CN107641637A - 一种复合酶解脱脂羊乳制备降血压肽的方法 - Google Patents
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Abstract
一种复合酶解脱脂羊乳制备降血压肽的方法，将脱脂羊奶粉加入纯净水中得脱脂乳液；向脱脂乳液中加入碱性蛋白酶、Alcalase酶和地衣芽孢杆菌蛋白酶复合蛋白酶，水解使ACE抑制肽充分释放，水解过程中每隔20min取4mL的样品在90℃下灭酶，将各次灭酶后的溶液混合得到酶解液；将上述酶解液先用NaOH溶液调节样品pH值至3.4‑3.6，离心除去沉淀，然后调节上清液pH值为8.3，再次离心得到上清液；将上清液经过截留分子量为10kDa、5kDa、1kDa的聚醚砜超滤膜进行超滤，收集分子量小于1kDa的组分，冷冻干燥得到较纯的ACE抑制肽。本发明直接对脱脂乳蛋白进行酶解，避免了提酪蛋白、乳清蛋白工艺的复杂化，同时能充分利用脱脂乳蛋白制备ACE抑制肽，避免蛋白资源的浪费，降低工业开发成本。
Description
技术领域
本发明涉及酶法制备ACE抑制肽的领域，特别涉及一种复合酶解脱脂羊乳制备降血压肽的方法。
背景技术
心血管病是对人类健康威胁最大、死亡率最高的三大疾病之一，在我国，高血压是一种常见的心血管疾病，其发病率呈逐年上升趋势，临床结果证实有六种降血压药物能够减少高血压并发症，分别是：β-受体阻段药、利尿剂、ACE抑制剂(ACEI)、钙通道阻滞剂(CCBs)、血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂和α-受体阻断药。这些合成类降压药物在治疗高血压方面具有很高的疗效，但会导致泌尿系统病变、降压过度或味觉失真等副作用的产生。在此背景下，天然、安全、高效的食源性ACE抑制肽成为降血压药物发展的新方向。
酶解法条件温和，成本低，可以对蛋白质定位水解以获取目标肽段，制备的降血压肽降压活性显著且无毒副作用。碱性蛋白酶、Alcalase酶和地衣芽孢杆菌蛋白酶是制备高活性ACE抑制肽的常用蛋白酶，现有研究只是采用其中的一种或两种蛋白酶来水解蛋白制备ACE抑制肽。不同成分进行复配，根据实际应用效果，来判断某种复配是增效、加和还是拮抗作用。
目前，用于制备降血压肽的食物来源很丰富，如植物蛋白、乳类蛋白及动物蛋白等。其中，乳类含有丰富的营养，且包含人体所需的多种必须氨基酸，也是生物活性多肽(尤其是ACE抑制肽)的重要来源。我国奶山羊资源丰富，陕西省更是生产奶山羊最多的基地。羊乳含有丰富的营养价值，成分和人乳接近，被称作乳中精品。羊乳相对牛乳具有以下优点：一是羊乳不易引发过敏反应，原因是αs1-酪蛋白为主要过敏原，其在羊乳中的含量远远低于牛乳的；二是羊乳更适用于乳糖不耐症患者食用，主要是羊乳中乳糖含量远低于牛乳。然而，当前对乳类蛋白的开发主要集中在牛乳上，而很少涉及羊乳。同时，对乳类蛋白的开发也只是针对单一蛋白，如酪蛋白或乳清蛋白，而造成乳中其他蛋白资源的浪费、开发成本的增加、制备工艺的复杂化。
发明内容
本发明的目的在于提供一种采用复合酶解脱脂羊乳制备降血压肽的方法，所制备的降血压肽降压效果好，同时，简化制备工艺，降低开发成本。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：
步骤1：将脱脂羊奶粉与纯净水按1：9-12的质量比混合均匀，得脱脂乳液；
步骤2：将脱脂乳液放入50-65℃的恒温水浴锅内并调节其pH值为8.0-10.5；
步骤3：向脱脂乳液中加入碱性蛋白酶、Alcalase酶和地衣芽孢杆菌蛋白酶复合蛋白酶，所用复合蛋白酶的总质量与脱脂乳液的质量比为：2-8：100，水解使ACE抑制肽充分释放，水解过程中每隔20min测量溶液的pH，当pH不再变化时，酶解反应完全，然后在90℃下灭酶15-20min得到酶解液；
步骤4：调节酶解液的pH值至3.4-3.6，离心除去沉淀，然后调节上清液pH值为8.3，再次离心得到上清液；
步骤5：将上清液经过滤膜进行超滤，收集分子量小于1kDa的组分，冷冻干燥得到较纯的ACE抑制肽。
所述步骤1采用涡旋振荡器使脱脂羊奶与纯净水混合均匀。
所述步骤2采用HCl溶液或NaOH溶液调节脱脂乳液pH值为8.0-10.5。
所述步骤3碱性蛋白酶、Alcalase酶和地衣芽孢杆菌蛋白酶的用酶比为1：2：2-3。
所述步骤3水解时间为1.5-6h。
所述步骤4采用NaOH溶液酶解液的pH值。
所述步骤4离心是在在6000-9000r/min离心10-25min。
所述步骤5滤膜进行超滤是将上清液经过截留分子量为10kDa、5kDa、1kDa的聚醚砜超滤膜进行超滤，温度为25℃、压力为0.09Mpa得到分子量小于1kDa的组分。
与现有技术相比，本发明直接对脱脂乳蛋白进行酶解，避免了提酪蛋白、乳清蛋白工艺的复杂化，同时能充分利用脱脂乳蛋白制备ACE抑制肽，避免蛋白资源的浪费，降低工业开发成本，适用于工业化生产。
本发明采用的复合蛋白酶碱性蛋白酶、Alcalase酶和地衣芽孢杆菌蛋白酶具有协同增效作用，制备的ACE抑制肽活性均在90％以上，ACE抑制肽具有降低人体血清胆固醇、降血压、减肥和低抗原性等功能，不像化学合成药物对人体产生副作用，若将ACE抑制肽作为药剂或制成各种保健食品，对抑制高血压将有着重要意义。同时，可以充分利用羊乳资源作为制备ACE抑制肽的原料来源，提高羊乳资源的附加值。
具体实施方式：
实施例1：
步骤1：将脱脂羊奶粉与纯净水按1：10的质量比混合，放置在涡旋振荡器中使其混合均匀得脱脂乳液；
步骤2：将脱脂乳液放入60℃的恒温水浴锅内并用1mol/L的HCl溶液调节其pH值为8.5；
步骤3：向脱脂乳液中加入碱性蛋白酶、Alcalase酶和地衣芽孢杆菌蛋白酶复合蛋白酶，所用复合蛋白酶的总质量与脱脂乳液的质量比为：6：100，碱性蛋白酶、Alcalase酶和地衣芽孢杆菌蛋白酶的用酶比为1：2：2，水解4.5h使ACE抑制肽充分释放，水解过程中每隔20min测量溶液的pH，当pH不再变化时，酶解反应完全，然后在90℃下灭酶18min得到酶解液；；
步骤4：将上述酶解液先用1mol/L的NaOH溶液调节样品pH值至3.5，在8000r/min离心15min，除去沉淀，然后调节上清液pH值为8.3，再次离心得到上清液；用紫外分光光度法测定样品在220nm波长下的吸光值，计算酶解物ACE抑制率，收集上清液；
步骤5：将上清液经过截留分子量为10kDa、5kDa、1kDa的聚醚砜超滤膜进行超滤，温度为25℃、压力为0.09Mpa，收集分子量小于1kDa的组分，冷冻干燥得到较纯的ACE抑制肽。测得该ACE抑制肽的抑制率为92.17±0.18％。
实施例2：
步骤1：将脱脂羊奶粉与纯净水按1：12的质量比混合，放置在涡旋振荡器中使其混合均匀得脱脂乳液；
步骤2：将脱脂乳液放入55℃的恒温水浴锅内并用1mol/L的NaOH溶液调节其pH值为9.0；
步骤3：向脱脂乳液中加入碱性蛋白酶、Alcalase酶和地衣芽孢杆菌蛋白酶复合蛋白酶，所用复合蛋白酶的总质量与脱脂乳液的质量比为：5：100，碱性蛋白酶、Alcalase酶和地衣芽孢杆菌蛋白酶的用酶比为1：2：2，水解4h使ACE抑制肽充分释放，水解过程中每隔20min测量溶液的pH，当pH不再变化时，酶解反应完全，然后在90℃下灭酶15min得到酶解液；；
步骤4：将上述酶解液先用1mol/L的NaOH溶液调节样品pH值至3.6，在7000r/min离心18min，除去沉淀，然后调节上清液pH值为8.3，再次离心得到上清液；用紫外分光光度法测定样品在220nm波长下的吸光值，计算酶解物ACE抑制率，收集上清液；
步骤5：将上清液经过截留分子量为10kDa、5kDa、1kDa的聚醚砜超滤膜进行超滤，温度为25℃、压力为0.09Mpa，收集分子量小于1kDa的组分，冷冻干燥得到较纯的ACE抑制肽。测得该条件下的ACE抑制率为91.33±0.58％。
实施例3：
步骤1：将脱脂羊奶粉与纯净水按1：10的质量比混合，放置在涡旋振荡器中使其混合均匀得脱脂乳液；
步骤2：将脱脂乳液放入64℃的恒温水浴锅内并用1mol/L的HCl溶液调节其pH值为9.2；
步骤3：向脱脂乳液中加入碱性蛋白酶、Alcalase酶和地衣芽孢杆菌蛋白酶复合蛋白酶，所用复合蛋白酶的总质量与脱脂乳液的质量比为：5：100，碱性蛋白酶、Alcalase酶和地衣芽孢杆菌蛋白酶的用酶比为1:2:3，水解4h使ACE抑制肽充分释放，水解过程中每隔20min测量溶液的pH，当pH不再变化时，酶解反应完全，然后在90℃下灭酶18min得到酶解液；；
步骤4：将上述酶解液先用1mol/L的NaOH溶液调节样品pH值至3.6，在9000r/min离心10min，除去沉淀，然后调节上清液pH值为8.3，再次离心得到上清液；用紫外分光光度法测定样品在220nm波长下的吸光值，计算酶解物ACE抑制率，收集上清液；
步骤5：将上清液经过截留分子量为10kDa、5kDa、1kDa的聚醚砜超滤膜进行超滤，温度为25℃、压力为0.09Mpa，收集分子量小于1kDa的组分，冷冻干燥得到较纯的ACE抑制肽。测得该条件下的ACE抑制率为91.63±0.33％。
实施例4：
步骤1：将脱脂羊奶粉与纯净水按1：9的质量比混合，放置在涡旋振荡器中使其混合均匀得脱脂乳液；
步骤2：将脱脂乳液放入50℃的恒温水浴锅内并用1mol/L的NaOH溶液调节其pH值为8.0；
步骤3：向脱脂乳液中加入碱性蛋白酶、Alcalase酶和地衣芽孢杆菌蛋白酶复合蛋白酶，所用复合蛋白酶的总质量与脱脂乳液的质量比为：8：100，碱性蛋白酶、Alcalase酶和地衣芽孢杆菌蛋白酶的用酶比为1:2:2.8，水解1.5h使ACE抑制肽充分释放，水解过程中每隔20min测量溶液的pH，当pH不再变化时，酶解反应完全，然后在90℃下灭酶16min得到酶解液；；
步骤4：将上述酶解液先用1mol/L的NaOH溶液调节样品pH值至3.4，在6000r/min离心25min，除去沉淀，然后调节上清液pH值为8.3，再次离心得到上清液；用紫外分光光度法测定样品在220nm波长下的吸光值，计算酶解物ACE抑制率，收集上清液；
步骤5：将上清液经过截留分子量为10kDa、5kDa、1kDa的聚醚砜超滤膜进行超滤，温度为25℃、压力为0.09Mpa，收集分子量小于1kDa的组分，冷冻干燥得到较纯的ACE抑制肽。
实施例5：
步骤1：将脱脂羊奶粉与纯净水按1：11的质量比混合，放置在涡旋振荡器中使其混合均匀得脱脂乳液；
步骤2：将脱脂乳液放入65℃的恒温水浴锅内并用1mol/L的HCl溶液调节其pH值为10.5；
步骤3：向脱脂乳液中加入碱性蛋白酶、Alcalase酶和地衣芽孢杆菌蛋白酶复合蛋白酶，所用复合蛋白酶的总质量与脱脂乳液的质量比为：2：100，碱性蛋白酶、Alcalase酶和地衣芽孢杆菌蛋白酶的用酶比为1:2:2.3，水解6h使ACE抑制肽充分释放，水解过程中每隔20min测量溶液的pH，当pH不再变化时，酶解反应完全，然后在90℃下灭酶20min得到酶解液；；
步骤4：将上述酶解液先用1mol/L的NaOH溶液调节样品pH值至3.6，在8000r/min离心20min，除去沉淀，然后调节上清液pH值为8.3，再次离心得到上清液；用紫外分光光度法测定样品在220nm波长下的吸光值，计算酶解物ACE抑制率，收集上清液；
步骤5：将上清液经过截留分子量为10kDa、5kDa、1kDa的聚醚砜超滤膜进行超滤，温度为25℃、压力为0.09Mpa，收集分子量小于1kDa的组分，冷冻干燥得到较纯的ACE抑制肽。
Claims (8)
1.一种复合酶解脱脂羊乳制备降血压肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：将脱脂羊奶粉与纯净水按1：9-12的质量比混合均匀，得脱脂乳液；
步骤2：将脱脂乳液放入50-65℃的恒温水浴锅内并调节其pH值为8.0-10.5；
步骤3：向脱脂乳液中加入碱性蛋白酶、Alcalase酶和地衣芽孢杆菌蛋白酶复合蛋白酶，所用复合蛋白酶的总质量与脱脂乳液的质量比为：2-8：100，水解使ACE抑制肽充分释放，水解过程中每隔20min测量溶液的pH，当pH不再变化时，酶解反应完全，然后在90℃下灭酶15-20min得到酶解液；
步骤4：调节酶解液的pH值至3.4-3.6，离心除去沉淀，然后调节上清液pH值为8.3，再次离心得到上清液；
步骤5：将上清液经过滤膜进行超滤，收集分子量小于1kDa的组分，冷冻干燥得到较纯的ACE抑制肽。
2.根据权利要求1所述的复合酶解脱脂羊乳制备降血压肽的方法，其特征在于：所述步骤1采用涡旋振荡器使脱脂羊奶与纯净水混合均匀。
3.根据权利要求1所述的复合酶解脱脂羊乳制备降血压肽的方法，其特征在于：所述步骤2采用HCl溶液或NaOH溶液调节脱脂乳液pH值为8.0-10.5。
4.根据权利要求1所述的复合酶解脱脂羊乳制备降血压肽的方法，其特征在于：所述步骤3碱性蛋白酶、Alcalase酶和地衣芽孢杆菌蛋白酶的用酶比为1：2：2-3。
5.根据权利要求1所述的复合酶解脱脂羊乳制备降血压肽的方法，其特征在于：所述步骤3水解时间为1.5-6h。
6.根据权利要求1所述的复合酶解脱脂羊乳制备降血压肽的方法，其特征在于：所述步骤4采用NaOH溶液酶解液的pH值。
7.根据权利要求1所述的复合酶解脱脂羊乳制备降血压肽的方法，其特征在于：所述步骤4离心是在6000-9000r/min离心10-25min。
8.根据权利要求1所述的复合酶解脱脂羊乳制备降血压肽的方法，其特征在于：所述步骤5滤膜进行超滤是将上清液经过截留分子量为10kDa、5kDa、1kDa的聚醚砜超滤膜进行超滤，温度为25℃、压力为0.09Mpa，得到分子量小于1kDa的组分。
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