CN103215331A - 一种复合酶解羊乳酪蛋白制备ace抑制肽的方法 - Google Patents

一种复合酶解羊乳酪蛋白制备ace抑制肽的方法 Download PDF

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王娟
舒国伟
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Abstract

一种复合酶解羊乳酪蛋白制备ACE抑制肽的方法，它以复原羊乳为原料，将其离心脱脂，并用等电点沉淀法制备酪蛋白，在特定的温度和PH条件下，将酪蛋白通过中性蛋白酶和胰蛋白酶进行复合水解，并对水解条件进行优化，用超声波对水解过程进行处理，得到的小分子ACE抑制肽并测定其活性，本发明制备的ACE抑制肽产品抑制比例达到80%以上，其分子质量小，在小肠内可以以完整肽段的形式被人体吸收，不会引起人体的免疫排斥反应，能够对高血压患者产生显著的降压作用，且对血压正常的人无作用，具有用量小、无毒副作用、性质温和、生理功能强的特点。

Description

一种复合酶解羊乳酪蛋白制备ACE抑制肽的方法
技术领域
本发明涉及酶法制备ACE抑制肽技术领域，特别涉及一种复合酶解羊乳酪蛋白制备ACE抑制肽的方法。
背景技术
目前我国人群中高血压患病率呈增长态势，每10个成人中就有2人患高血压，估计目前全国高血压患者至少2亿，但高血压知晓率、治疗率和控制率较低。高血压是脑卒中和冠状动脉性心脏病（冠心病）发病及死亡的主要危险因素，控制高血压可预防心脑血管疾病的发病及死亡。
目前，常用于高血压治疗的主要有6种的降压药物，分别是利尿剂、α-受体拮抗剂、钙通道阻滞剂、血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂α-肾上腺素受体阻滞剂。这些降血压药物虽然有显著的降压效果，但却存在一定的毒副作用，如引起咳嗽、过敏性血管水肿及肾功能不全加重等。
有研究报道将食物蛋白质进行水解后形成的小分子多肽，即血管紧张素转化酶（ACE）抑制肽，具有显著的降血压作用，将它与普通降压药物进行比较，发现无毒副作用，并且对正常的血压无影响。血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme,ACE)是一种膜结合的二肽羧基酶，是一种糖蛋白，含有维持其活性所必需的Zn2+和Cl-，广泛存在于人体组织及血浆中，在肺毛细管内皮细胞的含量最为丰富，它对血压的调节作用主要依靠肾素-血管紧张素系统(RAS)和激肽释放酶-激肽系统(KKS)。在血压调节方面，RAS和KKS是一对相互拮抗的体系,维持其平衡有重要作用，平衡一旦失调就会引起高血压的发病,而在RAS和KKS系统中ACE对血压调节起至关重要的作用,因此抑制ACE的活性对降低血压具有很重要的作用。
ACE的制备方法主要有5种：化学降解法、酶解法、微生物发酵法、化学合成法和基因工程法，现在研究最多的是酶解法和微生物发酵法。相对于微生物发酵法，酶法反应快速，制备ACE抑制肽抑制活性高，且原料广泛，主要有乳类蛋白、植物类蛋白及动物类蛋白，但目前乳源ACE抑制肽主要是以牛乳为原料，对羊乳尚未涉及到。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种复合酶解羊乳酪蛋白制备ACE抑制肽的方法，制备的ACE抑制肽抑制活性高，能够对高血压患者产生显著的降压作用，且对血压正常的人无作用，具有用量小、无毒副作用、性质温和、生理功能强的特点。
为了达到上述目的，本发明采取的技术方案为：一种复合酶解羊乳酪蛋白制备ACE抑制肽的方法，步骤如下：
步骤1：将羊奶粉与水按照质量比例1:9进行混合溶解，将得到的复原羊乳冷却到4℃，使用高速离心机在6400rpm下离心15min后，除去脂肪，得到脱脂乳；
步骤2：将所得脱脂乳在35-75℃范围内的恒温水浴箱中进行保温，采用磁力加热搅拌器进行搅拌，搅拌速度为0-1600rpm，边搅拌边滴加HCl溶液，使脱脂乳溶液的PH达到4.2-5.0，酪蛋白进行沉淀，使用高速离心机在6400rpm下离心15min后，弃去上清液，将沉淀的酪蛋白进行冷冻干燥，在温度为-40℃预冻12-24h，再转移到冷冻干燥机在-55℃下冷冻干燥24h，得到酪蛋白冻干粉，测定酪蛋白最大得率及条件；
步骤3：将上述步骤所得酪蛋白冻干粉制成质量浓度为10%的酪蛋白溶液100ml，放置恒温水浴箱内，调整温度在35-55℃范围内，滴加1mol/lNaOH溶液，调节酪蛋白溶液PH在7.0-9.0范围内；
步骤4：向酪蛋白溶液中加入质量比为1:1或1:2或2:1或4:1的中性蛋白酶和胰蛋白酶，所用的酶总量与酪蛋白溶液的质量比为2-10：100，进行水解反应2-5h，每间隔1h将5ml水解液在90℃水浴中保持10min使酶失活，使用高速离心机在9000rpm的条件下离心20min，除去未水解的酪蛋白，收集上清液并采用紫外分光光度法测定ACE抑制活性，并对上清液进行冷冻干燥；
步骤5：在确定最佳水解条件的基础上，检测在不同超声功率（0、90、180、225w）条件下对水解反应的影响，测定ACE抑制活性。
本发明采用的一种复合酶解羊乳酪蛋白制备ACE抑制肽的方法，将中性蛋白酶和胰蛋白酶两种酶同时作用于酪蛋白，使水解反应更彻底、更迅速，生成的ACE抑制肽抑制活性更高；将超声波作用于水解过程中，具有加强酪蛋白水解，利于ACE抑制肽生成。本发明通过复合酶解制备的ACE抑制肽产品为乳白色粉状物，其抑制比例达到80%以上，将其作为功能因子添加到各类食品中，对高血压患者具有显著的降压作用，而且性质温和并对血压正常的人无作用；其分子质量小，在小肠内可以以完整肽段的形式被人体吸收，不会引起人体的免疫排斥反应，具有用量小、无毒副作用、性质温和、生理功能强的特点。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细说明。
实施例一：
步骤1：将羊奶粉与水按照质量比例1:9进行混合溶解，将得到的复原羊乳冷却到4℃，使用高速离心机在6400rpm下离心15min后，除去脂肪，得到脱脂乳；
步骤2：将所得脱脂乳在35℃的恒温水浴箱中进行保温，采用磁力加热搅拌器进行搅拌，搅拌速度为800rpm，边搅拌边滴加HCl溶液，使脱脂乳溶液的PH达到4.6，酪蛋白进行沉淀，使用高速离心机在6400rpm下离心15min后，弃去上清液，将沉淀的酪蛋白进行冷冻干燥，在温度为-40℃预冻24h，再转移到冷冻干燥机在-55℃下冷冻干燥24h，得到酪蛋白冻干粉，测定得到当脱脂乳在35℃，PH为4.6，搅拌速度为800rpm条件下，酪蛋白得率最大，达到9.23%。
实施例二：
步骤1：将羊奶粉与水按照质量比例1:9进行混合溶解，将得到的复原羊乳冷却到4℃，使用高速离心机在6400rpm下离心15min后，除去脂肪，得到脱脂乳；
步骤2：将所得脱脂乳在45℃的恒温水浴箱中进行保温，采用磁力加热搅拌器进行搅拌，搅拌速度为800rpm，边搅拌边滴加HCl溶液，使脱脂乳溶液的PH达到4.5，酪蛋白进行沉淀，使用高速离心机在6400rpm下离心15min后，弃去上清液，将沉淀的酪蛋白进行冷冻干燥，在温度为-40℃预冻18h，再转移到冷冻干燥机在-55℃下冷冻干燥24h，得到酪蛋白冻干粉，测定得到当脱脂乳在45℃，PH为4.5，搅拌速度为800rpm条件下，酪蛋白得率最大，达到11.88%；
步骤3：将上述步骤所得酪蛋白冻干粉制成质量浓度为10%的酪蛋白溶液100ml，放置恒温水浴箱内，调整温度在35℃，滴加1mol/lNaOH溶液，调节酪蛋白溶液PH为7.0；
步骤4：向酪蛋白溶液中加入质量比为1:1的中性蛋白酶和胰蛋白酶，所用的酶总量与酪蛋白溶液的质量比为4：100，进行水解反应3h，每间隔1h将5ml水解液在90℃水浴中保持10min使酶失活，使用高速离心机在9000rpm的条件下离心20min，除去未水解的酪蛋白，收集上清液并采用紫外分光光度法测定ACE抑制活性为89.28%，并对上清液进行冷冻干燥。
实施例三：
步骤1：将羊奶粉与水按照质量比例1:9进行混合溶解，将得到的复原羊乳冷却到4℃，使用高速离心机在6400rpm下离心15min后，除去脂肪，得到脱脂乳；
步骤2：将所得脱脂乳在45℃的恒温水浴箱中进行保温，采用磁力加热搅拌器进行搅拌，搅拌速度为800rpm，边搅拌边滴加HCl溶液，使脱脂乳溶液的PH达到4.5，酪蛋白进行沉淀，使用高速离心机在6400rpm下离心15min后，弃去上清液，将沉淀的酪蛋白进行冷冻干燥，在温度为-40℃预冻12h，再转移到冷冻干燥机在-55℃下冷冻干燥24h，得到酪蛋白冻干粉，测定得到当脱脂乳在45℃，PH为4.5，搅拌速度为800rpm条件下，酪蛋白得率最大，达到11.88%；
步骤3：将上述步骤所得酪蛋白冻干粉制成质量浓度为10%的酪蛋白溶液100ml，放置恒温水浴箱内，调整温度在40℃，滴加1mol/lNaOH溶液，调节酪蛋白溶液PH在7.5；
步骤4：向酪蛋白溶液中加入质量比为2:1的中性蛋白酶和胰蛋白酶，所用的酶总量与酪蛋白溶液的质量比为6：100，进行水解反应2h，将5ml水解液在90℃水浴中保持10min使酶失活，使用高速离心机在9000rpm的条件下离心20min，除去未水解的酪蛋白，收集上清液并采用紫外分光光度法测定ACE抑制活性为90.29%，并对上清液进行冷冻干燥；
步骤5：将质量浓度为10%的酪蛋白溶液，用恒温水浴箱及1mol/lNaOH溶液分别调整酪蛋白溶液的温度为40℃和PH为7.5，加入质量比为2:1的中性蛋白酶和胰蛋白酶，所用的酶总量与酪蛋白溶液的质量比为6：100，在180w的超声场中进行水解反应2h，将5ml水解液在90℃水浴中保持10min使酶失活，使用高速离心机在9000rpm的条件下离心20min，除去未水解的酪蛋白，收集上清液并采用紫外分光光度法测定ACE抑制活性为91.52%。

Claims (4)

1.一种复合酶解羊乳酪蛋白制备ACE抑制肽的方法，其特征在于，包括如下步骤： 
步骤1：将羊奶粉与水按照质量比例1:9进行混合溶解，将得到的复原羊乳冷却到4℃，使用高速离心机在6400rpm下离心15min后，除去脂肪，得到脱脂乳； 
步骤2：将所得脱脂乳在35-75℃范围内的恒温水浴箱中进行保温，采用磁力加热搅拌器进行搅拌，搅拌速度为0-1600rpm，边搅拌边滴加HCl溶液，使脱脂乳溶液的PH达到4.2-5.0，酪蛋白进行沉淀，使用高速离心机在6400rpm下离心15min后，弃去上清液，将沉淀的酪蛋白进行冷冻干燥，在温度为-40℃预冻12-24h，再转移到冷冻干燥机在-55℃下冷冻干燥24h，得到酪蛋白冻干粉，测定酪蛋白最大得率及条件； 
步骤3：将上述步骤所得酪蛋白冻干粉制成质量浓度为10%的酪蛋白溶液100ml，放置恒温水浴箱内，调整温度在35-55℃范围内，滴加1mol/lNaOH溶液，调节酪蛋白溶液PH在7.0-9.0范围内； 
步骤4：向酪蛋白溶液中加入质量比为1:1或1:2或2:1或4:1的中性蛋白酶和胰蛋白酶，所用的酶总量与酪蛋白溶液的质量比为2-10：100，进行水解反应2-5h，每间隔1h将5ml水解液在90℃水浴中保持10min使酶失活，使用高速离心机在9000rpm的条件下离心 20min，除去未水解的酪蛋白，收集上清液并采用紫外分光光度法测定ACE抑制活性，并对上清液进行冷冻干燥； 
步骤5：在确定最佳水解条件的基础上，检测在不同超声功率（0、90、180、225w）条件下对水解反应的影响，测定ACE抑制活性。 
2.根据权利要求1所述的一种复合酶解羊乳酪蛋白制备ACE抑制肽的方法，其特征在于，包括如下步骤： 
步骤1：将羊奶粉与水按照质量比例1:9进行混合溶解，将得到的复原羊乳冷却到4℃，使用高速离心机在6400rpm下离心15min后，除去脂肪，得到脱脂乳； 
步骤2：将所得脱脂乳在35℃的恒温水浴箱中进行保温，采用磁力加热搅拌器进行搅拌，搅拌速度为800rpm，边搅拌边滴加HCl溶液，使脱脂乳溶液的PH达到4.6，酪蛋白进行沉淀，使用高速离心机在6400rpm下离心15min后，弃去上清液，将沉淀的酪蛋白进行冷冻干燥，在温度为-40℃预冻24h，再转移到冷冻干燥机在-55℃下冷冻干燥24h，得到酪蛋白冻干粉，测定得到当脱脂乳在35℃，PH为4.6，搅拌速度为800rpm条件下，酪蛋白得率最大，达到9.23%。
3.根据权利要求1所述的一种复合酶解羊乳酪蛋白制备ACE抑制肽的方法，其特征在于，包括如下步骤： 
步骤1：将羊奶粉与水按照质量比例1:9进行混合溶解，将得到的复原羊乳冷却到4℃，使用高速离心机在6400rpm下离心15min后，除去脂肪，得到脱脂乳； 
步骤2：将所得脱脂乳在45℃的恒温水浴箱中进行保温，采用磁力加热搅拌器进行搅拌，搅拌速度为800rpm，边搅拌边滴加HCl溶液，使脱脂乳溶液的PH达到4.5，酪蛋白进行沉淀，使用高速离心机在6400rpm下离心15min后，弃去上清液，将沉淀的酪蛋白进行冷冻干燥，在温度为-40℃预冻18h，再转移到冷冻干燥机在-55℃下冷冻干燥24h，得到酪蛋白冻干粉，测定得到当脱脂乳在45℃，PH为4.5，搅拌速度为800rpm条件下，酪蛋白得率最大，达到11.88%； 
步骤3：将上述步骤所得酪蛋白冻干粉制成质量浓度为10%的酪蛋白溶液100ml，放置恒温水浴箱内，调整温度在35℃，滴加1mol/lNaOH溶液，调节酪蛋白溶液PH为7.0； 
步骤4：向酪蛋白溶液中加入质量比为1:1的中性蛋白酶和胰蛋白酶，所用的酶总量与酪蛋白溶液的质量比为4：100，进行水解反应3h，每间隔1h将5ml水解液在90℃水浴中保持10min使酶失活，使用高速离心机在9000rpm的条件下离心20min，除去未水解的酪蛋白，收集上清液并采用紫外分光光度法测定ACE抑制活性为89.28%，并对上清液进行冷冻干燥。 
4.根据权利要求1所述的一种复合酶解羊乳酪蛋白制备ACE抑制肽的方法，其特征在于，包括如下步骤： 
步骤1：将羊奶粉与水按照质量比例1:9进行混合溶解，将得到的复原羊乳冷却到4℃，使用高速离心机在6400rpm下离心15min后，除去脂肪，得到脱脂乳； 
步骤2：将所得脱脂乳在45℃的恒温水浴箱中进行保温，采用磁力加热搅拌器进行搅拌，搅拌速度为800rpm，边搅拌边滴加HCl溶液，使脱脂乳溶液的PH达到4.5，酪蛋白进行沉淀，使用高速离心机在6400rpm下离心15min后，弃去上清液，将沉淀的酪蛋白进行冷冻干燥，在温度为-40℃预冻12h，再转移到冷冻干燥机在-55℃下冷冻干燥24h，得到酪蛋白冻干粉，测定得到当脱脂乳在45℃，PH为4.5，搅拌速度为800rpm条件下，酪蛋白得率最大，达到11.88%； 
步骤3：将上述步骤所得酪蛋白冻干粉制成质量浓度为10%的酪蛋白溶液100ml，放置恒温水浴箱内，调整温度在40℃，滴加1mol/lNaOH溶液，调节酪蛋白溶液PH在7.5； 
步骤4：向酪蛋白溶液中加入质量比为2:1的中性蛋白酶和胰蛋白酶，所用的酶总量与酪蛋白溶液的质量比为6：100，进行水解反应2h，将5ml水解液在90℃水浴中保持10min使酶失活，使用高速离心机在9000rpm的条件下离心20min，除去未水解的酪蛋白，收集上清液并采用紫外分光光度法测定ACE抑制活性为90.29%，并对上清液进行冷冻干燥； 
步骤5：将质量浓度为10%的酪蛋白溶液，用恒温水浴箱及1mol/lNaOH溶液分别调整酪蛋白溶液的温度为40℃和PH为7.5，加入质量比为2:1的中性蛋白酶和胰蛋白酶，所用的酶总量与酪蛋白溶液的质量比为6：100，在180w的超声场中进行水解反应2h，将5ml水解液在90℃水浴中保持10min使酶失活，使用高速离心机在9000rpm的条件下离心20min，除去未水解的酪蛋白，收集上清液并采用紫外分 光光度法测定ACE抑制活性为91.52%。 
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