JPWO2007108554A1 - 血圧上昇抑制作用を有するペプチド - Google Patents
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Abstract
ＡＣＥ（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ Ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ）阻害活性（血圧上昇抑制作用）・血管保全作用を有する、コラーゲン酵素分解物及びペプチドを提供する。本発明は、血圧上昇抑制作用及び／又は血管保全作用を有する鶏又は豚由来コラーゲンのプロテアーゼ分解物であり、特に鶏又は豚由来コラーゲンのプロテアーゼ分解物であって、分子量が３０００以下であるペプチドである。本発明の鶏又は豚由来コラーゲンのプロテアーゼ分解物及びペプチドはＡＣＥ阻害活性及び／又は血管保全作用を有し、血圧上昇抑制作用及び／又は血管保全作用を有する機能性食品などに有用である。
Description
本発明は血圧上昇抑制作用を有するペプチドに関する。より詳細には、鶏又は豚由来コラーゲンをプロテアーゼで分解した産物であり、血圧上昇抑制作用、血管保全作用などを有するペプチドに関する。
高血圧患者は、アメリカ・ヨーロッパ・日本で約２億人いると言われ、危険域のヒトを含めると１０億人に達すると推測されている。高血圧発症のメカニズムは種々存在するが、レニン・アンジオテンシン系とカリクレイン・キニン系が大きく関係するといわれている。アンジオテンシン変換酵素（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ Ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ、本明細書では、「ＡＣＥ」とも言う。）は、アンジオテンシンＩ（ｉｎａｃｔｉｖｅ ｆｏｒｍ）を強い血管収縮作用をもつアンジオテンシンＩＩ（ａｃｔｉｖｅ ｆｏｒｍ）に変換すると共に、血管拡張作用のあるブラジキニンを不活性な３種のペプチドに分解する。そこで、ＡＣＥ活性（アンジオテンシン変換酵素の酵素活性）を阻害するカプトプリルやエナラプリルなどのＡＣＥ阻害物質（アンジオテンシン変換酵素の酵素活性を阻害する物質）が高血圧治療薬として、従来から利用されている。
食品又は食品原料から得られるＡＣＥ阻害物質は低毒性で安全性の高い降圧剤、健康志向食品として期待でき、日常の食生活において摂取可能となる。これまで多くの天然物や食品等の酵素分解物の中からＡＣＥ阻害物質が報告されている。近年、イワシ、カツオ、ワカメなど食品由来成分に血圧の上昇を抑制する作用が見出されており、一部は血圧が高めの人に適した食品として市販されている（例えば、特開平２−３１１４９４公報、特開２０００−４７９９公報など）。しかし、食肉・食肉製品に由来するＡＣＥ阻害物質は非常に少ない。
また、食品由来のＡＣＥ阻害物質の中には、消化器官で分解されたりして活性が低下するものもあり、その有効性が疑問視されるものもある。そのため、通常の食事における摂取、つまり消化器官で分解などがされた後でも、十分に高い血圧上昇抑制作用を有する物質（ペプチド）が望まれるが、係る物質はほとんど見出されていなかった。
上述のように、食肉・食肉製品に由来するＡＣＥ阻害物質はあまり知られておらず、更に消化器官で分解などがされた後でも、十分に高い血圧上昇抑制作用を有する物質（ペプチド）はほとんど見出されていない。このような問題点から、本願発明者らは、食肉・食肉製品に由来するＡＣＥ阻害物質を研究したところ、鶏及び豚由来コラーゲンのプロテアーゼ分解物及びこの分解物に含有されているペプチドが、ｉｎ ｖｉｖｏにおいても優れた血圧上昇抑制作用を有することを見出した。
より具体的には、鶏足又は豚皮等から抽出したコラーゲンを各種プロテアーゼで分解し、当該分解物のＡＣＥ阻害活性を測定したところ、当該分解物はＡＣＥ阻害活性を有し、更に分子量３０００の限外濾過膜で分画したところ、分子量３０００以下の画分（Ｌｏｗ−Ｆｒａｃ．）に強い活性が認められた。
また、Ｌｏｗ−Ｆｒａｃ．を高血圧自然発症ラット（Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ Ｒａｔ，ＳＨＲ）に投与したところ、２時間後から血圧の低下が認められ、４週間の長期投与試験においても、有意に血圧の上昇を抑制することが明らかとなった。次いで、この画分をさらにＨＰＬＣで分画し、高いＡＣＥ阻害活性を有する画分のペプチドを得、それについてプロテインシークエンサーでアミノ酸配列を決定した。
更に、上述の鶏又は豚由来コラーゲンのプロテアーゼ分解物は血管保全作用を有することも判明した。
本発明は係る知見に基づくもので、血圧上昇抑制作用及び／又は血管保全作用を有する、鶏又は豚由来コラーゲンのプロテアーゼ分解物及びペプチド並びにそれを含有する機能性食品、更に上記のプロテアーゼ分解物及びペプチドを製造する方法を提供するものである。
食品又は食品原料から得られるＡＣＥ阻害物質は低毒性で安全性の高い降圧剤、健康志向食品として期待でき、日常の食生活において摂取可能となる。これまで多くの天然物や食品等の酵素分解物の中からＡＣＥ阻害物質が報告されている。近年、イワシ、カツオ、ワカメなど食品由来成分に血圧の上昇を抑制する作用が見出されており、一部は血圧が高めの人に適した食品として市販されている（例えば、特開平２−３１１４９４公報、特開２０００−４７９９公報など）。しかし、食肉・食肉製品に由来するＡＣＥ阻害物質は非常に少ない。
また、食品由来のＡＣＥ阻害物質の中には、消化器官で分解されたりして活性が低下するものもあり、その有効性が疑問視されるものもある。そのため、通常の食事における摂取、つまり消化器官で分解などがされた後でも、十分に高い血圧上昇抑制作用を有する物質（ペプチド）が望まれるが、係る物質はほとんど見出されていなかった。
上述のように、食肉・食肉製品に由来するＡＣＥ阻害物質はあまり知られておらず、更に消化器官で分解などがされた後でも、十分に高い血圧上昇抑制作用を有する物質（ペプチド）はほとんど見出されていない。このような問題点から、本願発明者らは、食肉・食肉製品に由来するＡＣＥ阻害物質を研究したところ、鶏及び豚由来コラーゲンのプロテアーゼ分解物及びこの分解物に含有されているペプチドが、ｉｎ ｖｉｖｏにおいても優れた血圧上昇抑制作用を有することを見出した。
より具体的には、鶏足又は豚皮等から抽出したコラーゲンを各種プロテアーゼで分解し、当該分解物のＡＣＥ阻害活性を測定したところ、当該分解物はＡＣＥ阻害活性を有し、更に分子量３０００の限外濾過膜で分画したところ、分子量３０００以下の画分（Ｌｏｗ−Ｆｒａｃ．）に強い活性が認められた。
また、Ｌｏｗ−Ｆｒａｃ．を高血圧自然発症ラット（Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ Ｒａｔ，ＳＨＲ）に投与したところ、２時間後から血圧の低下が認められ、４週間の長期投与試験においても、有意に血圧の上昇を抑制することが明らかとなった。次いで、この画分をさらにＨＰＬＣで分画し、高いＡＣＥ阻害活性を有する画分のペプチドを得、それについてプロテインシークエンサーでアミノ酸配列を決定した。
更に、上述の鶏又は豚由来コラーゲンのプロテアーゼ分解物は血管保全作用を有することも判明した。
本発明は係る知見に基づくもので、血圧上昇抑制作用及び／又は血管保全作用を有する、鶏又は豚由来コラーゲンのプロテアーゼ分解物及びペプチド並びにそれを含有する機能性食品、更に上記のプロテアーゼ分解物及びペプチドを製造する方法を提供するものである。
上記の課題を解決するためになされた本発明は、血圧上昇抑制作用及び／又は血管保全作用を有する鶏又は豚由来コラーゲンのプロテアーゼ分解物である。特に、血圧上昇抑制作用及び／又血管保全作用の効果の面から、鶏又は豚由来コラーゲンのプロテアーゼ分解物であって、分子量が３０００以下（限外濾過膜法）であるペプチドが好ましい。
また、本発明は、配列番号１〜４で示されるアミノ酸配列からなるペプチドで、係るペプチドは血圧上昇抑制作用及び／又は血管保全作用を有する。
更に、本発明は、上述した鶏又は豚由来コラーゲンのプロテアーゼ分解物又はペプチドを含有する、血圧上昇抑制作用及び／又は血管保全作用を有する機能性食品である。
また、本発明の製造方法は、鶏又は豚由来コラーゲンをプロテアーゼで酵素分解して、血圧上昇抑制作用及び血管保全作用を有するコラーゲンプロテアーゼ分解物を得ることからなるコラーゲンプロテアーゼ分解物の製造方法であり、また当該コラーゲンプロテアーゼ分解物をプロテアーゼで酵素分解して、また必要に応じて分子量分画に付しして分子量３０００以下（限外濾過膜法）の画分を採取し、血圧上昇抑制作用及び血管保全作用を有するコラーゲンペプチドを得ることからなるコラーゲンペプチドの製造方法である。
また、本発明は、配列番号１〜４で示されるアミノ酸配列からなるペプチドで、係るペプチドは血圧上昇抑制作用及び／又は血管保全作用を有する。
更に、本発明は、上述した鶏又は豚由来コラーゲンのプロテアーゼ分解物又はペプチドを含有する、血圧上昇抑制作用及び／又は血管保全作用を有する機能性食品である。
また、本発明の製造方法は、鶏又は豚由来コラーゲンをプロテアーゼで酵素分解して、血圧上昇抑制作用及び血管保全作用を有するコラーゲンプロテアーゼ分解物を得ることからなるコラーゲンプロテアーゼ分解物の製造方法であり、また当該コラーゲンプロテアーゼ分解物をプロテアーゼで酵素分解して、また必要に応じて分子量分画に付しして分子量３０００以下（限外濾過膜法）の画分を採取し、血圧上昇抑制作用及び血管保全作用を有するコラーゲンペプチドを得ることからなるコラーゲンペプチドの製造方法である。
図１は、鶏コラーゲンプロテアーゼ分解物を、各酵素で処理した鶏コラーゲンペプチドのＡＣＥ阻害活性（終濃度：０．２５ｍｇ／ｍｌ）を示す図である。
図２は、鶏コラーゲンペプチド（Ｃ）と豚コラーゲンペプチド（Ｐ）のＡＣＥ阻害活性（終濃度：０．２５ｍｇ／ｍｌ）を示す図である。限外濾過膜を用いて分子量３０００で分画し、図中の低分子は分子量３０００以下、高分子は分子量３０００以上である。
図３は、鶏コラーゲンペプチド（Ｃ）と豚コラーゲンペプチド（Ｐ）の消化酵素耐性を示す図であり、ＡＣＥ阻害活性は終濃度０．２５ｍｇ／ｍｌで測定した。Ｐはペプシン処理、Ｔ／Ｃはトリプシン／キモトリプシン処理を示す。また限外濾過膜を用いて分子量３０００で分画し、図中の低分子画分は分子量３０００以下、高分子画分は分子量３０００以上である。
図４は、本発明の鶏コラーゲンペプチドを投与したＳＨＲの血圧変動を示す図である。Ａは単回投与、Ｂは長期投与を示す。
図５は、本発明の鶏コラーゲンペプチドを単回摂取した被験者（Ａ及びＢの２名）の血圧変動を示す図である。
図６は、本発明の鶏コラーゲンペプチドを長期摂取した被験者（１４名）の血圧変動を示す図である。
図７は、実施例６のＥＰＣコロニーアッセイにおけるコロニー数の変化を示す図である。
図８は、実施例６のＥＰＣコロニーアッセイにおける形態の変化を示す図である。
図９は、鶏コラーゲンペプチドから逆相ＨＰＬＣでペプチドを精製するクロマト図であり、Ａは第１フラクション、Ｂは第２フラクション、Ｃは第３フラクションである。
図１０は、本発明の鶏コラーゲンペプチドの内皮型一酸化窒素合成酵素リン酸化（ｅＮＯＳ リン酸化）活性を示す図である。図中の数値は終濃度（％）である。
図２は、鶏コラーゲンペプチド（Ｃ）と豚コラーゲンペプチド（Ｐ）のＡＣＥ阻害活性（終濃度：０．２５ｍｇ／ｍｌ）を示す図である。限外濾過膜を用いて分子量３０００で分画し、図中の低分子は分子量３０００以下、高分子は分子量３０００以上である。
図３は、鶏コラーゲンペプチド（Ｃ）と豚コラーゲンペプチド（Ｐ）の消化酵素耐性を示す図であり、ＡＣＥ阻害活性は終濃度０．２５ｍｇ／ｍｌで測定した。Ｐはペプシン処理、Ｔ／Ｃはトリプシン／キモトリプシン処理を示す。また限外濾過膜を用いて分子量３０００で分画し、図中の低分子画分は分子量３０００以下、高分子画分は分子量３０００以上である。
図４は、本発明の鶏コラーゲンペプチドを投与したＳＨＲの血圧変動を示す図である。Ａは単回投与、Ｂは長期投与を示す。
図５は、本発明の鶏コラーゲンペプチドを単回摂取した被験者（Ａ及びＢの２名）の血圧変動を示す図である。
図６は、本発明の鶏コラーゲンペプチドを長期摂取した被験者（１４名）の血圧変動を示す図である。
図７は、実施例６のＥＰＣコロニーアッセイにおけるコロニー数の変化を示す図である。
図８は、実施例６のＥＰＣコロニーアッセイにおける形態の変化を示す図である。
図９は、鶏コラーゲンペプチドから逆相ＨＰＬＣでペプチドを精製するクロマト図であり、Ａは第１フラクション、Ｂは第２フラクション、Ｃは第３フラクションである。
図１０は、本発明の鶏コラーゲンペプチドの内皮型一酸化窒素合成酵素リン酸化（ｅＮＯＳ リン酸化）活性を示す図である。図中の数値は終濃度（％）である。
本発明は上記の構成からなり、本発明のプロテアーゼ分解物及びペプチドは、鶏又は豚コラーゲンに由来する。
使用されるコラーゲンに関し、コラーゲンのタイプ及び採取部位などは特に限定されず、種々のコラーゲンを使用することができる。好適には、原料が豊富であることから、鶏及び豚の足、皮、骨、腱、腸などに由来するＩ型コラーゲンが使用される。
上記コラーゲンは常法に準じて調製することができ、例えば、原料を１０倍量程度の酸（好ましくは希塩酸）中で、適当な時間（例えば２４時間〜３０時間程度）撹拌処理し、脱灰と酸膨潤を行い、十分に流水洗浄した後、適当量（例えば、約２倍量）の温水で抽出・濾過し、濾液を必要に応じてイオン交換担体などで処理し、適当な濃度（例えば、１０％程度）に濃縮することにより得ることができる。
なお、本発明において、コラーゲンにはコラーゲンの変性物であるゼラチンも包含され、係るゼラチンは常法に準じてコラーゲンより調製することができる。
次いで、上記で調製されたコラーゲン溶液をプロテアーゼで処理する。プロテアーゼとしては、コラーゲンを酵素分解できるプロテアーゼであれば特に限定はされず、酸性プロテアーゼ、中性プロテアーゼ、アルカリ性プロテアーゼのいずれも使用することができ、例えば、動物由来プロテアーゼ（例えば、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン等）、植物由来プロテアーゼ（例えば、パパイン、プロメリン、フィシン等）、微生物由来のプロテアーゼなどが挙げられ、酵素処理効率の点からコクラーゼＰ（商品名）が好適に使用される。上記のプロテアーゼは２種以上を併用してもよい。
プロテアーゼ処理は、酵素反応液のｐＨを各酵素の至適ｐＨに調整した後、３０〜８０℃、０．５〜３時間程度反応させ、酵素反応終了後加熱などの方法により酵素を失活させることにより行われる。酵素の使用量は所望する分解度に応じて適宜調整することができるが、コラーゲンに対して通常０．０１〜２％程度、好ましくは０．２％程度で使用される。
反応終了後、必要に応じて、反応液を慣用の精製手段、例えば、限外濾過、珪藻土濾過、イオン交換樹脂、逆浸透濾過、活性炭処理などにより精製することによりコラーゲンのプロテアーゼ分解物が得られる。更に必要に応じて、エキス分２５−３０％になるまで濃縮し、スプレードライヤーなどの手段で乾燥して粉末状とすることができる。
かくして得られたプロテアーゼ分解物は、後記実施例に示されるようにＡＣＥ阻害作用及び／又は血管保全作用を有する。
上記で得られたプロテアーゼ分解物は、更にプロテアーゼで処理して分子量を低減化したコラーゲンペプチドとすることにより、ＡＣＥ阻害作用及び／又は血管保全作用を強めることができる。より具体的には、上記のプロテアーゼ分解物を、更に前述のプロテアーゼ（原料に対し、１％程度酵素添加）を用いて、酵素の至適ｐＨ、至適温度で、１〜２４時間、好ましくは２〜６時間、更に好ましくは４時間程度反応させ、コラーゲンペプチドが得られる。
この酵素反応に使用される酵素は、前記の酵素反応に使用された酵素とは異なる酵素、即ち切断部位が異なる酵素を使用するのが好ましい。異なる酵素を使用することにより、低分子化を効率よく行うことができる。
上記で得られたコラーゲンペプチドは、限外濾過膜を用いて分子量３０００で分画を行い、分子量３０００以下の画分からなるペプチドとするのが好ましい。
かくして得られるコラーゲンペプチド及びそれの分子量３０００以下の画分からなるペプチドは、凍結乾燥などの慣用の方法にて粉末化することができる。また、当該ペプチドは後記実施例に示されるようにＡＣＥ阻害作用及び／又は血管保全作用を有する。
上記のコラーゲンペプチドの分子量３０００以下の画分の中のペプチドは、慣用の精製手段、例えば、ゲル濾過、イオン交換カラムクロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの慣用の方法で精製し、単離することができる。次いで、単離したペプチドの構造をプロテインシーケンサーと質量分析計により決定することができる。
その結果、ＡＣＥ阻害作用・血管保全作用を有するペプチドとして、下記のペプチドが得られた。
Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（配列番号１）
Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ（配列番号２）
Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（配列番号３）
Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ（配列番号４）
上記の配列番号１〜４のペプチドは、前述の方法により、コラーゲンペプチドより精製・単離して取得してもよいが、化学的方法で合成してもよい。化学的合成方法は、慣用のペプチド合成法に準じて行うことができ、例えば固相合成法などが例示できる。
本発明の機能性食品は、前記のコラーゲンプロテアーゼ分解物、コラーゲンペプチド及び／又は配列番号１〜４のペプチドを有効成分として含有することからなる、血圧上昇抑制作用及び／又は血管保全作用を有する機能性食品である。なお、本明細書において、機能性食品とは、通常の食品、飲料、菓子類、飼料などを含む概念である。
当該機能性食品は、有効成分そのまま、又は種々の栄養分を加えて、若しくは飲食品中に含有せしめて、血圧上昇抑制及び／又は血管保全を目的として、その治療及び予防に有用な機能性食品（又は食品素材）として食される。例えば、適当な助剤（例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、アミノ酸等）を添加した後、慣用の手段を用いて、食用に適した形態、例えば、顆粒状、粒状、錠剤、カプセル、ペースト等に成形して食用に供してもよく、また種々の食品（例えば、ハム、ソーセージ等の食肉加工食品、かまぼこ、ちくわ等の水産加工食品、スナック菓子等の菓子類、パン類、バター、粉乳等の乳製品、豆腐、油揚げ等の大豆製品など）に添加して使用されたり、水、果汁、牛乳、清涼飲料等の飲物に添加して使用してもよい。また、動物用の飼料（ペットフードなどを含む）の形態であってもよい。
係る機能性食品の形態における摂取量は、年齢、体重、症状、疾患の程度、食品の形態等により、適宜選択・決定され、例えば、１日当りペプチドの量として、１．０ｇ〜１０．０ｇ程度、好ましくは２．０ｇ〜８．０ｇとされるが、多量に摂取しても生体に悪影響を与えない利点を有することから、それ以上の量を摂取してもよい。
また、本発明のコラーゲンプロテアーゼ分解物及びペプチドは、血圧上昇抑制作用及び／又は血管保全作用を有する薬剤としても利用することができ、係る製剤は、コラーゲンプロテアーゼ分解物及びペプチドを有効成分とし、必要に応じて、適宜の生理的に許容される添加剤（例えば、担体、賦形剤、希釈剤等）などの製剤上必要な成分と混合し、適宜な剤形の形態に調製することにより得られ、係る形態としては錠剤状、粉末状、顆粒状、カプセル剤状などが例示できる。投与量は、患者の症状、年齢、体重などに応じて、上記の摂取量を参考にして適宜決定することができる。
使用されるコラーゲンに関し、コラーゲンのタイプ及び採取部位などは特に限定されず、種々のコラーゲンを使用することができる。好適には、原料が豊富であることから、鶏及び豚の足、皮、骨、腱、腸などに由来するＩ型コラーゲンが使用される。
上記コラーゲンは常法に準じて調製することができ、例えば、原料を１０倍量程度の酸（好ましくは希塩酸）中で、適当な時間（例えば２４時間〜３０時間程度）撹拌処理し、脱灰と酸膨潤を行い、十分に流水洗浄した後、適当量（例えば、約２倍量）の温水で抽出・濾過し、濾液を必要に応じてイオン交換担体などで処理し、適当な濃度（例えば、１０％程度）に濃縮することにより得ることができる。
なお、本発明において、コラーゲンにはコラーゲンの変性物であるゼラチンも包含され、係るゼラチンは常法に準じてコラーゲンより調製することができる。
次いで、上記で調製されたコラーゲン溶液をプロテアーゼで処理する。プロテアーゼとしては、コラーゲンを酵素分解できるプロテアーゼであれば特に限定はされず、酸性プロテアーゼ、中性プロテアーゼ、アルカリ性プロテアーゼのいずれも使用することができ、例えば、動物由来プロテアーゼ（例えば、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン等）、植物由来プロテアーゼ（例えば、パパイン、プロメリン、フィシン等）、微生物由来のプロテアーゼなどが挙げられ、酵素処理効率の点からコクラーゼＰ（商品名）が好適に使用される。上記のプロテアーゼは２種以上を併用してもよい。
プロテアーゼ処理は、酵素反応液のｐＨを各酵素の至適ｐＨに調整した後、３０〜８０℃、０．５〜３時間程度反応させ、酵素反応終了後加熱などの方法により酵素を失活させることにより行われる。酵素の使用量は所望する分解度に応じて適宜調整することができるが、コラーゲンに対して通常０．０１〜２％程度、好ましくは０．２％程度で使用される。
反応終了後、必要に応じて、反応液を慣用の精製手段、例えば、限外濾過、珪藻土濾過、イオン交換樹脂、逆浸透濾過、活性炭処理などにより精製することによりコラーゲンのプロテアーゼ分解物が得られる。更に必要に応じて、エキス分２５−３０％になるまで濃縮し、スプレードライヤーなどの手段で乾燥して粉末状とすることができる。
かくして得られたプロテアーゼ分解物は、後記実施例に示されるようにＡＣＥ阻害作用及び／又は血管保全作用を有する。
上記で得られたプロテアーゼ分解物は、更にプロテアーゼで処理して分子量を低減化したコラーゲンペプチドとすることにより、ＡＣＥ阻害作用及び／又は血管保全作用を強めることができる。より具体的には、上記のプロテアーゼ分解物を、更に前述のプロテアーゼ（原料に対し、１％程度酵素添加）を用いて、酵素の至適ｐＨ、至適温度で、１〜２４時間、好ましくは２〜６時間、更に好ましくは４時間程度反応させ、コラーゲンペプチドが得られる。
この酵素反応に使用される酵素は、前記の酵素反応に使用された酵素とは異なる酵素、即ち切断部位が異なる酵素を使用するのが好ましい。異なる酵素を使用することにより、低分子化を効率よく行うことができる。
上記で得られたコラーゲンペプチドは、限外濾過膜を用いて分子量３０００で分画を行い、分子量３０００以下の画分からなるペプチドとするのが好ましい。
かくして得られるコラーゲンペプチド及びそれの分子量３０００以下の画分からなるペプチドは、凍結乾燥などの慣用の方法にて粉末化することができる。また、当該ペプチドは後記実施例に示されるようにＡＣＥ阻害作用及び／又は血管保全作用を有する。
上記のコラーゲンペプチドの分子量３０００以下の画分の中のペプチドは、慣用の精製手段、例えば、ゲル濾過、イオン交換カラムクロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの慣用の方法で精製し、単離することができる。次いで、単離したペプチドの構造をプロテインシーケンサーと質量分析計により決定することができる。
その結果、ＡＣＥ阻害作用・血管保全作用を有するペプチドとして、下記のペプチドが得られた。
Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（配列番号１）
Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ（配列番号２）
Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（配列番号３）
Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ（配列番号４）
上記の配列番号１〜４のペプチドは、前述の方法により、コラーゲンペプチドより精製・単離して取得してもよいが、化学的方法で合成してもよい。化学的合成方法は、慣用のペプチド合成法に準じて行うことができ、例えば固相合成法などが例示できる。
本発明の機能性食品は、前記のコラーゲンプロテアーゼ分解物、コラーゲンペプチド及び／又は配列番号１〜４のペプチドを有効成分として含有することからなる、血圧上昇抑制作用及び／又は血管保全作用を有する機能性食品である。なお、本明細書において、機能性食品とは、通常の食品、飲料、菓子類、飼料などを含む概念である。
当該機能性食品は、有効成分そのまま、又は種々の栄養分を加えて、若しくは飲食品中に含有せしめて、血圧上昇抑制及び／又は血管保全を目的として、その治療及び予防に有用な機能性食品（又は食品素材）として食される。例えば、適当な助剤（例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、アミノ酸等）を添加した後、慣用の手段を用いて、食用に適した形態、例えば、顆粒状、粒状、錠剤、カプセル、ペースト等に成形して食用に供してもよく、また種々の食品（例えば、ハム、ソーセージ等の食肉加工食品、かまぼこ、ちくわ等の水産加工食品、スナック菓子等の菓子類、パン類、バター、粉乳等の乳製品、豆腐、油揚げ等の大豆製品など）に添加して使用されたり、水、果汁、牛乳、清涼飲料等の飲物に添加して使用してもよい。また、動物用の飼料（ペットフードなどを含む）の形態であってもよい。
係る機能性食品の形態における摂取量は、年齢、体重、症状、疾患の程度、食品の形態等により、適宜選択・決定され、例えば、１日当りペプチドの量として、１．０ｇ〜１０．０ｇ程度、好ましくは２．０ｇ〜８．０ｇとされるが、多量に摂取しても生体に悪影響を与えない利点を有することから、それ以上の量を摂取してもよい。
また、本発明のコラーゲンプロテアーゼ分解物及びペプチドは、血圧上昇抑制作用及び／又は血管保全作用を有する薬剤としても利用することができ、係る製剤は、コラーゲンプロテアーゼ分解物及びペプチドを有効成分とし、必要に応じて、適宜の生理的に許容される添加剤（例えば、担体、賦形剤、希釈剤等）などの製剤上必要な成分と混合し、適宜な剤形の形態に調製することにより得られ、係る形態としては錠剤状、粉末状、顆粒状、カプセル剤状などが例示できる。投与量は、患者の症状、年齢、体重などに応じて、上記の摂取量を参考にして適宜決定することができる。
後記実施例に示されるよう、本発明の鶏又は豚由来コラーゲンのプロテアーゼ分解物及びペプチドは強いＡＣＥ阻害活性を有しており、血圧上昇抑制作用を有する機能性食品又は薬剤として利用することができる。特に生体に吸収された後においても効果を持続することができるという特長を有している。本発明の鶏又は豚由来コラーゲンのプロテアーゼ分解物及びペプチドは、日常的に摂取可能な食品を原料としている。生活習慣病である高血圧は、日常の生活を通して、予防・改善することが重要であり、このような食品由来成分を食事などによりうまく摂取することで、対象者のＱＯＬ（Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ｌｉｆｅ）を損なうことなく、正常血圧へ導くことができるという特長を有する。
また、本発明の鶏又は豚由来コラーゲンのプロテアーゼ分解物及びペプチドは、血管内皮の修復を担う細胞であるＥＰＣ（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）の増殖を促進させる作用を有しており、血管内皮の障害、機能保持などの血管保全を図ることができる。
更に、本発明の製造方法によれば、上記のプロテアーゼ分解物及びペプチドを簡便且つ確実に製造することができる。
また、本発明の鶏又は豚由来コラーゲンのプロテアーゼ分解物及びペプチドは、血管内皮の修復を担う細胞であるＥＰＣ（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）の増殖を促進させる作用を有しており、血管内皮の障害、機能保持などの血管保全を図ることができる。
更に、本発明の製造方法によれば、上記のプロテアーゼ分解物及びペプチドを簡便且つ確実に製造することができる。
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。なお、使用した材料及びＡＣＥ阻害活性測定法は以下のとおりである。
（１）材料
新鮮な鶏足と豚皮は出願人会社の工場から調達した。ウサギ肺ＡＣＥ、Ｈｉｐ−ＨＬ（Ｂｚ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ）、ペプシン、トリプシン、キモトリプシンはシグマ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。コクラーゼＰ（三共ライフテック社製、東京、日本）、アマノＮ、ＡアマノＧ及びプロレザー（いずれも天野エンザイム社製、愛知、日本）、スミチームＫＰ、スミチームＦＰ及びスミチームＬＰ（いずれも新日本化学工業社製、愛知、日本）は市販品を使用した。ペプチド合成試薬は島津（京都、日本）より購入した。その他の試薬は和光純薬（大阪、日本）より購入した。
（２）ＡＣＥ阻害活性測定
ＡＣＥに対する阻害活性の測定はＣｈｅｕｎｇらの方法（Ｃｈｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８０，２５５，４０１−４０７）に従って行った。具体的には、最終容量が０．２５ｍｌとなるように１００ｍＭホウ酸溶液（ｐＨ８．３）、５ｍＭ Ｈｉｐ−ＨＬ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＵ ウサギＡＣＥ及び試験試料を加え、３７℃で３０分間インキュベートをおこなった。酵素反応は１Ｎ ＨＣｌの添加で停止させた。Ｈｉｐ−ＨＬの加水分解の程度は放出された馬尿酸（Ｈｉｐｐｕｒｉｃ ａｃｉｄ）量を吸光値２２８ｎｍで測定した。ＡＣＥを５０％阻害するときの阻害剤濃度をＩＣ５０と定義した。
実施例１
（１）コラーゲンプロテアーゼ分解物及びコラーゲンペプチドの調製
原料の鶏足（ブロイラー由来）を１０倍量の希塩酸中で、２４時間以上撹拌処理し、脱灰と酸膨潤を行った。そして、十分に流水洗浄した後、約２倍量の温水で抽出し、濾過した。濾液をイオン交換樹脂処理し、更に、エキス分１０％以上になるまで濃縮した。この濃縮液にコクラーゼＰ（コラーゲンに対して０．２％）を加え、５０℃，２時間処理した後、加熱して酵素を失活させた。次いで、珪藻土濾過、活性炭処理により精製することにより鶏コラーゲンプロテアーゼ分解物を得た。
得られた鶏コラーゲンプロテアーゼ分解物は、更に６種類の酵素（コクラーゼＰ、アマノＮ、ＡアマノＧ、プロレザー、スミチームＫＰ、スミチームＦＰ、スミチームＬＰ）を用いて酵素分解した。使用した酵素の性状を表１に示す。
この酵素分解反応は、５０℃、プロレザーについてはｐＨ１０．０、その他の酵素についてはｐＨ６．０で４時間から２４時間酵素処理し（原料に対し、１％酵素添加）、各酵素処理は２０分間の加熱により酵素を失活させ、遠心処理を行って上清を採取することによりコラーゲンペプチドを得た。
鶏コラーゲンプロテアーゼ分解物及び上記の各酵素で分解したコラーゲンペプチドのＡＣＥ阻害活性を図１に示す。
酵素分解前のコラーゲンでは阻害活性が認めらないなかったが、鶏コラーゲンプロテアーゼ分解物は阻害剤無添加の場合に対し、約３０％の阻害活性を示した（図１の処理前）。
鶏コラーゲンプロテアーゼ分解物を、更に酵素処理を行って得られたコラーゲンペプチドは、２倍近い活性の上昇が認められた。各酵素処理の中でもスミチームＦＰ（以下、単にＦＰという）酵素処理したものに、高い活性が認められた。
（２）分子量分画した画分のＡＣＥ阻害作用
上記ＦＰ酵素処理したコラーゲンペプチドを、限外濾過膜を用いて分子量３０００で分画を行い、各々の画分のＡＣＥ阻害活性の強さを比較した。その結果を表２に示した。表２に示されるように、低分子側画分（分子量３０００以下）に高い活性が認められた。
実施例２
畜種によるコラーゲンペプチドのＡＣＥ阻害活性を比較するため、豚皮を原料として、実施例１（１）と同様の方法で豚コラーゲンペプチドを調製し、そのＡＣＥ阻害活性を測定した。その結果を図２に示す。
図２に示されるように、豚コラーゲンペプチドもＡＣＥ阻害活性を有し、高分子側に比べて低分子側の方が強い活性を有していた。鶏と同様にＦＰ酵素処理したものの活性が最も強かった。
しかし、そのＡＣＥ阻害活性は鶏コラーゲンペプチドの方が強かった。この理由としては、（ａ）豚コラーゲンの方がプロテアーゼによる分解を受けやすく、ＡＣＥ阻害活性を示せないほどに低分子化（単体のアミノ酸）しやすいことと、（ｂ）鶏コラーゲンの方が、内因的にＡＣＥ阻害活性を発現しやすいアミノ酸配列を有していることが推察された。
実施例３（消化酵素処理によるＡＣＥ阻害活性への影響）
鶏コラーゲンペプチド（ＦＰ処理物）及び豚コラーゲンペプチド（ＦＰ処理物）を摂取した際に、体内でもＡＣＥ阻害活性が維持されるのか、モデル消化系を用いて検討を行った。
即ち、ＦＰ酵素処理鶏コラーゲンペプチド及び豚コラーゲンペプチド溶液（ｐＨ３．０）に、タンパク質重量に対し１％となるようにし、酵素反応液のｐＨを各酵素の至適ｐＨに調整した後、ペプシン（ｐＨ３．０）又はトリプシン／キモトリプシン（ｐＨ７．０）を添加し、３７℃で１時間処理を行った。反応終了後、前述と同様に限外濾過膜を用いて分子量３０００で分画を行い、低分子画分（分子量＜３０００）と高分子画分（分子量＞３０００）に分離した。
上記の消化酵素処理物及び分画画分について、ＡＣＥ阻害活性の測定を行った。その結果を図３に示す。
図３に示されるように、ＦＰ酵素処理鶏コラーゲンペプチド及び豚コラーゲンペプチドは、消化酵素処理（Ｐ：ペプシン処理、Ｔ／Ｃ：トリプシン／キモトリプシン処理）することによってもＡＣＥ阻害活性を維持しており、特に鶏コラーゲンペプチドの低分子画分は強い活性を示した。
実施例４（ＳＨＲにおける血圧上昇抑制作用）
鶏コラーゲンペプチド（ＦＰ処理物）をＳＨＲに投与し、血圧変動を経時的に測定した。
具体的には、雄ＳＨＲ（８週齢；チャールズリバー）は市販の非精製餌（ＡＴＮ−７６；オリエンタル酵母）と水で２３℃、湿度５５％に調整された部屋で飼育した。本試験には、血圧が十分に上昇したことが確認できた週齢のものを使用した。試験時に、生理的食塩水（コントロール群）又は鶏コラーゲンペプチド（ＦＰ処理物）を経口的に投与（３又は６ｇ／ｋｇ ｗｅｉｇｈｔ）し、血圧変動を２４時間測定した（単回投与系）。
また、同様に雄ＳＨＲに、鶏コラーゲンペプチド（ＦＰ処理物）を毎日経口的に投与（６ｇ／ｋｇ ｗｅｉｇｈｔ）し、血圧変動を４週間測定した（長期投与系）。
なお、ラット尾動脈圧は非観血式血圧測定器（Ｓｏｆｔｒｏｎ９８Ａ、Ｓｏｆｔｒｏｎ、東京、日本）で測定を行なった。データの解析はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔにより処理した。その結果を図４に示す。
単回投与系においては、コントロール群ＳＨＲに対し、鶏コラーゲンペプチドを投与したＳＨＲは投与後２時間後から血圧が低下し、６時間で最低血圧を記録した（図４Ａ参照）。
また、長期投与を行った場合は、鶏コラーゲンペプチドの投与で、１週目より血圧の低下が認められ、３週目には有意な血圧低下が認められた（ｐ＜０．０５）（図４Ｂ参照）。
ナトリウム、カリウム、カルシウムなどの血清ミネラル成分は血圧に影響を及ぼすことが知られているが、４週間にわたる長期投与の後でもコントロール群と鶏コラーゲンペプチド投与群に違いは認められなかった（表３参照）。血圧が上昇するメカニズムには種々の理由が存在する。アドレナリン、ノルアドレナリンなどのカテコールアミンは神経性の調圧因子としてよく知られているし、血清ミネラル成分のナトリウム、カリウム、カルシウムも血圧に影響する。今回鶏コラーゲンペプチドを投与したＳＨＲにおいても血清ミネラル成分が多く検出されると予想されたが、４週間にわたる長期投与の後でも血圧に影響すると考えられるこれらの成分に大きな違いは認められなかった。従って、本発明のペプチドの血圧上昇抑制作用の作用機序はＡＣＥの阻害作用であると考えられる。
実施例５（ヒトでの臨床試験）
鶏コラーゲンペプチド（ＦＰ処理物）のヒトでの効果を調べるために、被験者の事前の了解を得て、以下の試験条件で単回摂取試験と長期摂取試験を実施した。
（１）単回摂取試験（１日間、被験者：Ａ及びＢの２名）
被験者に、試験食（ペプチド量として７．８ｇ）を摂取後、安静時血圧を２時間毎に８時間まで測定した。
前日にプラセボ食を摂取時の値との前後比較で評価した。その結果を図５に示す。
図５に示されるように、摂取４時間後に最高血圧の中央値が低下する傾向を示した。
（２）長期摂取試験（２８日間、被験者：１４名）
被験者に、試験食（１日当たりのペプチド摂取量として５．２ｇ）を毎日摂取させ、２週間毎に４週間後まで血圧変動を測定した。各人について、摂取前の値との前後比較で評価した。その結果を図６に示す。
図６に示されるように、長期投与試験の結果、本試験食の摂取前と２週後と４週後の測定値の各々に有意差が認められ、本発明の鶏コラーゲンペプチドは、血圧変動を抑制する効果があることが認められた。
本試験の結果より、鶏コラーゲン酵素分解物の１日当たりの望ましい摂取量は、ペプチド量として１〜１０ｇ、より好ましくは２〜８ｇと考えられる。
実施例６（血管修復作用向上への影響：ＥＰＣコロニーアッセイ）
本発明のコラーゲンペプチドの摂取が、血圧を下げるだけでなく、血管機能の改善効果があることをＥＰＣ（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）コロニーアッセイで確認した。このＥＰＣは骨髄で産生される血管内皮細胞の前駆体で、末梢血中のＥＰＣは炎症や虚血、酸化ストレスなどの組織障害を感知し、細胞の修復を担う。高血圧症や高脂血症、糖尿病の患者ではＥＰＣの機能が低下しており、血管障害の程度と高い相関を示すことが知られている。
より具体的には、上記実施例５の血圧試験の被験者血液を使用した。つまり、本発明のコラーゲンペプチド摂取期間前後の被験者血液を同量（１０ｍｌ）採取し、１０００ｇ、３０ｍｉｎで遠心し、沈殿した細胞を細胞培養液を満たしたシャーレに播種し、３７℃，５％ＣＯ２，１週間培養後、本発明のコラーゲンペプチド摂取期間前後でコロニー数が増加したかどうか、形成されるコロニー形態に違いがないかを調べた。ＥＰＣコロニーアッセイにおけるコロニー数の変化を図７に、コロニーの形態の変化を図８に示す。
本試験の結果として、ＥＰＣコロニーアッセイにより、本発明のコラーゲンペプチドの摂取後において、形成されるコロニー数が増加し、コロニーの形態が改善されることが判明し、本発明のコラーゲンペプチドは、血圧を下げるだけでなく、血管の状態を改善する作用（血管保全作用）を有することが確認された。
実施例７（ＡＣＥ阻害ペプチドの単離・精製）
酵素処理によって得られた鶏コラーゲンペプチドからＡＣＥ阻害ペプチドを単離するため、逆相ＨＰＬＣ（ＣＨ３ＣＮ；８−４０％ ｉｎ ０．１％ ＣＦ３ＣＯＯＨ）によって分画を行った。溶出ピークは２２０ｎｍで検出を行った。
まず、図９Ａに示されるように、溶出時間に従い、すべてのクロマトを６つに分画（Ｆｒａｃ．１−Ｆｒａｃ．６）し、ＡＣＥ阻害活性の比較を行った（表４Ａ参照）。
その結果、Ｆｒａｃ．４に強い活性が認められたので、画分を濃縮し、アセトニトリルでの溶出条件を穏やかにして（０．４％／ｍｉｎ）再度ＨＰＬＣに供した（図９Ｂ参照）。得られたピークを溶出時間毎に分画し（Ｆｒａｃ．４−１〜Ｆｒａｃ．４−４）、ＡＣＥ阻害活性を比較した（表４Ｂ参照）。
最も高い活性が認められたＦｒａｃ．４−３は、各ペプチドを単離するため、濃縮を行い、アセトニトリルでの溶出条件を更に穏やかにして（０．１６％／ｍｉｎ）ＨＰＬＣに供した（図９Ｃ参照）。得られたピークはプロテインシークエンサーによりアミノ酸配列の決定を行った。
アミノ酸配列は常法に準じて、プロテインシークエンサーＧ１００５Ａ（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ Ｃｏ．Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）で決定した。
図９Ｃ得られた各ピークのアミノ酸配列及び質量分析の結果を表５に示した。
表５に示されるように、ピーク８、９、１１及び１２は、それぞれ下記のアミノ酸配列を有するペプチドであった。
Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（配列番号１）
Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ（配列番号２）
Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（配列番号３）
Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ（配列番号４）
上記配列番号１〜４に示されるアミノ酸配列を有するペプチドを、Ｆｍｏｃ固相法により自動ペプチド合成機（ＰＳＳＭ８ 島津）を用いて作製した。脱保護の後、逆相ＨＰＬＣ（ＰＥＧＡＳＩＬ−３００，２０×２５０ｍｍ；Ｓｅｎｓｈｕ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）及び質量分析計ＥＳＩ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ ＬＣ−Ｑ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｎｎｉｇａｎ，Ｓａｎ ｊｏｓｅ，ＣＡ）で確認を行った。
合成されたペプチドのＡＣＥ阻害活性を測定し、その活性（ＩＣ５０）を表５に示した。表５に示されるように、配列番号１〜４で示されるアミノ酸配列からなるペプチドはＡＣＥ阻害活性を有していた。特に配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドは強いＡＣＥ阻害活性を有していた。
実施例８（鶏コラーゲンペプチドの調製）
鶏ゼラチン溶液（ｐＨ６．０）を調製し、これにコクラーゼＰ（ゼラチンに対して０．２％）を加え、５０℃，３時間処理した後、加熱して酵素を失活させた。次いで、珪藻土濾過、活性炭処理により精製することにより鶏ゼラチンプロテアーゼ分解物を得た。
得られた鶏ゼラチンプロテアーゼ分解物の溶液（ｐＨ６．０）に、スミチームＦＰ（原料に対し、０．５％酵素添加）を添加し、５０℃で４時間酵素処理し、２０分間の加熱により酵素を失活させ、遠心処理を行って上清を採取することによりゼラチンペプチドを得た。
上記で得られたゼラチンペプチドを、限外濾過膜を用いて分子量３０００で分画を行い、低分子側画分（分子量３０００以下）を採取した。以下、分画前のコラーゲンペプチドをＡ２と称し、低分子側画分（分子量３０００以下）をＡ２Ｆと称する。
上記のＡ２及びＡ２Ｆについて、ＡＣＥ阻害活性を測定したところ、それぞれのＩＣ５０は０．５８６ｍｇ／ｍｌ及び０．３２６ｍｇ／ｍｌであった。
実施例９（コラーゲンペプチドによる血管内皮機能改善作用）
血管内皮細胞においては、種々のサイトカインの作用により、ＰＩ３Ｋ−プロテインキナーゼＡｋｔの活性化が起り、それに続いて内皮型一酸化窒素合成酵素（Ｅｎｄｏｔｈｅｒｉａｌ Ｎｉｔｒｉｃ−ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ，ｅＮＯＳ）が活性化され、ＮＯ産生増加を引き起こし、血管新生、血管拡張、単球接着阻害などの血管内皮機能改善をもたらす。ｅＮＯＳの活性化は、そのスレオニン残基とセリン残基のリン酸化により生じるので、ｅＮＯＳのリン酸化を促進する物質はＮＯ産生を増加させ、血管内皮機能の改善効果を有することになる。そこで、本発明のコラーゲンペプチドのｅＮＯＳリン酸化作用を試験した。
（１）供試材料
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）はタカラバイオから、ウシ大動脈血管内皮細胞（ＢＡＥＣ）は大日本住友製薬から購入した。実験に供したＨＵＶＥＣ及びＢＡＥＣは継代数４から６代目までのものを用いた。細胞培養に用いた試薬類（ＤＭＥＭ，ＦＢＳ，Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ）はインビトロジェンから購入した。ｐｈｏｓｐｈｏ−ｅＮＯＳ（Ｓｅｒ１１７７）抗体はＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社から購入した。また抗体の検出には、アマシャム・ファルマシアのＥＣＬｐｌｕｓを用いた。タンパク定量試薬にはバイオラッドのＤＣ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｒｅａｇｅｎｔを使用した。
試験ペプチドであるコラーゲンペプチドとしては、配列番号１に示されるオクタペプチド（合成品、以下ＣＣＯＰという）並びに上記のＡ２及びＡ２Ｆを試験した。
（２）細胞培養
ＨＵＶＥＣ及びＢＡＥＣは１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ，１００μＵ／ｍｌｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ−ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ，５０μｇ／ｍｌ ヘパリン）にて目的の継代数に至るまで培養を行った。リン酸化試験に供する際は０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭで１２時間培養し、ＦＢＳに含まれる成長促進因子などがリン酸化に及ぼす影響を除去した。
（３）リン酸化ｅＮＯＳの検出
リン酸化ｅＮＯＳの検出はＪｕら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．ｃｈｅｍ．１９９８，２７３，２４０２５−２４０２９．）の方法に準じて行った。即ち、ＢＥＡＣを０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭで処理した後、培地に試験ペプチドを０．１％〜０．００１％で添加した。また、ポジティブコントロールとして培地に、溶解させた１００μＭブラジキニン（ＢＫ；シグマ）を添加した。一定時間（３分間）刺激を与えた細胞をＰＢＳで洗浄し、Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（０．１％ ｔｒｉｔｏｎ，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），２０ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭ ＰＭＳＦ，１ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｏｒｔｈｏｖａｎａｄａｔｅ，１ｍＭｌｅｕｐｅｐｔｉｎ−ｐｅｐｓｔａｔｉｎ）で細胞を溶解させて、細胞溶解液を回収した。１５秒間のソニケーション、および１０分間の加熱処理を行った細胞溶解液を遠心処理（１０，０００×ｇ，１０ｍｉｎ）し、ｅＮＯＳを含む上清を得た。タンパク質量を揃えたサンプルは７．５％ゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開させた後、ＰＶＤＦ膜に転写した。５％脱脂粉乳を含むＴＢＳバッファーを用いて室温にて２時間ブロッキングした後、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｅＮＯＳ抗体で４℃、一晩処理した。１次抗体を洗い流した後、ＨＲＰを付けた２次抗体で１時間反応させた。１次抗体、２次抗体をマウントさせたＰＶＤＦ膜はＴＢＳ−Ｔで洗った後、化学発光試薬によりｐｈｏｓｐｈｏ−ｅＮＯＳを検出しＸ線フィルムに焼き付けた。
（４）結果
上記の結果を図１０に示す。本発明の鶏コラーゲンペプチドは、添加濃度依存的にリン酸化シグナルが強くみとめられたことから、ｅＮＯＳを活性化させ、血管内皮機能の改善に寄与すると考えられた。合成ペプチドであるＣＣＯＰにおいても、添加濃度依存的にｅＮＯＳのリン酸化が認められたことから、ＣＣＯＰが鶏由来コラーゲンプロテアーゼ分解物中の血管内皮機能改善に寄与する成分の一つであると考えられた。
製造例１
天然果汁（濃縮果汁還元）に、当該果汁２００ｍｌ当り鶏コラーゲンペプチド（ＦＰ処理物）５００ｍｇを混合した後、常法に準じて殺菌し、アセプティック包装して、果汁製品を得た。
製造例２
ウインナソーセージ用練り肉に、当該練り肉１５ｇ当り鶏コラーゲンペプチド（ＦＰ処理物）５００ｍｇを混合した後、常法に準じてソーセージケーシングに充填し、燻煙し、殺菌し、冷却後に包装し、ウインナソーセージを得た。
［配列表］
（１）材料
新鮮な鶏足と豚皮は出願人会社の工場から調達した。ウサギ肺ＡＣＥ、Ｈｉｐ−ＨＬ（Ｂｚ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ）、ペプシン、トリプシン、キモトリプシンはシグマ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。コクラーゼＰ（三共ライフテック社製、東京、日本）、アマノＮ、ＡアマノＧ及びプロレザー（いずれも天野エンザイム社製、愛知、日本）、スミチームＫＰ、スミチームＦＰ及びスミチームＬＰ（いずれも新日本化学工業社製、愛知、日本）は市販品を使用した。ペプチド合成試薬は島津（京都、日本）より購入した。その他の試薬は和光純薬（大阪、日本）より購入した。
（２）ＡＣＥ阻害活性測定
ＡＣＥに対する阻害活性の測定はＣｈｅｕｎｇらの方法（Ｃｈｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８０，２５５，４０１−４０７）に従って行った。具体的には、最終容量が０．２５ｍｌとなるように１００ｍＭホウ酸溶液（ｐＨ８．３）、５ｍＭ Ｈｉｐ−ＨＬ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＵ ウサギＡＣＥ及び試験試料を加え、３７℃で３０分間インキュベートをおこなった。酵素反応は１Ｎ ＨＣｌの添加で停止させた。Ｈｉｐ−ＨＬの加水分解の程度は放出された馬尿酸（Ｈｉｐｐｕｒｉｃ ａｃｉｄ）量を吸光値２２８ｎｍで測定した。ＡＣＥを５０％阻害するときの阻害剤濃度をＩＣ５０と定義した。
実施例１
（１）コラーゲンプロテアーゼ分解物及びコラーゲンペプチドの調製
原料の鶏足（ブロイラー由来）を１０倍量の希塩酸中で、２４時間以上撹拌処理し、脱灰と酸膨潤を行った。そして、十分に流水洗浄した後、約２倍量の温水で抽出し、濾過した。濾液をイオン交換樹脂処理し、更に、エキス分１０％以上になるまで濃縮した。この濃縮液にコクラーゼＰ（コラーゲンに対して０．２％）を加え、５０℃，２時間処理した後、加熱して酵素を失活させた。次いで、珪藻土濾過、活性炭処理により精製することにより鶏コラーゲンプロテアーゼ分解物を得た。
得られた鶏コラーゲンプロテアーゼ分解物は、更に６種類の酵素（コクラーゼＰ、アマノＮ、ＡアマノＧ、プロレザー、スミチームＫＰ、スミチームＦＰ、スミチームＬＰ）を用いて酵素分解した。使用した酵素の性状を表１に示す。
この酵素分解反応は、５０℃、プロレザーについてはｐＨ１０．０、その他の酵素についてはｐＨ６．０で４時間から２４時間酵素処理し（原料に対し、１％酵素添加）、各酵素処理は２０分間の加熱により酵素を失活させ、遠心処理を行って上清を採取することによりコラーゲンペプチドを得た。
酵素分解前のコラーゲンでは阻害活性が認めらないなかったが、鶏コラーゲンプロテアーゼ分解物は阻害剤無添加の場合に対し、約３０％の阻害活性を示した（図１の処理前）。
鶏コラーゲンプロテアーゼ分解物を、更に酵素処理を行って得られたコラーゲンペプチドは、２倍近い活性の上昇が認められた。各酵素処理の中でもスミチームＦＰ（以下、単にＦＰという）酵素処理したものに、高い活性が認められた。
（２）分子量分画した画分のＡＣＥ阻害作用
上記ＦＰ酵素処理したコラーゲンペプチドを、限外濾過膜を用いて分子量３０００で分画を行い、各々の画分のＡＣＥ阻害活性の強さを比較した。その結果を表２に示した。表２に示されるように、低分子側画分（分子量３０００以下）に高い活性が認められた。
畜種によるコラーゲンペプチドのＡＣＥ阻害活性を比較するため、豚皮を原料として、実施例１（１）と同様の方法で豚コラーゲンペプチドを調製し、そのＡＣＥ阻害活性を測定した。その結果を図２に示す。
図２に示されるように、豚コラーゲンペプチドもＡＣＥ阻害活性を有し、高分子側に比べて低分子側の方が強い活性を有していた。鶏と同様にＦＰ酵素処理したものの活性が最も強かった。
しかし、そのＡＣＥ阻害活性は鶏コラーゲンペプチドの方が強かった。この理由としては、（ａ）豚コラーゲンの方がプロテアーゼによる分解を受けやすく、ＡＣＥ阻害活性を示せないほどに低分子化（単体のアミノ酸）しやすいことと、（ｂ）鶏コラーゲンの方が、内因的にＡＣＥ阻害活性を発現しやすいアミノ酸配列を有していることが推察された。
実施例３（消化酵素処理によるＡＣＥ阻害活性への影響）
鶏コラーゲンペプチド（ＦＰ処理物）及び豚コラーゲンペプチド（ＦＰ処理物）を摂取した際に、体内でもＡＣＥ阻害活性が維持されるのか、モデル消化系を用いて検討を行った。
即ち、ＦＰ酵素処理鶏コラーゲンペプチド及び豚コラーゲンペプチド溶液（ｐＨ３．０）に、タンパク質重量に対し１％となるようにし、酵素反応液のｐＨを各酵素の至適ｐＨに調整した後、ペプシン（ｐＨ３．０）又はトリプシン／キモトリプシン（ｐＨ７．０）を添加し、３７℃で１時間処理を行った。反応終了後、前述と同様に限外濾過膜を用いて分子量３０００で分画を行い、低分子画分（分子量＜３０００）と高分子画分（分子量＞３０００）に分離した。
上記の消化酵素処理物及び分画画分について、ＡＣＥ阻害活性の測定を行った。その結果を図３に示す。
図３に示されるように、ＦＰ酵素処理鶏コラーゲンペプチド及び豚コラーゲンペプチドは、消化酵素処理（Ｐ：ペプシン処理、Ｔ／Ｃ：トリプシン／キモトリプシン処理）することによってもＡＣＥ阻害活性を維持しており、特に鶏コラーゲンペプチドの低分子画分は強い活性を示した。
実施例４（ＳＨＲにおける血圧上昇抑制作用）
鶏コラーゲンペプチド（ＦＰ処理物）をＳＨＲに投与し、血圧変動を経時的に測定した。
具体的には、雄ＳＨＲ（８週齢；チャールズリバー）は市販の非精製餌（ＡＴＮ−７６；オリエンタル酵母）と水で２３℃、湿度５５％に調整された部屋で飼育した。本試験には、血圧が十分に上昇したことが確認できた週齢のものを使用した。試験時に、生理的食塩水（コントロール群）又は鶏コラーゲンペプチド（ＦＰ処理物）を経口的に投与（３又は６ｇ／ｋｇ ｗｅｉｇｈｔ）し、血圧変動を２４時間測定した（単回投与系）。
また、同様に雄ＳＨＲに、鶏コラーゲンペプチド（ＦＰ処理物）を毎日経口的に投与（６ｇ／ｋｇ ｗｅｉｇｈｔ）し、血圧変動を４週間測定した（長期投与系）。
なお、ラット尾動脈圧は非観血式血圧測定器（Ｓｏｆｔｒｏｎ９８Ａ、Ｓｏｆｔｒｏｎ、東京、日本）で測定を行なった。データの解析はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔにより処理した。その結果を図４に示す。
単回投与系においては、コントロール群ＳＨＲに対し、鶏コラーゲンペプチドを投与したＳＨＲは投与後２時間後から血圧が低下し、６時間で最低血圧を記録した（図４Ａ参照）。
また、長期投与を行った場合は、鶏コラーゲンペプチドの投与で、１週目より血圧の低下が認められ、３週目には有意な血圧低下が認められた（ｐ＜０．０５）（図４Ｂ参照）。
ナトリウム、カリウム、カルシウムなどの血清ミネラル成分は血圧に影響を及ぼすことが知られているが、４週間にわたる長期投与の後でもコントロール群と鶏コラーゲンペプチド投与群に違いは認められなかった（表３参照）。血圧が上昇するメカニズムには種々の理由が存在する。アドレナリン、ノルアドレナリンなどのカテコールアミンは神経性の調圧因子としてよく知られているし、血清ミネラル成分のナトリウム、カリウム、カルシウムも血圧に影響する。今回鶏コラーゲンペプチドを投与したＳＨＲにおいても血清ミネラル成分が多く検出されると予想されたが、４週間にわたる長期投与の後でも血圧に影響すると考えられるこれらの成分に大きな違いは認められなかった。従って、本発明のペプチドの血圧上昇抑制作用の作用機序はＡＣＥの阻害作用であると考えられる。
鶏コラーゲンペプチド（ＦＰ処理物）のヒトでの効果を調べるために、被験者の事前の了解を得て、以下の試験条件で単回摂取試験と長期摂取試験を実施した。
（１）単回摂取試験（１日間、被験者：Ａ及びＢの２名）
被験者に、試験食（ペプチド量として７．８ｇ）を摂取後、安静時血圧を２時間毎に８時間まで測定した。
前日にプラセボ食を摂取時の値との前後比較で評価した。その結果を図５に示す。
図５に示されるように、摂取４時間後に最高血圧の中央値が低下する傾向を示した。
（２）長期摂取試験（２８日間、被験者：１４名）
被験者に、試験食（１日当たりのペプチド摂取量として５．２ｇ）を毎日摂取させ、２週間毎に４週間後まで血圧変動を測定した。各人について、摂取前の値との前後比較で評価した。その結果を図６に示す。
図６に示されるように、長期投与試験の結果、本試験食の摂取前と２週後と４週後の測定値の各々に有意差が認められ、本発明の鶏コラーゲンペプチドは、血圧変動を抑制する効果があることが認められた。
本試験の結果より、鶏コラーゲン酵素分解物の１日当たりの望ましい摂取量は、ペプチド量として１〜１０ｇ、より好ましくは２〜８ｇと考えられる。
実施例６（血管修復作用向上への影響：ＥＰＣコロニーアッセイ）
本発明のコラーゲンペプチドの摂取が、血圧を下げるだけでなく、血管機能の改善効果があることをＥＰＣ（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）コロニーアッセイで確認した。このＥＰＣは骨髄で産生される血管内皮細胞の前駆体で、末梢血中のＥＰＣは炎症や虚血、酸化ストレスなどの組織障害を感知し、細胞の修復を担う。高血圧症や高脂血症、糖尿病の患者ではＥＰＣの機能が低下しており、血管障害の程度と高い相関を示すことが知られている。
より具体的には、上記実施例５の血圧試験の被験者血液を使用した。つまり、本発明のコラーゲンペプチド摂取期間前後の被験者血液を同量（１０ｍｌ）採取し、１０００ｇ、３０ｍｉｎで遠心し、沈殿した細胞を細胞培養液を満たしたシャーレに播種し、３７℃，５％ＣＯ２，１週間培養後、本発明のコラーゲンペプチド摂取期間前後でコロニー数が増加したかどうか、形成されるコロニー形態に違いがないかを調べた。ＥＰＣコロニーアッセイにおけるコロニー数の変化を図７に、コロニーの形態の変化を図８に示す。
本試験の結果として、ＥＰＣコロニーアッセイにより、本発明のコラーゲンペプチドの摂取後において、形成されるコロニー数が増加し、コロニーの形態が改善されることが判明し、本発明のコラーゲンペプチドは、血圧を下げるだけでなく、血管の状態を改善する作用（血管保全作用）を有することが確認された。
実施例７（ＡＣＥ阻害ペプチドの単離・精製）
酵素処理によって得られた鶏コラーゲンペプチドからＡＣＥ阻害ペプチドを単離するため、逆相ＨＰＬＣ（ＣＨ３ＣＮ；８−４０％ ｉｎ ０．１％ ＣＦ３ＣＯＯＨ）によって分画を行った。溶出ピークは２２０ｎｍで検出を行った。
まず、図９Ａに示されるように、溶出時間に従い、すべてのクロマトを６つに分画（Ｆｒａｃ．１−Ｆｒａｃ．６）し、ＡＣＥ阻害活性の比較を行った（表４Ａ参照）。
その結果、Ｆｒａｃ．４に強い活性が認められたので、画分を濃縮し、アセトニトリルでの溶出条件を穏やかにして（０．４％／ｍｉｎ）再度ＨＰＬＣに供した（図９Ｂ参照）。得られたピークを溶出時間毎に分画し（Ｆｒａｃ．４−１〜Ｆｒａｃ．４−４）、ＡＣＥ阻害活性を比較した（表４Ｂ参照）。
最も高い活性が認められたＦｒａｃ．４−３は、各ペプチドを単離するため、濃縮を行い、アセトニトリルでの溶出条件を更に穏やかにして（０．１６％／ｍｉｎ）ＨＰＬＣに供した（図９Ｃ参照）。得られたピークはプロテインシークエンサーによりアミノ酸配列の決定を行った。
図９Ｃ得られた各ピークのアミノ酸配列及び質量分析の結果を表５に示した。
表５に示されるように、ピーク８、９、１１及び１２は、それぞれ下記のアミノ酸配列を有するペプチドであった。
Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（配列番号１）
Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ（配列番号２）
Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（配列番号３）
Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ（配列番号４）
上記配列番号１〜４に示されるアミノ酸配列を有するペプチドを、Ｆｍｏｃ固相法により自動ペプチド合成機（ＰＳＳＭ８ 島津）を用いて作製した。脱保護の後、逆相ＨＰＬＣ（ＰＥＧＡＳＩＬ−３００，２０×２５０ｍｍ；Ｓｅｎｓｈｕ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）及び質量分析計ＥＳＩ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ ＬＣ−Ｑ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｎｎｉｇａｎ，Ｓａｎ ｊｏｓｅ，ＣＡ）で確認を行った。
合成されたペプチドのＡＣＥ阻害活性を測定し、その活性（ＩＣ５０）を表５に示した。表５に示されるように、配列番号１〜４で示されるアミノ酸配列からなるペプチドはＡＣＥ阻害活性を有していた。特に配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドは強いＡＣＥ阻害活性を有していた。
鶏ゼラチン溶液（ｐＨ６．０）を調製し、これにコクラーゼＰ（ゼラチンに対して０．２％）を加え、５０℃，３時間処理した後、加熱して酵素を失活させた。次いで、珪藻土濾過、活性炭処理により精製することにより鶏ゼラチンプロテアーゼ分解物を得た。
得られた鶏ゼラチンプロテアーゼ分解物の溶液（ｐＨ６．０）に、スミチームＦＰ（原料に対し、０．５％酵素添加）を添加し、５０℃で４時間酵素処理し、２０分間の加熱により酵素を失活させ、遠心処理を行って上清を採取することによりゼラチンペプチドを得た。
上記で得られたゼラチンペプチドを、限外濾過膜を用いて分子量３０００で分画を行い、低分子側画分（分子量３０００以下）を採取した。以下、分画前のコラーゲンペプチドをＡ２と称し、低分子側画分（分子量３０００以下）をＡ２Ｆと称する。
上記のＡ２及びＡ２Ｆについて、ＡＣＥ阻害活性を測定したところ、それぞれのＩＣ５０は０．５８６ｍｇ／ｍｌ及び０．３２６ｍｇ／ｍｌであった。
実施例９（コラーゲンペプチドによる血管内皮機能改善作用）
血管内皮細胞においては、種々のサイトカインの作用により、ＰＩ３Ｋ−プロテインキナーゼＡｋｔの活性化が起り、それに続いて内皮型一酸化窒素合成酵素（Ｅｎｄｏｔｈｅｒｉａｌ Ｎｉｔｒｉｃ−ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ，ｅＮＯＳ）が活性化され、ＮＯ産生増加を引き起こし、血管新生、血管拡張、単球接着阻害などの血管内皮機能改善をもたらす。ｅＮＯＳの活性化は、そのスレオニン残基とセリン残基のリン酸化により生じるので、ｅＮＯＳのリン酸化を促進する物質はＮＯ産生を増加させ、血管内皮機能の改善効果を有することになる。そこで、本発明のコラーゲンペプチドのｅＮＯＳリン酸化作用を試験した。
（１）供試材料
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）はタカラバイオから、ウシ大動脈血管内皮細胞（ＢＡＥＣ）は大日本住友製薬から購入した。実験に供したＨＵＶＥＣ及びＢＡＥＣは継代数４から６代目までのものを用いた。細胞培養に用いた試薬類（ＤＭＥＭ，ＦＢＳ，Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ）はインビトロジェンから購入した。ｐｈｏｓｐｈｏ−ｅＮＯＳ（Ｓｅｒ１１７７）抗体はＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社から購入した。また抗体の検出には、アマシャム・ファルマシアのＥＣＬｐｌｕｓを用いた。タンパク定量試薬にはバイオラッドのＤＣ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｒｅａｇｅｎｔを使用した。
試験ペプチドであるコラーゲンペプチドとしては、配列番号１に示されるオクタペプチド（合成品、以下ＣＣＯＰという）並びに上記のＡ２及びＡ２Ｆを試験した。
（２）細胞培養
ＨＵＶＥＣ及びＢＡＥＣは１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ，１００μＵ／ｍｌｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ−ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ，５０μｇ／ｍｌ ヘパリン）にて目的の継代数に至るまで培養を行った。リン酸化試験に供する際は０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭで１２時間培養し、ＦＢＳに含まれる成長促進因子などがリン酸化に及ぼす影響を除去した。
（３）リン酸化ｅＮＯＳの検出
リン酸化ｅＮＯＳの検出はＪｕら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．ｃｈｅｍ．１９９８，２７３，２４０２５−２４０２９．）の方法に準じて行った。即ち、ＢＥＡＣを０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭで処理した後、培地に試験ペプチドを０．１％〜０．００１％で添加した。また、ポジティブコントロールとして培地に、溶解させた１００μＭブラジキニン（ＢＫ；シグマ）を添加した。一定時間（３分間）刺激を与えた細胞をＰＢＳで洗浄し、Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（０．１％ ｔｒｉｔｏｎ，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），２０ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭ ＰＭＳＦ，１ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｏｒｔｈｏｖａｎａｄａｔｅ，１ｍＭｌｅｕｐｅｐｔｉｎ−ｐｅｐｓｔａｔｉｎ）で細胞を溶解させて、細胞溶解液を回収した。１５秒間のソニケーション、および１０分間の加熱処理を行った細胞溶解液を遠心処理（１０，０００×ｇ，１０ｍｉｎ）し、ｅＮＯＳを含む上清を得た。タンパク質量を揃えたサンプルは７．５％ゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開させた後、ＰＶＤＦ膜に転写した。５％脱脂粉乳を含むＴＢＳバッファーを用いて室温にて２時間ブロッキングした後、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｅＮＯＳ抗体で４℃、一晩処理した。１次抗体を洗い流した後、ＨＲＰを付けた２次抗体で１時間反応させた。１次抗体、２次抗体をマウントさせたＰＶＤＦ膜はＴＢＳ−Ｔで洗った後、化学発光試薬によりｐｈｏｓｐｈｏ−ｅＮＯＳを検出しＸ線フィルムに焼き付けた。
（４）結果
上記の結果を図１０に示す。本発明の鶏コラーゲンペプチドは、添加濃度依存的にリン酸化シグナルが強くみとめられたことから、ｅＮＯＳを活性化させ、血管内皮機能の改善に寄与すると考えられた。合成ペプチドであるＣＣＯＰにおいても、添加濃度依存的にｅＮＯＳのリン酸化が認められたことから、ＣＣＯＰが鶏由来コラーゲンプロテアーゼ分解物中の血管内皮機能改善に寄与する成分の一つであると考えられた。
製造例１
天然果汁（濃縮果汁還元）に、当該果汁２００ｍｌ当り鶏コラーゲンペプチド（ＦＰ処理物）５００ｍｇを混合した後、常法に準じて殺菌し、アセプティック包装して、果汁製品を得た。
製造例２
ウインナソーセージ用練り肉に、当該練り肉１５ｇ当り鶏コラーゲンペプチド（ＦＰ処理物）５００ｍｇを混合した後、常法に準じてソーセージケーシングに充填し、燻煙し、殺菌し、冷却後に包装し、ウインナソーセージを得た。
［配列表］
Claims (10)
- 血圧上昇抑制作用を有する、鶏又は豚由来コラーゲンのプロテアーゼ分解物。
- 血管保全作用を有する、鶏又は豚由来コラーゲンのプロテアーゼ分解物。
- 鶏又は豚由来コラーゲンのプロテアーゼ分解物であって、分子量が３０００以下（限外濾過膜法）である、血圧上昇抑制作用を有するペプチド。
- 鶏又は豚由来コラーゲンのプロテアーゼ分解物であって、分子量が３０００以下（限外濾過膜法）である、血管保全作用を有するペプチド。
- 配列番号１〜４で示されるアミノ酸配列からなるペプチド。
- 請求項１〜５の何れかに記載されるプロテアーゼ分解物又はペプチドを含有する、血圧上昇抑制作用及び／又は血管保全作用を有する機能性食品。
- 食品の形態が、ハム、ソーセージ等の食肉加工食品、かまぼこ、ちくわ等の水産加工食品、スナック菓子等の菓子類、パン類、バター、粉乳等の乳製品、豆腐、油揚げ等の大豆製品、水、果汁、牛乳、清涼飲料等の飲料である請求項６記載の機能性食品。
- 鶏又は豚由来コラーゲンをプロテアーゼで酵素分解して、血圧上昇抑制作用及び血管保全作用を有するコラーゲンプロテアーゼ分解物を得ることを特徴とするコラーゲンプロテアーゼ分解物の製造方法。
- 請求項８記載のコラーゲンプロテアーゼ分解物を、更にプロテアーゼで酵素分解して、血圧上昇抑制作用及び血管保全作用を有するコラーゲンペプチドを得ることを特徴とするコラーゲンペプチドの製造方法。
- 請求項９記載のコラーゲンペプチドを、分子量分画に付し、分子量３０００以下（限外濾過膜法）の画分を採取し、血圧上昇抑制作用及び血管保全作用を有するコラーゲンペプチドを得ることを特徴とするコラーゲンペプチドの製造方法。
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