CN113502311A - 一种碱性蛋白酶法制备鲜牛奶粗蛋白acei混合肽的工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种碱性蛋白酶法制备鲜牛奶粗蛋白ACEI混合肽的工艺，属于食品技术领域，它包括以鲜牛奶为原料脱脂制备粗蛋白；以所述粗蛋白与碱性蛋白酶溶液混合进行酶解反应的单因素实验和正交实验得到粗蛋白的酶水解物；测定所述步骤酶解反应的单因素实验和正交实验得到粗蛋白的酶水解物的多肽水解度与ACEI活性，根据多肽水解度与ACEI活性的测定结构筛选出最佳工艺参数；将粗蛋白与碱性蛋白酶溶液混合进行酶解反应，制得鲜牛奶粗蛋白ACEI混合肽。本发明通过筛选试验确立了各反应步骤中的优选条件，得到了高产率的鲜牛奶粗蛋白ACEI混合肽制备工艺，通过本发明得到的鲜牛奶粗蛋白ACEI混合肽能够有效地应用于高血压等疾病的治疗中，具有很高的推广价值。
Description
技术领域
本发明属于食品技术领域，具体涉及一种碱性蛋白酶法制备鲜牛奶粗蛋白ACEI混合 肽的工艺，以及利用该工艺在乳类产品开发中的潜在应用。
背景技术
高血压是一种严重危害人类健康的心血管疾病，以血压长时间、持续性升高为典型特 征。伴随日常膳食中油脂类、固醇类成分增多，生活节奏加快和压力加大以及生态环境的 污染破环，近年来我国高血压患者数量持续增多，已给患者家庭和社会带来沉重的经济和 护理负担。长期以来，高血压病临床治疗药物的作用机制主要包括β受体阻滞剂、利尿剂、血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI)、 血管紧张素受体阻滞剂、钙拮抗剂及α受体阻滞剂等，虽然降压机制多样，但长期服用会 产生耐药性及一些副作用。因此，当前以非药物形式如食疗法来治疗高血压的探讨日益增 加，特别是一些药食同源的动植物越来越受高血压患者的青睐。
牛奶是一种营养价值丰富、方便易得的日常饮品，其中富含酪蛋白。自从1979年Brantle等从牛乳酪蛋白酶解产物中获得一个由7个氨基酸组成的短肽以来，牛奶粗蛋白，特别是酪蛋白已经成为生物活性肽制备的主要原料之一。ACEI作为一种对高血压治疗有显著效果的活性多肽，多年来是研究者关注的重点。例如Maruyama Set al.从酪蛋白水解物中获得一个ACEI，Nakamura Y et al.从酸奶中获得两个具有ACEI活性的三肽。但是目前在研究与生产中尚未出现确定在水解过程中酸碱度、温度、底物与酶的配比和水解时间的方法，以及如何高产率获得鲜牛奶粗蛋白ACEI混合肽的制备工艺。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种碱性蛋白酶法制备鲜牛奶粗蛋白ACEI混合 肽的工艺，以解决目前在鲜牛奶粗蛋白ACEI混合肽的制备提取过程中的产率低以及提取 困难的问题，本发明对碱性蛋白酶法制备鲜牛奶粗蛋白ACEI混合肽的工艺进行了研究，为乳品类产品的开发应用提供帮助。
本发明所采取的技术方案是：提供一种碱性蛋白酶法制备鲜牛奶粗蛋白ACEI混合肽 的工艺，包括以下步骤：
S1:以鲜牛奶为原料脱脂制备粗蛋白；
S2：以所述步骤S1制得的粗蛋白与碱性蛋白酶溶液混合进行酶解反应的单因素实验 和正交实验，所述单因素实验和正交实验的工艺参数包括温度、pH值、酶/底物组成比例和水解时间，所述酶解反应的单因素实验和正交实验得到粗蛋白的酶水解物；
S3:测定所述步骤S2的酶解反应的单因素实验和正交实验得到粗蛋白的酶水解物的 多肽水解度与ACEI活性，根据多肽水解度与ACEI活性的测定结构筛选出最佳工艺参数；
S4：以所述步骤S3筛选出的最佳工艺参数，将粗蛋白与碱性蛋白酶溶液混合进行酶 解反应，制得鲜牛奶粗蛋白ACEI混合肽。
作为优选的方案：所述步骤S1具体包括：
S11：将鲜牛奶进行搅拌加热后离心将其脱脂，调节pH至4.5-5，使蛋白沉淀；
S12：去除上清液，蒸馏水洗涤蛋白沉淀并调节pH至中性，离心去除上清液；
S13：提起沉淀并冷冻干燥，得到鲜牛奶粗蛋白。
作为优选的方案：所述步骤S11中加热温度为77℃，搅拌时间为30分钟，离心速度为3800rpm，离心时间为15分钟。
作为优选的方案：所述步骤S2中以所述步骤S1制得的粗蛋白与碱性蛋白酶溶液混合 进行酶解反应包括：
将所述步骤S1制得的粗蛋白加入至蒸馏水中充分溶解，按设定值调节溶液pH后，加 入设定量的碱性蛋白酶，在恒温振荡器内按设定温度进行水解，达到设定的水解时间后进 行水浴反应使酶灭活，冷却至室温。
作为优选的方案：所述步骤S2中，单因素实验的工艺参数如下：pH值设定为8、10、12三个参数，温度设定为20℃、40℃、60℃三个参数，酶与底物质量配比为1:60、1:40、 1:20三个参数，水解的时间为60min、180min、300min三个参数。
作为优选的方案：所述步骤S2中，正交试验为L25(54)正交实验，且L25(54)正交 实验的四因素五水平参数为：温度为37℃、38℃、39℃、40℃、41℃，pH值为8、9、10、 11、12，酶与底物的质量配比为1:60、1:50、1:40、1:30、1:20，水解时间为60min、 120min、180min、240min、300min。
作为优选的方案：所述步骤S3中，所述多肽水解度的测定方法为双缩脲法。
作为优选的方案：所述步骤S3中，所述多肽水解度测定时标准曲线制定所采用的标 准品为Gly-Gly-Tyr-Arg四肽标准品。
作为优选的方案：所述步骤S4中，所述ACEI的活性测定方法为HHL法。
上述工艺制备的鲜牛奶粗蛋白ACEI混合肽的应用，尤其是在鲜奶粗蛋白碱性蛋白酶 水解产物的乳品高科技附加值产品开发的应用。
本发明提出一种碱性蛋白酶法制备鲜牛奶粗蛋白ACEI混合肽的工艺，有益效果在于： 本发明通过对鲜牛奶进行脱脂以及粗蛋白的制备，并将碱性蛋白酶溶液混合进行酶解反应 得到粗蛋白酶水解物，通过合理地控制水解的温度、酸碱度、酶与底物的配比以及水解时 间，最终制备获得多肽水解度和ACEI值较高的ACEI混合肽，为乳品企业提高鲜牛奶高附 加值产品的开发和利用提供基础数据，能够有效地应用于高血压等疾病的治疗中，具有很 高的推广使用价值。
附图说明
图1为本发明实施例中温度的单因素实验结果图；
图2为本发明的实施例中pH的单因素实验结果图；
图3为本发明的实施例中酶和底物组成比例的单因素实验结果图；
图4为本发明实施例中水解时间下的单因素实验结果图；
图3中，1表示1:20,2表示1:40，3表示1:60，图1-4中，Y轴为多肽水解度％，X轴为对应的变量。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例 是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术 人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
鉴于不同来源的鲜牛奶中蛋白质种类和成分的差异，本发明以宁波本地公司生产的鲜 牛奶为原料开展碱性蛋白酶水解牛奶粗蛋白制备ACEI混合肽的研究，并通过正交实验优 化多个酶解因素，确定了一条具有较高ACEI混合态得率的酶解工艺。本项目的研究可为 当地乳品企业开展鲜奶精深加工提供参考数据。
本发明所采取的技术方案是：提供一种碱性蛋白酶法制备鲜牛奶粗蛋白ACEI混合肽 的工艺，包括以下步骤：
S1:以鲜牛奶为原料脱脂制备粗蛋白；
S2：以所述步骤S1制得的粗蛋白与碱性蛋白酶溶液混合进行酶解反应的单因素实验 和正交实验，所述单因素实验和正交实验的工艺参数包括温度、pH值、酶/底物组成比例和水解时间，所述酶解反应的单因素实验和正交实验得到粗蛋白的酶水解物；
S3:测定所述步骤S2的酶解反应的单因素实验和正交实验得到粗蛋白的酶水解物的 多肽水解度与ACEI活性，根据多肽水解度与ACEI活性的测定结构筛选出最佳工艺参数；
S4：以所述步骤S3筛选出的最佳工艺参数，将粗蛋白与碱性蛋白酶溶液混合进行酶 解反应，制得鲜牛奶粗蛋白ACEI混合肽。
作为优选的方案：所述步骤S1具体包括：
S11：将鲜牛奶进行搅拌加热后离心将其脱脂，调节pH至4.5-5，使蛋白沉淀；
S12：去除上清液，蒸馏水洗涤蛋白沉淀并调节pH至中性，离心去除上清液；
S13：提起沉淀并冷冻干燥，得到鲜牛奶粗蛋白。
作为优选的方案：所述步骤S11中加热温度为77℃，搅拌时间为30分钟，离心速度为3800rpm，离心时间为15分钟。
作为优选的方案：所述步骤S2中以所述步骤S1制得的粗蛋白与碱性蛋白酶溶液混合 进行酶解反应包括：
将所述步骤S1制得的粗蛋白加入至蒸馏水中充分溶解，按设定值调节溶液pH后，加 入设定量的碱性蛋白酶，在恒温振荡器内按设定温度进行水解，达到设定的水解时间后进 行水浴反应使酶灭活，冷却至室温。
作为优选的方案：所述步骤S2中，单因素实验的工艺参数如下：pH值设定为8、10、12三个参数，温度设定为20℃、40℃、60℃三个参数，酶与底物质量配比为1:60、1:40、 1:20三个参数，水解的时间为60min、180min、300min三个参数。
作为优选的方案：所述步骤S2中，正交试验为L25(54)正交实验，且L25(54)正交 实验的四因素五水平参数为：温度为37℃、38℃、39℃、40℃、41℃，pH值为8、9、10、 11、12，酶与底物的质量配比为1:60、1:50、1:40、1:30、1:20，水解时间为60min、 120min、180min、240min、300min。
作为优选的方案：所述步骤S3中，所述多肽水解度的测定方法为双缩脲法。
作为优选的方案：所述步骤S3中，所述多肽水解度测定时标准曲线制定所采用的标 准品为Gly-Gly-Tyr-Arg四肽标准品。
作为优选的方案：所述步骤S4中，所述ACEI的活性测定方法为HHL法。
实施例：
鲜奶粗蛋白的抽提：
取1kg鲜牛奶于大烧杯中，将其置于磁力搅拌器上边搅拌边加热至77℃左右约30min，之后3800rpm离心15min，将其脱脂。用6mol/L的盐酸调脱脂鲜奶溶液pH到4.6， 使蛋白沉淀。接着，4000rpm离心15min去上清。之后，用蒸馏水洗剂粗蛋白沉淀，调 节其pH为中性，再次离心去除上清液，将沉淀冷冻干燥，即为鲜牛奶粗蛋白。粗蛋白中 蛋白质含量的检测采用凯氏定氮法。
粗蛋白的碱性蛋白酶水解及多肽水解度的测定：
在50mL蒸馏水中加入一定量的鲜牛奶粗蛋白(15mg/mL)，磁力搅拌器上充分搅拌使其溶解，根据碱性性蛋白酶标示的pH值调节水解酸碱度，然后加入一定量的碱性蛋白酶，在一定温度下恒温振荡器内水解，持续一段时间后，用100℃水浴10min灭酶活以停 止酶解反应，将酶解混合液冷却至室温备用。
取2.5mL粗蛋白碱性蛋白酶水解物，加入2.5mL 10％(W/V)的三氯乙酸(TCA)水 溶液，漩涡混合仪混合均匀后静置10min，然后以4000rpm离心15min，将上清全部转 移到50mL的容量瓶中，并用5％的TCA定容至刻度，摇匀。之后，取6.0mL上述溶液置 于另一试管中，加入双缩脲试剂4.0mL(样液：双缩脲试剂＝3：2，V/V)，于漩涡混合仪 上混合均匀，静置10min，2000rpm离心10min，备用。
取上清液于540nm下测定OD值，对照标准曲线求得样品溶液中多肽浓度C(mg/mL)，求得样品中多肽含量。以不同浓度的Gly-Gly-Tyr-Arg四肽标准溶液为横坐标X(mg/mL)，以在OD540为纵坐标Y，绘制标准曲线。
单因素实验
(一)温度的单因素实验
根据碱性蛋白酶的生化特点，测定酶解温度在20℃、40℃、60℃等三个梯度时，鲜牛 奶粗蛋白的多肽水解率，其余实验条件参考通用设定值。每个实验设三个技术重复。
(二)pH的单因素实验
根据碱性蛋白酶的生化特点，测定pH值设定为8、10、12等三个梯度时鲜牛奶粗蛋白的多肽水解率，其余实验条件参考通用设定值。每个实验设三个技术重复。
(三)酶和底物组成比例的单因素实验
根据预实验结果，测定酶和底物的比例设定为1：20、1：40、1：60等三个梯度时， 鲜牛奶粗蛋白的多肽水解率，其余实验条件参考通用设定值。每个实验设三个技术重复。
(四)水解时间下的单因素实验
根据预实验结果，测定酶解时间设定为60min、180min、300min等三个梯度时鲜 牛奶粗蛋白的多肽水解率，其它条件参考通用条件设定值。每个实验设三个技术重复。
测定最终获得的结果绘制成图表，如说明书附图图1-4所示，依次为本发明的温度的 单因素实验、pH的单因素实验、酶和底物组成比例的单因素实验以及水解时间下的单因素 实验最终三次实验所得出的平均结果。
正交实验
依据单因素实验结果，本实验设置L25(54)的正交实验表，四因素五水平参数设计如下： 温度参数为37℃、38℃、39℃、40℃、41℃；pH值参数为8、9、10、11、12；酶和底物 组成比例参数为1:20、1:30、1:40、1:50、1:60；水解时间为60min、120min、180min、 240min、300min。依据Design Expert软件设计水解组合方案，测定每个组合的多肽水 解度，测定的具体参数与结果如表1所示。
ACEI活性实验
将250μl HHL加入100μl超纯水或不同酶解条件组合方案所获得的肽混合物后，37℃ 水浴预热5min，立即加入150μl ACE保温反应90min后立即加入250μl 0.5mol/L HCl 终止反应。空白对照组在加入ACE之前加入250μl 0.5mol/L HCl后75℃水浴5min， 加入ACE，再保温5min。反应后加入3mL乙酸乙酯萃取5min，静置5min后移取乙酸 乙酯层2mL至干净试管中，85℃水浴蒸除乙酸乙酯，用3mL 1mol/L的NaCl溶液溶解 萃取出的马尿酸，在228nm波长分别测定体系的吸光值，计算差值(△A＝A90 min-A0 min)。 以单位时间内吸光值的变化表示ACE活力，抑制剂对ACE的抑制作用按下列公式计算：
(注：式中Ac为加入超纯水时吸光值在90min内的变化；Ai为加入抑制剂(实验样品)时吸光值在90min内的变化。)
测定的结果如表1所示：
表1：碱性蛋白酶酶解鲜奶粗蛋白的L25(54)正交实验及多肽水解度和ACEI值
通过实验例1-25分组的测定，我们发现在实际的制备过程中，采用实验例19的温度、 酸碱度、酶与底物比例以及水解时间时，多肽的水解度以及ACEI的活力值都较高，这也与我们在上述单因素实验中得出的结果相似，有部分出入，说明了在综合反应的影响下，本发明中实验例19的各条件也具备有各自的协同作用，以及单因素反应由于实验3次可 能出现的部分误差；当然，采用其他实验例的条件同样也能获得水解度不错的多肽以及活 力值相对高的ACEI，这也进一步地说明了通过本发明能够高效的制备得到鲜牛奶粗蛋白ACEI混合肽，且反应条件相对简单，制备的工艺也易于操作，本发明的设计有效地提取了鲜牛奶粗蛋白ACEI混合肽，为乳品企业提高鲜牛奶高附加值产品的开发和利用提供基础数据，能够有效地应用于高血压等疾病的治疗中，具有较高的推广使用价值。
以上就本发明较佳的实施例作了说明，但不能理解为是对权利要求的限制。本发明不 仅局限于以上实施例，其具体结构允许有变化，凡在本发明独立要求的保护范围内所作的 各种变化均在本发明的保护范围内。
Claims (9)
1.一种碱性蛋白酶法制备鲜牛奶粗蛋白ACEI混合肽的工艺，其特征在于：包括以下步骤：
S1:以鲜牛奶为原料脱脂制备粗蛋白；
S2：以所述步骤S1制得的粗蛋白与碱性蛋白酶溶液混合进行酶解反应的单因素实验和正交实验，所述单因素实验和正交实验的工艺参数包括温度、pH值、酶/底物组成比例和水解时间，所述酶解反应的单因素实验和正交实验得到粗蛋白的酶水解物；
S3:测定所述步骤S2的酶解反应的单因素实验和正交实验得到粗蛋白的酶水解物的多肽水解度与ACEI活性，根据多肽水解度与ACEI活性的测定结构筛选出最佳工艺参数；
S4：以所述步骤S3筛选出的最佳工艺参数，将粗蛋白与碱性蛋白酶溶液混合进行酶解反应，制得鲜牛奶粗蛋白ACEI混合肽。
2.根据权利要求1所述的碱性蛋白酶法制备鲜牛奶粗蛋白ACEI混合肽的工艺，其特征在于：所述步骤S1具体包括：
S11：将鲜牛奶进行搅拌加热后离心将其脱脂，调节pH至4.5-5，使蛋白沉淀；
S12：去除上清液，蒸馏水洗涤蛋白沉淀并调节pH至中性，离心去除上清液；
S13：提起沉淀并冷冻干燥，得到鲜牛奶粗蛋白。
3.根据权利要求2所述的碱性蛋白酶法制备鲜牛奶粗蛋白ACEI混合肽的工艺，其特征在于：所述步骤S11中加热温度为77℃，搅拌时间为30分钟，离心速度为3800rpm，离心时间为15分钟。
4.根据权利要求1所述的碱性蛋白酶法制备鲜牛奶粗蛋白ACEI混合肽的工艺，其特征在于：所述步骤S2中以所述步骤S1制得的粗蛋白与碱性蛋白酶溶液混合进行酶解反应包括：
将所述步骤S1制得的粗蛋白加入至蒸馏水中充分溶解，按设定值调节溶液pH后，加入设定量的碱性蛋白酶，在恒温振荡器内按设定温度进行水解，达到设定的水解时间后进行水浴反应使酶灭活，冷却至室温。
5.根据权利要求1所述的碱性蛋白酶法制备鲜牛奶粗蛋白ACEI混合肽的工艺，其特征在于：所述步骤S2中，单因素实验的工艺参数如下：pH值设定为8、10、12三个参数，温度设定为20℃、40℃、60℃三个参数，酶与底物质量配比为1:60、1:40、1:20三个参数，水解的时间为60min、180min、300min三个参数。
6.根据权利要求1所述的一种碱性蛋白酶法制备鲜牛奶粗蛋白ACEI混合肽的工艺，其特征在于：所述步骤S2中，正交试验为L25(54)正交实验，且L25(54)正交实验的四因素五水平参数为：温度为37℃、38℃、39℃、40℃、41℃，pH值为8、9、10、11、12，酶与底物的质量配比为1:60、1:50、1:40、1:30、1:20，水解时间为60min、120min、180min、240min、300min。
7.根据权利要求1所述的一种碱性蛋白酶法制备鲜牛奶粗蛋白ACEI混合肽的工艺，其特征在于：所述步骤S3中，所述多肽水解度的测定方法为双缩脲法。
8.根据权利要求7所述的一种碱性蛋白酶法制备鲜牛奶粗蛋白ACEI混合肽的工艺，其特征在于：所述步骤S3中，所述多肽水解度测定时标准曲线制定所采用的标准品为Gly-Gly-Tyr-Arg四肽标准品。
9.根据权利要求1所述的一种碱性蛋白酶法制备鲜牛奶粗蛋白ACEI混合肽的工艺，其特征在于：所述步骤S4中，所述ACEI的活性测定方法为HHL法。
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| CN1552891A (zh) * | 2003-11-10 | 2004-12-08 | 东北农业大学 | 一种乳源ace抑制肽的制备方法 |
| CN103215333A (zh) * | 2013-04-16 | 2013-07-24 | 陕西科技大学 | 一种酶解羊乳酪蛋白制备ace抑制肽的方法 |
| CN107641637A (zh) * | 2017-10-17 | 2018-01-30 | 陕西科技大学 | 一种复合酶解脱脂羊乳制备降血压肽的方法 |
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2021
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| 贾永红等: "碱性蛋白酶法制备鲜牛奶粗蛋白ACEI混合肽的工艺研究", 《食品安全导刊》 * |
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