CN104945469B - Ace抑制三肽 - Google Patents

Abstract

ACE抑制三肽，氨基酸序列为Gly‑Ala‑Asp(GAD)。该短肽有明显的降血压效果。并且该活性三肽由食品来源，同时具有高安全性、廉价、可产业化的突出优点。该活性三肽或其衍生物可用于制备高血压治疗/预防药物，或作为功能食品添加剂，供高血压患者长期治疗保健使用。

Description

ACE抑制三肽

技术领域

本发明涉及一种生物来源的血管紧张素转换酶(ACE)抑制肽及其类似物。

背景技术

高血压是最常见的心血管疾病之一，它能造成大脑、心血管、肾脏的损害，是引起脑卒中、心力衰竭和冠心病等的重要因素，严重威胁着人类的健康。因此，治疗和预防高血压对提高人类的健康水准，延长寿命有着重要的意义。血管紧张素转换酶在人体肾素-血管紧张素系统和激肽释放酶-激肽系统中，对血压调节起着重要的作用。ACE可以将血管紧张素I转换为血管紧张素Ⅱ，使周围小动脉、血管平滑肌收缩，同时刺激醛固酮分泌，促进人体肾脏对Na⁺、K⁺的重吸收，引起钠储量和血容量的增加，使血压升高；还可以使舒缓激肽失活，引起血压升高。综上所述，ACE一方面产生使血压上升的血管紧缩素II，另一方面，使具有血管舒张作用的舒缓激肽失活，这都造成了血压的上升。所以，如果抑制了ACE的活性，就可以起到降压的作用。

现有的作为治疗高血压的合成物卡普托利就是ACE的抑制剂，但它有很多副作用，所以源于食品蛋白中的ACE抑制肽S因其无毒副作用，同时具有其它疗效而被广泛应用，市场前景极好。

发明内容

本发明提供一种分离自水溶性鱼鳞胶原蛋白酶解液的活性短肽，该短肽具有血管紧张素转换酶(ACE)抑制活性。

本发明所述的ACE抑制三肽，氨基酸序列为Gly-Ala-Asp(GAD)。

上述本发明的ACE抑制三肽应当包括由氨基酸璇光度不同而定义为L型氨基酸或D型氨基酸的不同构型的三肽。

优选地，本发明所述的ACE抑制三肽源自鱼鳞胶原蛋白。

另一方面，本发明的目的还在于提供上述本发明所述的ACE抑制三肽的制备方法，包括原料预处理、水溶性胶原蛋白提取及酶解，以及活性三肽分离的步骤，其中所述的活性三肽分离包括超滤、凝胶过滤及C₁₈高效液相色谱分离的步骤，分离过程中跟踪检测分离组分的ACE抑制活性，收集具有ACE活性的组分进行下一步分离。

作为具体的实施方式之一，上述本发明的ACE抑制三肽的制备方法中所述及的活性三肽分离包括如下步骤：

(1)酶解产物超滤后，取分子量小于3000道尔顿的组分，采用Sephadex LH-20，流动相为30％的甲醇溶液，温度为室温，检测波长为280nm；

跟踪检测分离组分的ACE抑制活性，按时间收集具有ACE抑制活性的组分V；

(2)步骤(1)所得的组分Ⅴ经PR-HPLC纯化，条件包括：

Hypersil C₁₈柱；检测波长215nm，室温，进样体积20μl；

梯度洗脱：0～60min：流动相A，100～50％线性降低；

流动相B，0～50％线性升高；

60～80min：流动相A，0％；流动相B，100％；

其中，流动相A为：按照体积百分比，含0.1％TFA水溶液，用前超声脱气；

流动相B为：按照体积百分比，含0.1％TFA的乙腈，用前超声脱气。

进一步的具体实施方式之一，上述本发明的ACE抑制三肽的制备方法中所述的原料预处理包括如下步骤：将干鱼鳞置于10～20倍重量的清水中浸泡2～4小时，滤网脱除游离水分后，再用10～12倍重量的质量浓度为0.1～1.0％盐酸浸泡1～6小时，然后以质量浓度为0.1～0.5％氢氧化钠溶液中和至中性，水洗脱除盐分，滤网沥干，作为水溶性胶原蛋白提取用原料鱼鳞。

具体实施方式中，上述本发明的ACE抑制三肽的制备方法中所述的水溶性胶原蛋白提取及酶解是将经预处理的原料鱼鳞与去离子水按照质量比1:2～10装入蒸煮釜，60～120℃加热2～8小时，收集溶液部分为水溶性胶原蛋白；然后以胃蛋白酶酶解24小时。

结合上述对ACE抑制三肽的制备方法的描述，本发明的目的也在于保护通过上述任意一种关于制备方法的技术方案所制得的ACE抑制三肽，抑或含所述制备方法所制得的组合物。

再一方面，本发明的目的还在于提供一种预防和/或治疗高血压组合物，所述组合物含有本发明所述的ACE抑制三肽。所述的组合物包括药物或者食品组合物。

基于上文对本发明的充分理解，申请人相信，本领域技术人员应当容易理解，本发明所述的肽及通过通用方法所获得的其它相关衍生产品，都应当属于本发明保护所延及的范畴。上述通用方法举例但不限于与酸反应产生盐类，或者与金属/阳离子形成的盐类。所述的酸包括但不限于盐酸，硫酸，硝酸，磷酸等无机酸；蚁酸，乙酸，丙酸，甘氨胆酸，苹果酸，柠檬酸，酒石酸，琥珀酸等有机酸。所述的与金属/阳离子形成的盐类包括但不限于钠盐，钾盐，钙盐，铵盐，或者与氨基乙醇，三乙氨，二环乙氨等形成的胺类盐等。

另一方面，对本发明中所述及药物的理解，申请人相信，结合本领域现有技术，所述“药物”可以毫无疑义地理解为各种药物制剂，包括但不限于加入各种医药辅料所制得的散剂、颗粒剂、片剂、胶囊、栓剂、悬浮液、乳化液、喷剂、注射液或粉针剂等。根据不同剂型特点，在使用这些药物进行治疗时，可以通过各种相应的途径给药，典型但不限于可经口服给药、注射给药及粘膜给药。

再一方面，对本发明中所述及的食品组合物的理解，即通常意义的食品或保健品，形态可以是清凉饮料，乳酸饮料，调味品，汤类，奶酪，火腿，点心等。

本发明相关的ACE抑制三肽或其相关制品，使用量是没有特别的限制，具体的要根据高血压的程度，患者的年龄，体重，身体状况和给与的方法等因素，适当地确定。该三肽有明显的降血压效果。并且该活性三肽由食品来源，同时具有高安全性、廉价、可产业化的突出优点。该活性三肽或其衍生物可用于制备高血压治疗/预防药物，或作为功能食品添加剂，供高血压患者长期治疗保健使用。

附图说明

本发明附图2幅，其中：

图1是Sephadex LH-20对酶解产物的分离图谱；

图2是组分Ⅴ的PR-HPLC分离图谱。

具体实施方式

下面以具体实施例的方式对本发明作进一步的阐述。无特殊说明，本发明参考102516358B的方法跟踪检测分离组分的ACE抑制活性。

1.水溶性胶原蛋白的制备

将干鱼鳞置于16倍重量的清水中浸泡4小时，滤网脱除游离水分后，再用10倍重量的0.5％盐酸浸泡5小时，然后再以0.5％氢氧化钠溶液中和至中性，水洗脱除盐分，滤网沥干，作为水溶性胶原蛋白提取用原料鱼鳞。

将原料鱼鳞装入蒸煮釜，加入8倍重量的去离子水，100℃加热6～8小时，收集溶液部分为水溶性胶原蛋白。

2.鱼鳞胶原蛋白ACE抑制三肽的制备

步骤1中制备的水溶性胶原蛋白经胃蛋白酶酶解24小时后，酶解产物经超滤，取分子量小于3000道尔顿的组分，采用Sephadex LH-20，流动相为30％的甲醇溶液，柱温为室温，检测波长为280nm，跟踪检测分离组分的ACE抑制活性，按照时间依次收集目标组分。

经Sephadex LH-20分离后得到的具有ACE抑制活性的组分Ⅴ(图1)。

3.ACE抑制三肽的分离

步骤2中经Sephadex LH-20分离所得活性组分Ⅴ用PR-HPLC进一步纯化，分离结果如图2所示，收集具有ACE抑制活性的组分A，冷冻干燥得产物T-2。

PR-HPLC条件包括：

Hypersil C₁₈柱；检测波长215nm，室温，进样体积20μl；

梯度洗脱：0～60min：流动相A，100～50％线性降低；

流动相B，0～50％线性升高；

60～80min：流动相A，0％；流动相B，100％；

其中，流动相A为：按照体积百分比，含0.1％TFA水溶液，用前超声脱气；

流动相B为：按照体积百分比，含0.1％TFA的乙腈，用前超声脱气。

产物T-2经过蛋白质序列分析仪分析，序列为Gly-Ala-Asp(GAD)。

并测得产物T-2对ACE的半抑制浓度IC₅₀为0.056mol/L。

实施例2.静脉注射动物实验

选择20只自发性高血压大白鼠为实验模型，大白鼠饲养一周后，将其分成2组，每一组10只，每日按大白鼠体重20mg/kg剂量(中剂量组)静脉注射产物T-2。

结果表明，1周后对照组大白鼠的血压持续升高，而治疗组自发性高血压大白鼠的血压明显下降，高血压大白鼠的平均收缩压从190mmHg下降到160mmHg说明产物T-2经静脉给药具有明显的降血压效果。

实施例3.灌胃动物实验

选择20只自发性高血压大白鼠为实验模型，大白鼠饲养一周后，将其分成3组，每一组10只，每日按大白鼠体重20mg/kg剂量(中剂量治疗组)灌胃产物T-2，另一组阳性药物卡普托力(Captopril)对照组，每日按大白鼠体重20mg/kg剂量灌胃。

4周后对照组大白鼠的血压持续升高，而治疗组自发性高血压大白鼠的血压明显下降，高血压大白鼠的平均收缩压从180mmHg下降到155mmHg说明产物T-2经口服给药具有明显的降血压效果，并且与阳性药物降血压效果及趋势基本一致。

Claims (1)

1.预防和/或治疗高血压组合物，含有氨基酸序列为Gly-Ala-Asp的ACE抑制三肽。