CN103275176A - 一种ace抑制肽及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种ACE抑制肽及其制备方法，而提供一种具有抗高血压作用，富含ACE抑制肽的酪蛋白水解物、具有抗高血压作用的ACE抑制肽及制备方法。该富含ACE抑制肽的酪蛋白水解物，含有两个具有ACE抑制活性的肽片段，两个ACE抑制活性的肽片段的氨基酸序列分别为：YS和YQKFPQYLQY。一种ACE抑制肽，其氨基酸序列为：YS或YQKFPQYLQY。将所上述的ACE抑制肽或富含ACE抑制肽的酪蛋白水解物与奶粉基质充分混合，制成具有抗高血压的奶粉；或与鲜奶混合，接种乳酸菌发酵获得具有抗高血压作用的酸奶。该乳制品具有显著降高血压作用，对正常血压无影响，食用安全，适合高血压人群食用。

Description

一种ACE抑制肽及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种是以牛乳酪蛋白为原料利用胃蛋白酶和胰蛋白酶水解，制备具有ACE抑制活性的肽，并将其添加到奶粉基质中，生产具有抗高血压作用的奶粉；或添加到杀菌的鲜奶中，经乳酸发酵获得具有抗高血压作用的酸奶。

背景技术

随着世界的发展和社会的进步，人们的生活水平不断提高；大众的生活方式和饮食结构都发生了巨大变化，现代文明病也接踵而来。

现代文明病主要包括肥胖症、糖尿病、高血压、抑郁症等。在这些常见病中，高血压是严重危害人类健康的慢性病之一，也是世界范围内的普遍病症，其发生的原因，目前尚不清楚；同时，高血压是心血管疾病发展过程中主要的可控危险因子，每降低5mmHg收缩压，患心血管疾病的风险就降低16%；持续升高的血压极可能增加中风、心脏病发作和肾衰竭的风险，每年，全世界有大约30%或更多的成年人受高血压疾病的困扰，并有数百万人因高血压及其并发症而死亡。高血压已成为危及人类身体健康的主要疾病之一，据世界卫生组织预测，到2020年，非传染性疾病将占死亡原因的79％，而其中高血压等心血管疾病将会占到首位。作为现代文明病标志之一的高血压，通常被人们称为“无预兆”的疾病。那是由于高血压引起的后果总要等到对机体产生明显的损害之后才被发觉，这时往往已经太迟了。因此，高血压疾病的预防和治疗工作尤为重要。

高血压发病期间，患者需要经常服用一些辅助降压药物，但这些降压药会产生许多副作用，尤其对肾功能影响很大。所以，如果能在日常饮食中食用一些含有抗高血压成分的食品，那么不仅可以有效控制高血压的发病频率，而且对身体无任何副作用。

生物活性肽是具有生理调节功能的肽类总称，一般而言，这类肽大多相对分子质量较小，在人体内的消化吸收较蛋白质容易。这些小肽不仅能提供人体生长发育所需要的营养，还能调节人体生理机能，起到预防、甚至治疗疾病的作用。食源性生物活性肽的种类较多，包括血管紧张素转化酶（angiotensionconverting enzyme，ACE）抑制肽、免疫调节肽、抗氧化肽、抗菌肽、抗血栓肽、阿片样活性肽、促钙吸收肽。其中ACE抑制肽与高血压疾病的预防和治疗关系紧密，已引起各国科学家与政府的高度关注。

在食源性生物活性肽中，又以乳源性生物活性肽作用显著。它是指与乳中某些蛋白质肽链的某些片段相同或相似，在乳中固有的或在乳蛋白降解过程中产生的具有生物活性的肽类。随着不同功能的乳源性活性肽的发现，对乳蛋白质的研究已成为生理学界和营养学界的研究热点。

酪蛋白（casein）是乳中含量最丰富的蛋白质，在其大分子中含有多种具有生物活性的小分子片段，在不同蛋白酶的作用下，可释放出具有不同功能的分子片段，ACE抑制肽就是其中的一种。近年来国内外研究结果表明，当乳中酪蛋白在生物体内或食品加工过程中用酶消化时，可以产生大量ACE抑制肽，这些ACE抑制肽具有无副作用、安全性高、易吸收等优点。

目前报道的ACE抑制肽包括：Maruyama和Suzuki在1982年报道牛乳酪蛋白的胰蛋白酶水解物中存在的α_s1-酪蛋白的f23～24、f23～27和f174～199；β-酪蛋白的f177～183，f193～202片段。Jiang等用As.1398中性蛋白酶水解牛乳酪蛋白所得两个肽段，即Arg-Tyr-Pro-Ser-Tyr-Gly（κ酪蛋白，f（25～30））和Asp-Glu-Arg-Phe（κ酪蛋白，f（15～18）），而且测得其IC₅₀值分别为（54±1.2）μg/mL和(21±0.8)μg/mL。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，而提供一种具有抗高血压作用、富含ACE抑制肽的酪蛋白水解物及其制备方法。

本发明的另一个目的是提供一种具有抗高血压作用的ACE抑制肽及其制备方法。

本发明的再一个目的是提供一种具有抗高血压作用的奶粉和酸奶。

本发明的再一个目的是提供一种具有抗高血压作用的酸奶的制备方法。

为实现本发明的目的所采用的技术方案是：

一种富含ACE抑制肽的酪蛋白水解物，含有两个具有ACE抑制活性的肽片段，两个所述ACE抑制活性的肽片段的氨基酸序列分别为：YS和YQKFPQYLQY。

一种ACE抑制肽，其氨基酸序列为：YS。

一种ACE抑制肽，其氨基酸序列为：YQKFPQYLQY。

一种富含ACE抑制肽的酪蛋白水解物的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：

（1）在底物浓度为7%的酪蛋白水溶液中，按照酶与底物的比为1:100的比例加入胃蛋白酶，胃蛋白酶的水解条件为：温度为37℃、pH值为2.0-3.0，水解3h后，用沸水浴加热10min结束反应，冷却至室温；

（2）调整步骤（1）所得水解液的pH值至7.7-8.5，再用胰蛋白酶继续水解，胰蛋白酶的水解条件为：温度为45-50℃，pH值为7.7-8.5，胰蛋白酶与底物的比为1:500；水解3h后，水解液以沸水浴煮沸10min灭酶，然后冷却至室温；调节体系的pH值为6.8-7.0；之后，离心，取上清液;

（3）将步骤（2）所得上清液进行超滤处理，截留分子量为6Ku，收集超滤透出物，进行真空干燥，获得水分小于5%的水解超滤物，得到富含ACE抑制肽的酪蛋白水解物，其中含有两个片段具有ACE抑制活性，氨基酸序列分别为YS和YQKFPQYLQY。

一种富含ACE抑制肽的酪蛋白水解物的制备方法，在胰蛋白酶水解后添加风味蛋白酶脱苦，风味蛋白酶的水解条件为：风味蛋白酶与底物的比为3200U/g，水解温度为45-50℃、pH值为6.8-7.0、水解时间为1.5-2小时。

一种ACE抑制肽的制备方法，包括下述步骤：

（1）在底物浓度为7%的酪蛋白水溶液中，按照酶与底物的比为1:100的比例加入胃蛋白酶，胃蛋白酶的水解条件为：温度为37℃、pH值为2.0-3.0，水解3h后，用沸水浴加热10min结束反应，冷却至45-50℃；

（2）调整步骤（1）所得水解液的pH值至7.7-8.5，再用胰蛋白酶继续水解，胰蛋白酶的水解条件为：温度为45-50℃，pH值为7.7-8.5，胰蛋白酶与底物的比为1:500；水解3h后，水解液以沸水浴煮沸10min灭酶，然后冷却至室温；调节体系的pH值回至7.0；之后，离心，取上清液;

（3）将步骤（2）所得上清液进行超滤处理，截留分子量为6Ku，收集超滤透出物;

（4）超滤透出物通过Sephadex G-15进行分离，获得三个组分，分别检测三个组分的ACE抑制活性；

（5）选择步骤（4）中ACE抑制活性高的组分用色谱质谱检测仪器进行氨基酸序列的质谱检测，获得氨基酸序列为YS的片段；采用固相合成技术进行合成，得到具有ACE抑制功能的活性肽。

一种ACE抑制肽的制备方法，包括下述步骤：

（1）在底物浓度为7%的酪蛋白水溶液中，按照酶与底物的比为1:100的比例加入胃蛋白酶，胃蛋白酶的水解条件为：温度为37℃、pH值为2.0-3.0，水解3h后，用沸水浴加热10min结束反应，冷却至45-50℃；

（2）调整步骤（1）所得水解液的pH值至7.7-8.5，再用胰蛋白酶继续水解，胰蛋白酶的水解条件为：温度为45-50℃，pH值为7.7-8.5，胰蛋白酶与底物的比为1:500；水解3h后，水解液以沸水浴煮沸10min灭酶，然后冷却至室温；调节体系的pH值回至7.0；之后，离心，取上清液;

（3）将步骤（2）所得上清液进行超滤处理，截留分子量为6Ku，收集超滤透出物;

（4）超滤透出物通过Sephadex G-15进行分离，获得三个组分，分别检测三个组分的ACE抑制活性；

（5）选择步骤（4）中ACE抑制活性高的组分用色谱质谱检测仪器进行氨基酸序列的质谱检测，获得氨基酸序列为YQKFPQYLQY的片段；采用固相合成技术进行合成，得到具有ACE抑制功能的活性肽。

一种富含ACE抑制肽的抗高血压的奶粉，奶粉基质中添加权利要求4所得的酪蛋白水解物，或奶粉基质中添加权利要求6所获得的氨基酸序列为YS的ACE抑制肽和/或权利要求7所得的氨基酸序列为YQKFPQYLQY的ACE抑制肽。

优选100克奶粉基质中添加12.6克权利要求4所得的酪蛋白水解物，或100克奶粉基质中添加0.6克氨基酸序列为YS的ACE抑制肽和/或氨基酸序列为YQKFPQYLQY的ACE抑制肽，添加所获得的氨基酸序列为YS的ACE抑制肽和氨基酸序列为YQKFPQYLQY的ACE抑制肽时，两种ACE抑制肽可按照任意比例混合添加。两种ACE抑制肽优选按照1：1的比例添加。

一种富含ACE抑制肽的抗高血压的酸奶，鲜奶中添加权利要求4所得的酪蛋白水解物，或鲜奶中添加权利要求6所获得的氨基酸序列为YS的ACE抑制肽和/或权利要求7所得的氨基酸序列为YQKFPQYLQY的ACE抑制肽。

优选每100毫升鲜奶中添加1.26克权利要求4所得的酪蛋白水解物，或100毫升鲜奶中添加60毫克氨基酸序列为YS的ACE抑制肽和/或氨基酸序列为YQKFPQYLQY的ACE抑制肽，添加所获得的氨基酸序列为YS的ACE抑制肽和氨基酸序列为YQKFPQYLQY的ACE抑制肽时，二者按照任意比例进行混合后添加。两种ACE抑制肽优选按照1：1的比例添加。

一种抗高血压的酸奶的制备方法，包括下述步骤：

（1）在经过杀菌的鲜牛奶中，添加权利要求4中所制备的富含ACE抑制肽的酪蛋白水解物，充分混合均匀；或者在经过杀菌的鲜牛奶中，添加氨基酸序列为YS的ACE抑制肽和/或氨基酸序列为YQKFPQYLQY的ACE抑制肽，充分混合均匀；

（2）接种0.06%直投乳酸菌,42℃发酵5小时，获得具有抗高血压作用的酸奶。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明的酪蛋白水解物中含有ACE抑制功能的两个肽片段，经分析对应于N端：α₂　f(56-57):YS和α₂　f(98-107):YQKFPQYLQY,是一种新型的具有ACE抑制功能的活性肽，经检测具有抗高血压功能。

2、本发明的活性肽的氨基酸序列分别为YS和YQKFPQYLQY,是一种新型的具有ACE抑制功能的活性肽，经检测具有抗高血压功能。

3、本发明的乳制品以获得的源于牛乳酪蛋白的具有ACE活性抑制作用的肽片段[N端：α₂　f(56-57):YS,α₂　f(98-107):YQKFPQYLQY]为主要功能成分，所生产的具有抗高血压作用的奶粉与奶粉基质相比，具有显著抗高血压作用（p＜0.05）；所生产的抗高血压作用的酸奶与普通发酵酸奶相比，具有显著抗高血压作用（p＜0.05）。而且，对正常血压无影响，食用安全，适合高血压人群食用。

4、本发明中生产ACE抑制肽的原料为牛乳酪蛋白，生产ACE抑制肽所用水解酶为人体消化系统所存在的胃蛋白酶和胰蛋白酶，产品的主要原料为奶粉和牛奶。因此，生产的产品食用安全。

5、本发明的酪蛋白水解物及ACE抑制肽的制备方法简单，实用性强。

附图说明

图1所示为片段YQK FPQ YLQY的ACE抑制率；

图2所示为片段α₂　f(56-57):YS的ACE抑制效果；

图3所示为灌胃片段α₂　f(56-57):YS对SHR血压的影响；

图4所示为灌胃片段α₂　f(98-107):YQKFPQYLQY对SHR血压的影响；

图5所示为灌胃片段α₂　f(56-57):YS对wistar大鼠血压的影响；

图6所示为灌胃片段α₂　f(98-107):YQKFPQYLQY对wistar大鼠血压的影响；

图7所示为超滤物浓度与ACE抑制活性关系曲线；

图8所示为灌胃超滤物对SHR大鼠血压变化的影响；

图9所示为灌胃超滤物对wistar大鼠血压变化的影响；

图10所示为氨基酸序列为YQKFPQYLQY的ACE抑制肽与氨基酸序列为YS的ACE抑制肽按1:1混合后制备的奶粉对SHR血压的影响；

图11所示为添加氨基酸序列为YQKFPQYLQY的ACE抑制肽奶粉对SHR血压的影响；

图12所示为添加氨基酸序列为YS的ACE抑制肽奶粉对SHR血压的影响；

图13所示为氨基酸序列为YQKFPQYLQY的ACE抑制肽与氨基酸序列为YS的ACE抑制肽按1:1混合后制备的酸奶对SHR血压的影响；

图14所示为添加氨基酸序列为YQKFPQYLQY的ACE抑制肽发酵乳对SHR血压的影响；

图15所示为添加氨基酸序列为YS的ACE抑制肽的发酵乳对SHR血压的影响。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。

以下实施例的反应过程中，通过滴加1mol/L的HCl溶液或氢氧化钠溶液来调节反应体系的pH值。

实施例1

1.在底物浓度为7%的酪蛋白水溶液中，按照酶与底物的比为1:100的比例加入胃蛋白酶，胃蛋白酶的水解条件为：温度为37℃、pH值为3.0，酶解3h后，用沸水浴加热10min结束反应，冷却至室温。

2.调整步骤1所得水解液的pH值至7.7，再用胰蛋白酶继续水解，胰蛋白酶的水解的条件为：温度为48℃，pH值为7.7，胰蛋白酶与底物的比为1:500；水解3h后，水解液以沸水浴煮沸10min灭酶，然后冷却至50℃。调解水解液的pH值为6.8，添加风味蛋白酶（丹麦Novo公司）脱苦，条件为：酶与底物比为3200U/g、水解温度50℃、pH6.8、水解时间1.5小时。将水解液冷却至室温，在4000r/min下离心15min，上清液用截留分子量为6Ku的中空纤维膜超滤，收集透出物进行真空冷冻干燥，获得水分小于5%的水解超滤物。即富含ACE抑制肽的酪蛋白水解物。

3.利用HHL(Hip-His-Leu)方法体外检测步骤2所得到产物的ACE抑制率，结果见图7。由图7所拟合方程y=-0.4858x²+1.1035x+0.2582，其中，R²=0.9696，可计算出水解超滤物的IC₅₀值为250μg/mL。

4.将步骤2所获得产物灌胃原发性高血压大鼠(SHR)，检测其对SHR血压的影响。选用12周龄雄性SHR大鼠32只，体质量为(260±15)g，自由采食饮水，保持环境温度(23±1)℃，相对湿度60%±5%，预饲养1周。大鼠随机分为4组，每组8只，分别为空白组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，分别灌胃生理盐水(10mL/kgm_b)、低、中、高剂量的水解产物（灌胃剂量为10、50、100mg/kgm_b）。另取Wistar大鼠8只，分为2组，分别作为空白组和正常对照组，灌胃生理盐水和高剂量水解产物。采用BP-2006A型智能无创血压计（北京软隆科技有限责任公司），测定大鼠尾动脉收缩压(SBP)。测定前，将大鼠固定于鼠网保温套中在39℃恒温预热，使尾动脉扩张，血流畅通。测定灌胃后1～8h的尾动脉血压，连续测3次，取平均值。其对血压的影响见图8、图9。

由图7、图8、图9可以看出，所获得水解超滤物，通过体内和体外实验，均具有降血压作用（p＜0.05），并且对正常血压无影响(p＞0.05)。

实施例2

（1）在底物浓度为7%的酪蛋白水溶液中，按照酶与底物的比为1:100的比例加入胃蛋白酶，胃蛋白酶的水解条件为：温度为37℃、pH值为3.0，酶解3h后，用沸水浴加热10min结束反应。然后，水解液冷却至48℃。调pH值至7.7，再用胰蛋白酶继续水解。胰蛋白酶的水解的条件为：温度为48℃，pH值为7.7，胰蛋白酶与底物的比为1:500；水解3h后，水解液以沸水浴煮沸10min灭酶，然后冷却至室温。调节水解液的pH值回至7.0，在4000r/min下离心，取上清液。上清液用截留分子量为6Ku的超滤膜处理，收集超滤透出物。超滤透出物通过Sephadex G-15进行分离，获得三个组分，分别检测三个组分的ACE活性半数抑制率分别为：组分1的IC₅₀值为123.41μg/mL；组分2的IC₅₀值为66.67μg/mL；组分3的IC₅₀值为64.29μg/mL。

（2）选择ACE抑制活性高的组分2和组分3，用LTQXL型色谱质谱检测仪器（Thermo Scientific），进行氨基酸序列的质谱检测，获得8个片段，与牛乳α₁-酪蛋白、α₂-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白的氨基酸序列比对，分别为N端：α₁　f(25-35):FVAPFPEVFGK,α₁　f(103-111):LGYLEQLLR，α₁f(178-190)YVPLGTQYTDAPSF；α₂　f(56-57):YS,α₂　f(98-107):YQKFPQYLQY；β　f(90-102):PVVVPPFLQPEVM；κ-f(34-49):SRYPSYGLNYYQQKPV，κ-f(52-61):INNQFLPYPY。分别检测各片段的ACE抑制活性，其中两个片段具有ACE抑制活性，分别为α₂　f(56-57):YS、α₂　f(98-107):YQKFPQYLQY，其ACE活性半数抑制力IC50值分别为11.89μg/mL和11.75μg/mL。

（3）对所获得的α₂　f(56-57):YS片段进行固相合成，采用常规的固相合成方法进行合成:

①称取2.0g Wang树脂于洁净干燥的反应管中，加入适量二甲基甲酰胺（DMF），活化30min左右，然后称取C端第一个氨基酸1mmol，二甲基氨基吡啶（DMAP）150mg，N,N-二异丙基碳二亚胺（DIC1）加入到反应管中，DMF做溶剂反应3h。反应完毕用DMF洗4-6次，加入适量吡啶和乙酸酐的混合物，吡啶和乙酸酐的体积比为1:1，反应30min。反应完毕用DMF洗4-6次。然后用哌啶溶液脱掉氨基酸的Fmoc，脱两次共15min（10min+5min）。再用DMF洗4次，甲醇洗2次，取出少量树脂用茚三酮检测试剂检测，检测为蓝色，即可进行下一步反应。

②称取C端第二个氨基酸3mmol，四甲基脲六氟磷酸酯（HBTU）3mmol于反应管中，加入二异丙基乙胺（DIEA）0.5mL，反应40min，用DMF洗4-6次，取少量树脂用茚三酮检测试剂检测，显无色，然后加入哌啶溶液脱Fmoc，10min+5min，然后用DMF洗4次，甲醇洗两次，取出少量树脂用茚三酮检测试剂检测，检测为蓝色，即可进行下一步反应。

③其余的氨基酸反应方法同②。

④最后用三氟乙酸切割液切割2h，反应液抽滤，得多肽的三氟乙酸溶液，用乙醚沉淀，离心，取沉淀然后再用乙醚洗3-5次，得白色固体即为氨基酸序列为为YS的ACE抑制肽，经HPLC脱盐，冻干，取少量MS分析。所获得产物纯度大于98%。

（4）采用与步骤（3）相同的方法进行α₂　f(98-107):YQKFPQYLQY的固相合成，得到氨基酸序列为YQKFPQYLQY的ACE抑制肽。

利用HHL(Hip-His-Leu)方法体外检测步骤（3）和步骤（4）所得到片段的ACE抑制率，结果见图1和图2。

图1为片段α₂　f(98-107):YQKFPQYLQY的ACE抑制效果。通过拟合方程y=-0.0002x²+0.0217x+0.2737，其中，R²=0.9754，可计算ACE活性半数抑制率IC50=11.75μg/mL。图2为片段α₂　f(56-57):YS的ACE抑制效果。通过拟合方程y=-9E-0.5x²+0.0139x+0.2795，其中，R²=0.9635，可计算ACE活性半数抑制率IC50=11.89μg/mL。

将步骤（3）和步骤（4）所获得肽的片段，分别灌胃原发性高血压大鼠（SHR）检测其对SHR血压的影响。选用12周龄雄性SHR大鼠32只，体质量为(260±15)g，自由采食饮水，保持环境温度(23±1)℃，相对湿度60%±5%，预饲养1周。大鼠随机分为4组，每组8只，分别为空白组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，分别灌胃生理盐水(10mL/kgm_b)、低、中、高剂量的合成产物(灌胃剂量为2、10、20mg/kg m_b)，另取Wistar大鼠8只，分为2组，分别作为空白组和正常对照组，灌胃生理盐水和高剂量的合成产物。采用BP-2006A型智能无创血压计（北京软隆科技有限责任公司），测定大鼠尾动脉收缩压(SBP)。测定前，将大鼠固定于鼠网保温套中在39℃恒温预热，使尾动脉扩张，血流畅通。测定灌胃后1～8h的尾动脉血压，连续测3次，取平均值。其对血压的影响见图3、图4、图5、图6。

由图3和图4可以看出，所获得片段对原发性高血压大鼠（SHR）具有很好具有很好的降血压作用（p＜0.05）。有图5和图6可知，所获得片段对正常大鼠（wistar大鼠）血压没有影响(p＞0.05)。

因此，无论体外还是体内实验，所获得片段均有较好的降血压作用。

实施例3

1.将实施例2所获得的氨基酸序列为为YS的ACE抑制肽和氨基酸序列为YQKFPQYLQY的ACE抑制肽按照1:1比例混合后，再与奶粉基质混合，每100克奶粉基质中添加0.6克ACE抑制肽，充分混合均匀，得到具有抗高血压作用的奶粉。

2.将步骤1所获得奶粉，灌胃原发性高血压大鼠（SHR），检测其对SHR血压的影响。选用12周龄雄性SHR大鼠24只，体质量为(260±15)g，自由采食饮水，保持环境温度(23±1)℃，相对湿度60%±5%，预饲养1周。大鼠随机分为3组，每组8只，分别为空白组、奶粉基质组和抗高血压奶粉组，分别灌胃生理盐水(10mL/kgm_b)和0.35g/kg m_b的抗高血压奶粉和奶粉基质。检测方法同实施例1。其对血压的影响见图10。由图10可以看出，当以0.35g/kg m_b剂量的奶粉灌胃原发性高血压大鼠，具有较好的抗高血压作用（p＜0.05）。其作用在灌胃后4小时达到最佳效果（26mmHg）。

实施例4

1.将实施例1中所获得的富含ACE抑制肽的酪蛋白水解物与奶粉基质以比例为100克奶粉基质中添加12.6克富含ACE抑制肽的酪蛋白水解物，充分混合后即为具有抗高血压作用的奶粉。

2.将步骤1所获得的奶粉灌胃原发性高血压大鼠，检测其对高血压大鼠血压的影响。检测方法同实施例3，灌胃剂量为0.35g/kg m_b，结果见图10。由图10可以看出，与奶粉基质相比，添加富含ACE抑制肽的酪蛋白水解物的奶粉具有较好的抗高血压作用（p＜0.05），在灌胃后4小时达到最佳效果（23mmHg）。

实施例5

1.将实施例2所获得的氨基酸序列为YQKFPQYLQY的ACE抑制肽，与奶粉基质混合，每100克奶粉基质中添加0.6克ACE抑制肽，充分混合均匀，得到具有抗高血压作用的奶粉。

2.将步骤1所获得奶粉，灌胃原发性高血压大鼠（SHR），检测其对SHR血压的影响。选用12周龄雄性SHR大鼠24只，体质量为(260±15)g，自由采食饮水，保持环境温度(23±1)℃，相对湿度60%±5%，预饲养1周。大鼠随机分为3组，每组8只，分别为空白组、奶粉基质组和抗高血压奶粉组，分别灌胃生理盐水(10mL/kgm_b)和0.35g/kg m_b的抗高血压奶粉和奶粉基质。检测方法同实施例1。其对血压的影响见图11。由图11可以看出，当以0.35g/kg m_b剂量的奶粉灌胃原发性高血压大鼠，具有较好的抗高血压作用（p＜0.05）。其作用在灌胃后4小时达到最佳效果（25mmHg）。

实施例6

1.将实施例2所获得的氨基酸序列为为YS的ACE抑制肽，与奶粉基质混合，每100克奶粉基质中添加0.6克ACE抑制肽，充分混合均匀，得到具有抗高血压作用的奶粉。

2.将步骤1所获得奶粉，灌胃原发性高血压大鼠（SHR），检测其对SHR血压的影响。选用12周龄雄性SHR大鼠24只，体质量为(260±15)g，自由采食饮水，保持环境温度(23±1)℃，相对湿度60%±5%，预饲养1周。大鼠随机分为3组，每组8只，分别为空白组、奶粉基质组和抗高血压奶粉组，分别灌胃生理盐水(10mL/kgm_b)和0.35g/kg m_b的抗高血压奶粉和奶粉基质。检测方法同实施例1。其对血压的影响见图12。由图12可以看出，当以0.35g/kg m_b剂量的奶粉灌胃原发性高血压大鼠，具有较好的抗高血压作用（p＜0.05）。其作用在灌胃后4小时达到最佳效果（27.5mmHg）。

实施例7

1.将实施例2中所获得的氨基酸序列为为YS的ACE抑制肽和氨基酸序列为YQKFPQYLQY的ACE抑制肽以1:1比例混合后，按照100毫升杀菌的鲜牛奶添加60毫克的ACE抑制肽的比例混合，进行充分混合，接种0.06%直投乳酸菌活性（50U的汉森公司的YF-L812）,42℃发酵5小时，获得具有抗高血压作用的酸奶。

2.将步骤1所获得酸奶灌胃原发性高血压大鼠（SHR）,检测其对SHR血压的影响。选用12周龄雄性SHR大鼠24只，体质量为(260±15)g，自由采食饮水，保持环境温度(23±1)℃，相对湿度60%±5%，预饲养1周。大鼠随机分为3组，每组8只，分别为空白组、普通发酵酸奶组和抗高血压酸奶组（添加ACE抑制肽组），分别灌胃生理盐水(10mL/kgm_b)和3.5g/kg m_b的抗高血压酸奶及普通发酵酸奶。检测方法同实施例1。结果见图13。

由图13可知，添加和未添加ACE抑制肽的鲜奶经发酵后所获得酸奶，经灌胃实验，对SHR血压影响具有显著差异（p＜0.05）。添加ACE抑制肽的鲜奶经发酵后所获得酸奶灌胃4小时后达到最佳效果（降压27mmHg），说明添加ACE抑制肽的酸奶具有较好的抗高血压作用。

实施例8

1.将实施例1所得富含ACE抑制肽的酪蛋白水解物按照100毫升杀菌的鲜奶添加1.26克的比例，充分混合均匀，接种0.06%直投乳酸菌（50U的汉森公司的YF-L812）,42℃发酵5小时，获得具有抗高血压作用的酸奶。

2.将步骤1所获得酸奶灌胃原发性高血压大鼠（SHR）,检测其对SHR血压的影响。选用12周龄雄性SHR大鼠24只，体质量为(260±15)g，自由采食饮水，保持环境温度(23±1)℃，相对湿度60%±5%，预饲养1周。大鼠随机分为3组，每组8只，分别为空白组、普通发酵酸奶组和抗高血压酸奶组（添加富含ACE抑制肽的水解超滤物），分别灌胃生理盐水(10mL/kgm_b)和3.5g/kg m_b的抗高血压酸奶及普通发酵酸奶。检测方法同实施例1。结果见图13。

由图13可知，与普通发酵酸奶相比，添加富含ACE抑制肽酪蛋白水解物的鲜奶经发酵后所获得酸奶，经灌胃实验，对SHR血压影响具有显著差异（p＜0.05）。灌胃4小时后达到最佳效果（降压28mmHg），说明添加富含ACE抑制肽酪蛋白水解物的酸奶具有较好的抗高血压作用。

实施例9

1.将实施例2中所获得的氨基酸序列为YQKFPQYLQY的ACE抑制肽，按照100毫升杀菌的鲜牛奶添加60毫克的ACE抑制肽（YQKFPQYLQY）的比例混合，进行充分混合，接种0.06%直投乳酸菌活性（50U的汉森公司的YF-L812）,42℃发酵5小时，获得具有抗高血压作用的酸奶。

2.将步骤1所获得酸奶灌胃原发性高血压大鼠（SHR）,检测其对SHR血压的影响。选用12周龄雄性SHR大鼠24只，体质量为(260±15)g，自由采食饮水，保持环境温度(23±1)℃，相对湿度60%±5%，预饲养1周。大鼠随机分为3组，每组8只，分别为空白组、普通发酵酸奶组和抗高血压酸奶组（加入YQKFPQYLQY的发酵乳），分别灌胃生理盐水(10mL/kgm_b)和3.5g/kg m_b的抗高血压酸奶及普通发酵酸奶。检测方法同实施例1。结果见图14。

由图14可知，添加和未添加ACE抑制肽的鲜奶经发酵后所获得酸奶，经灌胃实验，对SHR血压影响具有显著差异（p＜0.05）。添加ACE抑制肽的鲜奶经发酵后所获得酸奶灌胃4小时后达到最佳效果（降压31.37mmHg），说明添加ACE抑制肽的酸奶具有较好的抗高血压作用。

实施例10

1.将实施例2中所获得的氨基酸序列为YS的ACE抑制肽，按照100毫升杀菌的鲜牛奶添加60毫克的ACE抑制肽（YS）的比例混合，进行充分混合，接种0.06%直投乳酸菌活性（50U的汉森公司的YF-L812）,42℃发酵5小时，获得具有抗高血压作用的酸奶。

2.将步骤1所获得酸奶灌胃原发性高血压大鼠（SHR）,检测其对SHR血压的影响。选用12周龄雄性SHR大鼠24只，体质量为(260±15)g，自由采食饮水，保持环境温度(23±1)℃，相对湿度60%±5%，预饲养1周。大鼠随机分为3组，每组8只，分别为空白组、普通发酵酸奶组和抗高血压酸奶组（加入YS的发酵乳），分别灌胃生理盐水(10mL/kgm_b)和3.5g/kg m_b的抗高血压酸奶及普通发酵酸奶。检测方法同实施例1。结果见图15。

由图15可知，添加和未添加ACE抑制肽的鲜奶经发酵后所获得酸奶，经灌胃实验，对SHR血压影响具有显著差异（p＜0.05）。添加ACE抑制肽的鲜奶经发酵后所获得酸奶灌胃4小时后达到最佳效果（降压32.5mmHg），说明添加ACE抑制肽的酸奶具有较好的抗高血压作用。

本发明所得的富含ACE抑制肽的酪蛋白水解物及ACE抑制肽具有显著降低高血压的作用，将所得富含ACE抑制肽的酪蛋白水解物及ACE抑制肽添加到乳制品中具有显著降高血压作用，对正常血压无影响，食用安全，适合高血压人群食用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (12)

1.一种富含ACE抑制肽的酪蛋白水解物，其特征在于，含有两个具有ACE抑制活性的肽片段，两个所述ACE抑制活性的肽片段的氨基酸序列分别为：YS和YQKFPQYLQY。

2.一种ACE抑制肽，其氨基酸序列为：YS。

3.一种ACE抑制肽，其氨基酸序列为：YQKFPQYLQY。

4.一种权利要求1所述的富含ACE抑制肽的酪蛋白水解物的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：

（1）在底物浓度为5-9%的酪蛋白水溶液中，按照酶与底物的比为1:100的比例加入胃蛋白酶，胃蛋白酶的水解条件为：温度为37℃、pH值为2.0-3.0，水解3h后，用沸水浴加热10min结束反应，冷却至室温；

（2）调整步骤（1）所得水解液的pH值至7.7-8.5，再用胰蛋白酶继续水解，胰蛋白酶的水解条件为：温度为45-50℃，pH值为7.7-8.5，胰蛋白酶与底物的比为1:500；水解3h后，水解液以沸水浴煮沸10min灭酶，然后冷却至室温；调节体系的pH值为6.8-7.0；之后，离心，取上清液;

（3）将步骤（2）所得上清液进行超滤处理，截留分子量为6Ku，收集超滤透出物，进行真空干燥，获得水分小于5%的水解超滤物，得到富含ACE抑制肽的酪蛋白水解物，其中含有两个片段具有ACE抑制活性，氨基酸序列分别为YS和YQKFPQYLQY。

5.根据权利要求3所述的富含ACE抑制肽的酪蛋白水解物的制备方法，其特征在于，在胰蛋白酶水解后添加风味蛋白酶脱苦，风味蛋白酶的水解条件为：风味蛋白酶与底物的比为3200U/g，水解温度为45-50℃、pH值为6.8-7.0、水解时间为1.5-2小时。

6.一种权利要求2所述的ACE抑制肽的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：

（1）在底物浓度为5-9%的酪蛋白水溶液中，按照酶与底物的比为1:100的比例加入胃蛋白酶，胃蛋白酶的水解条件为：温度为37℃、pH值为2.0-3.0，水解3h后，用沸水浴加热10min结束反应，冷却至45-50℃；

（2）调整步骤（1）所得水解液的pH值至7.7-8.5，再用胰蛋白酶继续水解，胰蛋白酶的水解条件为：温度为48℃，pH值为7.7-8.5，胰蛋白酶与底物的比为1:500；水解3h后，水解液以沸水浴煮沸10min灭酶，然后冷却至室温；调节体系的pH值回至7.0；之后，离心，取上清液;

（3）将步骤（2）所得上清液进行超滤处理，截留分子量为6Ku，收集超滤透出物;

（4）超滤透出物通过Sephadex G-15进行分离，获得三个组分，分别检测三个组分的ACE抑制活性；

（5）选择步骤（4）中ACE抑制活性高的组分用色谱质谱检测仪器进行氨基酸序列的质谱检测，获得氨基酸序列为YS的片段；采用固相合成技术进行合成，得到具有ACE抑制功能的活性肽。

7.一种权利要求3所述的ACE抑制肽的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：

（1）在底物浓度为5-9%的酪蛋白水溶液中，按照酶与底物的比为1:100的比例加入胃蛋白酶，胃蛋白酶的水解条件为：温度为37℃、pH值为2.0-3.0，水解3h后，用沸水浴加热10min结束反应，冷却至45-50℃；

（2）调整步骤（1）所得水解液的pH值至7.7-8.5，再用胰蛋白酶继续水解，胰蛋白酶的水解条件为：温度为45-50℃，pH值为7.7-8.5，胰蛋白酶与底物的比为1:500；水解3h后，水解液以沸水浴煮沸10min灭酶，然后冷却至室温；调节体系的pH值回至7.0；之后，离心，取上清液;

（3）将步骤（2）所得上清液进行超滤处理，截留分子量为6Ku，收集超滤透出物;

（4）超滤透出物通过Sephadex G-15进行分离，获得三个组分，分别检测三个组分的ACE抑制活性；

（5）选择步骤（4）中ACE抑制活性高的组分用色谱质谱检测仪器进行氨基酸序列的质谱检测，获得氨基酸序列为YQKFPQYLQY的片段；采用固相合成技术进行合成，得到具有ACE抑制功能的活性肽。

8.一种富含ACE抑制肽的抗高血压的奶粉，其特征在于，奶粉基质中添加权利要求4所得的酪蛋白水解物，或奶粉基质中添加权利要求6所获得的氨基酸序列为YS的ACE抑制肽和/或权利要求7所得的氨基酸序列为YQKFPQYLQY的ACE抑制肽。

9.根据权利要求8所述的富含ACE抑制肽的抗高血压的奶粉，其特征在于，100克奶粉基质中添加12.6克权利要求4所得的酪蛋白水解物，或100克奶粉基质中添加0.6克权利要求6所获得的氨基酸序列为YS的ACE抑制肽和/或权利要求7所得的氨基酸序列为YQKFPQYLQY的ACE抑制肽。

10.一种富含ACE抑制肽的抗高血压的酸奶，其特征在于，鲜奶中添加权利要求4所得的酪蛋白水解物，或鲜奶中添加权利要求6所获得的氨基酸序列为YS的ACE抑制肽和/或权利要求7所得的氨基酸序列为YQKFPQYLQY的ACE抑制肽。

11.根据权利要求10所述的富含ACE抑制肽的抗高血压的酸奶，其特征在于，每100毫升鲜奶中添加1.26克权利要求4所得的酪蛋白水解物，或100毫升鲜奶中添加60毫克权利要求6所获得的氨基酸序列为YS的ACE抑制肽和/或权利要求7所得的氨基酸序列为YQKFPQYLQY的ACE抑制肽。

12.一种权利要求10所述的抗高血压的酸奶的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：

（1）在经过杀菌的鲜牛奶中，添加权利要求4中所制备的富含ACE抑制肽的酪蛋白水解物，充分混合均匀；或者在经过杀菌的鲜牛奶中，添加权利要求6所获得的氨基酸序列为YS的ACE抑制肽和/或权利要求7所得的氨基酸序列为YQKFPQYLQY的ACE抑制肽，充分混合均匀；

（2）接种0.06%直投乳酸菌,42℃发酵5小时，获得具有抗高血压作用的酸奶。

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