CN112176015A - 一种海参活性肽高效仿生制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种海参活性肽高效仿生制备方法，该制备方法包括：(1)粉碎干海参经模拟胃液充分浸透、振摇消化后，加入碱中和终止反应，减压蒸干得海参胃液消化样品。(2)海参胃液消化样品经模拟肠液充分浸透、振摇消化后，减压蒸干得海参肠液消化样品。(3)海参肠液消化样品加入50％～75％乙醇提取、离心，上清液以超滤、冷冻干燥技术精制获得高纯度海参活性肽样品；本发明制备的海参活性肽作为有效成分可用于抗氧化、肝保护、降血压、提升免疫等功能食品、保健品乃至药品等多用途产品开发使用，具有重要的经济和社会效益。

Description

一种海参活性肽高效仿生制备方法
技术领域
本发明涉及一种海参活性肽高效仿生制备方法，属于海洋生物功能食品加工领域。
背景技术
蛋白质作为生物大分子，一般认为是难以被人体直接吸收，特别是对于病患和老年人群，由于身体机能下降，消化和吸收能力比较差，更难于吸收食物中的蛋白类成分。生物活性肽为蛋白质水解的中间产物，是有特殊生理活性肽类的总称，在很多方面有更优于蛋白质的理化特性，其人体吸收效率甚至比氨基酸还要显著。
海参被列为世界八大珍品之一，刺参是其中一种极具营养价值的优质资源品种。据《本草纲目拾遗》中记载其味甘咸、补肾、益精髓、摄小便、壮阳疗痿，不仅是珍贵的食品，也是名贵的药材。刺参含有蛋白质、多糖、皂苷等多种重要生物活性物质，干燥的海参体壁中蛋白质可达90％以上，其丰富的蛋白质资源是制备生物活性肽的理想原料。
现代研究报道，海参肽具有延缓衰老、抗氧化、抗疲劳、降血压、提高免疫力、抗肿瘤等诸多生理功能。由于其多样的生理功能和极高的营养价值，在国际上受到广泛关注。欧美、日本等西方发达国家已有很多商品化产品得到广泛的应用，市场需求规模也呈现强劲增长势头。
由于受不同蛋白酶催化活性差异的影响，水解产物中活性肽的组成、得率及生物学功能各不相同。考虑到消化过程是人体营养物质吸收的关键步骤，能够将食物大分子转化为被机体吸收的小分子物质，进而被人体吸收利用。本专利采用仿生制备技术体外模拟胃肠环境对海参蛋白的消化过程，集合现代超滤技术对目标分子量物质进行分离浓缩，获取高纯度的优质活性短肽类组分。不但方法符合传统中医学理论、产品更适于人体吸收，且具有成本低、操作简单易行重复性好等优点。
中国专利文献CN102823715A(申请号：201210347135.6)公开了一种全仿生消化模型法制备生物活性肽的方法，该方法需要首先构建模拟咀嚼、胃肠蠕动等仿生消化系统体系，且为适合各类资源的制备消化液中需添加种类繁杂的电解质溶液来维护酶解效率；与之相比本专利构建的仿生酶解体系能够以更为简单的消化液组成达到优良的海参活性肽制备效果，操作步骤简便可进行规模化样品生产应用。
发明内容
基于传统中医药理论和人体消化系统对蛋白吸收利用优势，本发明提供一种海参活性肽高效仿生制备方法，操作流程简单、提取率优异，含量可达90％以上，极大程度的获取了高品质生物活性肽类成分，在清除体内自由基、提高免疫力、保护肝脏功能、调节血压方面具有较好的活性。
本发明技术方案如下：
一种海参活性肽高效仿生制备方法，包括如下步骤：
(1)干海参粉碎后，按质量体积比g/mL为1：(3～10)加入模拟胃液充分浸透，于36～38.5℃振摇消化0.5～4h，加入碱中和终止反应，减压蒸干即得海参胃液消化样品；
(2)取海参胃液消化样品，按质量体积比g/mL为1：(3～10)加入模拟肠液充分浸透，于36～38.5℃振摇消化0.5～4h，减压蒸干即得海参肠液消化样品；
(3)取海参肠液消化样品，加入50％～75％的乙醇溶液提取1～3h，提取液在4000～6000rpm/min条件下离心10～20min，上清液经滤膜超滤、冷冻干燥即得高纯度海参活性肽；
步骤(1)中，模拟胃液包括胃电解质溶液和胃蛋白酶；胃电解质溶液组成为0.03～0.08mol/L NaCl，0.03～0.08mol/L NaCl、0.005～0.03mol/L KCl，0.03～0.08mol/LNaCl、0.001～0.005mol/L CaCl2；胃蛋白酶和胃电解质溶液配比按质量体积比mg/mL为1:(4.5～12)；
步骤(2)中，模拟肠液包括肠电解质溶液和胰蛋白酶；肠电解质溶液组成为0.06～0.12mol/L NaCl，0.06～0.12mol/L NaCl、0.004～0.01mol/L KCl，0.06～0.12mol/LNaCl、0.002～0.008mol/L CaCl2；胰蛋白酶和肠电解质溶液配比按质量体积比mg/mL为1:(8～20)。
根据本发明优选的，步骤(1)中，胃电解质溶液组成为0.03～0.08mol/L NaCl、0.005～0.03mol/L KCl，胃蛋白酶和胃电解质溶液配比按质量体积比mg/mL为1:(6～10)。
进一步优选的，胃电解质溶液组成为0.05mol/L NaCl、0.01mol/L KCl，胃蛋白酶和胃电解质溶液配比按质量体积比mg/mL为1:8.5。
根据本发明优选的，步骤(1)中，模拟胃液用1mol/L HCl调pH值至1.2～2.2。
根据本发明优选的，步骤(1)中，碱终止反应使用0.5～1mol/L NaHCO3或Na2CO3。
根据本发明优选的，步骤(2)中，肠电解质溶液组成为0.06～0.12mol/L NaCl，胰蛋白酶和肠电解质溶液配比按质量体积比mg/mL为1:(10～16)。
进一步优选的，肠电解质溶液组成为0.085mol/L NaCl，胰蛋白酶和肠电解质溶液配比按质量体积比mg/mL为1:14。
根据本发明优选的，步骤(2)中，模拟肠液用NaHCO3调节pH值至7～7.5。
根据本发明优选的，步骤(3)中，加入乙醇溶液的量，按质量体积比g/mL为1：(20-45)，提取温度为30～50℃。
进一步优选的，加入乙醇溶液的量，按质量体积比g/mL为1：35，提取温度为40℃。
根据本发明优选的，步骤(3)中，超滤截取分子量范围为<10kDa。
进一步优选的，截取分子量范围为<5kDa。
上述方法制备的海参活性肽纯度按质量分数计不低于90％，所述活性肽中分子量在1kDa以下的含量按质量分数计不低于80％。
上述方法制备的高纯度海参活性肽作为有效成分在制备功能食品、保健食品或日化用品中的应用。
上述制备的海参活性肽作为有效成分在制备药品中的应用。
根据本发明优选的，上述制备的海参活性肽作为有效成分在制备清除体内自由基、提高免疫力、保护肝脏功能或调节血压功能药物中的应用。
本发明有益效果
1、本申请在一定程度模仿体内消化环境的基础上，建立了海参活性肽类成分仿生制备技术，对海参中丰富的蛋白资源进行深度开发，设计出海参活性肽的优良专属制备工艺。专利提升了我国海参蛋白资源加工利用技术的科技含量，提高的了产品的附加值，并且操作简单方便，成本低且安全性好，具有重要经济和社会效益；
2.本发明所述的制备方法对活性肽类目标组分具有获取量大、富集率高双重优点，产品总肽含量达到90％以上，可进行规模化放大生产；所得的活性短肽组分生物活性良好，具有抗氧化、降血压、提升免疫等功效；可作为有效成分在制备功能食品、保健品乃至药品中的应用，适用于各种常规剂型，易于广大消费者所接受。
附图说明
图1为海参活性肽促RAW 264.7细胞吞噬能力情况检测折线图；
图2为海参活性肽促RAW 264.7细胞因子分泌作用检测柱状图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此；实施例中使用的胃蛋白酶(1:3000，即3000U/mg)、胰蛋白酶(1:250，即250U/mg)、胃脂肪酶(≥500U/g)均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
牛血清白蛋白购自北京索莱宝科技有限公司
碱性蛋白酶(1:300)、木瓜蛋白酶(1:1000)均购自上海蓝季科技发展有限公司。
实施例1
一种海参活性肽高效仿生制备方法，具体步骤如下：
(1)模拟胃液消化：胃电解质溶液为0.05mol/L NaCl、0.01mol/L KCl，用1mol/LHCl调pH值至1.4；胃蛋白酶和胃电解质溶液配比按质量体积比mg/mL为1:8.5；1kg干海参粉碎后，按质量体积比g/mL为1:5加入模拟胃液充分浸透，于37℃振摇消化2h，加入1mol/LNaHCO3中和终止反应，-0.1Mpa减压蒸干即得海参胃液消化样品。
(2)模拟肠液消化：肠电解质溶液组成为0.085mol/L NaCl，用NaHCO3调节pH值至7.5；胰蛋白酶和肠电解质溶液配比按质量体积比mg/mL为1:14；取海参胃液消化样品，按质量体积比g/mL为1:5加入模拟肠液充分浸透，于37℃振摇消化2h，-0.1Mpa减压蒸干即得海参肠液消化样品。
(3)取海参肠液消化样品，按质量体积比g/mL为1:35加入70％乙醇40℃提取2h，提取液5000rpm/min条件下离心15min，上清液经5kDa滤膜超滤、冷冻干燥，得到粉末形式保存的提取物352g。
实施例2
一种海参活性肽高效仿生制备方法，具体步骤如下：
(1)模拟胃液消化：胃电解质溶液为0.03mol/L NaCl、0.002mol/L CaCl2，用1mol/L HCl调pH值至2.2；胃蛋白酶和胃电解质溶液配比按质量体积比mg/mL为1:10；1kg干海参粉碎后，按质量体积比g/mL为1:3加入模拟胃液充分浸透，于37℃振摇消化4h，加入0.5mol/L Na2CO3中和终止反应，-0.1Mpa减压蒸干即得海参胃液消化样品。
(2)模拟肠液消化：肠电解质溶液组成为0.06mol/L NaCl、0.008mol/L KCl，用NaHCO3调节pH值至7；胰蛋白酶和肠电解质溶液配比按质量体积比mg/mL为1:20；取海参胃液消化样品，按质量体积比g/mL为1:3加入模拟肠液充分浸透，于37℃振摇消化4h，-0.1Mpa减压蒸干即得海参肠液消化样品。
(3)取海参肠液消化样品，按质量体积比g/mL为1:45加入70％乙醇30℃提取3h，提取液4000rpm/min条件下离心20min，上清液经5kDa滤膜超滤、冷冻干燥，得到粉末形式保存的提取物326g。
实施例3
一种海参活性肽高效仿生制备工艺，具体步骤如下：
(1)模拟胃液消化：胃电解质溶液为0.08mol/L NaCl，用1mol/L HCl调pH值至1.2；胃蛋白酶和胃电解质溶液配比按质量体积比mg/mL为1:6；1kg干海参粉碎后，按质量体积比g/mL为1:10加入模拟胃液充分浸透，于37℃振摇消化0.5h，加入0.5mol/L NaHCO3中和终止反应，-0.1Mpa减压蒸干即得海参胃液消化样品。
(2)模拟肠液消化：肠电解质溶液组成为0.12mol/L NaCl、0.006mol/L CaCl2，用NaHCO3调节pH值至7.5；胰蛋白酶和肠电解质溶液配比按质量体积比mg/mL为1:8；取海参胃液消化样品，按质量体积比g/mL为1:10加入模拟肠液充分浸透，于37℃振摇消化0.5h，-0.1Mpa减压蒸干即得海参肠液消化样品。
(3)取海参肠液消化样品，按质量体积比g/mL为1:20加入60％乙醇50℃提取1h，提取液6000rpm/min条件下离心10min，上清液经10kDa滤膜超滤、冷冻干燥，得到粉末形式保存的提取物331g。
对比例1
一种海参活性肽仿生制备工艺，与实施例1的不同之处在于：
(1)模拟胃液消化：胃蛋白酶、胃脂肪酶和胃电解质溶液按质量质量体积比mg/mg/mL为1:1:8.5配比，胃电解质溶液及模拟消化过程与实施例1相同。
(2)模拟肠液消化：胰蛋白酶、牛血清白蛋白和肠电解质溶液按质量体积比mg/mg/mL为1:0.5:14配比；肠电解质溶液及模拟消化过程与实施例1相同。
(3)步骤同实施例1，得到粉末形式保存的提取物335g。
对比例2
一种海参活性肽组分的制备方法，采用传统的蛋白酶酶解技术：
1kg干海参粉碎后，按质量体积比g/mL为1:10加入纯净水充分浸透，按照6000U/g加入复合蛋白酶(碱性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶配比以质量比计为2∶1∶1)，在温度50℃、PH8.5条件下酶解2h，酶解液5000rpm/min条件下离心15min，上清液经10kDa滤膜超滤、冷冻干燥，得到粉末形式保存的提取物341g。
对比例3
一种海参活性肽组分的制备方法，同实施例1，不同之处在于：
步骤(1)胃电解质溶液替换为0.05mol/L MgCl2、0.01mol/L AlCl3溶液，步骤(2)肠电解质溶液替换为0.085mol/L MgCl2溶液；其他制备步骤同实施例1相同，得到粉末形式保存的提取物306g。
对比例4
一种海参活性肽组分的制备方法，同实施例1，不同之处在于：
步骤(3)中采用10kDa透析袋透析24h的方法，对提取上清液中目标分子量肽类成分进行富集，其他制备步骤同实施例1，得到粉末形式保存的提取物284g。
对比例5
一种花生肽的仿生制备方法，具体步骤如下：
1kg干花生粉碎，消化制备步骤同实施例1，得到粉末形式保存的提取物383g。
对比例6
一种海参活性肽仿生制备工艺，与实施例1的不同之处在于不进行步骤(1)的模拟胃液消化，其他均相同；得到粉末形式保存的提取物207g。
对比例7
一种海参活性肽仿生制备工艺，与实施例1的不同之处在于不进行步骤(2)的模拟肠液消化，其他均相同；到粉末形式保存的提取物265g。
应用试验例1
海参活性肽含量及分子量分布检测
(1)双缩脲溶液的配制：称取3g CuSO4·5H2O，溶于500mL蒸馏水中，加入9g酒石酸钾钠，再加入5g KI，待所加试药完全溶解后，搅拌加入6mol/L NaOH溶液100ml，蒸馏水稀释至1000mL，混匀备用。
(2)绘制标准曲线：以还原型谷胱甘肽(GSH)浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，操作如下：向6支刻度比色试管分别加入1mL浓度为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL的GSH标准溶液，加入4mL双缩脲溶液，室温静置30min显色，在540nm下测定并记录吸光度值。
线性回归方程：Y＝0.184x+0.235，R2＝0.9961，线性范围0.1～1.0mg/mL
(3)活性肽含量检测：称取10mg提取物粉末，定溶至10mL，备用。吸取1m L样品溶液置刻度比色试管中，加入双缩脲试剂4mL，混合均匀，按“标准曲线”项下显色，于540nm下测定吸光度值，对照标准曲线求得样品溶液中活性肽的质量(mg)，计算提取物中活性肽含量(％)。
表1活性肽含量测定结果
Figure BDA0002716041880000061
Figure BDA0002716041880000071
由表1可以得出，本发明涉及的制备方法对活性肽类目标组分具有获取量大、富集率高双重优点，产品总肽含量达到90％以上。
对比例1在胃肠模拟消化过程中分别添加了胃脂肪酶与牛血清白蛋白，但酶解消化结果与实施例1-3相比没有明显差别，说明此类原料的引进并不能显著提升海参活性肽的产量；相反由于其也属于蛋白类物质，引入后会在消化过程生成外源性肽段产物，对海参活性肽的收集造成不利影响；从规模化生产考虑，实施例中的生产原料更为简单有效，成本也更为经济。
对比例2与本专利技术相比，虽然传统的蛋白酶酶解制备工艺对提取物的得率影响不大，但终产物中活性肽类成分的含量大大降低。
对比例3的结果与实施例1-3相比存在差距，说明电解质溶液变化对活性肽的提取效果具有一定影响，并不是所有盐溶液对海参活性肽的酶解都产生促进效果，电解质溶液只有在接近人体内环境的条件下，才能充分发挥其协同促进作用。
对比例4说明采用透析技术的活性肽得率明显低于本发明涉及的实施例，说明本发明专利通过仿生酶解结合超滤富集工艺，大大提高了海参活性肽的提取率，且避免了透析时间过长的不利因素。
对比例5通过本专利仿生消化酶解技术对花生肽制备的尝试，发现获得的目标成分含量远远低于海参样品组，对海参活性肽的高富集能力并不能推广到所有物种，进一步证实了该技术的专属性。针对实验样品花生的特质，产品生物肽含量较低可能与其中油脂类成分较多有关，该技术无法对其进行有效分离。
对比例6和对比例7分别对海参以本专利所阐述的单一胃液或肠液进行消化处理，无论多肽得率还是纯度均呈现明显下降趋势，这可能与样品消化不完全有关。
综上含量检测说明，依照本技术的实施例可以获得较高含量海参活性肽样本。
(4)分子量分布检测
采用国标《GB/T22729-2008海洋低聚肽》中的凝胶过滤色谱法。TSK Gel G2000SWXL色谱柱，流动相为45％乙腈水溶液(0.1％三氟乙酸)，流速0.5mL/min，检测波长214nm。标准品为：细胞色素C(12384Da)、抑肽酶(6511Da)、杆菌肽(1450Da)、氧化型谷胱甘肽(651Da)和Gly-Gly-Gly(189Da)。分子量(x,Da)与保留时间(y,min)的标准曲线方程为：y＝33.2467–4.7102lg(x)，相关系数R2＝0.9913。根据标准曲线以面积归一化法计算生物活性肽不同分子量肽段分布比例，见表2。
表2海参活性肽分子量分布
Figure BDA0002716041880000081
由表2可以看出，依照本专利技术制备获得的海参生物活性肽分子量大都在1kDa以下，由数个氨基酸组成短肽的形式存在。现代研究证实，短肽可以完整地通过肠黏膜细胞进入体循环，其与游离氨基酸在体内具有相互独立的吸收机制，从而参与蛋白合成、调节特殊生理活动。对比例1中3kDa～5kDa的活性肽分布有所上升，推测可能与实验过程中外源性肽段的引入有关，而对比例2常规酶解技术作用效果明显弱于实施例。上述实验证明本专利仿生消化技术针对海参短肽具有很好的制备效果，在生物功能产品开发方面蕴含广阔的发展前景。
应用试验例2
海参活性肽免疫调节实验
(1)中性红吞噬试验
取对数期RAW 264.7细胞以浓度2×105个/mL铺96孔板，每孔100μL。空白组加入100μL DMEM细胞培养液，给药组(实施例1组、对比例1组和对比例2组)加入20μL活性肽稀释液和80μL DMEM细胞培养液，活性肽终浓度分别为3.13、6.25、12.5、25、50和100μg/mL，每组设置3个复孔。5％CO2、37℃条件下培养24h，之后用PBS洗涤3次，加入终浓度为1μg/mL的中性红溶液100μL，继续培养30min。最后加入200μL裂解液(冰醋酸：无水乙醇＝1：1)静置过夜，收集裂解液在540nm波长下测定吸光度值，实验结果见图1。
(2)促细胞因子分泌活性
海参活性肽加样处理同上。细胞培养结束后，按照ELISA试剂盒操作说明用酶标仪在450nm波长下测定吸光度，检测上清液中TNF-α细胞因子的浓度，实验结果见图2。
(3)结果分析
如图1所示，实施例1和对比例1的样品能够显著促进RAW 264.7细胞的中性红吞噬能力，50μg/mL较3.13μg/mL浓度处理细胞的吞噬活性提高了近2倍，两者没有显著差异。根据实验结果推测，高效的促吞噬能力可能与小分子活性肽所占的比重有关。吞噬作用是巨噬细胞最具有代表性的免疫活动之一，较强的促细胞吞噬能力说明其能够提高先天免疫反应。
如图2所示，依照本专利技术制备得到的海参活性肽对RAW 264.7细胞TNF-α因子分泌的促进效果优于对比例样本，测试浓度50～100μg/mL可达到最高水平，与低浓度给药差异极显著。巨噬细胞通过分泌诸如细胞因子等生物活性物质来调控局部微环境，保护机体免受外界不良因素的侵害。
应用试验例3
海参活性肽肝保护活性研究
(1)取70只清洁级KM雄性小鼠(体重20±2g)，随机分为7组，分别为：空白对照组、模型组、实施例1给药组(100mg/kg、200mg/kg、400mg/kg)、对比例1给药组(400mg/kg)及对比例2给药组(400mg/kg)，每组10只。1～3d，空白组小鼠腹腔注射生理盐水，其他组小鼠腹腔注射环磷酰胺80mg/kg；4～17d，空白组、模型组小鼠每日用生理盐水灌胃，给药组分别用相应方法制得的海参活性肽样品灌胃。
(2)小鼠禁食不禁水12h后颈椎脱臼处死，迅速摘取肝组织冰生理盐水洗净，以预冷的PBS缓冲液(pH＝7.4)冰浴下研磨匀浆，4℃3600r/min离心20min，收集上清液为待测组织液。
(3)分别采用SOD试剂盒、GSH-Px试剂盒、MDA试剂盒检测肝脏抗氧化指标。
(4)实验结果，见表3
表3.海参活性肽对小鼠肝脏抗氧化酶活性的影响
Figure BDA0002716041880000101
实施例1样品400mg/kg给药组，小鼠肝脏组织中SOD活性提升至56.3±1.7U/mg蛋白，GSH-Px活性提升至55.3±1.5U/mg蛋白，MDA水平下降至18.8±0.5nmol/mL水平，与模型组小鼠相比显著减少了ROS对肝脏组织的氧化损伤(P<0.05)；对比例1样品400mg/kg给药组除对GSH-Px活性有较好改善外，其余两个指标略弱于实施例1样品高剂量组。实验结果表明，本专利提供的仿生酶解技术可以获得肝保护活性更为显著的海参生物活性肽样本，这可能与其口服生物利用度提高有关。
应用试验例4
海参活性肽降血压活性研究
(1)取36只清洁级SHR雄性大鼠(10周龄，体重240g±8g)，随机分为6组；分别为对照组(蒸馏水)、实施例1给药组(50mg/kg、100mg/kg和400mg/kg灌胃)、对比例1给药组(400mg/kg灌胃)及对比例2给药组(400mg/kg灌胃)。以灌胃1、2、4d为测定时间点，测定各组在血压监测时间点对应的血压值，每只大鼠测定3次并取平均值。
(2)实验结束当天，用质量分数1％戊巴比妥钠(0.5mL/100g)将动物麻醉，腹主动脉取血5mL注入含抗凝剂的试管中混匀，在4℃下3 000r/min离心15min，分离上清液收集于灭菌离心管中。按碘[125I]血管紧张素II放射免疫分析药盒说明书，采用DFM-96型放射免疫γ计数器测定各组大鼠血浆中血管紧张素II质量浓度，见表4。
表4海参活性肽对SHR大鼠血压的影响
Figure BDA0002716041880000102
Figure BDA0002716041880000111
血管紧张素转化酶(ACE)可作用于肾素-血管紧张素-醛固酮系统中的血管紧张素I，使之转化为有效的血管收缩剂-血管紧张素II，从而导致血压升高。经过4d海参活性肽给药实验，SHR大鼠血压的变化情况如表3所示。各给药组与对照组相比大鼠血压均呈现下降趋势。其中，实施例1样品400mg/kg组的下降幅度最为明显，优于对比例给药组。对比例2样品400mg/kg组给药情况下大鼠血液中血管紧张素Ⅱ也显著低于对照组水平，显现ACE抑制活性，与相应的实施例1检测结果较为接近；但测试数据显示实施例1组有更好的降血压功效，推测实施例1制备得到的海参活性肽样品可能对机体其它生物学途径也有较好作用，从而综合发挥优良的降血压功效。
综上，本发明所述的制备方法对海参活性肽类目标组分具有获取量大、富集率高双重优点，产品总肽含量达到90％以上，所述活性肽中分子量在1kDa以下的含量按质量分数计不低于80％。可进行规模化放大生产；所得的活性短肽组分生物活性良好，能够显著促进RAW264.7细胞的中性红吞噬能力；对RAW 264.7细胞TNF-α因子分泌的促进效果优于对比例样本；具有抗氧化、降血压、提升免疫等功效；可作为有效成分在制备功能食品、保健品乃至药品中的应用，适用于各种常规剂型，易于广大消费者所接受。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (10)

1.一种海参活性肽高效仿生制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)干海参粉碎后，按质量体积比g/mL为1：(3～10)加入模拟胃液充分浸透，于36～38.5℃振摇消化0.5～4h，加入碱中和终止反应，减压蒸干即得海参胃液消化样品；
(2)取海参胃液消化样品，按质量体积比g/mL为1：(3～10)加入模拟肠液充分浸透，于36～38.5℃振摇消化0.5～4h，减压蒸干即得海参肠液消化样品；
(3)取海参肠液消化样品，加入50％～75％的乙醇溶液提取1～3h，提取液在4000～6000rpm/min条件下离心10～20min，上清液经滤膜超滤、冷冻干燥即得高纯度海参活性肽；
步骤(1)中，模拟胃液包括胃电解质溶液和胃蛋白酶；胃电解质溶液组成为0.03～0.08mol/L NaCl，0.03～0.08mol/L NaCl、0.005～0.03mol/L KCl，0.03～0.08mol/LNaCl、0.001～0.005mol/L CaCl2；胃蛋白酶和胃电解质溶液配比按质量体积比mg/mL为1:(4.5～12)；
步骤(2)中，模拟肠液包括肠电解质溶液和胰蛋白酶；肠电解质溶液组成为0.06～0.12mol/L NaCl，0.06～0.12mol/L NaCl、0.004～0.01mol/L KCl，0.06～0.12mol/LNaCl、0.002～0.008mol/L CaCl2；胰蛋白酶和肠电解质溶液配比按质量体积比mg/mL为1:(8～20)。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，胃电解质溶液组成为0.03～0.08mol/L NaCl、0.005～0.03mol/L KCl，胃蛋白酶和胃电解质溶液配比按质量体积比mg/mL为1:(6～10)；
优选的，胃电解质溶液组成为0.05mol/L NaCl、0.01mol/L KCl，胃蛋白酶和胃电解质溶液配比按质量体积比mg/mL为1:8.5。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，模拟胃液用1mol/L HCl调pH值至1.2～2.2。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，碱终止反应使用0.5～1mol/LNaHCO3或Na2CO3。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，肠电解质溶液组成为0.06～0.12mol/L NaCl，胰蛋白酶和肠电解质溶液配比按质量体积比mg/mL为1:(10～16)；
优选的，肠电解质溶液组成为0.085mol/L NaCl，胰蛋白酶和肠电解质溶液配比按质量体积比mg/mL为1:14。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，模拟肠液用NaHCO3调节pH值至7～7.5。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，加入乙醇溶液的量，按质量体积比g/mL为1：(20-45)，提取温度为30～50℃；
优选的，加入乙醇溶液的量，按质量体积比g/mL为1：35，提取温度为40℃；
优选的，步骤(3)中，超滤截取分子量范围为<10kDa；
优选的，截取分子量范围为<5kDa。
8.权利要求1-7任一项制备的海参活性肽纯度按质量分数计不低于90％，所述活性肽中分子量在1kDa以下的含量按质量分数计不低于80％。
9.权利要求1-7任一项制备的海参活性肽作为有效成分在制备功能食品、保健食品或日化用品中的应用。
10.权利要求1-7任一项制备的海参活性肽作为有效成分在制备药品中的应用；
优选的，所述海参活性肽作为有效成分在制备清除体内自由基、提高免疫力、保护肝脏功能或调节血压功能药物中的应用。
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