CN103215333A - 一种酶解羊乳酪蛋白制备ace抑制肽的方法 - Google Patents
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Abstract
一种酶解羊乳酪蛋白制备ACE抑制肽的方法，将复原羊乳离心脱脂，得到脱脂乳，并用等电点沉淀法制备酪蛋白，将酪蛋白沉淀进行冷冻干燥，将得到的酪蛋白冻干粉进行溶解制成酪蛋白溶液，通过加入不同种类的酶进行水解，对水解条件进行优化后，用超声波对水解过程进行处理，提高了其催化活力，使水解反应进行更彻底，得到的小分子ACE抑制肽能够对高血压患者产生显著的降压作用，并且对正常的血压无影响，具有无毒副作用、安全性高、易吸收的特点。
Description
技术领域
本发明涉及乳源ACE抑制肽制备技术领域，特别涉及一种酶解羊乳酪蛋白制备ACE抑制肽的方法。
背景技术
随着经济的发展和人们生活水平的逐渐提高，饮食中脂肪和热量的比重也有了显著的提高，随着机械化、自动化、信息化程度的提高，导致了体力活动的减少，这些都引起了我国心脑血管疾病的发病率快速上升。心血管疾病以冠心病为主，冠心病又称冠状动脉硬化性心脏病，而高血压是动脉粥样硬化的重要危险因素，且血压水平与心血管发病危险呈正相关。2010年中国高血压防治指南指出，我国人群高血压患病率仍呈增长态势，每10个成人中就有2人患高血压；估计目前全国高血压患者至少2亿。
高血压是指在未使用降压药物的情况下，收缩压≥140mmHg和（或）舒张压≥90mmHg。目前，常用于抗高血压药物治疗的有6种主要的降压药物，它们分别是利尿剂、α-受体拮抗剂、钙通道阻滞剂、血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂和α-肾上腺素受体阻滞剂。这些降血压药物虽然有显著的降压效果，但却存在一定的毒副作用，如引起咳嗽、过敏性血管水肿及肾功能不全加重等。有研究报道将食物蛋白质进行水解后形成的小分子多肽，即血管紧张素转化酶（angiotensin converting enzyme,ACE）抑制肽，具有显著的降血压作用，将它与普通降压药物进行比较，发现无毒副作用，并且对正常的血压无影响。ACE抑制肽一般以无活性的形式存在于蛋白质序列中，但当蛋白质通过热、酸碱的降解、酶制剂的水解或微生物的发酵等，无活性的蛋白质中可以释放出具有降压作用的ACE抑制肽。ACE的制备方法主要有5种：化学降解法、酶解法、微生物发酵法、化学合成法和基因工程法，现在研究最多的是酶解法和微生物发酵法。相对于微生物发酵法，酶法反应快速，制备ACE抑制肽抑制活性高，且原料广泛，主要有乳类蛋白、植物类蛋白及动物类蛋白，但目前乳源ACE抑制肽主要是以牛乳为原料，对羊乳尚未涉及到。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种酶解羊乳酪蛋白制备ACE抑制肽的方法，制备的ACE抑制肽能够对高血压患者产生显著的降压作用，并且对正常的血压无影响，具有无毒副作用、安全性高、易吸收的特点。
为了达到上述目的，本发明采取的技术方案为：一种酶解羊乳酪蛋白制备ACE抑制肽的方法，步骤如下：
步骤1：将羊奶粉与水按照质量比例1:9进行混合溶解，将得到的复原羊乳冷却到4℃，使用高速离心机在6400rpm下离心15min后，除去脂肪，得到脱脂乳；
步骤2：将所得脱脂乳在35-75℃范围内的恒温水浴箱中进行保温，采用磁力加热搅拌器进行搅拌，搅拌速度为0-1600rpm，边搅拌边滴加HCl溶液，使脱脂乳溶液的PH达到4.2-5.0，使酪蛋白进行沉淀，使用高速离心机在6400rpm下离心15min后，弃去上清液，将沉淀的酪蛋白进行冷冻干燥，在温度为-40℃预冻12-24h，再转移到冷冻干燥机在-55℃下冷冻干燥24h，得到酪蛋白冻干粉，测定酪蛋白最大得率及条件；
步骤3：将上述步骤所得酪蛋白冻干粉制成质量浓度为10%的酪蛋白溶液100ml，分别用蛋白酶K、胃蛋白酶、中性蛋白酶、Alcalase、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶6种蛋白酶进行水解反应1-8h，酶与酪蛋白溶液的质量比为1：10，用恒温水浴箱及1mol/lNaOH溶液分别调整酪蛋白溶液的温度和PH,测试不同种类的酶较优的水解条件及在该条件下达到的ACE抑制率，每间隔1h将5ml水解液在90℃水浴中保持10min使酶失活，使用高速离心机在9000rpm的条件下离心20min，除去未水解的酪蛋白，收集上清液并采用紫外分光光度法测定ACE抑制率；
步骤4：在确定酶的种类及其较优水解条件的基础上，以ACE抑制率为指标，对水解过程进行优化，确定出该种类酶最佳的水解温度、PH、水解时间、酶与酪蛋白溶液的质量比；
步骤5：在确定最佳水解条件的基础上，检测在不同超声功率（0、90、180、225w）条件下对水解反应的影响。
本发明采用的一种酶解羊乳酪蛋白制备ACE抑制肽的方法，以羊奶粉为原料，选材纯天然，营养价值高，不会引起乳糖不耐症，更易消化吸收；酪蛋白是乳中含量最丰富的蛋白质,含有人体生长发育所必需的氨基酸，当乳中酪蛋白用酶消化时,可以产生大量ACE抑制肽。本发明通过酶解的方法制备的ACE抑制肽产品，条件温和，对酪蛋白的营养价值破坏小，水解过程易控制，而且酶可以对酪蛋白进行定位水解进而产生人们所需要的特定肽类；超声波对酶解过程的处理，给蛋白酶的构象带来一定程度的变化，适宜的声场强度和频率会使蛋白酶分子构象发生变化,使其折叠得更合理,更容易与酪蛋白结合生成中间产物，从而提高其催化活力，制备的ACE抑制肽产品具有用量小、无毒副作用、性质温和、生理功能强的特点。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细说明。
实施例一：
步骤1：将羊奶粉与水按照质量比例1:9进行混合溶解，将得到的复原羊乳冷却到4℃，使用高速离心机在6400rpm下离心15min后，除去脂肪，得到脱脂乳；
步骤2：将所得脱脂乳在35℃的恒温水浴箱中进行保温，采用磁力加热搅拌器进行搅拌，搅拌速度为800rpm，边搅拌边滴加HCl溶液，使脱脂乳溶液的PH达到4.6，使酪蛋白进行沉淀，使用高速离心机在6400rpm下离心15min后，弃去上清液，将沉淀的酪蛋白进行冷冻干燥，在温度为-40℃预冻12h，再转移到冷冻干燥机在-55℃下冷冻干燥24h，得到酪蛋白冻干粉，测定得到当脱脂乳在35℃，PH为4.6，搅拌速度为800rpm条件下，酪蛋白得率最大，达到9.23%。
实施例二：
步骤1：将羊奶粉与水按照质量比例1:9进行混合溶解，将得到的复原羊乳冷却到4℃，使用高速离心机在6400rpm下离心15min后，除去脂肪，得到脱脂乳；
步骤2：将所得脱脂乳在45℃的恒温水浴箱中进行保温，采用磁力加热搅拌器进行搅拌，搅拌速度为800rpm，边搅拌边滴加HCl溶液，使脱脂乳溶液的PH达到4.5，使酪蛋白进行沉淀，使用高速离心机在6400rpm下离心15min后，弃去上清液，将沉淀的酪蛋白进行冷冻干燥，在温度为-40℃预冻20h，再转移到冷冻干燥机在-55℃下冷冻干燥24h，得到酪蛋白冻干粉，测定得到当脱脂乳在45℃，PH为4.5，搅拌速度为800rpm条件下，酪蛋白得率最大，达到11.88%；
步骤3：将上述步骤所得酪蛋白冻干粉制成质量浓度为10%的酪蛋白溶液100ml，用中性蛋白酶进行水解反应1-8h，酶与酪蛋白溶液的质量比为1：10，用恒温水浴箱及1mol/lNaOH溶液分别调整酪蛋白溶液的温度和PH,测试中性蛋白酶较优的水解及在该条件下达到的ACE抑制率，每间隔1h将5ml水解液在90℃水浴中保持10min使酶失活，使用高速离心机在9000rpm的条件下离心20min，除去未水解的酪蛋白，收集上清液并采用紫外分光光度法测定ACE抑制率，测得中性蛋白酶在50℃、PH7.0的条件下，水解1.5h时，其ACE抑制率较大，为79.43%。
实施例三：
步骤1：将羊奶粉与水按照质量比例1:9进行混合溶解，将得到的复原羊乳冷却到4℃，使用高速离心机在6400rpm下离心15min后，除去脂肪，得到脱脂乳；
步骤2：将所得脱脂乳在45℃的恒温水浴箱中进行保温，采用磁力加热搅拌器进行搅拌，搅拌速度为800rpm，边搅拌边滴加HCl溶液，使脱脂乳溶液的PH达到4.5，使酪蛋白进行沉淀，使用高速离心机在6400rpm下离心15min后，弃去上清液，将沉淀的酪蛋白进行冷冻干燥，在温度为-40℃预冻24h，再转移到冷冻干燥机在-55℃下冷冻干燥24h，得到酪蛋白冻干粉，测定得到当脱脂乳在45℃，PH为4.5，搅拌速度为800rpm条件下，酪蛋白得率最大，达到11.88%；
步骤3：将上述步骤所得酪蛋白冻干粉制成质量浓度为10%的酪蛋白溶液100ml，用Alcalase进行水解反应1-8h，酶与酪蛋白溶液的质量比为1：10，用恒温水浴箱及1mol/lNaOH溶液分别调整酪蛋白溶液的温度和PH,测试Alcalase较优的水解条件及在该条件下达到的ACE抑制率，每间隔1h将5ml水解液在90℃水浴中保持10min使酶失活，使用高速离心机在9000rpm的条件下离心20min，除去未水解的酪蛋白，收集上清液并采用紫外分光光度法测定ACE抑制率，测得Alcalase在55℃、PH7.5的条件下、水解2h时，其ACE抑制率较大，为83.47%；
步骤4：在确定Alcalase及其较优水解条件的基础上，以ACE抑制率为指标，对水解过程进行优化：将质量浓度为10%的酪蛋白溶液，用恒温水浴箱及1mol/lNaOH溶液分别调整酪蛋白溶液的温度和PH，水解时间1-3h，每间隔0.5h将5ml水解液在90℃水浴中保持10min使酶失活，使用高速离心机在9000rpm的条件下离心20min，除去未水解的酪蛋白，收集上清液并采用紫外分光光度法测定ACE抑制率，确定出Alcalase最佳的水解温度为45℃、PH为6.5、水解时间为2.5h、酶与酪蛋白溶液的质量比为4：100，此时ACE抑制率达到最大，为84.13%。
实施例四：
步骤1：将羊奶粉与水按照质量比例1:9进行混合溶解，将得到的复原羊乳冷却到4℃，使用高速离心机在6400rpm下离心15min后，除去脂肪，得到脱脂乳；
步骤2：将所得脱脂乳在45℃的恒温水浴箱中进行保温，采用磁力加热搅拌器进行搅拌，搅拌速度为800rpm，边搅拌边滴加HCl溶液，使脱脂乳溶液的PH达到4.5，使酪蛋白进行沉淀，使用高速离心机在6400rpm下离心15min后，弃去上清液，将沉淀的酪蛋白进行冷冻干燥，在温度为-40℃预冻24h，再转移到冷冻干燥机在-55℃下冷冻干燥24h，得到酪蛋白冻干粉，测定得到当脱脂乳在45℃，PH为4.5，搅拌速度为800rpm条件下，酪蛋白得率最大，达到11.88%；
步骤3：将上述步骤所得酪蛋白冻干粉制成质量浓度为10%的酪蛋白溶液100ml，用Alcalase（酶与酪蛋白溶液的质量比为1：10）进行水解1-8h，用恒温水浴箱及1mol/lNaOH溶液分别调整酪蛋白溶液的温度和PH,测试Alcalase较优的水解条件及在该条件下达到的ACE抑制率，每间隔1h将5ml水解液在90℃水浴中保持10min使酶失活，使用高速离心机在9000rpm的条件下离心20min，除去未水解的酪蛋白，收集上清液并采用紫外分光光度法测定ACE抑制率，测得Alcalase在55℃、PH7.5的条件下，水解2h时，其ACE抑制率较大，为83.47%；
步骤4：在确定Alcalase及其较优水解条件的基础上，以ACE抑制率为指标，对水解过程进行优化：将质量浓度为10%的酪蛋白溶液，用恒温水浴箱及1mol/lNaOH溶液分别调整酪蛋白溶液的温度和PH，水解时间1-3h，每间隔0.5h将5ml水解液在90℃水浴中保持10min使酶失活，使用高速离心机在9000rpm的条件下离心20min，除去未水解的酪蛋白，收集上清液并采用紫外分光光度法测定ACE抑制率，确定出Alcalase最佳的水解温度为50℃、PH为8.0、水解时间为2.5h、酶与酪蛋白溶液的质量比为6：100时，ACE抑制率达到最大，为88.32%；
步骤5：将质量浓度为10%的酪蛋白溶液，用恒温水浴箱及1mol/lNaOH溶液分别调整酪蛋白溶液的温度为50℃和PH为8.0，加入Alcalase（酶与酪蛋白溶液的质量比为6：100）在90w的超声场中水解2.5h时，将水解液在90℃水浴中保持10min使酶失活，使用高速离心机在9000rpm的条件下离心20min，除去未水解的酪蛋白，收集上清液并采用紫外分光光度法测定ACE抑制率为89.64%。
Claims (5)
1.一种酶解羊乳酪蛋白制备ACE抑制肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：将羊奶粉与水按照质量比例1:9进行混合溶解，将得到的复原羊乳冷却到4℃，使用高速离心机在6400rpm下离心15min后，除去脂肪，得到脱脂乳；
步骤2：将所得脱脂乳在35-75℃范围内的恒温水浴箱中进行保温，采用磁力加热搅拌器进行搅拌，搅拌速度为0-1600rpm，边搅拌边滴加HCl溶液，使脱脂乳溶液的PH达到4.2-5.0，使酪蛋白进行沉淀，使用高速离心机在6400rpm下离心15min后，弃去上清液，将沉淀的酪蛋白进行冷冻干燥，在温度为-40℃预冻12-24h，再转移到冷冻干燥机在-55℃下冷冻干燥24h，得到酪蛋白冻干粉，测定酪蛋白最大得率及条件；
步骤3：将上述步骤所得酪蛋白冻干粉制成质量浓度为10%的酪蛋白溶液100ml，分别用蛋白酶K、胃蛋白酶、中性蛋白酶、Alcalase、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶6种蛋白酶进行水解反应1-8h，酶与酪蛋白溶液的质量比为1：10，用恒温水浴箱及1mol/l NaOH溶液分别调整酪蛋白溶液的温度和PH,测试不同种类的酶较优的水解条件及在该条件下达到的ACE抑制率，每间隔1h将5ml水解液在90℃水浴中保持10min使酶失活，使用高速离心机在9000rpm的条件下离心20min，除去未水解的酪蛋白，收集上清液并采用紫外分光光度法测定ACE抑制率；
步骤4：在确定酶的种类及其较优水解条件的基础上，以ACE抑制率为指标，对水解过程进行优化，确定出该种类酶最佳的水解温度、PH、水解时间、酶与酪蛋白溶液的质量比；
步骤5：在确定最佳水解条件的基础上，检测在不同超声功率（0、90、180、225w）条件下对水解反应的影响。
2.根据权利要求1所述的一种酶解羊乳酪蛋白制备ACE抑制肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：将羊奶粉与水按照质量比例1:9进行混合溶解，将得到的复原羊乳冷却到4℃，使用高速离心机在6400rpm下离心15min后，除去脂肪，得到脱脂乳；
步骤2：将所得脱脂乳在35℃的恒温水浴箱中进行保温，采用磁力加热搅拌器进行搅拌，搅拌速度为800rpm，边搅拌边滴加HCl溶液，使脱脂乳溶液的PH达到4.6，使酪蛋白进行沉淀，使用高速离心机在6400rpm下离心15min后，弃去上清液，将沉淀的酪蛋白进行冷冻干燥，在温度为-40℃预冻12h，再转移到冷冻干燥机在-55℃下冷冻干燥24h，得到酪蛋白冻干粉，测定得到当脱脂乳在35℃，PH为4.6，搅拌速度为800rpm条件下，酪蛋白得率最大，达到9.23%。
3.根据权利要求1所述的一种酶解羊乳酪蛋白制备ACE抑制肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：将羊奶粉与水按照质量比例1:9进行混合溶解，将得到的复原羊乳冷却到4℃，使用高速离心机在6400rpm下离心15min后，除去脂肪，得到脱脂乳；
步骤2：将所得脱脂乳在45℃的恒温水浴箱中进行保温，采用磁力加热搅拌器进行搅拌，搅拌速度为800rpm，边搅拌边滴加HCl溶液，使脱脂乳溶液的PH达到4.5，使酪蛋白进行沉淀，使用高速离心机在6400rpm下离心15min后，弃去上清液，将沉淀的酪蛋白进行冷冻干燥，在温度为-40℃预冻20h，再转移到冷冻干燥机在-55℃下冷冻干燥24h，得到酪蛋白冻干粉，测定得到当脱脂乳在45℃，PH为4.5，搅拌速度为800rpm条件下，酪蛋白得率最大，达到11.88%；
步骤3：将上述步骤所得酪蛋白冻干粉制成质量浓度为10%的酪蛋白溶液100ml，用中性蛋白酶进行水解反应1-8h，酶与酪蛋白溶液的质量比为1：10，用恒温水浴箱及1mol/l NaOH溶液分别调整酪蛋白溶液的温度和PH,测试中性蛋白酶较优的水解及在该条件下达到的ACE抑制率，每间隔1h将5ml水解液在90℃水浴中保持10min使酶失活，使用高速离心机在9000rpm的条件下离心20min，除去未水解的酪蛋白，收集上清液并采用紫外分光光度法测定ACE抑制率，测得中性蛋白酶在50℃、PH7.0的条件下，水解1.5h时，其ACE抑制率较大，为79.43%。
4.根据权利要求1所述的一种酶解羊乳酪蛋白制备ACE抑制肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：将羊奶粉与水按照质量比例1:9进行混合溶解，将得到的复原羊乳冷却到4℃，使用高速离心机在6400rpm下离心15min后，除去脂肪，得到脱脂乳；
步骤2：将所得脱脂乳在45℃的恒温水浴箱中进行保温，采用磁力加热搅拌器进行搅拌，搅拌速度为800rpm，边搅拌边滴加HCl溶液，使脱脂乳溶液的PH达到4.5，使酪蛋白进行沉淀，使用高速离心机在6400rpm下离心15min后，弃去上清液，将沉淀的酪蛋白进行冷冻干燥，在温度为-40℃预冻24h，再转移到冷冻干燥机在-55℃下冷冻干燥24h，得到酪蛋白冻干粉，测定得到当脱脂乳在45℃，PH为4.5，搅拌速度为800rpm条件下，酪蛋白得率最大，达到11.88%；
步骤3：将上述步骤所得酪蛋白冻干粉制成质量浓度为10%的酪蛋白溶液100ml，用Alcalase进行水解反应1-8h，酶与酪蛋白溶液的质量比为1：10，用恒温水浴箱及1mol/l NaOH溶液分别调整酪蛋白溶液的温度和PH,测试Alcalase较优的水解条件及在该条件下达到的ACE抑制率，每间隔1h将5ml水解液在90℃水浴中保持10min使酶失活，使用高速离心机在9000rpm的条件下离心20min，除去未水解的酪蛋白，收集上清液并采用紫外分光光度法测定ACE抑制率，测得Alcalase在55℃、PH7.5的条件下、水解2h时，其ACE抑制率较大，为83.47%；
步骤4：在确定Alcalase及其较优水解条件的基础上，以ACE抑制率为指标，对水解过程进行优化：将质量浓度为10%的酪蛋白溶液，用恒温水浴箱及1mol/l NaOH溶液分别调整酪蛋白溶液的温度和PH，水解时间1-3h，每间隔0.5h将5ml水解液在90℃水浴中保持10min使酶失活，使用高速离心机在9000rpm的条件下离心20min，除去未水解的酪蛋白，收集上清液并采用紫外分光光度法测定ACE抑制率，确定出Alcalase最佳的水解温度为45℃、PH为6.5、水解时间为2.5h、酶与酪蛋白溶液的质量比为4：100，此时ACE抑制率达到最大，为84.13%。
5.根据权利要求1所述的一种酶解羊乳酪蛋白制备ACE抑制肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：将羊奶粉与水按照质量比例1:9进行混合溶解，将得到的复原羊乳冷却到4℃，使用高速离心机在6400rpm下离心15min后，除去脂肪，得到脱脂乳；
步骤2：将所得脱脂乳在45℃的恒温水浴箱中进行保温，采用磁力加热搅拌器进行搅拌，搅拌速度为800rpm，边搅拌边滴加HCl溶液，使脱脂乳溶液的PH达到4.5，使酪蛋白进行沉淀，使用高速离心机在6400rpm下离心15min后，弃去上清液，将沉淀的酪蛋白进行冷冻干燥，在温度为-40℃预冻24h，再转移到冷冻干燥机在-55℃下冷冻干燥24h，得到酪蛋白冻干粉，测定得到当脱脂乳在45℃，PH为4.5，搅拌速度为800rpm条件下，酪蛋白得率最大，达到11.88%；
步骤3：将上述步骤所得酪蛋白冻干粉制成质量浓度为10%的酪蛋白溶液100ml，用Alcalase进行水解1-8h，酶与酪蛋白溶液的质量比为1：10，用恒温水浴箱及1mol/l NaOH溶液分别调整酪蛋白溶液的温度和PH,测试Alcalase较优的水解条件及在该条件下达到的ACE抑制率，每间隔1h将5ml水解液在90℃水浴中保持10min使酶失活，使用高速离心机在9000rpm的条件下离心20min，除去未水解的酪蛋白，收集上清液并采用紫外分光光度法测定ACE抑制率，测得Alcalase在55℃、PH7.5的条件下，水解2h时，其ACE抑制率较大，为83.47%；
步骤4：在确定Alcalase及其较优水解条件的基础上，以ACE抑制率为指标，对水解过程进行优化：将质量浓度为10%的酪蛋白溶液，用恒温水浴箱及1mol/l NaOH溶液分别调整酪蛋白溶液的温度和PH，水解时间1-3h，每间隔0.5h将5ml水解液在90℃水浴中保持10min使酶失活，使用高速离心机在9000rpm的条件下离心20min，除去未水解的酪蛋白，收集上清液并采用紫外分光光度法测定ACE抑制率，确定出Alcalase最佳的水解温度为50℃、PH为8.0、水解时间为2.5h、酶与酪蛋白溶液的质量比为6：100时，ACE抑制率达到最大，为88.32%；
步骤5：将质量浓度为10%的酪蛋白溶液，用恒温水浴箱及1mol/lNaOH溶液分别调整酪蛋白溶液的温度为50℃和PH为8.0，加入Alcalase（酶与酪蛋白溶液的质量比为6：100）在90w的超声场中水解2.5h时，将水解液在90℃水浴中保持10min使酶失活，使用高速离心机在9000rpm的条件下离心20min，除去未水解的酪蛋白，收集上清液并采用紫外分光光度法测定ACE抑制率为89.64%。
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-
2013
- 2013-04-16 CN CN2013101323513A patent/CN103215333A/zh active Pending
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