CN102296100A - 一种酪蛋白降血压肽的制备方法 - Google Patents

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王桂春
陆剑平
王剑峰
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Abstract

本发明公开了一种酪蛋白降血压肽的制备方法，属于生物技术领域。该方法包括以下步骤：将酪蛋白悬浊液加热变性，冷却后调节pH加入胃蛋白酶，反应完成后灭酶，离心，调节上清液pH后再加入胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶继续反应，反应完成后灭酶，离心，上清液经真空浓缩和冷冻干燥后得到酪蛋白降血压肽粗品，利用大孔吸附树脂和葡聚糖凝胶层析分离得到具有ACE抑制活性的酪蛋白降血压肽。该方法通过模拟胃肠道消化的方式，利用两步酶解制备的小分子肽，具有高ACE抑制活性，无毒副作用，易于体内吸收，可用于制备降血压药物和食品。

Description

一种酪蛋白降血压肽的制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，尤其涉及多肽的制备及初步分离技术。
背景技术：
降血压肽，也称为ACE抑制肽(Angiotensin-converting Enzyme Inhibitory Peptides，ACEIP)是一类能够降低人体血压的小分子肽，它是血管紧张素转换酶(Angiotensin-converting Enzyme，ACE)的抑制剂，可通过抑制血管紧张素I向血管紧张素II转换以及阻止ACE降解缓激肽而起到降低血压的作用。尽管目前的多种化学合成肽类可以抑制ACE活性，但都有一定的副作用，且由于他们的作用时间不长，停药后会使血压反弹，而大量的实验证明乳蛋白来源的ACE抑制肽具有较高的体内降压作用，主要集中在小分子的肽类。1979年Oshima等最早报道食品蛋白源ACE抑制肽是由细菌胶原酶降解明胶获得的六条活性肽，并证实抑制ACE活性的肽分子量主要集中在1500u以下。1982年Maruyamas第一次从酪蛋白的胰蛋白酶水解液中分离出具有ACE抑制作用的十二肽、七肽、六肽和五肽。目前酶法制备酪蛋白降血压肽的方法包括直接酶解法和利用微生物间接酶解法，直接酶解又可分为单酶水解和复合酶水解。Nakamura和Yamamoto等采用微生物间接酶解法从酸牛乳、干酪中得到了具ACE抑制作用的降血压肽；Maruyamas、Saito、Miguel、Jiang等陆续从酪蛋白的酶水解液中得到大量的具ACE抑制作用的降压肽。目前已有的文献报道的无论是单酶或复合酶水解酪蛋白，均为一步酶解法，上述方法得到的降血压肽的分子量主要集中在1500u左右。
本发明模拟人体胃肠道消化的方式，采用胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶单酶和复合酶两步酶解法制备酪蛋白降血压肽，较一步酶解法得到的降血压肽分子量更小、体内吸收更容易。
发明内容：
本发明的目的是提供一种以酪蛋白为原料生产降血压肽的方法，通过模拟人体胃肠道消化的方式，采用两步酶解法获得具有高ACE抑制活性，且易于体内吸收的小分子降血压肽。
本发明是这样实现的，一种酪蛋白降血压肽的制备方法如下：
(1)酪蛋白为原料，加水配制成质量浓度为1％～3％的酪蛋白悬浊液，85℃～95℃保持10min使酪蛋白变性，冷却至室温后调节pH＝1.5～2.0，水解温度为35℃～40℃，每1g酪蛋白加胃蛋白酶25000U～35000U，水解时间为1～3h；
(2)酶解结束后80℃～90℃保持10min灭酶，冷却至室温后4000r/min离心；
(3)取步骤(2)所得上清液，调节pH＝7.5～8.0，水解温度为45℃～50℃，每1g酪蛋白加胰蛋白酶10000U～20000U和胰凝乳蛋白酶10000U～20000U，水解时间为4～6h；
(4)酶解结束后80℃～90℃保持10min灭酶，冷却至室温后4000r/min离心，上清液真空浓缩后冷冻干燥得酪蛋白降血压肽粗品。
(5)取步骤(4)的酪蛋白降血压肽粗品，配制20mg/ml的多肽溶液100mL，加入30g的DA201-C大孔吸附树脂，30℃条件下静态吸附3～5h，依次用25％、50％、75％、100％乙醇洗脱1～3h，收集并浓缩75％的乙醇洗脱组分。
(6)取步骤(5)中的75％的乙醇洗脱组分，利用Sephadex G-10凝胶层析进一步分离，超纯水1mL/min的流速进行洗脱，收集第二个洗脱峰，真空浓缩后冷冻干燥得粉末状酪蛋白降血压肽。
本发明所具有的优点：
(1)本发明提出了一种制备酪蛋白降血压肽的新方法，通过模拟人体胃肠道消化的方式，采用两步酶解法。此法安全、无毒副作用，工艺简单易行，便于工业化生产。
(2)本发明制备的降血压肽分子量分布在1000u以下、主要集中在600u左右，易于体内吸收，且具高ACE抑制活性。
(3)本发明制备的降血压肽来源于牛乳酪蛋白，因此具有安全、无毒副作用，对正常血压无作用等特点，可用于制备降血压药物和食品。
具体实施方式：
实施例1
本发明所述一种酪蛋白降血压肽的制备方法，以酪蛋白为原料，每1.5g酪蛋白加水100mL，85℃～95℃保持10min使酪蛋白变性，冷却至室温后调节pH＝1.8，水解温度为37℃，每1g酪蛋白加胃蛋白酶29000U，水解2h，在80℃～90℃条件下保持10min灭酶，冷却至室温后4000r/min离心，将上清液调节pH＝7.8，水解温度为48℃，每1g酪蛋白加胰蛋白酶15000U和胰凝乳蛋白酶15000U，水解5h，在80℃～90℃条件下保持10min灭酶，冷却至室温后4000r/min离心，将上清液真空浓缩后冷冻干燥得白色或淡黄色的粉末状酪蛋白降血压肽粗品。取酪蛋白降血压肽粗产品配制20mg/ml的多肽溶液，每100mL溶液加30g DA201-C大孔吸附树脂，30℃条件下静态吸附4h，依次用25％、50％、75％、100％乙醇洗脱2h，收集并浓缩75％的洗脱组分。75％的乙醇洗脱组分利用Sephadex G-10凝胶层析进一步分离，超纯水1mL/min的流速洗脱，收集第二个洗脱峰，真空浓缩后冷冻干燥得酪蛋白降血压肽产品。
实施例2
与实施例1类似，其区别在于每3g酪蛋白加水100mL，pH＝2.0，每1g酪蛋白加胃蛋白酶20000U，水解时间为3h。

Claims (6)

1.一种酪蛋白降血压肽的制备方法，其特征在于其步骤为：
(1)酪蛋白悬浊液在85～95℃条件下保持10min变性，冷却至室温，调节pH后加入胃蛋白酶，反应1～3h后灭酶，冷却后离心取上清液；
(2)取步骤(1)所得上清液调节pH，加入胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，反应4～6h后灭酶，冷却后离心取上清液；
(3)取步骤(2)所得上清液，真空浓缩后冷冻干燥得到白色或淡黄色的酪蛋白降血压肽粗品；
(4)取步骤(3)所得酪蛋白降血压肽粗品用DA201-C大孔吸附树脂吸附，然后乙醇梯度洗脱，收集并浓缩75％的乙醇洗脱组分；
(5)取步骤(4)所得到的75％的乙醇洗脱组分利用葡聚糖Sephadex G-10凝胶层析分离得到酪蛋白降血压肽。
2.如权利要求1所述一种酪蛋白降血压肽的制备方法，其特征是：步骤(1)中酪蛋白悬浊液质量浓度为1％～3％，加酶量为每1g酪蛋白加胃蛋白酶25000U～35000U，pH＝1.5～2.0，水解温度为35℃～40℃。
3.如权利要求1所述一种酪蛋白降血压肽的制备方法，其特征是：步骤(2)中加酶量为每1g酪蛋白加胰蛋白酶10000U～20000U和胰凝乳蛋白酶10000U～20000U，pH＝7.5～8.0，水解温度为45℃～50℃。
4.如权利要求1所述一种酪蛋白降血压肽的制备方法，其特征是：步骤(1)和(2)中灭酶条件为80～90℃保持10min，冷却至室温后4000r/min离心。
5.如权利要求1所述一种酪蛋白降血压肽的制备方法，其特征是：步骤(4)中取酪蛋白降血压肽粗品溶于水中，加入DA201-C大孔吸附树脂下静态吸附3～5h，依次用体积分数为25％、50％、75％、100％的乙醇洗脱1～3h，收集并浓缩75％的乙醇洗脱组分，实现酪蛋白降血压肽的初步分离。
6.如权利要求1所述一种酪蛋白降血压肽的制备方法，其特征是：步骤(4)中将75％的乙醇洗脱组分通过Sephadex G-10凝胶层析进一步分离，收集第二个洗脱峰，真空浓缩后冷冻干燥获得粉末状酪蛋白降血压肽。
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