步骤S4所得酶解液中加入树脂D301R，酶解液和树脂D301R的体积比为3：1，于30℃以170转/分钟搅拌2小时；随后以4000转/分钟离心25分钟后，取上清液；
步骤S6：将步骤S5所得上清液通过截留相对分子质量为10000的中空纤维素膜，在0.2MPa的压力下进行超滤，得到多肽液；
步骤S7：将步骤S6所得多肽液在50℃、真空度0.06MPa的条件下浓缩至固含量为25％，冷冻干燥，得到所述海参肽。
实施例3
海参肽的酶解提取工艺，包括以下步骤：
步骤S1：取新鲜海参，去内脏和杂物后，得到海参体壁；将海参体壁切碎，加入海参体壁质量2倍的0℃的去离子水，以3000转/分钟匀浆45秒，获得匀浆液；将匀浆液以14000转/分钟离心15分钟，弃上清液；
步骤S2：重复步骤S1中加水匀浆清洗过程3次，得到清洗后的海参体壁；
步骤S3：向步骤S2得到的清洗后的海参体壁中加入0.1mol/L的pH8.0的Tris-HCl缓冲液，海参体壁和Tris-HCl缓冲液的固液比为1：4(g/mL)，以100转/分钟搅拌8小时后，以14000转/分钟离心20分钟，弃上清液，取沉淀A；向沉淀A中加入4℃、0.1mol/L的氢氧化钠水溶液，沉淀A和氢氧化钠水溶液的固液比为1：10(g/mL)，以100转/分钟搅拌24小时，以14000转/分钟离心20分钟，弃上清液，收集沉淀B；将沉淀B用去离子水洗涤至洗液呈中性，冷冻干燥，得到固体备用；
步骤S4：向步骤S3所得固体中加入水以及固体质量3％的混合酶，固体和水的固液比是1：4(g/mL)，于55℃酶解12小时，酶解过程中用0.1mol/L氢氧化钠水溶液保持pH在7.5；将酶解液于90℃水浴处理5分钟，终止酶反应；
步骤S5：向步骤S4所得酶解液中加入树脂D280，酶解液和树脂D280的体积比为3：1，于30℃以170转/分钟搅拌2小时；随后以4000转/分钟离心25分钟后，取上清液；
步骤S6：将步骤S5所得上清液通过截留相对分子质量为10000的中空纤维素膜，在0.2MPa的压力下进行超滤，得到多肽液；
步骤S7：将步骤S6所得多肽液在50℃、真空度0.06MPa的条件下浓缩至固含量为25％，冷冻干燥，得到所述海参肽。
实施例4
海参肽的酶解提取工艺，包括以下步骤：
步骤S1：取新鲜海参，去内脏和杂物后，得到海参体壁；将海参体壁切碎，加入海参体壁质量2倍的0℃的去离子水，以3000转/分钟匀浆45秒，获得匀浆液；将匀浆液以14000转/分钟离心15分钟，弃上清液；
步骤S2：重复步骤S1中加水匀浆清洗过程3次，得到清洗后的海参体壁；
步骤S3：向步骤S2得到的清洗后的海参体壁中加入0.1mol/L的pH8.0的Tris-HCl缓冲液，海参体壁和Tris-HCl缓冲液的固液比为1：4(g/mL)，以100转/分钟搅拌8小时后，以14000转/分钟离心20分钟，弃上清液，取沉淀A；向沉淀A中加入4℃、0.1mol/L的氢氧化钠水溶液，沉淀A和氢氧化钠水溶液的固液比为1：10(g/mL)，以100转/分钟搅拌24小时，以14000转/分钟离心20分钟，弃上清液，收集沉淀B；将沉淀B用去离子水洗涤至洗液呈中性，冷冻干燥，得到固体备用；
步骤S4：向步骤S3所得固体中加入水以及固体质量3％的混合酶，固体和水的固液比是1：4(g/mL)，于55℃酶解12小时，酶解过程中用0.1mol/L氢氧化钠水溶液保持pH在7.5；将酶解液于90℃水浴处理5分钟，终止酶反应；
步骤S5：向步骤S4所得酶解液中加入树脂D380，酶解液和树脂D380的体积比为3：1，于30℃以170转/分钟搅拌2小时；随后以4000转/分钟离心25分钟后，取上清液；
步骤S6：将步骤S5所得上清液通过截留相对分子质量为10000的中空纤维素膜，在0.2MPa的压力下进行超滤，得到多肽液；
步骤S7：将步骤S6所得多肽液在50℃、真空度0.06MPa的条件下浓缩至固含量为25％，冷冻干燥，得到所述海参肽。
实施例5
海参肽的酶解提取工艺，包括以下步骤：
步骤S1：取新鲜海参，去内脏和杂物后，得到海参体壁；将海参体壁切碎，加入海参体壁质量2倍的0℃的去离子水，以3000转/分钟匀浆45秒，获得匀浆液；将匀浆液以14000转/分钟离心15分钟，弃上清液；
步骤S2：重复步骤S1中加水匀浆清洗过程3次，得到清洗后的海参体壁；
步骤S3：向步骤S2得到的清洗后的海参体壁中加入0.1mol/L的pH8.0的Tris-HCl缓冲液，海参体壁和Tris-HCl缓冲液的固液比为1：4(g/mL)，以100转/分钟搅拌8小时后，以14000转/分钟离心20分钟，弃上清液，取沉淀A；向沉淀A中加入4℃、0.1mol/L的氢氧化钠水溶液，沉淀A和氢氧化钠水溶液的固液比为1：10(g/mL)，以100转/分钟搅拌24小时，以14000转/分钟离心20分钟，弃上清液，收集沉淀B；将沉淀B用去离子水洗涤至洗液呈中性，冷冻干燥，得到固体备用；
步骤S4：向步骤S3所得固体中加入水以及固体质量3％的混合酶，固体和水的固液比是1：4(g/mL)，于55℃酶解12小时，酶解过程中用0.1mol/L氢氧化钠水溶液保持pH在7.5；将酶解液于90℃水浴处理5分钟，终止酶反应；
步骤S5：将树脂D280填入层析柱中，然后把酶解液以2mL/min的流速泵入柱内，酶解液和树脂D280的体积比为3：1，收集从泵中流出的酶解液；随后以4000转/分钟离心25分钟后，取上清液；
步骤S6：将步骤S5所得上清液通过截留相对分子质量为10000的中空纤维素膜，在0.2MPa的压力下进行超滤，得到多肽液；
步骤S7：将步骤S6所得多肽液在50℃、真空度0.06MPa的条件下浓缩至固含量为25％，冷冻干燥，得到所述海参肽。
实施例6
海参肽的酶解提取工艺，包括以下步骤：
步骤S1：取新鲜海参，去内脏和杂物后，得到海参体壁；将海参体壁切碎，加入海参体壁质量2倍的0℃的去离子水，以3000转/分钟匀浆45秒，获得匀浆液；将匀浆液以14000转/分钟离心15分钟，弃上清液；
步骤S2：重复步骤S1中加水匀浆清洗过程3次，得到清洗后的海参体壁；
步骤S3：向步骤S2得到的清洗后的海参体壁中加入0.1mol/L的pH8.0的Tris-HCl缓冲液，海参体壁和Tris-HCl缓冲液的固液比为1：4(g/mL)，以100转/分钟搅拌8小时后，以14000转/分钟离心20分钟，弃上清液，取沉淀A；向沉淀A中加入4℃、0.1mol/L的氢氧化钠水溶液，沉淀A和氢氧化钠水溶液的固液比为1：10(g/mL)，以100转/分钟搅拌24小时，以14000转/分钟离心20分钟，弃上清液，收集沉淀B；将沉淀B用去离子水洗涤至洗液呈中性，冷冻干燥，得到固体备用；
步骤S4：向步骤S3所得固体中加入水以及固体质量3％的混合酶，固体和水的固液比是1：4(g/mL)，于55℃酶解12小时，酶解过程中用0.1mol/L氢氧化钠水溶液保持pH在7.5；将酶解液于90℃水浴处理5分钟，终止酶反应；
步骤S5：将树脂D380填入层析柱中，然后把酶解液以2mL/min的流速泵入柱内，酶解液和树脂D380的体积比为3：1，收集从泵中流出的酶解液；随后以4000转/分钟离心25分钟后，取上清液；
步骤S6：将步骤S5所得上清液通过截留相对分子质量为10000的中空纤维素膜，在0.2MPa的压力下进行超滤，得到多肽液；
步骤S7：将步骤S6所得多肽液在50℃、真空度0.06MPa的条件下浓缩至固含量为25％，冷冻干燥，得到所述海参肽。
统计实施例1～6步骤S5所得上清液的的氮回收率，脱色率，以及腥味值。
脱色率的测定方法：用722分光光度计测定步骤S4所得酶解液与步骤S5所得上清液的吸光度值OD0、OD1(波长为458nm)，并计算脱色率。脱色率的计算公式为：脱色率(％)＝(OD0-OD1)/OD0×100％。
氮回收率的测定方法：用722分光光度计测定步骤S4所得酶解液及步骤S5所得上清液的吸光度值OD酶解液、OD上清液(波长为540nm)，并计算氮回收率。氮回收率的计算公式为：氮回收率(％)＝OD上清液/OD酶解液×100％。
腥味值的感官评定方法：以基本无腥味为10分，略微腥味为8分，腥味较弱为6分，腥味一般为4分，腥味较重为2分，腥味很重为0分。以8人小组评分，取其平均值。脱腥率的计算公式为：脱腥率(％)＝(步骤S4所得酶解液腥味值-步骤S5所得上清液的腥味值)/步骤S4所得酶解液腥味值×100％。
氮回收率，脱色率，以及腥味值的统计结果表见表1。
表1：氮回收率，脱色率，以及腥味值统计表
从表1可以看出，实施例1采用活性炭作为脱色剂，可以达到很好的脱色效果，但是活性炭对酶解液中含氮化合物的吸附比较大，这样会对海参肽的制备造成较大的损失。比较实施例2～4可以看出，D301和D280相较于D301R，脱色效果有所改善，因此推测酶解液中色素去除可能和树脂的极性有关，也可能和树脂的离子有关。实施例5～6进一步使用D301和D280进行动态吸附，结果发现，实施例5的脱色率、脱腥率和氮回收率都高于实施例6。
对比例1
海参肽的酶解提取工艺，包括以下步骤：
步骤S1：取新鲜海参，去内脏和杂物后，得到海参体壁；将海参体壁切碎，加入海参体壁质量2倍的0℃的去离子水，以3000转/分钟匀浆45秒，获得匀浆液；将匀浆液以14000转/分钟离心15分钟，弃上清液；
步骤S2：重复步骤S1中加水匀浆清洗过程3次，得到清洗后的海参体壁；
步骤S3：向步骤S2所得清洗后的海参体壁中加入水以及海参体壁质量3％的混合酶，海参体壁和提取用水的固液比是1：4(g/mL)，于55℃酶解12小时，酶解过程中用0.1mol/L氢氧化钠水溶液保持pH在7.5；将酶解液于90℃水浴处理5分钟，终止酶反应；
步骤S4：将树脂D280填入层析柱中，然后把酶解液以2mL/min的流速泵入柱内，酶解液和树脂D280的体积比为3：1，收集从泵中流出的酶解液；随后以4000转/分钟离心25分钟后，取上清液；
步骤S5：将步骤S4所得上清液通过截留相对分子质量为10000的中空纤维素膜，在0.2MPa的压力下进行超滤，得到多肽液；
步骤S6：将步骤S5所得多肽液在50℃、真空度0.06MPa的条件下浓缩至固含量为25％，冷冻干燥，得到所述海参肽。
实施例7
海参肽的酶解提取工艺，包括以下步骤：
步骤S1：取新鲜海参，去内脏和杂物后，得到海参体壁；将海参体壁切碎，加入海参体壁质量2倍的0℃的去离子水，以3000转/分钟匀浆45秒，获得匀浆液；将匀浆液以14000转/分钟离心15分钟，弃上清液；
步骤S2：重复步骤S1中加水匀浆清洗过程3次，得到清洗后的海参体壁；
步骤S3：向步骤S2得到的清洗后的海参体壁中加入0.1mol/L的pH8.0的Tris-HCl缓冲液，海参体壁和Tris-HCl缓冲液的固液比为1：4(g/mL)，以100转/分钟搅拌8小时后，以14000转/分钟离心20分钟，弃上清液，取沉淀A；向沉淀A中加入4℃、0.1mol/L的氢氧化钠水溶液，沉淀A和氢氧化钠水溶液的固液比为1：10(g/mL)，以100转/分钟搅拌24小时，以14000转/分钟离心20分钟，弃上清液，收集沉淀B；将沉淀B用去离子水洗涤至洗液呈中性，冷冻干燥，得到固体Ⅰ备用；
步骤S4：向步骤S3所得固体Ⅰ中加入0.5mol/L的柠檬酸水溶液，固体Ⅰ和柠檬酸水溶液的固液比为1：10(g/mL)，混匀后，随后加入固体Ⅰ质量2％的胃蛋白酶，于2℃提取36小时；向提取液中加入氯化钠，使得氯化钠的浓度达到0.8moL/L，以100转/分钟搅拌40分钟后，于2℃以14000转/分钟离心20分钟，取沉淀；将沉淀复溶于0.5moL/L的柠檬酸水溶液中，在2℃下用0.01moL/L的磷酸氢二钠水溶液透析72小时，每隔5小时更换一次；将透析液以14000转/分钟离心20分钟，取上清液，冷冻干燥，得到固体Ⅱ；
步骤S5：向步骤S4所得固体Ⅱ中加入水以及固体Ⅱ质量3％的混合酶，固体Ⅱ和水的固液比是1：4(g/mL)，于55℃酶解12小时，酶解过程中用0.1mol/L氢氧化钠水溶液保持pH在7.5；将酶解液于90℃水浴处理5分钟，终止酶反应；
步骤S6：将树脂D280填入层析柱中，然后把酶解液以2mL/min的流速泵入柱内，酶解液和树脂D280的体积比为3：1，收集从泵中流出的酶解液；随后以4000转/分钟离心25分钟后，取上清液；
步骤S7：将步骤S6所得上清液通过截留相对分子质量为10000的中空纤维素膜，在0.2MPa的压力下进行超滤，得到多肽液；
步骤S8：将步骤S7所得多肽液在50℃、真空度0.06MPa的条件下浓缩至固含量为25％，冷冻干燥，得到所述海参肽。
实施例8
海参肽的酶解提取工艺，包括以下步骤：
步骤S1：取新鲜海参，去内脏和杂物后，得到海参体壁；将海参体壁切碎，加入海参体壁质量2倍的0℃的去离子水，以3000转/分钟匀浆45秒，获得匀浆液；将匀浆液以14000转/分钟离心15分钟，弃上清液；
步骤S2：重复步骤S1中加水匀浆清洗过程3次，得到清洗后的海参体壁；
步骤S3：向步骤S2得到的清洗后的海参体壁中加入0.1mol/L的pH8.0的Tris-HCl缓冲液，海参体壁和Tris-HCl缓冲液的固液比为1：4(g/mL)，以100转/分钟搅拌8小时后，以14000转/分钟离心20分钟，弃上清液，取沉淀A；向沉淀A中加入4℃、0.1mol/L的氢氧化钠水溶液，沉淀A和氢氧化钠水溶液的固液比为1：10(g/mL)，以100转/分钟搅拌24小时，以14000转/分钟离心20分钟，弃上清液，收集沉淀B；将沉淀B用去离子水洗涤至洗液呈中性，冷冻干燥，得到固体Ⅰ备用；
步骤S4：向步骤S3所得固体Ⅰ中加入0.5mol/L的乳酸水溶液，固体Ⅰ和乳酸水溶液的固液比为1：10(g/mL)，混匀后，随后加入固体Ⅰ质量2％的胃蛋白酶，于2℃提取36小时；向提取液中加入氯化钠，使得氯化钠的浓度达到0.8moL/L，以100转/分钟搅拌40分钟后，于2℃以14000转/分钟离心20分钟，取沉淀；将沉淀复溶于0.5moL/L的乳酸水溶液中，在2℃下用0.01moL/L的磷酸氢二钠水溶液透析72小时，每隔5小时更换一次；将透析液以14000转/分钟离心20分钟，取上清液，冷冻干燥，得到固体Ⅱ；
步骤S5：向步骤S4所得固体Ⅱ中加入水以及固体Ⅱ质量3％的混合酶，固体Ⅱ和水的固液比是1：4(g/mL)，于55℃酶解12小时，酶解过程中用0.1mol/L氢氧化钠水溶液保持pH在7.5；将酶解液于90℃水浴处理5分钟，终止酶反应；
步骤S6：将树脂D280填入层析柱中，然后把酶解液以2mL/min的流速泵入柱内，酶解液和树脂D280的体积比为3：1，收集从泵中流出的酶解液；随后以4000转/分钟离心25分钟后，取上清液；
步骤S7：将步骤S6所得上清液通过截留相对分子质量为10000的中空纤维素膜，在0.2MPa的压力下进行超滤，得到多肽液；
步骤S8：将步骤S7所得多肽液在50℃、真空度0.06MPa的条件下浓缩至固含量为25％，冷冻干燥，得到所述海参肽。
实施例9
海参肽的酶解提取工艺，包括以下步骤：
步骤S1：取新鲜海参，去内脏和杂物后，得到海参体壁；将海参体壁切碎，加入海参体壁质量2倍的0℃的去离子水，以3000转/分钟匀浆45秒，获得匀浆液；将匀浆液以14000转/分钟离心15分钟，弃上清液；
步骤S2：重复步骤S1中加水匀浆清洗过程3次，得到清洗后的海参体壁；
步骤S3：向步骤S2得到的清洗后的海参体壁中加入0.1mol/L的pH8.0的Tris-HCl缓冲液，海参体壁和Tris-HCl缓冲液的固液比为1：4(g/mL)，以100转/分钟搅拌8小时后，以14000转/分钟离心20分钟，弃上清液，取沉淀A；向沉淀A中加入4℃、0.1mol/L的氢氧化钠水溶液，沉淀A和氢氧化钠水溶液的固液比为1：10(g/mL)，以100转/分钟搅拌24小时，以14000转/分钟离心20分钟，弃上清液，收集沉淀B；将沉淀B用去离子水洗涤至洗液呈中性，冷冻干燥，得到固体Ⅰ备用；
步骤S4：向步骤S3所得固体Ⅰ中加入酸液，固体Ⅰ和酸液的固液比为1：10(g/mL)，混匀后，随后加入固体Ⅰ质量2％的胃蛋白酶，于2℃提取36小时；向提取液中加入氯化钠，使得氯化钠的浓度达到0.8moL/L，以100转/分钟搅拌40分钟后，于2℃以14000转/分钟离心20分钟，取沉淀；将沉淀复溶于酸液中，在2℃下用0.01moL/L的磷酸氢二钠水溶液透析72小时，每隔5小时更换一次；将透析液以14000转/分钟离心20分钟，取上清液，冷冻干燥，得到固体Ⅱ；所述酸液中柠檬酸的摩尔浓度为0.25mol/L，所述酸液中乳酸的摩尔浓度为0.25mol/L；
步骤S5：向步骤S4所得固体Ⅱ中加入水以及固体Ⅱ质量3％的混合酶，固体Ⅱ和水的固液比是1：4(g/mL)，于55℃酶解12小时，酶解过程中用0.1mol/L氢氧化钠水溶液保持pH在7.5；将酶解液于90℃水浴处理5分钟，终止酶反应；
步骤S6：将树脂D280填入层析柱中，然后把酶解液以2mL/min的流速泵入柱内，酶解液和树脂D280的体积比为3：1，收集从泵中流出的酶解液；随后以4000转/分钟离心25分钟后，取上清液；
步骤S7：将步骤S6所得上清液通过截留相对分子质量为10000的中空纤维素膜，在0.2MPa的压力下进行超滤，得到多肽液；
步骤S8：将步骤S7所得多肽液在50℃、真空度0.06MPa的条件下浓缩至固含量为25％，冷冻干燥，得到所述海参肽。
海参肽对伤口愈合的促进评价
试验动物：db/db型糖尿病小鼠，SPF级，雄性，10周龄，购自上海应为信生物科技有限公司。
饲养条件：环境温度21～23℃，相对湿度50～60％，动物分笼饲养，自由进食饮水。
创伤模型的建立：小鼠经过4％的水合氯醛麻醉后，进行背部脱毛。常规皮肤消毒，于背部两侧分别切一个长1.5cm的纵向切口。切口切开肌肉，深达腹腔。然后模拟临床手术过程逐层缝合肌肉与皮肤。术后涂抹2％碘伏消毒，并注射青霉素G钠(1000IU/g·BW)防止感染。术后禁食6小时，保持正常饮水。手术当天记为第0天。
试验动物分组：小鼠随机分组。正常对照组为同窝初生的非糖尿病db/m小鼠。实验组由手术当天开始灌胃海参肽，灌胃量为1.00g/kg·BW。正常对照组和模型对照组用等量的蒸馏水进行灌胃。于手术后第14天后处死小鼠。
伤口的张力强度测试：各组小鼠于第4,7,14天处死时取右侧伤口皮肤，以伤口处为中线，宽0.5cm，距伤口两侧各0.5cm为长的长方形皮肤，去除皮下脂肪组织。将皮肤短边的一头连接到张力感受器，另一端连接到可以通过旋钮微调距离的装置上。缓慢调动旋钮拉伸皮肤，通过多动能生物信号采集系统记录皮肤断开时的张力大小。通过测微尺测量皮肤的厚度计算横截面积，张力除以横截面积即为皮肤的张力强度。
具体测试结果见表2。
表2：伤口张力强度测试表
从表2可以看出，实施例5～9的张力强度明显高于模型对照组，差异具有统计学意义。说明海参肽对小鼠伤口愈合过程中的炎症具有一定的抑制作用。
海参肽促进成纤维细胞增殖评价
小鼠胚胎成纤维细胞(NIH/3T3)，购于中国科学院细胞库。
海参肽溶液的制备：将海参肽用维持培养液溶解，在96孔细胞培养板中，依次稀释为6.25、12.5、25、50、100、200、400和800μg/mL，每个浓度7个复孔。以上操作均在无菌条件下进行。
成纤维细胞的培养：NIH/3T3细胞株传代时先倒出细胞培养液，用2mLPBS清洗两次细胞，弃去液体，加入1mL质量分数0.25％的胰蛋白酶消化液3分钟至细胞完全脱壁，将细胞悬液转移至离心管中，加入2mL完全培养液终止消化，1000转/分钟离心5分钟。离心完毕后，弃去上清，加入2mL培养基充分吹打，控制细胞浓度为每1mL含(1.0×105)～(5.0×105)个细胞，于37℃、5％二氧化碳、饱和湿度条件下培养。传代后24～36小时用于药理学活性测定。以上操作均在无菌条件下进行。
海参肽对成纤维细胞的作用：细胞传代24～36小时，弃去培养瓶中的培养液，消化和收集细胞，用完全培养液配成每1mL含(5.0×104)～(8.0×104)个细胞的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μL，于37℃、5％二氧化碳、饱和湿度条件下培养。24小时后换成维持培养液，于37℃、5％二氧化碳、饱和湿度条件下培养24小时。制成的细胞培养板弃去维持液，加入海参肽溶液，每孔100μL，并设置空白对照组(只加入100μL的维持培养液)和阳性对照组(加入质量浓度为10ng/mL的bFGF维持培养液)100μL，于37℃、5％二氧化碳、饱和湿度条件下培养48小时。每孔加入MTT溶液10μL，于37℃、5％二氧化碳、饱和湿度条件下培养5小时。以上操作均在无菌条件下进行。弃去培养板中的液体后，向每孔中加入二甲基亚砜100μL，混匀后在酶标仪上以630nm为参比波长，在570nm处测定吸光度，记录测定结果。
细胞增值率＝(实验组吸光值A570-空白对照组吸光值A570)/空白对照组吸光值A570×100％。
具体测试结果见表3。
表3：成纤维细胞增殖率测试表
从表2和表3可以看出，实施例5和实施例7～9的海参肽对伤口的愈合以及成纤维细胞的增殖促进作用更加明显。推测是经过碱洗去除了海参体壁中的非胶原蛋白，并促进胶原蛋白进行溶胀，其中含有盐酸的缓冲溶液可以达到去除海参多糖的效果，提高海参肽的纯度。另外，海参的体壁是海参的主要食用(药用)部位，其主要成分是胶原蛋白、酸性粘多糖和海参皂苷。和其他的脊椎动物相比，海参胶原蛋白具有显著的难溶性。实施例7～9通过酸液和酶法结合提取，在不改变海参肽结构的情况下，增加海参蛋白的活性，提高了海参肽的纯度。
本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (9)

1.海参肽的酶解提取工艺，包括匀浆、清洗、碱洗、酶解、脱色脱腥、超滤、冷冻干燥，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1：取新鲜海参，去内脏和杂物后得到海参体壁，切碎，加水匀浆清洗；
步骤S2：重复步骤S1中加水匀浆清洗1-5次，获得清洗后的海参体壁：
步骤S3：向清洗后的海参体壁中加入Tris-HCl缓冲液，搅拌，离心，弃上清液；收集沉淀；向沉淀中加入氢氧化钠水溶液，搅拌，离心，弃上清液，收集沉淀；将沉淀用水洗涤，冷冻干燥，得到固体备用；
步骤S4：向固体中加入提取溶剂以及混合酶，酶解，随后终止酶反应；
步骤S5：将酶解液脱色脱腥处理，离心得到上清液；
步骤S6：将上清液通过中空纤维素膜超滤，得到多肽液；
步骤S7：将多肽液真空浓缩，冷冻干燥，得到所述海参肽。
2.根据权利要求1所述的海参肽的酶解提取工艺，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1：取新鲜海参，去内脏和杂物后，得到海参体壁；将海参体壁切碎，加入海参体壁质量1～2倍的0℃的水匀浆，获得匀浆液；将匀浆液离心，弃上清液；
步骤S2：重复步骤S1中加水匀浆清洗2～3次，得到清洗后的海参体壁；
步骤S3：向步骤S2得到的清洗后的海参体壁中加入0.1～0.2mol/L的pH8.0的Tris-HCl缓冲液，海参体壁和Tris-HCl缓冲液的固液比为1：(4～5)(g/mL)，搅拌8～12小时，离心，弃上清液，取沉淀A；向沉淀A中加入2～4℃、0.1～0.5mol/L的氢氧化钠水溶液，沉淀A和氢氧化钠水溶液的固液比为1：(10～20)(g/mL)，搅拌15～24小时，离心，弃上清液，收集沉淀B；将沉淀B用去离子水洗涤至洗液呈中性，冷冻干燥，得到固体备用；
步骤S4：向步骤S3所得固体中加入水以及固体质量1～3％的混合酶，固体和水的固液比是1：(4～10)(g/mL)，于50～60℃酶解12～24小时，酶解过程中保持pH在6.8～7.5；将酶解液于90～100℃水浴处理5～10分钟，终止酶反应；
步骤S5：将步骤S4所得酶解液使用活性炭或树脂脱色脱腥处理，离心，取上清液；
步骤S6：将步骤S5所得上清液通过截留相对分子质量为6000～10000的中空纤维素膜，在0.15～0.25MPa的压力下进行超滤，得到多肽液；
步骤S7：将步骤S6所得多肽液真空浓缩至固含量为25～30％，冷冻干燥，得到所述海参肽。
3.根据权利要求2所述的海参肽的酶解提取工艺，其特征在于，步骤S5使用活性炭脱色脱腥处理的具体工艺为：向酶解液中加入酶解液质量的2～5％的活性炭，充分搅拌后，采用0.1～1mol/L的盐酸调节pH至5～6，于50～60℃水浴放置30～60分钟。
4.根据权利要求2所述的海参肽的酶解提取工艺，其特征在于，步骤S5使用树脂脱色脱腥处理的具体工艺为：向酶解液中加入树脂，酶解液和树脂的体积比为(3～5)：1，于20～30℃搅拌2～5小时；
或者，将树脂填入层析柱中，然后把酶解液以1～3mL/min的流速泵入柱内，酶解液和树脂的体积比为(3～5)：1，收集从泵中流出的酶解液。
5.根据权利要求4所述的海参肽的酶解提取工艺，其特征在于，所述树脂为D301R、D280、D380中的一种。
6.根据权利要求2所述的海参肽的酶解提取工艺，其特征在于，所述混合酶由碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶按照质量比3：3：4组成。
7.根据权利要求2所述的海参肽的酶解提取工艺，其特征在于，所述海参肽的酶解提取工艺由以下步骤组成：
步骤S1：取新鲜海参，去内脏和杂物后，得到海参体壁；将海参体壁切碎，加入海参体壁质量1～2倍的0℃的水匀浆，获得匀浆液；将匀浆液离心，弃上清液；
步骤S2：重复步骤S1中加水匀浆清洗2～3次，得到清洗后的海参体壁；
步骤S3：向步骤S2得到的清洗后的海参体壁中加入0.1～0.2mol/L的pH8.0的Tris-HCl缓冲液，海参体壁和Tris-HCl缓冲液的固液比为1：(4～5)(g/mL)，搅拌8～12小时，离心，弃上清液，取沉淀A；向沉淀A中加入2～4℃、0.1～0.5mol/L的氢氧化钠水溶液，沉淀A和氢氧化钠水溶液的固液比为1：(10～20)(g/mL)，搅拌15～24小时，离心，弃上清液，收集沉淀B；将沉淀B用去离子水洗涤至洗液呈中性，冷冻干燥，得到固体Ⅰ备用；
步骤S4：向步骤S3所得固体Ⅰ中加入0.1～0.8mol/L的酸液，固体Ⅰ和酸液的固液比为1：(8～12)(g/mL)，混匀后，随后加入固体Ⅰ质量1～3％的胃蛋白酶，于2～4℃提取12～36小时；向提取液中加入氯化钠，使得氯化钠的浓度达到0.5～0.8moL/L，充分搅拌后，于2～4℃离心，取沉淀；将沉淀复溶于0.1～0.5moL/L的乙酸中，在2～4℃下用0.01～0.02moL/L的磷酸氢二钠水溶液透析48～72小时，每隔5～6小时更换一次；将透析液离心，取上清液，冷冻干燥，得到固体Ⅱ；
步骤S5：向步骤S4所得固体Ⅱ中加入水以及固体Ⅱ质量1～3％的混合酶，固体Ⅱ和水的固液比是1：(4～10)(g/mL)，于50～60℃酶解12～24小时，酶解过程中保持pH在6.8～7.5；将酶解液于90～100℃水浴处理5～10分钟，终止酶反应；
步骤S6：将步骤S5所得酶解液使用活性炭或树脂脱色脱腥处理，离心，取上清液；
步骤S7：将步骤S6所得上清液通过截留相对分子质量为6000～10000的中空纤维素膜，在0.15～0.25MPa的压力下进行超滤，得到多肽液；
步骤S8：将步骤S7所得多肽液真空浓缩至固含量为25～30％，冷冻干燥，得到所述海参肽。
8.根据权利要求7所述的海参肽的酶解提取工艺，其特征在于，所述酸液为酸的水溶液，所述酸为柠檬酸、乳酸、醋酸中的一种或几种的混合物。
9.海参肽，其特征在于，采用权利要求1～8中任一项所述的海参肽的酶解提取工艺制备得到。
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