CN104974225B - 松茸多肽、松茸提取物以及它们的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种松茸多肽、松茸提取物以及它们的应用。本发明提供的多肽，来源于松茸，将其命名为松茸多肽，如序列表的序列1所示。含有所述松茸多肽的松茸提取物也属于本发明的保护范围。所述松茸提取物，其制备方法可包括如下步骤：(1)将松茸子实体加入水中，匀浆后提取；(2)完成步骤(1)后，离心并收集上清液。本发明提供的多肽是食品来源，不仅丰富了降血压药物筛选库，更为松茸的进一步开发提供理论依据。本发明对于高血压的治疗具有重大的应用价值。

Description

松茸多肽、松茸提取物以及它们的应用

技术领域

本发明涉及一种松茸多肽、含有该松茸多肽的松茸提取物以及它们的应用。

背景技术

国际卫生组织(WHO)2014年更新的数据显示，心血管疾病引起的死亡人口在全球十大导致死亡疾病中排名第一，引起心血管疾病的一个重要的危险因素是高血压。随着生活水平的提高和人们生活方式的改变，高血压不仅患病率越来越高，而且趋向年轻化，中国心血管疾病报告表明，我国现有高血压超2亿，发病率17％左右(高血压个体化治疗进展——中国卫生年鉴2009)。除高血压疾病本身对人健康的危害之外，高血压并发症引起的健康损坏更严重，其并发症主要有冠心病、视网膜相关疾病、脑卒中和肾病等。高血压大型随机临床试验已充分说明降压可减少心血管并发症和死亡率。

动脉血压由很多代谢途径参与调控，肾素-血管紧张素调节系统(renia-angiotensin system,RAS)和激肽释放酶-激肽系统(kallikrein-kininsystem,KKS)是人体内两种重要的调节系统，RAS与KKS的平衡失调是高血压发病的重要原因之一，其中血管紧张素转化酶(ACE)是系统调节过程中起关键作用的酶，是使血压升高的主要因素。血管紧张素转换酶是一种含锌二肽-羧肽酶，相对分子质量为12-15kDa。在RAS中，ACE通过催化血管紧张素-I转换为血管紧张素-II。血管紧张素-II是RAS中所知道的活性最强的血管收缩剂，使血管平滑肌收缩从而引起升压效应。此外，血管紧张素-II还能刺激醛固酮的分泌和直接对肠胃作用，引起钠贮量和血容量的增加，也能使血压升高。KKS中，缓激肽是一种降压物质，ACE从缓激肽的C末端脱去2个氨基酸残基而使其失活，引起血压升高。因此，抑制ACE的活性，是有效预防和治疗高血压的一种手段。从1981年第一个口服有效的人工合成ACE抑制剂卡托普利(Captorip)批准使用以来，现在应用于临床上的ACE抑制剂已经非常普遍，但是人工合成的ACE抑制剂在临床应用过程中往往会产生副作用，如咳嗽、味觉功能紊乱、皮疹等。食物来源的ACE抑制肽因其独特的安全性高，无副作用的优点引起了人们的极大关注。

松茸(Tricholomama tsutake)又名松口蘑、松蕈、合菌、台菌，隶属担子菌门，口蘑科，是松栎等树木外生的菌根真菌，具有独特的浓郁香味，是世界上珍稀名贵的天然食药用菌，被誉为“菌中之王”，在宋代《经史证类务急本草》中有过记载。新鲜松茸子实体粗壮，形若伞状，色泽鲜明，菌盖呈球形，展开为扁半球形，直径为5-20cm,具有纤维状茸毛鳞片，表面干燥，边缘内卷；菌柄较粗壮，呈圆柱形，长6-14cm，菌环以上为乳白色，菌环以下为土黄色至栗褐色；菌肉白嫩肥厚，质地细密，菌褶白色至淡褐色。

发明内容

本发明的目的是提供松茸多肽、松茸提取物以及它们的应用。

本发明提供的多肽，来源于松茸，将其命名为松茸多肽，如序列表的序列1所示。

含有所述松茸多肽的松茸提取物也属于本发明的保护范围。

所述松茸提取物，其制备方法可包括如下步骤：

(1)将松茸子实体加入水中，匀浆后提取；

(2)完成步骤(1)后，离心并收集上清液。

所述方法还包括将步骤(2)得到的上清液进行冷冻干燥的步骤。

所述步骤(1)中，松茸子实体与水的配比可为：2质量份松茸子实体：1质量份水。

所述步骤(1)中，所述水具体可为蒸馏水。

所述步骤(1)中，所述提取具体可为4℃静置12小时。

所述步骤(2)中，所述离心的参数具体可为：8000g离心15分钟。

本发明还保护一种松茸提取物的制备方法，包括如下步骤：

(1)将松茸子实体加入水中，匀浆后提取；

(2)完成步骤(1)后，离心并收集上清液。

所述方法还包括将步骤(2)得到的上清液进行冷冻干燥的步骤。

所述步骤(1)中，松茸子实体与水的配比可为：2质量份松茸子实体：1质量份水。

所述步骤(1)中，所述水具体可为蒸馏水。

所述步骤(1)中，所述提取具体可为4℃静置12小时。

所述步骤(2)中，所述离心的参数具体可为：8000g离心15分钟。

本发明还保护所述松茸多肽或所述松茸提取物在制备药物中的应用；所述药物的功能为如下(a)和/或(b)和/或(c)：(a)降血压；(b)治疗高血压；(c)预防高血压。所述(a)中，所述血压具体可为收缩压。

本发明还保护一种药物，其活性成分为所述松茸多肽或所述松茸提取物；所述药物的功能为如下(a)和/或(b)和/或(c)：(a)降血压；(b)治疗高血压；(c)预防高血压。所述(a)中，所述血压具体可为收缩压。

本发明提供的多肽是食品来源，不仅丰富了降血压药物筛选库，更为松茸的进一步开发提供理论依据。本发明对于高血压的治疗具有重大的应用价值。

附图说明

图1为实施例1分组给药后原发性高血压大鼠的收缩压变化；*，与阴性组相比p<0.05；●代表阴性组，▇代表阳性组，▲代表高剂量试验组，□代表低剂量试验组。

图2为实施例3分组给药后原发性高血压大鼠的收缩压变化；*，与阴性组相比p<0.05；●代表阴性组，▇代表阳性组，▲代表高剂量试验组，△代表低剂量试验组。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

松茸，又称松口蘑，分布于黑龙江、吉林、安徽、四川、甘肃、山西、贵州、云南、西藏等地。参考文献：中国大型真菌，卯晓岚主编，河南科学技术出版社，2000.10，p130。本实施例中的松茸(Tricholomamatsutake)采集自云南德钦。

原发性高血压大鼠(Spontaneous Hypertensive Rat,SHR)：北京维通利华实验动物技术有限公司。SHR属于自发性高血压大鼠，高血压发生率高，且无明显原发性肾脏或肾上腺损伤，可作为高血压动物模型，用于降压药物的筛选。

大鼠收缩压(SBP)的测定使用BP-100A全自动大小鼠无创血压测量系统(成都泰盟科技有限公司)。

卡托普利：北京曙光药业有限责任公司，产品目录号国药准字H11020833。

HHL(Hip‐His‐Leu)：Sigma Aldrich公司,产品目录号H1635。

实施例1、松茸粗提取物及其降压作用

一、松茸粗提取物的制备

将1质量份蒸馏水与2质量份松茸子实体充分搅碎成匀浆，4℃静置12小时，然后8000g离心15分钟，收集上清液，冻干，即为松茸提取物。

每14.52g松茸子实体可得到400mg松茸粗提取物。

二、松茸提取物对原发性高血压大鼠的降压作用(单剂量短期实验)

1、实验动物

原发性高血压大鼠，雄性，12周龄，体重240-270g。动物实验设施持续保持屏障环境标准。主要环境指标的控制范围：温度25±2℃，相对湿度55±5％，光照明:暗＝12h:12h。动物饲养于标准盒内，大鼠每盒2只。每周2次更换消毒后的垫料和笼具，保持盒内环境清洁和干燥，每日添加饲料和饮水，保持动物自由饮食活动。检疫及驯化过程：新领到的动物检疫期3-6天。在检疫期间所有动物饮水、摄食及健康状况良好。动物反应灵敏、无异常分泌物。提前适应性测定血压，一周4次。

2、分组处理

取实验动物，分成4组，每组4只，分别处理如下：

阴性组：单次灌胃给予生理盐水，每只实验动物给予2毫升；

阳性组：单次灌胃给予卡托普利溶液(将卡托普利溶于生理盐水，得到卡托普利溶液)，每只实验动物给予2毫升，给药剂量为100mg/kg(即每千克动物体重给予100mg卡托普利)；

高剂量试验组：单次灌胃给予松茸粗提取物溶液(将松茸粗提取物溶于生理盐水，得到松茸粗提取物溶液)，每只实验动物给予2毫升，给药剂量为400mg/kg(即每千克动物体重给予400mg松茸粗提取物)；

低剂量试验组：单次灌胃给予松茸粗提取物溶液(将松茸粗提取物溶于生理盐水，得到松茸粗提取物溶液)，每只实验动物给予2毫升，给药剂量为200mg/kg(即每千克动物体重给予200mg松茸粗提取物)。

3、收缩压检测

分别于给药0h、给药0.5h、给药2h、给药4h、给药6h和给药8h之后测定大鼠的收缩压。处理数据组间比较采用t检验。

结果见图1。给药0.5h后，阳性组和高剂量试验组大鼠的血压都有所下降。给药2h后，阳性组和高剂量试验组大鼠的血压下降到了最低值，分别下降了约38mmHg和36mmHg，并且可以在此最低血压处维持2个小时。给药4h后，阳性组和高剂量试验组大鼠的血压都开始回升。低剂量试验组大鼠的血压水平与阴性组大鼠相比处于同等水平，没有显著性差异。整个实验过程中，大鼠没有出现过敏和咳嗽等不良反应。这为松茸作为功能性食品的进一步开发提供了一定的理论依据。

实施例2、松茸多肽的发现

一、ACE抑制活性的测定方法

1、制备ACE溶液

取5g剔除结缔组织的新鲜兔肺，用预冷的生理盐水洗干净，切成小块，置于45mL预冷的含0.25mM蔗糖、0.1mM PMSF的硼酸钠缓冲液(pH8.3、0.1M)中匀浆，匀浆液置于硼酸钠缓冲液(pH8.3、0.1M)中4℃透析12小时，然后4℃、9000g离心40分钟，收集上清液，将上清液4℃、9000g离心40分钟，收集上清液(该上清液即为ACE溶液)，-20℃备用。

2、ACE抑制活性的测定方法(ACE与HHL反应生成马尿酸，借助马尿酸的生成量估测ACE抑制活性)

1、将20μL步骤1制备的ACE溶液和20μL待测溶液混合，37℃预热5分钟，然后向反应体系中加入500μL的HHL溶液(HHL溶液的制备方法：向含0.3M NaCl的pH8.3、0.1M硼酸钠缓冲液中加入HHL并使其浓度为5mM)以启动反应，37℃静置反应30分钟后向反应体系中加入500μL 1M HCl水溶液以终止反应。

2、完成步骤1后，用1.2mL预冷的乙酸乙酯萃取反应体系中的马尿酸，然后取0.8mL乙酸乙酯相在95℃加热35分钟使乙酸乙酯完全挥发，然后用0.8mL蒸馏水溶解残留物，然后在228nm处测定光吸收值。

A：对照组(ACE+蒸馏水)：用等体积蒸馏水代替待测溶液进行上述步骤得到的光吸收值；

B:空白组(蒸馏水+蒸馏水)：用等体积蒸馏水代替ACE溶液，同时用等体积蒸馏水代替待测溶液进行上述步骤得到的光吸收值；

C:实验组(ACE+待测溶液)：待测溶液进行上述步骤得到的光吸收值；

D:实验空白组(蒸馏水+待测溶液)：用等体积蒸馏水代替ACE溶液进行上述步骤得到的光吸收值。

二、松茸多肽的发现

1、取实施例1的步骤一得到的松茸粗提取物，用生理盐水溶解，然后经过分子量大小为5kDa的超滤膜，收集滤出液。

2、取步骤1得到的滤出液，依次进行Q Fast Flow阴离子交换柱层析、Mono-Q阴离子交换柱层析和FPLC凝胶过滤层析。

Q Fast Flow阴离子交换柱层析的参数：层析柱规格为2.5×20cm；先用500mlpH8.8、10mM的Tris-HCl缓冲液洗脱以去除未吸附组分，然后用含NaCl的pH8.8、10mM的Tris-HCl缓冲液进行洗脱(在240min内，NaCl在Tris-HCl缓冲液中的浓度由0线性上升至1M，流速为2.5mL/min),收集用含NaCl的Tris-HCl缓冲液进行洗脱时保留体积为140-220mL的过柱后溶液。

Mono-Q阴离子交换柱层析的参数：层析柱规格为4.6×100mm；先用20mL pH8.0、10mM的Tris-HCl缓冲液洗脱以去除未吸附组分，然后用含NaCl的pH8.0、10mM的Tris-HCl缓冲液进行洗脱(在30min内，NaCl在Tris-HCl缓冲液中的浓度由0线性上升至1M，流速为1mL/min),收集用含NaCl的Tris-HCl缓冲液进行洗脱时保留体积为36-40mL的过柱后溶液。

FPLC凝胶过滤层析的参数：填充物为Superdex peptide 10/300；层析柱规格为10×300-310mm；用去离子水进行洗脱，流速0.5mL/min,每管收集0.8mL,将第25管和第26管中的液体混合，即为含有目标组分的液体。

将含有目标组分的液体进行冷冻干燥，得到产物。

取产物，测质谱，该产物为序列表的序列1所示的多肽，将其命名为松茸多肽。

松茸多肽的氨基酸序列为(序列表的序列1)：WALKGYK。

三、松茸多肽的性能

取步骤二得到的松茸多肽，用PBS缓冲液(pH7.4，0.01M)溶解，得到待测溶液。按照步骤一的方法检测待测溶液的ACE抑制活性。松茸多肽的IC50值(即ACE抑制率为50％时对应的多肽浓度)为0.34mg/mL。

取步骤二得到的松茸多肽，用PBS缓冲液(pH7.4，0.01M)溶解，然后100℃加热10分钟，得到待测溶液。按照步骤一的方法检测待测溶液的ACE抑制活性。松茸多肽的IC50值(即ACE抑制率为50％时对应的多肽浓度)为0.34mg/mL。

结果表明，松茸多肽对热稳定，热处理不影响其降压活性。

实施例3、松茸多肽对原发性高血压大鼠的降压作用(单剂量短期实验)

人工合成序列表的序列1所示的松茸多肽(上海波泰生物科技有限公司)。

1、实验动物

原发性高血压大鼠，雄性，12周龄，体重240-270g。动物实验设施持续保持屏障环境标准。主要环境指标的控制范围：温度25±2℃，相对湿度55±5％，光照明:暗＝12h:12h。动物饲养于标准盒内，大鼠每盒2只。每周2次更换消毒后的垫料和笼具，保持盒内环境清洁和干燥，每日添加饲料和饮水，保持动物自由饮食活动。检疫及驯化过程：新领到的动物检疫期3-6天。在检疫期间所有动物饮水、摄食及健康状况良好。动物反应灵敏、无异常分泌物。提前适应性测定血压，一周4次。

2、分组处理

取实验动物，分成4组，每组4只，分别处理如下：

阴性组：单次灌胃给予生理盐水，每只实验动物给予2毫升；

阳性组：单次灌胃给予卡托普利溶液(将卡托普利溶于生理盐水，得到卡托普利溶液)，每只实验动物给予2毫升，给药剂量为100mg/kg(即每千克动物体重给予100mg卡托普利)；

高剂量试验组：单次灌胃给予松茸多肽溶液(将松茸多肽溶于生理盐水，得到松茸多肽溶液)，每只实验动物给予2毫升，给药剂量为50mg/kg(即每千克动物体重给予50mg松茸多肽)；

低剂量试验组：单次灌胃给予松茸多肽溶液(将松茸多肽溶于生理盐水，得到松茸多肽溶液)，每只实验动物给予2毫升，给药剂量为25mg/kg(即每千克动物体重给予25mg松茸多肽)。

3、收缩压检测

分别于给药0h、给药0.5h、给药2h、给药4h、给药6h和给药8h之后测定大鼠的收缩压。处理数据组间比较采用t检验。

结果见图2。给药0.5h后，阳性组、高剂量试验组和低剂量试验组大鼠的血压都有所下降。给药2h后，阳性组、高剂量试验组和低剂量试验组大鼠的血压均下降到了最低值，分别下降了38mmHg、36mmHg和18mmHg。给药2h后，阳性组、高剂量试验组和低剂量试验组大鼠的血压都开始回升。给药8h后，低剂量试验组大鼠的血压水平与阴性组大鼠相比处于同等水平，而阳性组和高剂量试验组大鼠的血压仍然保持在较低的水平。整个实验过程中，大鼠没有出现过敏和咳嗽等不良反应。

Claims (3)

1.序列表的序列1所示的多肽。

2.权利要求1所述多肽在制备药物中的应用；所述药物的功能为如下(a)和/或(b)和/或(c)：(a)降血压；(b)治疗高血压；(c)预防高血压。

3.一种药物，其活性成分为权利要求1所述多肽；所述药物的功能为如下(a)和/或(b)和/或(c)：(a)降血压；(b)治疗高血压；(c)预防高血压。