TW201709924A - 含有來自動植物之胜肽的血清肌肽分解酵素阻礙用組成物 - Google Patents

含有來自動植物之胜肽的血清肌肽分解酵素阻礙用組成物 Download PDF

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Abstract

提供一種肌肽二肽酶1阻礙用組成物、一種用以阻礙肌肽二肽酶1的材料的使用、以及一種阻礙肌肽二肽酶1的方法。 本發明發現來自動植物之胜肽具有肌肽二肽酶1阻礙作用。本發明提供一種協助認知功能減退等的預防或改善之有效且嶄新的手段。

Description

含有來自動植物之胜肽的血清肌肽分解酵素阻礙用組成物
本發明係關於血清肌肽分解酵素阻礙用組成物。更詳細地來說，本發明係關於包含來自動植物之胜肽作為有效成分的肌肽二肽酶1阻礙用組成物、用以阻礙肌肽二肽酶1的來自動植物之胜肽的使用、阻礙肌肽二肽酶1的方法、以及包含來自動植物之胜肽與血清肌肽的組成物。
肌肽，為由β-丙胺酸與組胺酸構成的雙肽，以高濃度存在於人類等的哺乳動物的肌肉或神經組織。作為肌肽的作用，已知有(1)質子緩衝作用活性、(2)鈣分泌與鈣敏感性控制、(3)抗氧化作用、(4)金屬離子螯合作用、(5)組胺酸/組織胺的胞外供體、(6)高血糖改善作用、(7)抗發炎作用等。此外，關於肌肽的作用，也有糖化終產物的產生抑制、腦缺血所引起的細胞死亡的抑制、阿茲海默症(AD)模型小鼠的類澱粉β蓄積作用、免疫調節作用等的報告。雖然肌肽如此地在體內有助於各式各樣的功 能，但是被肌肽分解酵素分解對藥理學作用的發揮來說已成為一個課題。
已知肌肽分解酵素存在血清肌肽酶(carnosine dipeptidase 1；CNDP1)與組織肌肽酶(carnosine dipeptidase 2；CNDP2)兩種。文獻中顯示其中CNDP1僅存在於高等靈長類(人類及大型猿猴)，不存在於其他幾乎所有的哺乳動物(非專利文獻1)。CNDP1及CNDP2互為相同性高的蛋白質，但是組織分布和酵素的特性不同，認為兩者為各有不同的功能者。
有關CNDP2，例如，已知貝他定(Bestatin)為其阻礙劑(非專利文獻2)，其他還有β-丙胺酸，與Gly-His及L-Pro-L-His之類的直鏈狀雙肽對CNDP2的阻礙有效的報告(專利文獻1)。此外，有關CNDP1，例如雖有啡啉被報告為其阻礙劑(非專利文獻3)，但現況是，著眼於CNDP1活性阻礙的肌肽分解抑制劑鮮為人知。
因為CNDP1及CNDP2如上所述互為相異的蛋白質，所以認為對各自之酵素的阻礙劑也互為不同的物質。事實上，文獻中顯示上述CNDP2阻礙劑貝他定(Bestatin)對於CNDP1的阻礙不具效果(非專利文獻4)。此外，上述揭示的啡啉雖然具有CNDP1的阻礙活性，但已知表現出口服毒性為其副作用。因此，如果能發現更安全的CNDP1阻礙劑，認為也能實現CNDP1活性相關疾病或症狀的臨床應用。
關於CNDP1，非專利文獻5中確認了，將人 類血清肌肽酶(CNDP1)基因導入至db/db小鼠的動物模型中，從幼年期即出現表現出高空腹血糖值和HbAlc值，並表現出體重減少等類糖尿病症狀。即暗示了，血清肌肽酶(CNDP1)所造成的肌肽分解亢進，成為疾病發病原因的可能性。因此，認為血清肌肽分解酵素(CNDP1)阻礙劑可以作為，將L-肌肽有效率地送至血漿、標靶器官或其他器官，提高對糖尿病或氧化壓力、糖化終產物的產生所引起的各種疾病之預防效果的方法。
此外，在非專利文獻6等複數的文獻中，有確認了血清肌肽酶(CNDP1)基因中特定基因多型性((CTG)n)與糖尿病性腎異常的發病之間的關係之報告。與此相關地，已有非專利文獻7報告保有同型結合型(CTG)5者糖尿病性腎異常的發病風險低，且血清肌肽酶的活性低。因此，認為抑制血清肌肽酶活性對維持肌肽活性是重要的，且有對相關疾病的預防和治療有效的可能性。
此外，作為人類的肌肽口服攝取後的體內動態實驗的驗證例，可以舉出非專利文獻8。根據該文獻，攝取肌肽60mg/kg之後，在各個時間的肌肽血中濃度之個人差異大，也存在血中肌肽濃度和攝取前相比沒有顯著上升的被實驗者(25人中17人)，而且上升獲得確認的群與沒有獲得確認的群相比，血清肌肽酶的活性與蛋白質質量為顯著的低。因此認為抑制血清肌肽酶(CNDP1)的作用對維持血中肌肽濃度有效的可能性高。
如此，由於CNDP1在作為哺乳動物尤其是人 類的體內造成各種影響，迫切需求一種用以有效阻礙其活性之安全性高的藥劑。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]國際公開WO2004/064866號
[非專利文獻]
[非專利文獻1] Clin. Chim. Acta, 1991, 196, 193-205。
[非專利文獻2] Biol. Chem. Hoppe Seyler, 1988, 369, 1281-1286。
[非專利文獻3] Molecules, 2014, 19, 2299-2329。
[非專利文獻4] Clin. Chim. Acta 1982, 123, 221-231。
[非專利文獻5] Diabetes, 2007, 56, 2425-2432. Epub 2007 Jun 29。
[非專利文獻6] Diabetes, 2007, 56, 2410-2413。
[非專利文獻7] Diabetes, 2005, 54, 2320-2327。
[非專利文獻8] Am. J. Physiol. Renal. Physiol., 2012, 302(12), F1537-F1544。
本發明的課題在於，提供一種生物安全性高，且有助於維持肌肽的血中濃度之血清肌肽分解酵素(CNDP1)阻礙用組成物。此外，本發明的課題在於，提供一種用以阻礙CNDP1之材料的使用、一種阻礙CNDP1的方法、以及生物安全性高，且有助於維持肌肽的血中濃度之組成物等。
本發明者們針對上述課題進行專注探討的結果，首次發現膠原蛋白肽、茶肽以及大豆肽具有血清肌肽分解酵素(CNDP1)的阻礙活性。本發明者們基於這些發現而完成本發明。
即，本發明與以下有關，但並不被限定於此等。
(1)一種肌肽二肽酶1阻礙用組成物，其含有來自動植物之胜肽。
(2)如(1)之肌肽二肽酶1阻礙用組成物，其中來自動植物之胜肽為來自膠原蛋白、茶、或大豆。
(3)如(1)或(2)之肌肽二肽酶1阻礙用組成物，其係認知功能減退、糖尿病、免疫功能減退、血管或組織發炎、因氧化壓力或糖化終產物的產生而引起的各種疾病、阿茲海默症、或自閉症的預防或改善用。
(4)如(1)~(3)中任一項之肌肽二肽酶1阻礙用組成物，其中來自動植物之胜肽為熱處理物。
(5)如(1)~(4)中任一項之肌肽二肽酶1阻礙用組成物，其係附有透過阻礙肌肽二肽酶1而發揮的功能的聲明。
(6)如(5)之肌肽二肽酶1阻礙用組成物，其中功能聲明為選自由「抑制認知功能的減退」、「期待認知功能的維持」、「抑制血糖值的上升」、「提高免疫功能」、「期待抗氧化作用」、「減低氧化壓力」、「期待抗糖化作用」、「減低糖化壓力」、「抑制血管的發炎」、「期待阿茲海默症的預防或改善」、以及「期待自閉症的預防或改善」所成群者。
(7)如(1)~(6)中任一項之肌肽二肽酶1阻礙用組成物，其中前述組成物為藥劑。
(8)一種來自動植物之胜肽的使用，其係用以阻礙肌肽二肽酶1。
(9)如(8)之使用，其中來自動植物之胜肽為熱處理物。
(10)一種阻礙肌肽二肽酶1的方法，其係使用來自動植物之胜肽。
(11)如(10)之方法，其中來自動植物之胜肽為熱處理物。
藉由本發明，可以提供具有優異血清肌肽分解酵素(CNDP1)阻礙效果的組成物。若利用本發明之組成 物，則隨著CNDP1的功能抑制可以得到肌肽的分解延遲效果，因此能實現將較高濃度的肌肽有效地送至血漿、標靶器官或其他器官。因此，本發明之組成物，對於提高肌肽原本相關的已知之各種藥理學作用(對於伴隨精神分裂症之認知功能減退、糖尿病、免疫功能減退、血管或組織發炎、因氧化壓力而引起的各種疾病發病、阿茲海默症、自閉症的預防、改善效果)可為有效。
可認為因為本發明之組成物中所包含的來自動植物之胜肽，由於多數被當作食品材料利用等，所以安全性高，副作用和傳統的醫藥品相比極少。
[圖1]圖1為，圖示肌肽的體內動態之圖。
[圖2]圖2為，研究茶肽熱處理物的血中肌肽分解抑制作用之圖。
1‧肌肽二肽酶1及肌肽二肽酶1阻礙
本說明書中所謂的「肌肽二肽酶1」，是指可以將肌肽(L-肌肽)分解成β-丙胺酸與組胺酸的血清型肌肽分解酵素。肌肽二肽酶(肌肽分解酵素)可以簡略表示為CNDP(carnosine dipeptidase)，而且也被稱為肌肽酶或肌肽降解 酶。肌肽二肽酶包含血清(型)肌肽分解酵素CNDP1與組織(型)肌肽分解酵素CNDP2。其中被設為本發明對象的肌肽二肽酶的是CNDP1，有別於CNDP2。
本說明書中所謂的「肌肽二肽酶1阻礙」，是指阻礙肌肽二肽酶1的肌肽分解活性。肌肽二肽酶1的阻礙作用，可以按照眾所周知的方法評估。例如，使肌肽與肌肽二肽酶1接觸時，有組胺酸從肌肽生成，此時由組胺酸的存在可以測量組胺酸特有的螢光，所以經由研究該螢光強度的減退，可以評估肌肽二肽酶1的阻礙作用。
2‧來自動植物之胜肽
本發明中所謂的「來自動植物之胜肽」，包含來自動物之胜肽以及來自植物之胜肽兩個概念。在這裡所謂的「來自動物之胜肽」，只要沒有特別聲明，意指經由對來自動物的蛋白質、或是包含蛋白質的動物組織施以已知的分解處理(熱或壓力的分解處理、酸或鹼的分解處理、酵素的分解處理等)並且低分子化而產生的胜肽。而所謂的「來自植物之胜肽」，只要沒有特別聲明，意指經由對來自植物的蛋白質、或是包含蛋白質的植物體或植物組織施以已知的分解處理(熱或壓力的分解處理、酸或鹼的分解處理、酵素的分解處理等)並且低分子化而產生的胜肽。此外，本發明中來自動植物之胜肽，也可以是對以這樣的方式所得到的胜肽更進一步進行加熱等處理者。
本發明中所使用的胜肽，可以為能從動物或 植物取得的一種胜肽，也可以為兩種以上的胜肽的混合物。構成來自動植物之胜肽的胺基酸的個數，雖無特殊限制，但以2~數十個(具體來說，2~10個、2~15個、2~20個、2~25個、2~30個、2~35個、或是2~40個)為佳，以2~數個(具體來說，2~3個、2~4個、2~5個、2~6個、2~7個、2~8個、或是2~9個)(即，寡肽)為更佳。
本發明中來自動植物之胜肽，以使用分子量5000以下的胜肽的比例高者為佳，以使用分子量3000以下的胜肽的比例高者為更佳，以使用分子量1000以下的胜肽的比例高者為特佳。在這裡，所謂的「胜肽的比例高」，意指相當於來自動植物之胜肽全體的至少50%為該胜肽的狀態。該分子量的測量，可以利用本領域中具有通常知識者眾所周知的方法及設備(HPLC等)來進行。
作為來自動物之胜肽，雖無特殊限制，但例如能利用從哺乳動物(牛、豬等)、鳥類(雞等)、魚類(竹莢魚、沙丁魚、鮭魚、鰹魚等)、蛋(雞蛋等)、乳(牛乳等)取得的胜肽。作為從此等取得之胜肽的具體例子，可以舉出來自膠原蛋白、白蛋白、酪蛋白、胎盤、球蛋白等之胜肽。於本發明，來自膠原蛋白之胜肽適合地被使用作為來自動物之胜肽。
作為來自植物之胜肽，雖無特殊限制，但例如能利用來自豆類、葉類、種子類、芋類等植物之胜肽。作為豆類，例如可舉出大豆、紅豆、黑豆等。作為葉類，例如可舉出茶(綠茶、紅茶、烏龍茶)等。作為種子類，例 如可舉出大麥、小麥(包含小麥胚芽)、麥芽、芝麻、米等。作為芋類，例如可舉出甘藷、馬鈴薯等。於本發明，作為來自植物之胜肽，以來自大豆或茶之胜肽為佳，以來自茶之胜肽為更佳。
於本說明書，有時候會將來自動植物之胜肽(來自動物之胜肽及來自植物之胜肽)中「來自...之」的記載省略。例如，在「來自膠原蛋白之胜肽」的情況，有時將之稱為「膠原蛋白肽」。此外，例如，在「來自大豆之胜肽」的情況，有時將之稱為「大豆肽」。此時，兩者能互換使用。
來自動植物之胜肽，雖無特殊限制，但可以是將來自動物的蛋白質或是包含蛋白質的動物組織、或者是來自植物的蛋白質或是包含蛋白質的植物體或植物組織，以一直以來眾所周知的方法進行分解處理而得。作為相關的分解處理，可以舉出熱或壓力的分解處理、酸或鹼的分解處理、酵素的分解處理等。無論在哪一種處理，皆能使用水或乙醇等作為溶劑。若是用酵素的分解處理，則可以視其目的適當地使用各種蛋白質分解酵素(蛋白酶)。
來自動植物之胜肽，可以使用利用眾所周知的方法自行調配者，也可以使用市售品。作為市售的來自動物之胜肽，例如可以舉出Nippi Peptide(Nippi.Inc.)、Ixos HDL、膠原蛋白肽800F、超級膠原蛋白肽SCP、發酵膠原蛋白肽LCP(以上，Nitta Gelatin Inc.)等的膠原蛋白肽等。此外，作為市售的來自植物之胜肽，例如可以舉 出，Hinute AM、Hinute DC、Hinute HK(以上，Fuji Oil Co.,Ltd.公司製)等的大豆肽，Oryza peptide-P60(Oryza Oil&Fat Chemical Co.,Ltd.公司製)等的米肽，麩胺酸肽GP-1N、麩胺酸肽GP-N(以上，Nisshin Pharma Inc.公司製)等的小麥肽，芝麻肽KM-20(Kisco Ltd.公司製)等的芝麻肽。
本發明中來自動植物之胜肽，亦可為對上述胜肽更進一步施以熱處理者。熱處理，例如可以利用本領域技術人員眾所周知的耐壓性萃取設備、壓力鍋、及高壓釜等來進行，但並不被限定於此等。本發明中來自動植物之胜肽的熱處理，也可以參考國際公開第2014/200000號中所揭示的方法來進行。此外，來自動植物之胜肽，也可以是在熱處理之前及/或之後進行固液分離者。經由進行固液分離的處理，可以回收液部，於是能夠僅處理固體。固液分離，使用過濾及/或離心分離等手段。此外，來自動植物之胜肽，也可以是在熱處理後更進一步施以精製處理者。精製處理，可以利用眾所周知的方法及設備進行。此外，來自動植物之胜肽，也可以是更進一步進行澄清化處理者。澄清化處理，可以利用眾所周知的方法及設備進行，透過該處理可以增加添加來自動植物之胜肽的組成物的設計自由度。此外，來自動植物之胜肽，也可以是利用眾所周知的方法及設備而冷凍乾燥或粉末化者。
本發明中來自動植物之胜肽，雖無特殊限制，但是可以在100℃以上的溫度及超過大氣壓的壓力下 進行熱處理。該溫度，以105℃以上、110℃以上、115℃以上、120℃以上、125℃以上、130℃以上、或是135℃以上為佳。而且，該溫度，以170℃以下、165℃以下、160℃以下、155℃以下、150℃以下、145℃、或是140℃以下為佳。再者，這個溫度代表，在使用耐壓萃取設備作為加熱設備的情況下，萃取管柱之出口溫度的測量值，且代表在使用高壓釜作為加熱設備的情況下，壓力容器內中心溫度的溫度測量值。
有關熱處理的壓力條件，只要是超過大氣壓力則其數值並無特殊限制，但以0.101MPa以上、0.15MPa以上、0.2MPa以上、0.25MPa以上、或是0.3MPa以上為佳。而且，該壓力，以0.79MPa以下、0.75MPa以下、0.7MPa以下、0.65MPa以下、0.6MPa以下、0.55MPa以下、0.5MPa以下、或是0.48MPa以下為佳。
熱處理的處理時間，亦無特殊限制。該處理時間，例如，為15分鐘~600分鐘左右，以30分鐘~500分鐘左右為佳、以60分鐘~300分鐘左右為更佳。再者，本發明中用來得到來自動植物之胜肽熱處理物的更適當熱處理條件為，例如，在以橫軸為時間(min)，以縱軸為溫度(℃)的座標系中，保持在被下列座標系(i)~(vi)所包圍的時間及溫度範圍內的加熱處理。(i)(170℃，30min)、(ii)(150℃，30min)、(iii)(115℃，180min)、(iv)(105℃，480min)、(v)(135℃，480min)、(vi)(150℃，180min)。
本發明中熱處理的條件，並無特殊限制，但是關於溫度、壓力及時間例如可以設定如下：(溫度、壓力、時間)=(105℃~170℃、0.101MPa~0.79MPa、15分鐘~600分鐘)、(105℃~170℃、0.101MPa~0.79MPa、30分鐘~500分鐘)、(105℃~170℃、0.101MPa~0.79MPa、60分鐘~300分鐘)、(105℃~170℃、0.15MPa~0.48MPa、15分鐘~600分鐘)、(105℃~170℃、0.15MPa~0.48MPa、30分鐘~500分鐘)、(105℃~170℃、0.15MPa~0.48MPa、60分鐘~300分鐘)、(110℃~150℃、0.101MPa~0.79MPa、15分鐘~600分鐘)、(110℃~150℃、0.101MPa~0.79MPa、30分鐘~500分鐘)、(110℃~150℃、0.101MPa~0.79MPa、60分鐘~300分鐘)、(110℃~150℃、0.15MPa~0.48MPa、15分鐘~600分鐘)、(110℃~150℃、0.15MPa~0.48MPa、30分鐘~500分鐘)、(110℃~150℃、0.15MPa~0.48MPa、60分鐘~300分鐘)、(120℃~140℃、0.101MPa~0.79MPa、15分鐘~600分鐘)、(120℃~140℃、0.101MPa~0.79MPa、30分鐘~500分鐘)、(120℃~140℃、0.101MPa~0.79MPa、60分鐘~300分鐘)、(120℃~140℃、0.15MPa~0.48MPa、15分鐘~600分鐘)、(120℃~140℃、0.15MPa~0.48MPa、30分鐘~500分鐘)、(120℃~140℃、0.15MPa~0.48MPa、60分鐘~300分鐘)等。
作為本發明中來自動植物之胜肽的適合態樣，為膠原蛋白肽、茶肽、以及大豆肽。以下，針對這些 來自動植物之胜肽做說明。
(膠原蛋白肽)
本說明書中所謂的「膠原蛋白肽」，是指經由對膠原蛋白本身或者膠原蛋白的粉碎物施以酵素處理或熱處理，將膠原蛋白低分子化而得到的低分子胜肽。膠原蛋白為動物結締組織的主要蛋白質，是包含人類在內的哺乳類身體內含量最大的蛋白質。所得到的低分子胜肽，也可以視需要進一步進行過濾、離心分離、濃縮、超過濾、冷凍乾燥、粉末化等處理。
(茶肽)
本說明書中所謂的「茶肽」，是指經由對茶(包含茶葉和茶葉渣)本身或茶萃取物進行酵素處理或熱處理，將蛋白質低分子化而得的來自茶之低分子胜肽。作為萃取原料的茶葉，可以使用以茶樹(學名：Camellia sinensis)所製造之茶葉的葉、莖等，萃取後可以飲用的部位。而且，其形態也無限制，可為大葉、粉狀等。茶葉的採收期也可以配合所期望的香味適當地選擇。所得到的低分子胜肽，也可以視需要進一步進行過濾、離心分離、濃縮、超過濾、冷凍乾燥、粉末化等處理。
本發明中所使用的茶萃取物，以副產物含有量少，香味好者為佳。從香味的觀點來看，作為原料的茶葉以使用煎茶、粗茶、焙茶、玉露、冠茶、甜茶等的蒸製 不發酵茶(綠茶)、或嬉野茶、青柳茶、各種中國茶等的炒青茶等的不發酵茶為佳。
(大豆肽)
本說明書中所謂的「大豆肽」，是指經由對大豆蛋白質本身或大豆蛋白質進行酵素處理或熱處理，經由將蛋白質低分子化而得的低分子胜肽。作為原料的大豆(學名：Glycine max)可以不限品種或產地等使用，也可使用粉碎品等加工品階段的大豆。所得到的低分子胜肽，也可以視需要進一步進行過濾、離心分離、濃縮、超過濾、冷凍乾燥、粉末化等處理。
3‧肌肽二肽酶1阻礙用組成物 3-1‧含有來自動植物之胜肽的肌肽二肽酶1阻礙用組成物
本發明的其中一個態樣為，包含來自動植物之胜肽作為有效成分的肌肽二肽酶1阻礙用組成物。
本發明之肌肽二肽酶1阻礙用組成物中來自動植物之胜肽的含有量，只要是考慮其給藥方式、給藥方法等，且能得到本發明所期望的效果的份量即可，並無特殊限制。例如，來自動植物之胜肽的含有量為，相對於本發明之肌肽二肽酶1阻礙用組成物的總重量為0.1重量%以上、以0.2重量%以上為佳、以0.3重量%以上為更佳。而且，來自動植物之胜肽的含有量為，相對於本發明之肌 肽二肽酶1阻礙用組成物的總重量為30重量%以下、以20重量%以下為佳、以10重量%以下為更佳。典型地來說，來自動植物之胜肽的含有量為，相對於本發明之肌肽二肽酶1阻礙用組成物的總重量為0.1重量%~30重量%、以0.2重量%~20重量%為佳、以0.3重量%~10重量%為更佳。再者，只要沒有特別聲明，本說明書中使用的「重量%」，意指重量/容量(w/v)。
3-2‧作用機制
如上所述，因肌肽二肽酶1受到抑制，被肌肽二肽酶1分解的肌肽在人類等哺乳動物的體內濃度會維持，或是該濃度的降低會受到抑制。作為肌肽的作用，可以舉出質子緩衝作用活性、鈣分泌與鈣敏感控制、抗氧化作用、金屬離子螯合作用、組胺酸/組織胺的胞外供體、高血糖改善作用、抗發炎作用、糖化終產物的產生抑制、腦缺血所引起的細胞死亡的抑制、阿茲海默症(AD)模型小鼠的類澱粉β蓄積作用、免疫調節作用等。因此，藉由維持肌肽在體內的高濃度，基於類澱粉β蓄積作用可以得到伴隨精神分裂症之認知功能減退或阿茲海默症、自閉症的預防或是改善效果、基於高血糖改善作用可以得到糖尿病或是氧化壓力或糖化終產物的產生所引起的各種疾病發病之預防或改善效果，基於抗發炎作用可以得到血管或組織的發炎的預防或改善效果，基於免疫調節作用可以得到免疫機能減退的預防或改善效果。
3-3‧其他成分
本發明之肌肽二肽酶1阻礙用組成物，可以視其形態，在來自動物或植物的材料以外，含有任意的添加劑、一般常用的任意成分。作為此等之添加劑及/或成分之例，在維生素E、維生素C等的維生素類、礦物質類、營養成分、香料等的生理活性成分以外、可以舉出在製劑化過程中搭配的賦形劑、黏合劑、乳化劑、張力劑(等滲壓劑)、緩衝劑、溶解輔助劑、防腐劑、穩定劑、抗氧化劑、著色劑、凝固劑、或塗覆劑等，但並不被限定於此等。
3-4‧用途
本發明之肌肽二肽酶1阻礙用組成物，以含有前述之來自動物或植物的材料(即，來自動植物之胜肽)為有效成分為特徵，該材料阻礙肌肽二肽酶1的活性，而且被肌肽二肽酶1分解的肌肽的體內濃度會維持，或是該濃度的降低會受到抑制。藉由維持肌肽在體內的高濃度，可以有效地進行認知功能減退、糖尿病、免疫功能減退、血管或組織發炎、因氧化壓力或糖化終產物的產生而引起的各種疾病、阿茲海默症、或自閉症的預防或改善。因此，本發明之組成物被用於認知功能減退、糖尿病、免疫功能減退、血管或組織發炎、因氧化壓力或糖化終產物的產生而引起的各種疾病、阿茲海默症、或自閉症的預防或改善。基於 這些用途，本發明之肌肽二肽酶1阻礙用組成物也能成為認知功能減退、糖尿病、免疫功能減退、血管或組織發炎、因氧化壓力或糖化終產物的產生而引起的各種疾病、阿茲海默症、或自閉症的預防或改善用組成物。再者，本說明書的「預防或改善」中，包含使現在的狀態成為更佳的狀態與防止現在的狀態成為更差的狀態兩方面的概念，因此治療、恢復、減輕、緩和等用語也可以被包含於此。
本發明之肌肽二肽酶1阻礙用組成物，可以按照眾所周知的方法，製劑化為錠劑(包含包覆錠劑)、顆粒劑、散劑、粉末劑、或膠囊等固體劑、和普通液劑、懸浮劑、或乳劑等液劑。這些組成物可以直接和水等一起服用。此外，調配為可以簡單地搭配的形態(例如，粉末形態和顆粒形態)之後，例如，可以作為醫藥品的原材料使用。
本發明之肌肽二肽酶1阻礙用組成物，作為其中一例，可以以藥劑的形式提供，但並不被限定於此形式。也可以將該藥劑直接作為組成物提供，或是作為包含該藥劑的組成物提供。作為本發明之組成物，可以舉出醫藥組成物、飲食品組成物、食品組成物、飲料組成物、化妝用組成物等，但並不被限定於此等。作為食品組成物的非限制性的例子，可以舉出功能性食品、健康輔助食品、營養功能食品、特別用途食品、特定保健用食品、營養輔助食品、飲食療法用食品、健康食品、補充劑、食品添加劑等。
本發明之肌肽二肽酶1阻礙用組成物，無論是在治療性用途(醫療用途)或是在非治療用途(非醫療用途)皆可適用。具體地來說，可以舉出作為醫藥品、準醫藥品及化妝料等的使用，還可以舉出，在藥事法上雖然不屬於此等，但作為明示地或暗示地訴求認知功能減退、糖尿病、免疫功能減退、血管或組織發炎、因氧化壓力或糖化終產物的產生而引起的各種疾病、阿茲海默症、或自閉症的預防或改善效果等的組成物的使用。
本發明在另一方面，是與附有透過肌肽二肽酶1阻礙而發揮的功能的聲明之前述肌肽二肽酶1阻礙用組成物有關。這種聲明或功能聲明雖無特殊限制，但是例如可以舉出「抑制認知功能的減退」、「期待認知功能的維持」、「抑制血糖值的上升」、「提高免疫功能」、「期待抗氧化作用」、「減低氧化壓力」、「期待抗糖化作用」、「減低糖化壓力」、「抑制血管的發炎」、「期待阿茲海默症的預防或改善」、以及「期待自閉症的預防或改善」等，或是可以等同於此等之聲明或功能聲明。於本說明書，類似該聲明及功能聲明的聲明，可以附在組成物本身，也可以附在組成物的容器或包裝上。
本發明之肌肽二肽酶1阻礙用組成物，可以視其形態以適當的方法攝取。本發明之組成物，例如，可以做成口服固體製劑、內服液劑或糖漿劑等口服液體製劑、或是注射劑、外用劑、栓劑或經皮吸收劑等的非口服製劑等的形態，但並不被限定於此等。再者，本說明書中 所謂的「攝取」，為被用作包含攝取、服用、或飲用的所有態樣者。
本發明之肌肽二肽酶1阻礙用組成物的適用量，視其形態、給藥方法、使用目的及給藥對象患者或患獸的年齡、體重、症狀適時設定，並非固定不變。本發明之組成物的有效人類攝取量並非固定不變，但是例如為，作為該有效成分來自動物或植物的材料(即，來自動植物之胜肽)的重量，以體重50kg的人類來說，每一天以100mg以上為佳、以500mg以上為更佳、以1000mg以上為進一步更佳，以10g以下為佳、以5g以下為更佳、以3g以下為進一步更佳。而且，在需要的給藥量範圍內，1天之內可以給藥一次或分成數次進行給藥。給藥期間也是任意的。再者，所謂的本發明之組成物的有效人類攝取量，為在人類表現出有效的效果之本發明之肌肽二肽酶1阻礙用組成物的攝取量，該組成物中所包含的來自動植物之胜肽的種類並無特殊限制。
本發明之肌肽二肽酶1阻礙用組成物的攝取對象，雖然以人類為佳，但也可以是牛、馬、山羊等家畜動物、狗、貓、兔子等寵物動物、或者，小鼠、大鼠、天竺鼠、猴子等的實驗動物。在以人類以外的動物作為對象給藥的情況，對每1隻約20g的小鼠，每1天的使用量雖然視組成物中有效成分的含有量、適用對象者的狀態、體重、性別及年齡等的條件而不同，但作為來自動物或植物的材料(即，來自動植物之胜肽)的總搭配量，例如設定成 以能夠攝取到100mg/kg以上的量為佳、以能夠攝取到500mg/kg以上的量為更佳、以能夠攝取到1000mg/kg以上的量為進一步更佳，以能夠攝取到10g/kg以下的量為佳、以能夠攝取到5g/kg以下的量為更佳、以能夠攝取到3g/kg以下的量為進一步更佳即可。
3-5‧與肌肽的組合(並用)
上述來自動植物之胜肽，可以與肌肽並用。為此本發明，作為其中一個態樣，可以提供上述來自動植物之胜肽與肌肽組合而成的組成物(以下也稱為「本發明之並用組成物」)。
透過組合使用上述的來自動植物之胜肽與肌肽，該來自動植物之胜肽的肌肽二肽酶1阻礙作用可以延遲肌肽二肽酶1造成的肌肽分解，並且有效地將該肌肽送至作為標靶的組織或器官。不僅原本存在於體內的肌肽，藉由並用與本發明有關的來自動植物之胜肽與肌肽，可以維持較高的體內肌肽濃度，並且可以有效地增強肌肽的作用。
本發明之並用組成物，因包含來自動植物之胜肽所以可以成為肌肽二肽酶1阻礙用組成物。此外，從肌肽作用效果的增強的觀點來看，本發明之並用組成物以用於上述3-4中說明的用途為佳。即，本發明之並用組成物以認知功能減退、糖尿病、免疫功能減退、血管或組織發炎、因氧化壓力或糖化終產物的產生而引起的各種疾 病、阿茲海默症、或自閉症的預防或改善用組成物為佳。
本發明之並用組成物，雖無特殊限制，但與上述肌肽二肽酶1阻礙用組成物同樣地，作為其中一例可以以藥劑(並用劑)的形式提供。也可以將該藥劑直接作為組成物提供，或是作為包含該藥劑的組成物提供。本發明之並用組成物，可以作為醫藥組成物、飲食品組成物、食品組成物、飲料組成物、化妝用組成物等，但並不被限定於此等。作為食品組成物的非限制性的例子，可以舉出功能性食品、健康輔助食品、營養功能食品、特別用途食品、特定保健用食品、營養輔助食品、飲食療法用食品、健康食品、補充劑、食品添加劑等。
本發明之肌肽為以β-丙胺酸與組胺酸構成的雙肽，也稱為β-丙胺酸組胺酸。肌肽中包含D型(D-肌肽)、L型(L-肌肽)及DL型(DL-肌肽)的任何型，但是在本發明以L型(L-肌肽)及DL型(DL-肌肽)為佳，以L型(L-肌肽)為更佳。再者，D型(D-肌肽)的CAS登錄編號為5853-00-9，L型(L-肌肽)的CAS登錄編號為305-84-0。
本發明中所使用的肌肽，關於其取得方法並無特殊限制，可以是來自動物的天然的肌肽，或以化學合成法等取得的肌肽的任何肌肽。在本發明，適合使用市售之肌肽。此外，本發明之並用組成物中肌肽的含有量，只要是考慮其給藥方式、給藥方法等，且能得到本發明所期望的效果的份量即可，並無特殊限制。
本發明之並用組成物中來自動物或植物的材 料(即，來自動植物之胜肽)與肌肽的量比，為只要能達到本發明所期望的效果的比例即可，並無特殊限制。例如，本發明之並用組成物中該比例(來自動物或植物的材料：肌肽)，作為重量比，為1：300~300：1、以1：30~30：1為佳、以1：3~3：1為更佳、以1：1.5~1.5：1為進一步更佳。
4‧用以阻礙肌肽二肽酶1的來自動物或植物之材料的使用
本發明的一種態樣為，將來自動物或植物之材料(即，來自動植物之胜肽)用以阻礙肌肽二肽酶1之使用。
本發明之使用，包含例如用以預防或改善認知功能減退、糖尿病、免疫功能減退、血管或組織發炎、因氧化壓力或糖化終產物的產生而引起的各種疾病、阿茲海默症、或自閉症之預防或改善之來自動物或植物之材料的使用，但並不被限定於此。此外，該使用為在人類或非人類動物的使用，而且可以是治療性使用，也可以是非治療性的使用。在這裡，所謂的「非治療性」為不包含醫療行為，即不含治療對人體的處理行為的概念。
5‧阻礙肌肽二肽酶1的方法
本發明的其中一個態樣為，使用來自動物或植物的材料(即，來自動植物之胜肽)作為有效成分之阻礙肌肽二肽酶1的方法。此外，與該方法有關的其他態樣為，包含對 需要肌肽二肽酶1阻礙的對象，以來自動物或植物的材料作為有效成分給藥治療有效量之阻礙肌肽二肽酶1的方法。
上述方法中，所謂需要肌肽二肽酶1阻礙的對象，與本發明之肌肽二肽酶1阻礙用組成物之前述適用對象相同。此外，本說明書中所謂的治療有效量為，在將本發明之肌肽二肽酶1阻礙用組成物對上述對象給藥時，與未給藥的對象相比，肌肽二肽酶1的肌肽分解活性受到阻礙的量。作為具體的有效量，視其給藥方式、給藥方法、使用目的及該個體的年齡、體重、症狀做適時設定，並非固定不變。
於本發明之方法，也可以以達到前述治療有效量的方式，將前述來自動物或植物之材料直接給藥，或作為含有來自動物或植物之材料的組成物給藥。
經由本發明之方法，可以實現不產生副作用而阻礙肌肽二肽酶1。
[實施例]
以下，透過實施例更詳細地說明本發明，但並不因此而限定本發明之範圍。本領域技術人員有可能將本發明之方法進行各種變更、修飾再使用，這些也都被包含在本發明之範圍內。
實施例1‧茶肽的調配
作為植物體，使用茶葉(鹿兒島產的初摘茶茶葉(品種：藪北))。首先，對此茶進行減少水溶性蛋白質的前處理(三次的預萃取)。即，對10g茶，加入熱水200g適當地攪拌，進行5分鐘萃取。萃取結束後，以140網目過濾，回收萃取殘渣(茶渣)。對此茶渣，注入200g熱水，進行5分鐘萃取並回收茶渣。再次對此茶渣進行同樣地進行萃取處理並回收茶渣。
接著，對進行了該預萃取的茶(茶渣)，進行酵素分解處理。對茶渣(總量)注入200g 50℃的熱水，添加1g蛋白酶(商品名：PROTIN NY100,Daiwa Fine Chemicals Co.公司製)，一邊用攪拌子攪拌(300rpm)，一邊在55℃的水浴內使之反應3小時。其後，維持95℃，30分鐘使酵素失活。將此酵素處理液，經由冷凍乾燥處理，調配茶肽。
實施例2‧血清肌肽(CNDP1)活性阻礙效果的探討
以膠原蛋白肽(HACP-50,Jellice公司)、大豆肽(Hinute AM,Fuji Oil Co.,Ltd.公司製))、以及上述的茶肽做實驗。人類血清肌肽酶CNDP1，使用recombinant Human Carnosine Dipeptidase 1/CNDP1(R&D systems)。肌肽係使用Tokyo Chemical Industry Co.,Ltd.公司製造的產品。按照以下的步驟，探討在室溫下的血清肌肽(CNDP1)活性阻礙效果。
在1.5mL微量離心管中，添加50μL溶解於緩 衝液(50mM Tris,pH7.5)的2ng/μL CNDP1溶液與25μL各種來自動植物之胜肽的水溶液，以添加25μL溶解於同樣緩衝液的4mM肌肽溶液來開始反應。將反應溶液在室溫下培養60分鐘後，添加50μL溶解於去離子水的1%Trichloroacetic acid(TCA)(Sigma)水溶液，以渦流混合來使反應結束。於反應結束後的樣品中，添加含有5mg/mL o-Phthaldialdehyde(OPA)(Sigma)的1.8M氫氧化鈉水溶液(含有10%DMSO)，混合後在室溫下進一步培養30分鐘。以用緩衝液在15.625~250μM的範圍內製作L-組胺酸稀釋系列，並且同樣地添加TCA及OPA後，培養30分鐘者作為校正曲線溶液。再者，以添加含有相同含有率之DMSO的水取代各種來自動植物之胜肽者為對照組。將樣品及校正曲線溶液總量添加至96 well black plate，利用螢光光度計測量激發波長360nm，螢光波長460nm的螢光強度。
針對結果，以減去用緩衝液取代酵素(CNDP1)添加之樣品的螢光強度的方式來算出修正值，並且將把對照組的螢光強度修正值當作100%時，含有各種來自動植物之胜肽的樣品的螢光強度修正值當作CNDP1殘存活性(%)。其結果示於表1~3。
如表1~3所示，可知膠原蛋白肽、茶肽、及大豆肽無論何者皆有血清肌肽酶(CNDP1)活性的阻礙作用。
實施例3‧來自動植物之胜肽熱處理物的CNDP1活性阻礙效果的探討
以在實施例2使用的各種胜肽的熱處理物作實驗。各種胜肽的熱處理物，按照以下的步驟製造。
(1)膠原蛋白肽熱處理物
將實施例2中使用的膠原蛋白肽在液體中進行高溫高壓處理並製造膠原蛋白肽熱處理物。具體地來說，將膠原蛋白肽以達到250mg/mL的方式加入蒸餾水中，置入高壓釜(Tomy Seiko Co.,Ltd.公司製)，在135℃、0.31MPa、10小時的條件下進行高溫高壓處理。
(2)茶肽熱處理物
對在實施例1所得到的酵素處理液以固液不分離的茶葉體混合物形態，施以加熱處理。加熱處理為，置入高壓釜(Tomy Seiko Co.,Ltd.公司製)，在135℃、0.31MPa、3小時的高溫高壓流體加熱處理。處理後的液體以140網目過濾，並得到茶肽熱處理物。
(3)大豆肽熱處理物
將實施例2中使用的大豆肽在液體中進行高溫高壓處理並製造大豆肽熱處理物。具體地來說，對大豆肽3g，各加入15ml的蒸餾水，置入高壓釜(Tomy Seiko Co.,Ltd.公司製)，在135℃、0.31MPa、3小時的條件下進行高溫高壓處理。
上述各種肽熱處理物以外的材料使用和實施例2相同者，以和實施例2同樣的方法調查各種胜肽熱處理物的血清肌肽酶(CNDP1)活性的阻礙作用。其結果示於表4~6。
如表4~6所示，可知膠原蛋白肽熱處理物、茶肽熱處理物、以及大豆肽熱處理物無論何者皆有血清肌肽酶(CNDP1)活性的阻礙作用。
實施例4‧直鏈狀雙肽的血清肌肽酶(CNDP1)活性阻礙效果的探討
針對已知組織肌肽酶(CNDP2)阻礙活性之直鏈狀雙肽，進行血清肌肽酶(CNDP1)活性阻礙效果的探討。各種 直鏈狀雙肽的標準品，以購自BACHEM公司者進行實驗。其他材料使用與實施例2相同者，並且以與實施例2相同的方法研究直鏈狀雙肽的血清肌肽酶(CNDP1)活性的阻礙作用。其結果示於表7。
如表7所示，已知CNDP2阻礙活性之直鏈狀雙肽即使濃度設為500μM也沒有觀察到血清肌肽酶(CNDP1)活性的阻礙效果。由此結果可知，已知CNDP2阻礙活性之直鏈狀雙肽不具有血清肌肽酶(CNDP1)活性的阻礙作用。上述結果暗示，已知CNDP2阻礙活性之CNDP1阻礙物質與組織肌肽酶(CNDP2)阻礙物質互異且不 具關聯性。
實施例5‧並用茶肽熱處理物對肌肽的人類體內動態造成的影響
以探討單獨攝取肌肽或攝取肌肽以及茶肽熱處理物時的血中肌肽濃度為目的實施以下的實驗。茶肽熱處理物，使用與實施例3所使用的相同茶肽熱處理物。在第0天(Day 0)攝取肌肽(被實驗食品1)，並且抽血用以測量肌肽血中濃度。第1天~第6天每天攝取規定量的茶肽熱處理物(被實驗食品2)。第7天(Day 7)，攝取肌肽以及茶肽熱處理物(被實驗食品3)，並且抽血用以測量肌肽血中濃度。具體的實驗方法如下所述。
(1)被實驗者
健康的成年男女10人(男性：5人、女性：5人)
(2)被實驗食品
(3)被實驗食品的攝取方法
被實驗食品1以及被實驗食品3，在實驗當天溶於250mL水中並口服攝取。此外，被實驗食品2的膠囊劑(一次4個膠囊)，在上午與水250mL一起口服攝取。
(4)抽血及血液處理
在被實驗食品1及3的攝取前、攝取15分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘、90分鐘、120分鐘、180分鐘後進行抽血。再者，為了防止抽血後血液中的肌肽分解，抽血時按照以下步驟施以前處理。將血液抽血至預先冰涼的抽血管(EDTA處理)中，以離心分離(3,000rpm/5分鐘/4℃)得到血漿。進一步僅添加血漿的一半份量之冰冷2%三氯乙酸(TCA)水溶液並混合，在冰冷的條件下靜置10分鐘後，再次進行離心分離(15,000rpm/10分鐘/4℃)。回收上清液，在設定為-20℃的冷凍庫內冷凍保存至分析為止。
(5)肌肽分析方法 (5)-1‧前處理
將冷凍保存的前處理完成之血漿融化，將40μL水與40μL含有內標準物之水溶液加入其中的80μL，並且攪拌。添加320μL乙腈於其中並且再次攪拌，進行離心分離(15,000rpm/10分鐘/4℃)之後，在下述條件下以LC- MS/MS對上清液進行肌肽分析。用於定量分析的校正曲線，為將樣品血漿換成空白血漿，將水換成肌肽標準水溶液而製成。
(5)-2‧HPLC條件
高效液相層析：UFLC system[prominence](Shimadzu Corporation公司)
分析管柱：Scherzo SS-C18 2.0mm I.D.×100mm,3μm,(Imtakt公司)
管柱溫度：40℃
移動相：A：水/乙腈/甲酸(50/50/0.5)
B：含有50mM(最終濃度)甲酸銨之乙腈/水(50/50)
流量：0.4mL/min
自動進樣器洗淨液：乙腈/水(50/50,v/v)
自動進樣器溫度：4℃
注入量：10μL
(5)-3‧MS/MS條件
質譜設備：API5000 AB Sciex Pte.Ltd.
API interface：Turbo Spray(ESI)
氣體溫度：600℃
Ionspray voltage：5500V
Nebulizer gas setting(GS1)：50psi,air
Heated gas setting(GS2)：70psi,air
Curtain gas setting：20psi,nitrogen
Collision gas setting：4,nitrogen
Ionization mode：MRM mode,positive ion detection mode
MRM條件：
肌肽：m/z 227→m/z 110
內標準物(苯妥英)：m/z 206→m/z 60
(5)-4‧其他
在樣品的測量之前，先針對對象物質確認層析圖尖峰的選擇性以及添加校正曲線的直線性。根據經由樣品測量而得到的各被實驗者的血中濃度數據(Day0,Day7)，各以梯形法算出AUC(血漿中藥物濃度-時間曲線下面積)(單位：ng‧hr/mL)。
圖1中圖示各被實驗者的AUC的變動。Day7的AUC為以各被實驗者Day0的AUC為1的情況下的比例來表示。再者，分析是將AUC與其他9人的平均 值相比確認有10倍以上離散的1人除外後實施。
與Day0比較的Day7的AUC，在分析對象被實驗者9人中的6人表現出10%以上的上升率，9人的平均值為約上升20%。10%以內的變動的被實驗者為2人，表現出10%以上的下降的被實驗者為1人。由上述結果確認了，透過在攝取肌肽前的茶肽熱處理物之連續給藥還有肌肽及茶肽熱處理物的並用，肌肽的血漿濃度有上升的傾向。(實行Paired t-test時，p值為0.21。)
實施例6‧茶肽熱處理物對人類血清中肌肽分解造成的影響
探討人類血清中，茶肽熱處理物是否會表現出肌肽分解抑制效果。
使用1.5mL微量離心管，在100μL人類血清(Kohjinbio.,Co.Ltd.公司製)及300μL緩衝液(50mM Tris,pH7.5)中，加入50μL以達到最終濃度的10倍濃度的方式調配的被實驗物質(茶肽熱處理物)含有水溶液，輕輕地攪拌後在37℃下進行預培養。接著，添加50μL預先在37℃下保溫之含有1000μM肌肽(Tokyo Chemical Industry Co.,Ltd.公司製)的緩衝液，以輕輕地攪拌來開始肌肽分解反應。一連串的肌肽分解反應是在37℃下實施。在反應開始0、10、20分鐘後回收50μL反應液，在冰冷的條件下，以添加至預先分注有25μL 1%Trichloroacetic acid(TCA)水溶液之微量離心管來停止反應。添加150μL乙腈 並且進行離心分離(15,000rpm/10分鐘/4℃)，將150μL上清液稀釋至450μL 0.1%甲酸水溶液中作為分析樣品。使用LC-MS/MS定量肌肽濃度，從相對於反應0分後肌肽濃度的各個時間肌肽濃度算出殘存率(%)。肌肽的定量以與實施例5相同的方式進行。
圖2中圖示將反應開始時(反應0分後)的肌肽濃度當作100%時在各個時間的肌肽殘存率(%)(平均值±標準差)。實驗數為n=3，圖中的茶肽熱處理物水溶液濃度代表反應時的最終濃度。
由此結果顯示，肌肽僅在人類血清存在下被分解，而且茶肽熱處理物抑制人類血清中肌肽的分解。
[產業上的利用可能性]
本發明為提供一種含有來自動植物之胜肽作為有效成分之肌肽二肽酶1阻礙用組成物者。由於本發明提供一種協助認知功能減退等的預防或改善之嶄新的手段，故產業上的利用性高。

Claims (8)

  1. 一種肌肽二肽酶1阻礙用組成物，其含有來自動植物之胜肽。
  2. 如請求項1之肌肽二肽酶1阻礙用組成物，其中來自動植物之胜肽為來自膠原蛋白、茶、或大豆。
  3. 如請求項1或2之肌肽二肽酶1阻礙用組成物，其係認知功能減退、糖尿病、免疫功能減退、血管或組織發炎、因氧化壓力或糖化終產物的產生而引起的各種疾病、阿茲海默症、或自閉症的預防或改善用。
  4. 如請求項1~3中任一項之肌肽二肽酶1阻礙用組成物，其係附有透過阻礙肌肽二肽酶1而發揮的功能的聲明。
  5. 如請求項4之肌肽二肽酶1阻礙用組成物，其中功能聲明為選自由「抑制認知功能的減退」、「期待認知功能的維持」、「抑制血糖值的上升」、「提高免疫功能」、「期待抗氧化作用」、「減低氧化壓力」、「期待抗糖化作用」、「減低糖化壓力」、「抑制血管的發炎」、「期待阿茲海默症的預防或改善」、以及「期待自閉症的預防或改善」所成群者。
  6. 如請求項1~5中任一項之肌肽二肽酶1阻礙用組成物，其中前述組成物為藥劑。
  7. 一種來自動植物之胜肽的使用，其係用以阻礙肌肽二肽酶1。
  8. 一種阻礙肌肽二肽酶1的方法，其係使用來自動 植物之胜肽。
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