CN104906164B - 黄刺果实多糖降血糖的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了黄刺果实多糖在制备降血糖的药物、保健品或食品中的用途。本发明研究发现，黄刺果实多糖具有良好的降血糖功能，可升高胰岛素量，对相应的ROS代谢相关酶活性即：超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性有一定程度的调节作用。同时，本发明还发现，黄刺果实高剂量组的效果与格列本脲的效果相当，而格列本脲虽为治疗糖尿病的一线化学药物，长期大量地服用格列本脲，最终会造成病人的低血糖和肾病，甚至导致死亡，反之，黄刺果实本为可食用浆果，安全性良好，更适合作为治疗和预防糖尿病的食品、保健品或药物。

Description

黄刺果实多糖降血糖的用途

技术领域

本发明属于保健品领域，具体涉及黄刺果实多糖在制备降血糖药物中的用途。

技术背景

据统计，目前我国糖尿病的患病人数已经达到了9240万，居全球之首(Yang W，etal.N Engl J Med，2010，362(12)：1090-1101)。中国糖尿病治疗费用每年高达1734亿元，糖尿病所致的直接医疗开支已经占到中国医疗总开支的13％(Alcorn T，et al.Lancet，2012，379(9833)：2227-2228)。由此可见，糖尿病不仅严重危害人民的健康，而且为国家带来沉重的经济负担。因而，防治糖尿病刻不容缓。

黄刺，小檗科植物直穗小檗Berberis dasystachya Maxim.，是与白刺、沙棘(黑刺)一样为蒙、藏、维吾尔等少数民族药用与食用的传统野生浆果，统称为“青海三刺”。《青海常用中草药手册》中对黄刺皮(即根皮)有详细记载：黄刺皮即为双子叶植物药小檗科植物直穗小檗的茎皮。其果实医药功能也做了简要的记述，其具有治疗腹痛，消化不良，腹胀，痢疾等功能。

目前还未见对黄刺果实多糖降血糖的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供黄刺果实多糖的新用途。

具体地，本发明提供了黄刺果实多糖在制备降血糖的药物、保健品或食品中的用途。

进一步地，所述药物、保健品或食品是预防或治疗I型、II型糖尿病或/和糖尿病并发症的药物、保健品或食品。

更进一步地，所述药物、保健品或食品是提高胰岛素水平的药物、保健品或食品。

更进一步地，所述药物、保健品或食品是提高氧化酶为超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT、谷胱甘肽过氧化物酶GSHPx活性，降低丙二醛MDA浓度的药物、保健品或食品。

进一步地，所述药物、保健品或食品是预防或治疗糖尿病并发症的药物、保健品或食品。

其中，所述药物、保健品或食品为口服剂型；进一步地，所述口服剂型选自片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、散剂、浸膏剂或口服液。

其中，本发明所述的黄刺果实多糖为小檗科植物直穗小檗Berberis dasystachyaMaxim.果实的提取物，提取物中多糖为主要成分。本发明具体实施方式中测定表明，提取物中多糖含量为93±2％w/w，该多糖纯度较高，用此纯度下的多糖进行生物活性实验，其结果能够真实的反映出黄刺果实多糖的生物活性，有效地避免了其他成分对多糖活性测定的干扰。在已知多糖生物活性的基础上，即便是降低多糖在提取物中的含量，只要适当调节提取物用量，使得多糖达到相应的起效浓度，同样能够发挥出相同或相似的生物活性。因此，本发明限定，提取物中多糖含量应为60～95％w/w。

进一步地，提取物中多糖含量为80～95％w/w，更进一步为90～95％w/w。

进一步地，所述黄刺果实多糖采用水提醇沉法制备得到。

进一步地，醇沉步骤中，乙醇终浓度达到60～85％v/v即可，更进一步为70～80％v/v，优选为75±2％v/v。

更进一步地，所述水提醇沉法具体操作如下：将黄刺果实脱脂、去单糖后，加水提取，水提液脱色、除蛋白、透析除小分子后，加入乙醇，静置，待沉淀完全，取沉淀，干燥，即得到黄刺果实多糖。

即，具体操作流程为：

(1)脱脂：将黄刺果实粉碎后，过筛，采用石油醚或乙醚为提取溶剂，提取后的残渣过滤，挥干溶剂，得已脱脂黄刺果实残渣；

(2)去单糖：所得已脱脂黄刺果实残渣，以乙醇(70～85％v/v)提取，提取后的残渣挥干溶剂，即得已除单糖黄刺果实残渣；

(3)粗多糖提取：所得已除单糖黄刺果实残渣，加水提取，提取液浓缩后，即得到粗多糖提取液；

(4)粗多糖纯化：粗多糖提取液脱色、除蛋白后，通过透析法，去除分子量在3500Da以下的小分子物质，再加入乙醇溶液(使其终浓度达到60～85％)，静置，待沉淀完毕，取沉淀，干燥，即得到黄刺果实多糖。

进一步地，去单糖时，所用乙醇浓度为80％v/v。

更进一步地，透析除小分子后加入乙醇至含醇量至70～80％v/v，优选为75±2％v/v。

经过上述纯化步骤，可以有效提高黄刺果实多糖的纯度。当然，若是仅仅需要制备纯度较低的黄刺果实多糖，亦可以省略除醇沉外的其他纯化步骤中的一项或多项。

另外，对于多糖的脱色处理，常常采用离子交换法(如DEAE-纤维素)、氧化法(如H₂O₂)、吸附法(如活性炭)等，在实际使用过程中可以根据自身需求，结合后期多糖的收率和纯度来选定适合的脱色方法，本发明一个具体实施方式中选用H₂O₂脱色，但这并不限于本发明仅仅只能使用此种脱色方式。

对于除蛋白而言，常用方法有三氯乙酸法、盐酸法、Sevage法(亦有记载为Sevag法)等，在实际使用过程中可以根据自身需求，结合后期多糖的收率和纯度来选定适合的除蛋白方法，本发明一个具体实施方式中选用Sevage法，但这并不限于本发明仅仅只能使用此种除蛋白方式。

其中，所述黄刺为小檗科植物直穗小檗Berberis dasystachya Maxim.。

本发明研究发现，黄刺果实多糖具有良好的降血糖功能，可升高胰岛素量，对相应的ROS代谢相关酶活性即：超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性有一定程度的调节作用。

同时，本发明还发现，黄刺果实高剂量组的效果与格列本脲的效果相当，而格列本脲虽为治疗糖尿病的一线化学药物，长期大量地服用格列本脲，最终会造成病人的低血糖和肾病，甚至导致死亡，反之，黄刺果实本为可食用浆果，安全性良好，更适合作为治疗和预防糖尿病的食品、保健品或药物。

附图说明：

图1黄刺果实多糖对STZ诱导的糖尿病大鼠的体重的影响

具体实施方式

本发明具体实施方式中使用的黄刺果实多糖采用常规的多糖提取、纯化方式制备得到，在本发明中具体操作如下：

实施例1：黄刺果实多糖的制备

1)黄刺果实脱脂：取成熟的黄刺(即直穗小檗)的果实400g烘干，粉碎后过筛；取黄刺果实与石油醚混合，混合后超声提取，离心除去提取液，残渣过滤，挥干石油醚，得已除脂黄刺果实残渣；

2)黄刺果实除单糖：已除脂黄刺果实残渣与乙醇混合，所述乙醇浓度为70～85％v/v，回流提取，离心除去提取液，残渣过滤后挥干乙醇，得已除单糖黄刺果实残渣；

3)黄刺粗多糖提取：将步骤2)所得已除单糖黄刺果实残渣与纯水混合，微波辅助提取，离心得到提取液，残渣过滤后弃去；提取液浓缩得到粗多糖提取液；

4)黄刺粗多糖的纯化：粗多糖提取液中依次采用H₂O₂，进行脱色、Savege法除去蛋白质，再透析除去3500Da以下小分子物质，得到纯化的多糖水提液；

5)黄刺果实多糖的制备：将步骤4)所得的已纯化的多糖水提液浓缩液加入乙醇溶液，使乙醇终浓度达到75％v/v，所得沉淀干燥后，即得到黄刺果实多糖BDP共计2.06g。

实施例2：黄刺果实多糖的制备

1)黄刺果实脱脂：取成熟的黄刺(即直穗小檗)的果实400g烘干，粉碎后过筛；取黄刺果实与石油醚混合，回流提取，离心除去提取液，残渣过滤，挥干石油醚，得已除脂黄刺果实残渣；

2)黄刺果实除单糖：已除脂黄刺果实残渣与乙醇混合，所述乙醇浓度为70～85％v/v，超声提取，离心除去提取液，残渣过滤后挥干乙醇，得已除单糖黄刺果实残渣；

3)黄刺粗多糖提取：将步骤2)所得已除单糖黄刺果实残渣与纯水混合，温浸提取，离心得到提取液，残渣过滤后弃去；提取液浓缩得到粗多糖提取液；

4)黄刺粗多糖的纯化：粗多糖提取液中依次采用H₂O₂，进行脱色、Savege法除去蛋白质，再透析除去3500Da以下小分子物质，得到纯化的多糖水提液；

5)黄刺果实多糖的制备：将步骤4)所得的已纯化的多糖水提液浓缩液加入乙醇溶液，使乙醇终浓度达到80％v/v，所得沉淀干燥，即得到黄刺果实多糖BDP共计1.355g。

实施例3：黄刺果实多糖的制备

1)黄刺果实脱脂：取成熟的黄刺(即直穗小檗)的果实400g烘干，粉碎后过筛；取黄刺果实与石油醚混合，超声后再回流提取，离心除去提取液，残渣过滤，挥干石油醚，得已除脂黄刺果实残渣；

2)黄刺果实除单糖：已除脂黄刺果实残渣与乙醇混合，所述乙醇浓度为70～85％v/v，超声提取，离心除去提取液，残渣过滤后挥干乙醇，得已除单糖黄刺果实残渣；

3)黄刺粗多糖提取：将步骤2)所得已除单糖黄刺果实残渣与纯水混合，回流提取，离心得到提取液，残渣过滤后弃去；提取液浓缩得到粗多糖提取液；

4)黄刺粗多糖的纯化：粗多糖提取液中依次采用H₂O₂，进行脱色、Savege法除去蛋白质，再透析除去3500Da以下小分子物质，得到纯化的多糖水提液；

5)黄刺果实多糖的制备：将步骤4)所得的已纯化的多糖水提液浓缩液加入乙醇溶液，使乙醇终浓度达到70％v/v，所得沉淀用20mL无水乙醇洗涤3次，其洗涤后的沉淀物进行喷雾干燥，使得物料水分含量降至10％以下，得到黄刺果实多糖BDP共计1.67g。

对本发明方法制备的黄刺果实多糖进行蒽酮-硫酸法测定，其中多糖含量为93％±2w/w。

实施例4黄刺果实多糖降血糖作用实验

1)实验药物：黄刺果实多糖，为本发明制备所得。给药量按大鼠体重计，灌胃低剂量、中剂量、高剂量分别为75mg/kg，150mg/kg，300mg/kg(以制备所得多糖质量计)

2)动物：四周龄昆明大鼠，雄性，普通级，135g，由甘肃中医学院提供。于实验室内安置于鼠笼中饲养一周后进行实验(每笼8只，温度22±1℃，湿度42％±2％)。分为六组：分别为空白组(静脉注射柠檬酸缓冲液未造模，超纯水灌胃)，模型组(尾静脉注射STZ造模，超纯水灌胃)，阳性药组(尾静脉注射STZ造模，格列本脲20mg/kg灌胃)，黄刺果实多糖低剂量组BDP-L(尾静脉注射STZ造模，黄刺果实多糖灌胃75mg/kg)，黄刺果实多糖中剂量组BDP-M(尾静脉注射STZ造模，黄刺果实多糖灌胃150mg/kg)，黄刺果实多糖高剂量组BDP-H(尾静脉注射STZ造模，黄刺果实多糖灌胃300mg/kg)。造模方法：提前禁食16h，而后对其进行STZ(柠檬酸缓冲液配制)尾静脉注射60mg/kg，注射后，72小时测其血糖，检验模型成功与否。

3)实验试剂：95％医用酒精，南京宁氏化学试剂有限公司；生理盐水，山东齐都药业有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)/谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)，丙二醛(MDA)南京建成生物科技有限公司。

4)实验仪器：Bio-Rad680型酶标仪，美国伯乐公司；DS-1型组织匀浆仪，上海正慧工贸有限公司；TGL-16G-A型管式离心机，上海安亭科学仪器厂；UV-722N可见紫外分光光度计，上海尼柯有限公司；HD型恒温水浴锅，辽阳市恒温仪器厂。

5)实验过程：取健康SD大鼠48只，按体重随机分为6组，分为空白组、模型组、阳性药组和低，中，高剂量组。空白组和模型组每天灌胃给予蒸馏水；阳性药组每天灌胃给予格列本脲1次；给受试药物组每天灌胃给予黄刺果实多糖1次，六组均连续给予28d，其中每组保持每隔7天测一次血糖，并记录；末次给予受试物后，麻醉后，经颈动脉取血，所取得血离心取上清，用于检测末次血糖和胰岛素。至其死亡后，取大鼠肝脏组织，用生理盐水洗去表面血污，用滤纸吸干，组织匀浆仪进行匀浆，收集匀浆液到离心管中，以3000rpm离心10min，吸取上清液，进行氧化酶和丙二醛活性测定(结果见表1和表2)。

6)黄刺果实多糖降低患糖尿病大鼠体内的血糖、体重、胰岛素的测定及结果

表1黄刺果实多糖对STZ诱导的大鼠血糖的影响(Mean±SD)

注：与正常组比较^ap＜0.05；与成模组比较^bp＜0.05；

表2黄刺果粉对STZ诱导的大鼠胰岛素的影响(Mean±SD)

注：与正常组比较^ap＜0.05；与成模组比较^bp＜0.05；

体重测定数据见图1。

由表1、2和图1可知，本发明黄刺果实多糖各剂量组对STZ诱导的糖尿病大鼠的血糖具有降低作用，对胰岛素、体重具调节上升作用，且呈剂量效应关系，高剂量组与模型组有显著性差异(p＜0.05)。同时，实验表明，高剂量组的效果与格列本脲的效果相当，而格列本脲作为化学合成的药品，其对机体有一定的副作用，因此，建议采用天然植物中提取的黄刺果实多糖可做替代药物使用。

7)黄刺果实多糖降低患糖尿病大鼠体内氧化酶及MDA测定及结果

STZ诱导的糖尿病，会使得大鼠胰岛细胞发生核固缩，和玻璃样病变。其脂代谢随之发生紊乱。同时被诱导大鼠体内的自由基迅速增加以作出应激反应，这时大量的自由基将诱导细胞或者组织损伤，随之会出现糖尿病引发的各种并发症。有研究表明，体内常见的氧化酶为超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT、谷胱甘肽过氧化物酶GSHPx，这三种酶的存在可以减少活性氧的量，并且降低由脂代谢紊乱造成的自由基对细胞的损害，且可以减少自由基破坏细胞膜或者其膜内的DNA及蛋白质。因此，选择糖尿病大鼠体内肝脏中这三种酶活性作为其体内抗氧化活性的指标。

机体通过酶系统和非酶系统产生氧自由基，后者能共计生物膜中的多不饱和脂肪酸PUFA，引发脂质过氧化作用，并因此形成脂质过氧化物。组织在发生脂质过氧化的时候，产生了大量的醛类、醇类和烃类物质，醛类以丙二醛(MDA)最具代表性，所以体系中丙二醛的含量高低可间接反映体系中脂质过氧化作用的强弱。MDA的测定常常与SOD的测定相互配合，SOD的活力的高低简介反映了机体清除氧自由基的能力，而MDA的高低又反映了机体细胞收自由基攻击的严重程度。(以酶活力/mg蛋白计)

表3黄刺果实多糖成分对STZ诱导的大鼠SOD，CAT，GSH-PX，MDA影响(Mean±SD)

注：与正常组比较^ap＜0.05；与成模组比较^bp＜0.05；与正常组相比^cp＜0.05.

黄刺果实多糖能够使实验大鼠SOD，CAT，GSH活性增加，进而达到调节机体脂代谢紊乱的作用。而对于给药组MDA与模型组相比，均有不同程度的降低，说明给药组对于脂质过氧化有很好的抑制作用。

实验结论：对STZ诱导的糖尿病大鼠进行灌胃，患糖尿病大鼠的血糖具有降低作用，对胰岛素、体重具调节上升作用，且呈剂量效应关系，高剂量组与模型组有显著性差异(p＜0.05)。对相应的ROS代谢相关酶活性即：超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性有一定程度的调节作用，且上述调节作用与用药浓度呈一定的量效关系。

Claims (16)

1.黄刺果实多糖作为唯一活性成分在制备降血糖的药物中的用途；所述黄刺为小檗科植物直穗小檗Berberis dasystachya Maxim.。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述药物是预防或治疗I型、II型糖尿病或/和糖尿病并发症的药物。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述药物是提高胰岛素水平的药物。

4.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述药物是提高氧化酶为超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性，降低丙二醛浓度的药物。

5.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述药物为口服剂型。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述口服剂型选自片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、散剂、浸膏剂或口服液。

7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：多糖纯度为60-95％w/w。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：多糖纯度为80～95％w/w。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：多糖纯度为90～95％w/w。

10.根据权利要求1、7～9中任意一项所述的用途，其特征在于：所述黄刺果实多糖采用水提醇沉法制备得到。

11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于：所述水提醇沉法具体操作如下：将黄刺果实脱脂、去单糖后，加水提取，水提液脱色、除蛋白、透析除小分子后，加入乙醇至乙醇终浓度达到60～85％v/v，静置，待沉淀完全，取沉淀，干燥，即得到黄刺果实多糖。

12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于：透析除去的小分子分子量在3500Da以下。

13.根据权利要求11所述的用途，其特征在于：脱脂具体操作如下：将黄刺果实粉碎后，过筛，采用石油醚或乙醚为提取溶剂，提取后的残渣过滤，挥干溶剂，得已脱脂黄刺果实残渣；

去单糖的具体操作如下：所得已脱脂黄刺果实残渣，以70～85％v/v乙醇提取，提取后的残渣挥干溶剂，即得已除单糖黄刺果实残渣。

14.根据权利要求13所述的用途，其特征在于：去单糖的具体操作中，乙醇浓度为80％v/v。

15.根据权利要求11所述的用途，其特征在于：透析除小分子后加入乙醇至含醇量至70～80％v/v。

16.根据权利要求15所述的用途，其特征在于：透析除小分子后加入乙醇至含醇量至75±2％v/v。