CN103215331A - 一种复合酶解羊乳酪蛋白制备ace抑制肽的方法 - Google Patents
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Abstract
一种复合酶解羊乳酪蛋白制备ACE抑制肽的方法,它以复原羊乳为原料,将其离心脱脂,并用等电点沉淀法制备酪蛋白,在特定的温度和PH条件下,将酪蛋白通过中性蛋白酶和胰蛋白酶进行复合水解,并对水解条件进行优化,用超声波对水解过程进行处理,得到的小分子ACE抑制肽并测定其活性,本发明制备的ACE抑制肽产品抑制比例达到80%以上,其分子质量小,在小肠内可以以完整肽段的形式被人体吸收,不会引起人体的免疫排斥反应,能够对高血压患者产生显著的降压作用,且对血压正常的人无作用,具有用量小、无毒副作用、性质温和、生理功能强的特点。
Description
技术领域
本发明涉及酶法制备ACE抑制肽技术领域,特别涉及一种复合酶解羊乳酪蛋白制备ACE抑制肽的方法。
背景技术
目前我国人群中高血压患病率呈增长态势,每10个成人中就有2人患高血压,估计目前全国高血压患者至少2亿,但高血压知晓率、治疗率和控制率较低。高血压是脑卒中和冠状动脉性心脏病(冠心病)发病及死亡的主要危险因素,控制高血压可预防心脑血管疾病的发病及死亡。
目前,常用于高血压治疗的主要有6种的降压药物,分别是利尿剂、α-受体拮抗剂、钙通道阻滞剂、血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂α-肾上腺素受体阻滞剂。这些降血压药物虽然有显著的降压效果,但却存在一定的毒副作用,如引起咳嗽、过敏性血管水肿及肾功能不全加重等。
有研究报道将食物蛋白质进行水解后形成的小分子多肽,即血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽,具有显著的降血压作用,将它与普通降压药物进行比较,发现无毒副作用,并且对正常的血压无影响。血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme,ACE)是一种膜结合的二肽羧基酶,是一种糖蛋白,含有维持其活性所必需的Zn2+和Cl-,广泛存在于人体组织及血浆中,在肺毛细管内皮细胞的含量最为丰富,它对血压的调节作用主要依靠肾素-血管紧张素系统(RAS)和激肽释放酶-激肽系统(KKS)。在血压调节方面,RAS和KKS是一对相互拮抗的体系,维持其平衡有重要作用,平衡一旦失调就会引起高血压的发病,而在RAS和KKS系统中ACE对血压调节起至关重要的作用,因此抑制ACE的活性对降低血压具有很重要的作用。
ACE的制备方法主要有5种:化学降解法、酶解法、微生物发酵法、化学合成法和基因工程法,现在研究最多的是酶解法和微生物发酵法。相对于微生物发酵法,酶法反应快速,制备ACE抑制肽抑制活性高,且原料广泛,主要有乳类蛋白、植物类蛋白及动物类蛋白,但目前乳源ACE抑制肽主要是以牛乳为原料,对羊乳尚未涉及到。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点,本发明的目的在于提供一种复合酶解羊乳酪蛋白制备ACE抑制肽的方法,制备的ACE抑制肽抑制活性高,能够对高血压患者产生显著的降压作用,且对血压正常的人无作用,具有用量小、无毒副作用、性质温和、生理功能强的特点。
为了达到上述目的,本发明采取的技术方案为:一种复合酶解羊乳酪蛋白制备ACE抑制肽的方法,步骤如下:
步骤1:将羊奶粉与水按照质量比例1:9进行混合溶解,将得到的复原羊乳冷却到4℃,使用高速离心机在6400rpm下离心15min后,除去脂肪,得到脱脂乳;
步骤2:将所得脱脂乳在35-75℃范围内的恒温水浴箱中进行保温,采用磁力加热搅拌器进行搅拌,搅拌速度为0-1600rpm,边搅拌边滴加HCl溶液,使脱脂乳溶液的PH达到4.2-5.0,酪蛋白进行沉淀,使用高速离心机在6400rpm下离心15min后,弃去上清液,将沉淀的酪蛋白进行冷冻干燥,在温度为-40℃预冻12-24h,再转移到冷冻干燥机在-55℃下冷冻干燥24h,得到酪蛋白冻干粉,测定酪蛋白最大得率及条件;
步骤3:将上述步骤所得酪蛋白冻干粉制成质量浓度为10%的酪蛋白溶液100ml,放置恒温水浴箱内,调整温度在35-55℃范围内,滴加1mol/lNaOH溶液,调节酪蛋白溶液PH在7.0-9.0范围内;
步骤4:向酪蛋白溶液中加入质量比为1:1或1:2或2:1或4:1的中性蛋白酶和胰蛋白酶,所用的酶总量与酪蛋白溶液的质量比为2-10:100,进行水解反应2-5h,每间隔1h将5ml水解液在90℃水浴中保持10min使酶失活,使用高速离心机在9000rpm的条件下离心20min,除去未水解的酪蛋白,收集上清液并采用紫外分光光度法测定ACE抑制活性,并对上清液进行冷冻干燥;
步骤5:在确定最佳水解条件的基础上,检测在不同超声功率(0、90、180、225w)条件下对水解反应的影响,测定ACE抑制活性。
本发明采用的一种复合酶解羊乳酪蛋白制备ACE抑制肽的方法,将中性蛋白酶和胰蛋白酶两种酶同时作用于酪蛋白,使水解反应更彻底、更迅速,生成的ACE抑制肽抑制活性更高;将超声波作用于水解过程中,具有加强酪蛋白水解,利于ACE抑制肽生成。本发明通过复合酶解制备的ACE抑制肽产品为乳白色粉状物,其抑制比例达到80%以上,将其作为功能因子添加到各类食品中,对高血压患者具有显著的降压作用,而且性质温和并对血压正常的人无作用;其分子质量小,在小肠内可以以完整肽段的形式被人体吸收,不会引起人体的免疫排斥反应,具有用量小、无毒副作用、性质温和、生理功能强的特点。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细说明。
实施例一:
步骤1:将羊奶粉与水按照质量比例1:9进行混合溶解,将得到的复原羊乳冷却到4℃,使用高速离心机在6400rpm下离心15min后,除去脂肪,得到脱脂乳;
步骤2:将所得脱脂乳在35℃的恒温水浴箱中进行保温,采用磁力加热搅拌器进行搅拌,搅拌速度为800rpm,边搅拌边滴加HCl溶液,使脱脂乳溶液的PH达到4.6,酪蛋白进行沉淀,使用高速离心机在6400rpm下离心15min后,弃去上清液,将沉淀的酪蛋白进行冷冻干燥,在温度为-40℃预冻24h,再转移到冷冻干燥机在-55℃下冷冻干燥24h,得到酪蛋白冻干粉,测定得到当脱脂乳在35℃,PH为4.6,搅拌速度为800rpm条件下,酪蛋白得率最大,达到9.23%。
实施例二:
步骤1:将羊奶粉与水按照质量比例1:9进行混合溶解,将得到的复原羊乳冷却到4℃,使用高速离心机在6400rpm下离心15min后,除去脂肪,得到脱脂乳;
步骤2:将所得脱脂乳在45℃的恒温水浴箱中进行保温,采用磁力加热搅拌器进行搅拌,搅拌速度为800rpm,边搅拌边滴加HCl溶液,使脱脂乳溶液的PH达到4.5,酪蛋白进行沉淀,使用高速离心机在6400rpm下离心15min后,弃去上清液,将沉淀的酪蛋白进行冷冻干燥,在温度为-40℃预冻18h,再转移到冷冻干燥机在-55℃下冷冻干燥24h,得到酪蛋白冻干粉,测定得到当脱脂乳在45℃,PH为4.5,搅拌速度为800rpm条件下,酪蛋白得率最大,达到11.88%;
步骤3:将上述步骤所得酪蛋白冻干粉制成质量浓度为10%的酪蛋白溶液100ml,放置恒温水浴箱内,调整温度在35℃,滴加1mol/lNaOH溶液,调节酪蛋白溶液PH为7.0;
步骤4:向酪蛋白溶液中加入质量比为1:1的中性蛋白酶和胰蛋白酶,所用的酶总量与酪蛋白溶液的质量比为4:100,进行水解反应3h,每间隔1h将5ml水解液在90℃水浴中保持10min使酶失活,使用高速离心机在9000rpm的条件下离心20min,除去未水解的酪蛋白,收集上清液并采用紫外分光光度法测定ACE抑制活性为89.28%,并对上清液进行冷冻干燥。
实施例三:
步骤1:将羊奶粉与水按照质量比例1:9进行混合溶解,将得到的复原羊乳冷却到4℃,使用高速离心机在6400rpm下离心15min后,除去脂肪,得到脱脂乳;
步骤2:将所得脱脂乳在45℃的恒温水浴箱中进行保温,采用磁力加热搅拌器进行搅拌,搅拌速度为800rpm,边搅拌边滴加HCl溶液,使脱脂乳溶液的PH达到4.5,酪蛋白进行沉淀,使用高速离心机在6400rpm下离心15min后,弃去上清液,将沉淀的酪蛋白进行冷冻干燥,在温度为-40℃预冻12h,再转移到冷冻干燥机在-55℃下冷冻干燥24h,得到酪蛋白冻干粉,测定得到当脱脂乳在45℃,PH为4.5,搅拌速度为800rpm条件下,酪蛋白得率最大,达到11.88%;
步骤3:将上述步骤所得酪蛋白冻干粉制成质量浓度为10%的酪蛋白溶液100ml,放置恒温水浴箱内,调整温度在40℃,滴加1mol/lNaOH溶液,调节酪蛋白溶液PH在7.5;
步骤4:向酪蛋白溶液中加入质量比为2:1的中性蛋白酶和胰蛋白酶,所用的酶总量与酪蛋白溶液的质量比为6:100,进行水解反应2h,将5ml水解液在90℃水浴中保持10min使酶失活,使用高速离心机在9000rpm的条件下离心20min,除去未水解的酪蛋白,收集上清液并采用紫外分光光度法测定ACE抑制活性为90.29%,并对上清液进行冷冻干燥;
步骤5:将质量浓度为10%的酪蛋白溶液,用恒温水浴箱及1mol/lNaOH溶液分别调整酪蛋白溶液的温度为40℃和PH为7.5,加入质量比为2:1的中性蛋白酶和胰蛋白酶,所用的酶总量与酪蛋白溶液的质量比为6:100,在180w的超声场中进行水解反应2h,将5ml水解液在90℃水浴中保持10min使酶失活,使用高速离心机在9000rpm的条件下离心20min,除去未水解的酪蛋白,收集上清液并采用紫外分光光度法测定ACE抑制活性为91.52%。
Claims (4)
1.一种复合酶解羊乳酪蛋白制备ACE抑制肽的方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤1:将羊奶粉与水按照质量比例1:9进行混合溶解,将得到的复原羊乳冷却到4℃,使用高速离心机在6400rpm下离心15min后,除去脂肪,得到脱脂乳;
步骤2:将所得脱脂乳在35-75℃范围内的恒温水浴箱中进行保温,采用磁力加热搅拌器进行搅拌,搅拌速度为0-1600rpm,边搅拌边滴加HCl溶液,使脱脂乳溶液的PH达到4.2-5.0,酪蛋白进行沉淀,使用高速离心机在6400rpm下离心15min后,弃去上清液,将沉淀的酪蛋白进行冷冻干燥,在温度为-40℃预冻12-24h,再转移到冷冻干燥机在-55℃下冷冻干燥24h,得到酪蛋白冻干粉,测定酪蛋白最大得率及条件;
步骤3:将上述步骤所得酪蛋白冻干粉制成质量浓度为10%的酪蛋白溶液100ml,放置恒温水浴箱内,调整温度在35-55℃范围内,滴加1mol/lNaOH溶液,调节酪蛋白溶液PH在7.0-9.0范围内;
步骤4:向酪蛋白溶液中加入质量比为1:1或1:2或2:1或4:1的中性蛋白酶和胰蛋白酶,所用的酶总量与酪蛋白溶液的质量比为2-10:100,进行水解反应2-5h,每间隔1h将5ml水解液在90℃水浴中保持10min使酶失活,使用高速离心机在9000rpm的条件下离心 20min,除去未水解的酪蛋白,收集上清液并采用紫外分光光度法测定ACE抑制活性,并对上清液进行冷冻干燥;
步骤5:在确定最佳水解条件的基础上,检测在不同超声功率(0、90、180、225w)条件下对水解反应的影响,测定ACE抑制活性。
2.根据权利要求1所述的一种复合酶解羊乳酪蛋白制备ACE抑制肽的方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤1:将羊奶粉与水按照质量比例1:9进行混合溶解,将得到的复原羊乳冷却到4℃,使用高速离心机在6400rpm下离心15min后,除去脂肪,得到脱脂乳;
步骤2:将所得脱脂乳在35℃的恒温水浴箱中进行保温,采用磁力加热搅拌器进行搅拌,搅拌速度为800rpm,边搅拌边滴加HCl溶液,使脱脂乳溶液的PH达到4.6,酪蛋白进行沉淀,使用高速离心机在6400rpm下离心15min后,弃去上清液,将沉淀的酪蛋白进行冷冻干燥,在温度为-40℃预冻24h,再转移到冷冻干燥机在-55℃下冷冻干燥24h,得到酪蛋白冻干粉,测定得到当脱脂乳在35℃,PH为4.6,搅拌速度为800rpm条件下,酪蛋白得率最大,达到9.23%。
3.根据权利要求1所述的一种复合酶解羊乳酪蛋白制备ACE抑制肽的方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤1:将羊奶粉与水按照质量比例1:9进行混合溶解,将得到的复原羊乳冷却到4℃,使用高速离心机在6400rpm下离心15min后,除去脂肪,得到脱脂乳;
步骤2:将所得脱脂乳在45℃的恒温水浴箱中进行保温,采用磁力加热搅拌器进行搅拌,搅拌速度为800rpm,边搅拌边滴加HCl溶液,使脱脂乳溶液的PH达到4.5,酪蛋白进行沉淀,使用高速离心机在6400rpm下离心15min后,弃去上清液,将沉淀的酪蛋白进行冷冻干燥,在温度为-40℃预冻18h,再转移到冷冻干燥机在-55℃下冷冻干燥24h,得到酪蛋白冻干粉,测定得到当脱脂乳在45℃,PH为4.5,搅拌速度为800rpm条件下,酪蛋白得率最大,达到11.88%;
步骤3:将上述步骤所得酪蛋白冻干粉制成质量浓度为10%的酪蛋白溶液100ml,放置恒温水浴箱内,调整温度在35℃,滴加1mol/lNaOH溶液,调节酪蛋白溶液PH为7.0;
步骤4:向酪蛋白溶液中加入质量比为1:1的中性蛋白酶和胰蛋白酶,所用的酶总量与酪蛋白溶液的质量比为4:100,进行水解反应3h,每间隔1h将5ml水解液在90℃水浴中保持10min使酶失活,使用高速离心机在9000rpm的条件下离心20min,除去未水解的酪蛋白,收集上清液并采用紫外分光光度法测定ACE抑制活性为89.28%,并对上清液进行冷冻干燥。
4.根据权利要求1所述的一种复合酶解羊乳酪蛋白制备ACE抑制肽的方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤1:将羊奶粉与水按照质量比例1:9进行混合溶解,将得到的复原羊乳冷却到4℃,使用高速离心机在6400rpm下离心15min后,除去脂肪,得到脱脂乳;
步骤2:将所得脱脂乳在45℃的恒温水浴箱中进行保温,采用磁力加热搅拌器进行搅拌,搅拌速度为800rpm,边搅拌边滴加HCl溶液,使脱脂乳溶液的PH达到4.5,酪蛋白进行沉淀,使用高速离心机在6400rpm下离心15min后,弃去上清液,将沉淀的酪蛋白进行冷冻干燥,在温度为-40℃预冻12h,再转移到冷冻干燥机在-55℃下冷冻干燥24h,得到酪蛋白冻干粉,测定得到当脱脂乳在45℃,PH为4.5,搅拌速度为800rpm条件下,酪蛋白得率最大,达到11.88%;
步骤3:将上述步骤所得酪蛋白冻干粉制成质量浓度为10%的酪蛋白溶液100ml,放置恒温水浴箱内,调整温度在40℃,滴加1mol/lNaOH溶液,调节酪蛋白溶液PH在7.5;
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