CN109897877A - 南极磷虾肽亚铁螯合物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种南极磷虾肽亚铁螯合物的制备方法，包括以下步骤：A、制备南极磷虾脱脂粉：向南极磷虾粉中加入正己烷和无水乙醇混合液进行脱脂，将所得滤饼风干、粉碎，得到南极磷虾脱脂粉；B、制备模拟胃消化物：向制得的南极磷虾脱脂粉中加水制得消化反应液，向消化反应液中加入模拟胃消化液，制得南极磷虾胃消化反应液，将南极磷虾胃消化反应液制备得到模拟胃消化物；C、制备南极磷虾消化物：将制得的模拟胃消化物用NaHCO₃调节pH，加入模拟肠消化液，进行灭酶和离心；D、制备南极磷虾肽亚铁螯合物。本发明提高了南极磷虾的附加值及利用率；操作过程简单，制得的南极磷虾肽的亚铁结合量高达70‑90%，提高了生产效率，适合工业化生产。

Description

南极磷虾肽亚铁螯合物的制备方法

技术领域

本发明涉及南极磷虾深加工技术领域，尤其涉及一种南极磷虾肽亚铁螯合物的制备方法。

背景技术

南极磷虾（Euphausia superba）是地球上最大的单种生物资源之一，蕴藏量丰富，年最高捕捞量可达1亿吨，因其富含优质蛋白，被认为是地球上最大、也是最后一个潜在动物性蛋白资源库，因而南极磷虾被日本、挪威、英国、美国、俄罗斯等世界各国列为重要的经济战略资源进行开发，我国对南极磷虾也极为重视，2009年农业部将南极磷虾列为“国家经济战略资源”，并发布了探捕令，每年以上千吨的捕获量进入我国市场，然而相对于发达国家，我国的南极磷虾产品以虾粉、虾干等用于饲料的初级产品为主，深加工技术瓶颈仍是制约我国南极磷虾产业发展的关键因素之一。

铁是人体必需的微量元素，是血红蛋白和肌红蛋白的重要组成部分，也是许多酶如细胞色素酶、过氧化物酶的组成成分，在生物氧化和呼吸系统中起着重要作用，缺铁在临床上上一般表现为缺铁性贫血，目前约1/3的世界人口收到贫血的困扰，其中半数是由铁缺乏引起的，“健康中国2030”规划纲要中提出通过引导合理膳食，重点解决微量营养素缺乏等问题，目前，广泛使用的补铁制剂多为无机亚铁盐类、有机酸亚铁盐类。无机亚铁盐类如硫酸亚铁，虽然铁含量高，价格便宜，但性质不稳定，易造成食品变质、变色等不良影响，具有浓重的铁腥味，胃肠刺激强烈，生物利用度低。有机酸亚铁盐类，包括乳酸亚铁、柠檬酸亚铁、富马酸亚铁、琥珀酸亚铁等，此类铁强化剂避免了药物在胃中瞬间浓度过大，剌激作用降低，但亚铁盐性质不稳定，同样存在铁腥味和引起食品变色等问题，这两类补铁剂在肠道中都是通过亚铁离子通道途径吸收，游离的铁离子易使某些维生素氧化失活，过多的铁离子还会引发人体的自由基反应，从而导致细胞老化和死亡，多肽亚铁螯合物作为一种新型的补铁制剂可以通过肽吸收途径或胞吞途径直接被肠上皮细胞吸收，并且没有肠道副作用，吸收利用率高，是一种优良的补铁营养剂。

生物酶解法提取生物活性多肽条件温和，成本相对较低，水解过程更容易控制，使实验研究操作更方便。虽然利用酶解法从海洋生物中提取多肽常有报道，但利用模拟人体胃肠消化法获取南极磷虾多肽来制备肽亚铁螯合物，目前还未见相关的文献报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种一方面提高南极磷虾肽的附加值及利用率，另一方面根据南极磷虾蛋白质高、富含优质蛋白的特点，开发一种利用南极磷虾制备具有良好亚铁结合能力的南极磷虾肽亚铁螯合物的制备方法。

本发明为实现上述目的所采用的技术方案是：一种南极磷虾肽亚铁螯合物

的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、制备南极磷虾脱脂粉：向南极磷虾粉中加入正己烷和无水乙醇混合液进行脱脂，在一定温度下萃取，萃取一定时间后抽滤，将所得滤饼自然风干、粉碎，得到南极磷虾脱脂粉；

B、制备模拟胃消化物：向步骤A中制得的南极磷虾脱脂粉中加水制得消化反应液，在一定温度和转速下振荡孵育一定时间，将消化反应液用HCl调

节pH，向消化反应液中加入模拟胃消化液，调节pH，制得南极磷虾胃消化反

应液，将南极磷虾胃消化反应液在一定温度水浴条件下消化一定的时间得到模

拟胃消化物；

C、制备南极磷虾消化物：将步骤B中制得的模拟胃消化物用NaHCO₃调节pH，然后加入模拟肠消化液，调节pH，制得南极磷虾肠消化反应液，将南极磷虾肠消化反应液在一定温度水浴条件下消化一定时间，调pH，再进行灭酶和离心，取上清液冷冻干燥即得南极磷虾消化物；

D、制备南极磷虾肽亚铁螯合物：调节步骤C中制得的南极磷虾消化物的浓度和pH，与FeCl2混合，加入还原剂，进行螯合反应后，进行离心，取上清液冷冻干燥即得南极磷虾肽亚铁螯合物。

所述步骤A中正己烷和无水乙醇混合液中正己烷与无水乙醇的体积比为1:1-1:5，在50℃下萃取4-8h，重复1-2次。

所述步骤B中消化反应液的底物蛋白浓度为2-5 %（w/v），消化反应液在37℃温度下140 rpm振荡孵育30 min，将消化反应液用2 M HCl调节pH至3.5，向消化反应液中加入模拟胃消化液，调节pH至2.0，将南极磷虾胃消化反应液在 37℃水浴条件下消化60-120 min，南极磷虾胃消化反应液中胃蛋白酶与底物蛋白的质量比为1:50-200 (wt/wt)。

所述模拟胃消化液是将20-50 mg胃蛋白酶溶解于1mL 0.1N HCl制得。

所述步骤C中将制得的模拟胃消化物用1 M NaHCO₃调节pH至6.0，加入模拟肠消化液，调节pH至7.5，南极磷虾肠消化反应液在37℃水浴条件下消化60-150 min，调pH至7.2，在100℃灭酶10 min，4℃离心30 min，取上清液冷冻干燥即得南极磷虾消化物，所述南极磷虾肠消化反应液中胰蛋白酶与底物蛋白的质量比为1:200-800(wt/wt)，胰蛋白酶与胆盐的的质量比为1:2-8(wt/wt)。

所述的模拟肠消化液是将20-50 mg胰蛋白酶和80-150 mg牛胆酸钠溶解于10 mL0.1 M NaHCO₃制得。

所述步骤D中将南极磷虾消化物浓度调为20-50mg/mL，pH调节至6.0，与终浓度为20-50mmol/L的FeCl₂混合，加入还原剂，进行螯合反应30-100 min后， 在4℃下离心30min。

所述还原剂为连二亚硫酸钠，终浓度为10-100 mmol/L。

所述步骤D中螯合反应条件为控制反应液温度20-50℃、控制反应液pH为6.0。

本发明一种南极磷虾肽亚铁螯合物的制备方法，提高了南极磷虾的附加值及利用率，使其含有的活性物质得到充分开发利用；通过模拟人体胃肠消化法制备南极磷虾肽，与亚铁离子结合形成的肽亚铁螯合物更耐受胃肠道的降解，有利于铁的吸收，可用于开发高值化的南极磷虾肽亚铁补充剂；操作过程简单，不需要复杂的设备，制得的南极磷虾肽的亚铁结合量高达70-90%，提高了生产效率，适合工业化生产。

具体实施方式

南极磷虾肽亚铁螯合物的制备方法，包括以下步骤：A、制备南极磷虾脱脂粉：向南极磷虾粉中加入正己烷和无水乙醇混合液进行脱脂，在一定温度下萃取，萃取一定时间后抽滤，将所得滤饼自然风干、粉碎，得到南极磷虾脱脂粉；B、制备模拟胃消化物：向步骤A中制得的南极磷虾脱脂粉中加水制得消化反应液，在一定温度和转速下振荡孵育一定时间，将消化反应液用HCl调节pH，向消化反应液中加入模拟胃消化液，调节pH，制得南极磷虾胃消化反应液，将南极磷虾胃消化反应液在一定温度水浴条件下消化一定的时间得到模拟胃消化物；C、制备南极磷虾消化物：将步骤B中制得的模拟胃消化物用NaHCO₃调节pH，然后加入模拟肠消化液，调节pH，制得南极磷虾肠消化反应液，将南极磷虾肠消化反应液在一定温度水浴条件下消化一定时间，调pH，再进行灭酶和离心，取上清液冷冻干燥即得南极磷虾消化物；D、制备南极磷虾肽亚铁螯合物：调节步骤C中制得的南极磷虾消化物的浓度和pH，与FeCl₂混合，加入还原剂，进行螯合反应后，进行离心，取上清液冷冻干燥即得南极磷虾肽亚铁螯合物。

实施例一：

向南极磷虾粉加入体积比为1:1的正己烷和无水乙醇混合液脱脂，在50℃温度下萃取4h，重复1-2次，抽滤，将所得滤饼自然风干、粉碎，得到南极磷虾脱脂粉；将制得的南极磷虾脱脂粉加水制得底物蛋白浓度为2%（w/v）的消化反应液，在37℃温度，140 rpm转速下振荡孵育30 min，用2 M HCl调节pH至3.5，加入模拟胃消化液（胃蛋白酶与底物蛋白的质量比为1:50），调节pH至2.0，在37℃水浴条件下消化60 min；将制得的模拟胃消化物用1 M NaHCO₃调节pH至6.0，加入模拟肠消化液（胰蛋白酶与底物蛋白的质量比为1:200，胰蛋白酶与胆盐的的质量比为1:2），调节pH至7.5，在37℃水浴条件下消化60min，调pH至7.2，在100℃温度下灭酶10 min，12,000×g、在4℃温度下离心30 min，取上清液冷冻干燥即得南极磷虾消化物；配置20mg/mL南极磷虾消化物，调pH至6.0，与终浓度为20mmol/L的FeCl2、10 mmol/L还原剂混合，在20℃、pH 6.0条件下进行螯合反应30min后，12,000×g、在4 ℃温度下离心30min，取上清液冷冻干燥即得南极磷虾肽亚铁螯合物。

实施例2：

向南极磷虾粉中加入体积比为1:2的正己烷和无水乙醇混合液脱脂，在50℃温度下萃取6 h，重复1-2次，抽滤，将所得滤饼自然风干、粉碎，得到南极磷虾脱脂粉；将制得的南极磷虾脱脂粉加水制得底物蛋白浓度为4%（w/v）的消化反应液，在37℃温度、140 rpm转速下振荡孵育30 min，用2 M HCl调节pH至3.5，加入模拟胃消化液（胃蛋白酶与底物蛋白的质量比为1:100），调节pH至2.0，在37℃水浴条件下消化90 min；将制得的模拟胃消化物用1 MNaHCO₃调节pH至6.0，加入模拟肠消化液（胰蛋白酶与底物蛋白的质量比为1:500，胰蛋白酶与胆盐的的质量比为1:5），调节pH至7.5，在37℃水浴条件下消化100min，调pH至7.2，100℃灭酶10 min，12,000×g、在4 ℃温度下离心30 min，取上清液冷冻干燥即得南极磷虾消化物；配置30mg/mL南极磷虾消化物，调pH至6.0，与终浓度为40 mmol/L的FeCl₂、50 mmol/L还原剂混合，在20℃、pH 6.0条件下进行螯合反应60min后，12,000×g、在4℃温度下离心30min，取上清液冷冻干燥即得南极磷虾肽亚铁螯合物。

实施例3：

向南极磷虾粉加入体积比为1:5的正己烷和无水乙醇混合液脱脂，在50℃温度下萃取4h，重复1-2次，抽滤，将所得滤饼自然风干、粉碎，得到南极磷虾脱脂粉；将制得的南极磷虾脱脂粉加水制得底物蛋白浓度为5%（w/v）的消化反应液，在37℃温度、140 rpm转速下振荡孵育30 min，用2 M HCl调节pH至3.5，加入模拟胃消化液（胃蛋白酶与底物蛋白的质量比为1:200），调节pH至2.0，在37℃水浴条件下消化120 min；将制得的模拟胃消化物用1 MNaHCO₃调节pH至6.0，加入模拟肠消化液（胰蛋白酶与底物蛋白的质量比为1:800，胰蛋白酶与胆盐的的质量比为1:8），调节pH至7.5，在37℃水浴条件下消化150min，调pH至7.2，在100℃温度下灭酶10 min，12,000×g、在4 ℃温度下离心30 min，取上清液冷冻干燥即得南极磷虾消化物；配置50mg/mL南极磷虾消化物，调pH至6.0，与终浓度为50mmol/L的FeCl₂、100mmol/L还原剂混合，在20℃、pH 6.0条件下进行螯合反应100min后，12,000×g、在4 ℃温度下离心30 min，取上清液冷冻干燥即得南极磷虾肽亚铁螯合物。

以上实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围，在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

Claims (9)

1.一种南极磷虾肽亚铁螯合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、制备南极磷虾脱脂粉：向南极磷虾粉中加入正己烷和无水乙醇混合液进行脱脂，在一定温度下萃取，萃取一定时间后抽滤，将所得滤饼自然风干、粉碎，得到南极磷虾脱脂粉；

B、制备模拟胃消化物：向步骤A中制得的南极磷虾脱脂粉中加水制得消化反应液，在一定温度和转速下振荡孵育一定时间，将消化反应液用HCl调节pH，向消化反应液中加入模拟胃消化液，调节pH，制得南极磷虾胃消化反应液，将南极磷虾胃消化反应液在一定温度水浴条件下消化一定的时间得到模拟胃消化物；

C、制备南极磷虾消化物：将步骤B中制得的模拟胃消化物用NaHCO₃调节pH，然后加入模拟肠消化液，调节pH，制得南极磷虾肠消化反应液，将南极磷虾肠消化反应液在一定温度水浴条件下消化一定时间，调pH，再进行灭酶和离心，取上清液冷冻干燥即得南极磷虾消化物；

D、制备南极磷虾肽亚铁螯合物：调节步骤C中制得的南极磷虾消化物的浓度和pH，与FeCl₂混合，加入还原剂，进行螯合反应后，进行离心，取上清液冷冻干燥即得南极磷虾肽亚铁螯合物。

2.根据权利要求1所述的一种南极磷虾肽亚铁螯合物的制备方法，其特征在于：所述步骤A中正己烷和无水乙醇混合液中正己烷与无水乙醇的体积比为1:1-1:5，在50℃下萃取4-8h，重复1-2次。

3.根据权利要求1所述的一种南极磷虾肽亚铁螯合物的制备方法，其特征在于：所述步骤B中消化反应液的底物蛋白浓度为2-5 %（w/v），消化反应液在37℃温度下140 rpm振荡孵育30 min，将消化反应液用2 M HCl调节pH至3.5，向消化反应液中加入模拟胃消化液，调节pH至2.0，将南极磷虾胃消化反应液在 37℃水浴条件下消化60-120 min，南极磷虾胃消化反应液中胃蛋白酶与底物蛋白的质量比为1:50-200 (wt/wt)。

4.根据权利要求3所述的一种南极磷虾肽亚铁螯合物的制备方法，其特征在于：所述模拟胃消化液是将20-50 mg胃蛋白酶溶解于1mL 0.1N HCl制得。

5.根据权利要求1所述的一种南极磷虾肽亚铁螯合物的制备方法，其特征在于：所述步骤C中将制得的模拟胃消化物用1 M NaHCO₃调节pH至6.0，加入模拟肠消化液，调节pH至7.5，南极磷虾肠消化反应液在37℃水浴条件下消化60-150 min，调pH至7.2，在100℃灭酶10 min，4℃离心30 min，取上清液冷冻干燥即得南极磷虾消化物，所述南极磷虾肠消化反应液中胰蛋白酶与底物蛋白的质量比为1:200-800(wt/wt)，胰蛋白酶与胆盐的的质量比为1:2-8(wt/wt)。

6.根据权利要求5所述的一种南极磷虾肽亚铁螯合物的制备方法，其特征在于：所述的模拟肠消化液是将20-50 mg胰蛋白酶和80-150 mg牛胆酸钠溶解于10 mL 0.1 M NaHCO₃制得。

7.根据权利要求1所述的一种南极磷虾肽亚铁螯合物的制备方法，其特征在于：所述步骤D中将南极磷虾消化物浓度调为20-50mg/mL，pH调节至6.0，与终浓度为20-50mmol/L的FeCl₂混合，加入还原剂，进行螯合反应30-100 min后， 在4℃下离心30 min。

8.根据权利要求7所述的一种南极磷虾肽亚铁螯合物的制备方法，其特征在于：所述还原剂为连二亚硫酸钠，终浓度为10-100 mmol/L。

9.根据权利要求1所述的一种南极磷虾肽亚铁螯合物的制备方法，其特征在于：所述步骤D中螯合反应条件为控制反应液温度20-50℃、控制反应液pH为6.0。