TWI747443B - 卵繫帶水解物用於製備改善認知行為組成物的用途 - Google Patents

Abstract

本發明係關於一種卵繫帶水解物用於製備改善認知行為組成物的用途，係以一有效劑量之一卵繫帶水解物施予一所需個體，以降低神經細胞退化、減少海馬迴齒狀區域的細胞萎縮以及減少β-澱粉樣蛋白與糖化終端產物在腦部的堆積；本發明所使用之卵繫帶水解物係將一卵繫帶材料以一酵素水解後獲得，且卵繫帶水解物中包含短鏈胜肽與多種特殊游離胺基酸。

Description

卵繫帶水解物用於製備改善認知行為組成物的用途

本發明關於一種卵繫帶水解物用於製備改善認知行為組成物的用途，所使用的卵繫帶水解物具有降低神經細胞退化、改善認知行為以及抗氧化之功效。

隨著人類平均壽命的延長，多種與老化相關的疾病也受到重視，其中失智症因為會造成相當大的社會負擔而更為重要。失智症患者因為腦細胞退化或是受損，而造成其記憶力及其它神經功能的減退，甚至會影響到語言能力、空間感、判斷力、抽象思考與注意力等等，此外患者甚至會有妄想症或是產生幻覺，因此患者的家庭甚至是整體社會都會受到很大的影響，但目前失智症並沒有有效的治療或是預防方式。

近年來的研究指出，將富含蛋白質的食物原料水解後，所獲得的水解物與食物原料相比具有更多的活性成分，且可用於改善人體的健康情形；而富含多種蛋白質的卵繫帶(chalaza)在液蛋製備的過程中往往被視為廢棄物而丟棄，十分可惜。

今，發明人有鑑於卵繫帶具有豐富的蛋白質，但並無獲得良好的利用，於是乃一本孜孜不倦之精神，並藉由其豐富專業知識及多年之實務經驗所輔佐，而加以改善，並據此研創出本發明。

本發明關於一種卵繫帶水解物用於製備改善認知行為組成物的用途，係以一有效劑量之一卵繫帶水解物施予一所需個體，以降低神經細胞退化、減少海馬迴齒狀區域的細胞萎縮以及減少β-澱粉樣蛋白與糖化終端產物在腦部的堆積。

於本發明之一實施例中，卵繫帶水解物之製備方法係包含：將一卵繫帶材料以去離子水洗去雜質，並離心以保留下層之一第一產物；將該第一產物以95℃恆溫加熱10~30分鐘並冷卻，再加入去離子水均質以獲得一卵繫帶均質液；將卵繫帶均質液與一蛋白酶A (protease A)，以酵素受質比1:100~1:200 (w/w)之比例混合，調整水解液pH值=5~7，水解一作用時間之後獲得一第一水解液；將第一水解液於95℃恆溫加熱10~30分鐘並冷卻，離心後保留上層的第二水解液；過濾並凍乾第二水解液以獲得本發明使用的卵繫帶水解物。

於本發明之一實施例中，卵繫帶水解物包含10~20 wt%之白胺酸(leucine)、10~20 wt%之精胺酸(arginine)、5~15 wt%之離胺酸(lysine)以及5~15 wt%之苯丙胺酸(phenylalanine)。

於本發明之一實施例中，卵繫帶水解物係包含100~400 mg/100 g的甲肌肽(anserine)。

於本發明之一實施例中，卵繫帶水解物之有效劑量為4~200 mg/kg-體重。

於本發明之一實施例中，卵繫帶水解物之該有效劑量為4~20 mg/kg-體重。

於本發明之一實施例中，卵繫帶水解物之該有效劑量為20 mg/kg-體重。

於本發明之一實施例中，卵繫帶水解物降低AGEs受體(receptor for advanced glycation endproduct)、核因子活化B細胞κ輕鏈增強子(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)、NADPH氧化酶2(NADPH oxidase 2)、白介素-1β(interleukin-1β)、白介素-6(interleukin-6)或腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α)其中至少一基因的表現。

於本發明之一實施例中，卵繫帶水解物降低AGEs受體、核因子活化B細胞κ輕鏈增強子、NADPH氧化酶2、白介素-1β、白介素-6與腫瘤壞死因子α的基因表現。

藉此，本發明之卵繫帶水解物，確實具有改善認知功能的功效，並且減少腦部神經元細胞萎縮以及降低腦部Aβ的表現與堆積；此外，本發明之卵繫帶水解物亦具有抗氧化與抗發炎之功效，故卵繫帶水解物確實具有作為製備改善認知功能的保健組成物或是醫藥組成物的潛力。

為令本發明之技術手段其所能達成之效果，能夠有更完整且清楚的揭露，茲詳細說明如下，請一併參閱揭露之圖式。

本發明關於一種卵繫帶水解物於製備改善認知行為之組成物的用途，所使用的卵繫帶水解物係使用酵素水解卵繫帶所獲得，包含短鏈胜肽與多種游離胺基酸，具有降低神經細胞退化、減少海馬迴齒狀區域的細胞萎縮、減少β-澱粉樣蛋白在腦部的堆積、以及抗氧化與抗發炎之突出功效。

此外，藉由下述具體實施例，可進一步證明本發明可實際應用之範圍，但不意欲以任何形式限制本發明之範圍。

一、卵繫帶水解物的製備方法

本實驗所使用之卵繫帶(crude chalaza)由大毅蛋品有限公司(Daiegg Co. Ltd., Tainan city, Taiwan)提供，每天於液蛋生產線上收集後並保存於-20℃冷凍儲存之冰櫃中。本實驗所使用的卵繫帶製備方法可參見中華民國專利第 TW I608840(B)號發明專利，簡述如下：將卵繫帶解凍、清洗後離心，收集下層的第一產物，並以95℃熱水恆溫加熱10~30分鐘，以去除第一產物內部酵素的活性；將水浴後的樣品冷卻，並加入去離子水並均質，以獲得一卵繫帶均質液，再將卵繫帶均質液的酸鹼值調整至pH=6，再以酵素受質比為1:100~1:200(w/w)的比例加入蛋白酶A(protease A，活性63,000 unit/g)，於50℃水解30分鐘，以獲得卵繫帶水解液，其中又以酵素受質比為1:100(w/w)的作用比例更佳，水解液調整至pH值=6最佳；將卵繫帶水解液以95℃恆溫加熱10~30分鐘以終止水解反應，離心並過濾卵繫帶水解液並保留濾液，將濾液酸鹼值調整至pH=7.0後再進行冷凍乾燥，以獲得卵繫帶水解物。

將上述製得的卵繫帶水解物，以及未經水解的卵繫帶凍粉材料，委託財團法人食品發展工業研究所進行游離胺基酸與短鏈胜肽的檢測，二樣本胺基酸成分的測量分析結果如下表一所示，實驗數據的表示方法為「平均值±標準誤差」，又「N. D.」表示未檢測到該成分：

表一

游離胺基酸	卵繫帶 (mg/100 g 乾粉)	卵繫帶水解物(mg/100 g 乾粉)
白胺酸(Leucine)	23.21±4.49	1596.08±81.33
精胺酸(Arginine)	6.36±3.02	1294.72±83.93
離胺酸(Lysine)	10.05±2.66	1144.80±64.18
苯丙胺酸(Phenylalanine)	9.71±1.83	896.92±65.81
纈胺酸(Valine)	12.58±6.11	691.46±59.52
異白胺酸(Isoleucine)	4.30±1.80	641.03±42.14
蘇胺酸(Theronine)	10.83±1.01	417.06±23.37
甲硫胺酸(Methionine)	4.59±2.62.	332.94±29.23
色胺酸(Tryptophan)	N. D.	323.54±49.18
組胺酸(Histidine)	N. D.	268.40±15.38
總必需胺基酸	81.61 ±11.58	7606.95 ±500.20
L-丙胺酸(L-Alanine)	10.61±6.85	515.83±29.25
天門冬醯胺(Asparagine)	N. D.	505.50±39.38
酪胺酸(Tyrosine)	4.26±2.25	464.26±45.04
谷胺酸(Glutamic acid)	33.36±6.54	410.70±33.95
絲胺酸(Serine)	4.56±2.78	396.77±151.48
3-胺基異丁酸(3-Aminoisobutyric acid)	N. D.	388.27±151.48
o-磷絲胺酸(o-Phosphoserine)	4.84±0.77	325.35±40.66
甘胺酸(Glycine)	6.77±2.50	154.93±9.10
脯胺酸(Proline)	10.18±0.31	146.25±11.35
β-丙胺酸(β-Alanine)	0.67±0.06	128.74±10.44
天門冬胺酸(Aspartic acid)	3.63±2.48	110.52±6.76
2-胺基己二酸(2-Aminiadipic acid)	N. D.	100.71±11.18
o-磷酸乙醇胺(o-phosphoethanolamine)	N. D.	94.11±9.45
鳥胺酸(Ornithine)	8.24±2.88	82.05±2.31
胱胺酸(Cystine)	8.89±1.35	51.33±8.35
肌胺酸(Sarcosine)	N. D.	48.02±5.88
DL-plus allo-δ-羥離胺酸(DL-plus allo-δ-Hydroxylysine)	0.55±0.48	4.45±0.21
總非必需 胺基酸	96.55 ±15.75	3927.81 ±308.60
甲肌肽(Anserine)	N. D.	309.06±26.55
肌肽(Carnosine)	N. D.	N. D.

結果顯示，卵繫帶經水解後，游離態胺基酸中，總必需胺基酸的含量由卵繫帶的81.61±11.58 mg/100 g，提高至卵繫帶水解物的7606.95±500.20 mg/100 g，且總非必需胺基酸的含量由卵繫帶的96.55±15.75 mg/100 g，提高至卵繫帶水解物的3927.81±308.60 mg/100 g，即總游離胺基酸含量由卵繫帶的178.16 mg/100 g提高至卵繫帶水解物的11543.76 mg/100 g，顯然卵繫帶水解物中含有更高比例的游離胺基酸，與未水解之卵繫帶的游離胺基酸含量相比，高出64.7倍；又，卵繫帶水解物的組成以白胺酸(leucine)、精胺酸(arginine)、離胺酸(lysine) 以及苯丙胺酸(phenylalanine)為主，並分別佔總游離胺基酸之13.84 wt%、11.22 wt%、9.92 wt%以及7.78 wt%；此外，未經水解的的卵繫帶中並無法驗出甲肌肽(anserine)以及肌肽(carnosine)，而卵繫帶水解物中則驗出含有309.06±26.55 mg/100 g的甲肌肽，證明卵繫帶經過水解後的產物，與未水解的卵繫帶相比，含有較多的游離胺基酸以及短鏈胜肽。

二、認知行為研究

(一)、實驗動物模式

本實驗所使用的ICR實驗鼠係購自樂斯科生物科技股份有限公司(BioLASCO Taiwan Co., Ltd., Taipei, Taiwan)，購買8週齡、體重約28~35克的ICR實驗鼠，先使其培養於實驗環境中4週，並於12週齡時進行實驗；實驗鼠飼養於環境控制在22±2℃、濕度60~80%、明暗週期12小時的動物房中，飼料與飲水都採取任食供應方式給予；進行實驗時，實驗鼠被隨機分成6組，每組實驗鼠的隻數為9隻，6組組別如下：

(1)對照組：於實驗鼠背部以皮下注射(subcutaneous injection)之方式注射0.1 mL之0.9%生理食鹽水，並以口服方式每日給予0.1 mL的去離子水；

(2)D-半乳糖組：於實驗鼠背部以皮下注射之方式，每日注射 100 mg/kg-體重之D-半乳糖，其中D-半乳糖溶解於0.1 mL之生理食鹽水中，並以口服方式每日給予0.1 mL的去離子水，D-半乳糖的注射可以誘發實驗鼠產生多種與自然老化類似的生理行為，包含神經退化現象；

(3)LCH組：於實驗鼠背部以皮下注射之方式，每日注射 100 mg/kg-體重之D-半乳糖，其中D-半乳糖溶解於0.1 mL之生理食鹽水中，並以口服方式每日給予50 mg/kg-體重之卵繫帶水解物，卵繫帶水解物溶解於0.1 mL去離子水中；

(4)MCH組：於實驗鼠背部以皮下注射之方式，每日注射 100 mg/kg-體重之D-半乳糖，其中D-半乳糖溶解於0.1 mL之生理食鹽水中，並以口服方式每日給予100 mg/kg-體重之卵繫帶水解物，卵繫帶水解物溶解於0.1 mL去離子水中；

(5)HCH組：於實驗鼠背部以皮下注射之方式，每日注射 100 mg/kg-體重之D-半乳糖，其中D-半乳糖溶解於0.1 mL之生理食鹽水中，並以口服方式每日給予200 mg/kg-體重之卵繫帶水解物，卵繫帶水解物溶解於0.1 mL去離子水中；

(6)AG組：於實驗鼠背部以皮下注射之方式，每日注射 100 mg/kg-體重之D-半乳糖，其中D-半乳糖溶解於0.1 mL之生理食鹽水中，並以口服方式每日給予100 mg/kg-體重之氨基胍鹽酸鹽(aminoguanidine hydrochloride，簡稱AG)，AG為一種二胺氧化酶(Diamine oxidase)與一氧化氮合成酶(Nitric oxide synthase)的抑制劑，可以降低體內糖化終端產物(Advanced glycation end products, AGEs)的產生，是作為正對照組，且溶解於0.1 mL之去離子水中。

總實驗時間為84日，在實驗進行第78~83日，所有實驗鼠每日皆接受莫里斯水迷宮測試(Morris water maze)，此方法廣泛用於行為神經科學中關於空間學習和記憶的研究，還可以用以評估大腦特定皮質區域的損害。

測試方式簡述如下：準備一直徑為100公分、深度為80公分之圓形水池，以及一可移動之逃脫平台(escape platform)，逃脫平台直徑為4.3公分，高度為16公分；將圓形水池均分為四區，分別以Z1、Z2、Z3以及Z4稱之，且分別於四區的水面上以及對應的水池內壁設置有不同的視覺提示物；水池中的水溫保持在23±1℃，且在水中加入脫脂奶粉以減少味道造成的實驗誤差，也同時在水中加入藍色食用色素使水呈現不透明的狀態。在測試前一日(實驗進行第77日)，實驗鼠會被移動到實驗環境至少30分鐘，以令其可以適應實驗環境，同時會在逃脫平台上綁上紅色橡皮圈，放置於水池中央，並使其突出水面1~1.5公分，以增加逃脫平台的可見度，將實驗鼠放置於水池中訓練，使其可以尋找到逃脫平台。

進行測試時，逃脫平台上的紅色橡皮圈會被取下，並將逃脫平台放置於Z2區域的中心點，且令逃脫平台沉在水面下1~1.5公分的深度，此時再將實驗鼠放置於水池中定義為Z3的區域，並使實驗鼠面向水池內壁，再令實驗鼠尋找逃脫平台；若實驗鼠可以在60秒內找到逃脫平台，便會可以在逃脫平台上休息15秒，再放回籠子休息中60秒，之後再重複接接受測試；若實驗鼠無法找到逃脫平台，則實驗人員會溫和的引導實驗鼠移動到逃脫平台處並於逃脫平台上停留15秒，並再放回籠子中休息60秒後，再接受測試；每一隻實驗鼠每日會接受4次測試，且每隻實驗鼠的測試順序每日也都會相同；實驗鼠的找到逃脫平台需要的時間、在水池中游泳的行徑方向、游泳速度都會被記錄以作為評估參數。

在實驗進行第82日，先將逃脫平台自水池的Z2區域移除，再將實驗鼠放入水池的Z3區域中，令實驗鼠自由游泳60秒，再紀錄實驗鼠試圖尋找逃脫平台的時間，以及紀錄每次實驗中實驗鼠自Z3區域越過到其他區域的次數。

上述獲得的測試結果會以動物行為分析軟體Singa Trace mouse II軟體進行分析。

請參見第一圖(A)，為各組別實驗鼠找到逃脫平台所需時間試驗的實驗結果，其中D-半乳糖組的實驗鼠，在實驗第3天以及第4天時，其尋找到逃脫平台所需要的時間皆顯著長於對照組(p＜0.05)，顯示對實驗鼠處理D-半乳糖確實會影響到實驗鼠的參考性記憶(reference memory)；而給予D-半乳糖及補充卵繫帶水解物的組別(LCH組、MCH組以及HCH組)以及同時給予D-半乳糖以及AG的組別(AG組)，其尋找到逃脫平台所需要的時間與對照組相比都沒有顯著差異(p＞0.05)。又，請參見第一圖(B)，各組別實驗鼠的游泳時間並沒有顯著差異(p＞0.05)。

請再參見第二圖(A)，逃脫平台移除後，D-半乳糖組的實驗鼠，其試圖尋找逃脫平台的時間明顯低於其他組別(p＜0.05)，而給予D-半乳糖及補充卵繫帶水解物或是AG的組別，尤其是MCH組、HCH組以及AG組，其試圖尋找逃脫平台的時間顯著高於D-半乳糖組(p＜0.05)，表示給予卵繫帶水解物能夠改善D-半乳糖所誘發的記憶受損現象；但請參見第二圖(B)，各組別之間自Z3區域越過到其他區域的次數並沒有顯著差異(p＞0.05)。

又，第三圖為各組別實驗鼠游泳路徑的記錄圖，對照組的實驗鼠的游泳路徑主要是位於水池中央，而D-半乳糖組的實驗鼠主要會沿著水池週緣游泳，給予D-半乳糖及補充卵繫帶水解物或是AG的組別，實驗鼠的游泳路徑也較集中於水池中央，與對照組實驗鼠的游泳路徑較為相似。

三、生理指數變化

在實驗期間，會每週記錄所有實驗鼠的體重變化，以及記錄食物與飲水的攝取量，在實驗第84天令實驗鼠禁食一日後，於第85天犧牲實驗鼠，並採集血液與腦組織樣本。

(一)、生化指標分析結果

請參閱表二，為各組實驗鼠的體重、飲食紀錄，以及犧牲後大腦重量等檢測結果，其中大腦重量的表示方法為「相對於100克體重的大腦重量」；各組數值以「平均值±標準誤差」表示；後續所有實驗結果分析皆使用最小顯著差異法(least significant difference)方法比較各組之間差異，且實驗數據結果皆以SAS9.4軟體處理，在分析結果呈現上，若兩組結果之間沒有顯著差異，則會以相同之小寫英文字母標記，若兩組結果之間具有顯著差異，則會以不同的小寫英文字母標記。

根據表二，各組別的實驗鼠經過84日的實驗之後，其體重、食物與飲水的攝取情形都沒有明顯的差異，且各組別中的大腦相對重量(relative sizes of brain)也沒有明顯的改變。

表二

	對照組	D-半乳糖組	LCH組	MCH組	HCH組	AG組
體重(第1日)(g)	37.44±0.47a	37.60±0.74a	37.39±0.59a	38.04±0.56a	36.87±0.65a	37.22±0.59a
體重(第84日)(g)	40.81±1.98a	39.94±1.36a	40.49±1.42a	41.60±1.46a	40.11±1.00a	39.84±1.07a
食物攝取(g/鼠/日)	7.17±0.20a	7.61±0.13a	7.12±0.57a	7.14±1.10a	7.14±0.37a	7.06±0.32a
飲水攝取 (g/鼠/日)	6.9±0.26a	6.25±0.45a	6.47±0.44a	6.43±0.38a	7.04±0.22a	6.28±0.27a
大腦相對重量(g/100g體重)	1.30±0.07a	1.30±0.06a	1.31±0.04a	1.29±0.06a	1.32±0.03a	1.33±0.04a

再請參見表三，為各組實驗鼠血清中天門冬胺酸轉胺酶(aspartate transaminase，AST)、丙胺酸轉胺酶(alanine transaminase，ALT)、三酸甘油酯(triglyceride，TG)與總膽固醇(total cholesterol，T-Cho)的含量分析結果，各組數值以「平均值±標準誤差」表示，如下：

表三

血清生化分析
	對照組	D-半乳糖組	LCH組	MCH組	HCH組	AG組
AST(IU/L)	94.63±4.49a	97.33±11.67a	102.29±7.56a	83.75±2.43a	84.67±13.81a	80.33±6.13a
ALT(IU/L)	33.86±2.82a	32.29±4.03a	33.78±3.16a	25.89±3.57ab	22.43±2.68b	19.80±2.15b
TG(mg/dL)	65.63±5.51a	87.43±10.90a	85.43±6.41a	80.89±5.32a	83.60±6.49a	68.6±6.17a
T-Cho(mg/dL)	136.44±6.36a	131.78±9.51a	139.44±7.45a	142.25±8.13a	122.00±7.69a	131.33±10.11a

又根據表三，各組別實驗鼠血清中的天門冬胺酸轉胺酶(AST)含量、三酸甘油酯(TG)含量以及總膽固醇(T-Cho)含量都沒有顯著差異(p＞0.05)，但是D-半乳糖組的血清三酸甘油酯(TG)含量與對照組相比有些微上升的趨勢，且於AG組別中有下降的趨勢；又，與D-半乳糖組相比，丙胺酸轉胺酶(ALT)的含量在HCH組以及AG組中有顯著下降的情形(p＜0.05)。

(二)、腦部海馬迴齒狀區域分析

請參第四圖，為實驗鼠腦組織切片的組織染色分析照片，觀察實驗鼠腦部海馬迴(hippocampus)的齒狀區域(dentate gyrus area)，並觀察β-澱粉樣蛋白(β-amyloid，簡稱Aβ蛋白)在腦組織中的表現情形；Aβ蛋白是在阿茲海默氏病病人大腦中發現的蛋白斑的主要成分，被認為與阿茲海默氏病具有密切的關聯性；請參見第四圖(A)與第四圖(B)，為蘇木精-伊紅(hematoxylin & eosin)的組織染色結果，與對照組相比，D-半乳糖組的實驗鼠具有較多萎縮的神經元細胞體(contracted neuron body)，該些細胞體會被蘇木精染劑(hematoxylin)染色，而呈現深染色的情形，並在圖中以黑色箭頭標記；但，在給予D-半乳糖及補充卵帶水解物或是AG的組別，尤其是MCH組、HCH組以及AG組，萎縮的神經元細胞體數目有明顯減少的趨勢，且在HCH組中，海馬迴齒狀區域的型態已與對照組或是AG組十分相近。請再參見第四圖(C)，為針對Aβ蛋白進行免疫螢光染色的照片，並在各圖中以箭頭標記出Aβ蛋白染色的位置；在對照組中，實驗鼠的海馬迴齒狀區域並沒有觀察到明顯的Aβ蛋白沉積現象，但是在D-半乳糖組中，實驗鼠的海馬迴齒狀區域有明顯觀察到Aβ蛋白沉積於細胞外的情形，此外在同時處理D-半乳糖與卵帶水解物或是AG的組別，Aβ蛋白沉積的情形有減少的趨勢。

請接著參見第五圖(A)，以西方點墨法分析腦組織中Aβ蛋白的表現情形，可觀察到D-半乳糖組中的Aβ蛋白表現量明顯高於對照組，而在給予D-半乳糖及補充卵帶水解物或是AG的組別中，Aβ蛋白表現量有明顯下降的情形；第五圖(B)為西方點墨法的定量分析圖，顯示卵繫帶水解物確實具有降低Aβ蛋白表現的功效，且有劑量依存(dose dependent)的現象(p＜0.05)。

(三)、抗氧化分析

以ABTS自由基清除之情形，作為實驗鼠血清與腦組織抗氧化能力(trolox equivalent antioxidant capacity，TEAC)的評估，單位以每重量單位樣品中含有多少trolox當量表示(TE)；另以硫代巴比妥酸反應測試(thiobarbituric acid reactive substances assay，TBARS assay)量測脂質過氧化情形；最後量測實驗鼠抗氧化防禦系統，如還原態榖胱甘肽(glutathione，GSH)含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、榖胱甘肽過氧化氫酶(glutathione peroxidase，GPx)的活性變化。

請參見表四之血清分析結果，D-半乳糖組中，實驗鼠的血清TBARS值顯著高於對照組(p＜0.05)，而給予卵繫帶水解物後，實驗鼠血清的TBARS值與D-半乳糖組相比會有顯著下降的情形(p＜0.05)；此外，D-半乳糖組中，實驗鼠的血清TEAC值略低於對照組，但給予卵繫帶水解物之後，實驗鼠血清的TEAC值有回升的現象；同樣的，D-半乳糖組中，實驗鼠的血清中還原態GSH的含量顯著低於對照組(p＜0.05)，但給予卵繫帶水解物之後，實驗鼠血清的還原態GSH的含量有顯著上升的現象(p＜0.05)。

表四

血清抗氧化分析
	對照組	D-半乳糖組	LCH組	MCH組	HCH組	AG組
TBARS (nmol MDA eq./mL)	28.03±1.78c	39.75±3.03a	33.76±1.29b	29.57±1.30bc	27.55±1.94c	24.13±1.32c
TEAC (μmol/mL)	8.45±0.24ab	7.96±0.22b	8.36±0.09ab	8.39±0.15ab	8.52±0.15a	8.56±0.22a
還原態GSH (nmol/mL)	78.11±8.23b	56.39±2.74c	66.28±5.36bc	95.66±5.47a	94.80±6.42a	101.07±5.53a

再請參見表五，D-半乳糖組中，實驗鼠的腦組織TBARS值也顯著高於對照組，而給予卵繫帶水解物之後，實驗鼠的TBARS值與D-半乳糖組相比會有明顯下降的情形；此外，D-半乳糖組中，實驗鼠的腦組織TEAC值顯著低於對照組，但給予卵繫帶水解物之後，實驗鼠血清的TEAC值有回升的現象；在還原態GSH含量的分析中，D-半乳糖組的實驗鼠腦組織還原態GSH的含量，略低於對照組，但給予卵繫帶水解物之後，實驗鼠腦組織的原態GSH的含量會顯著上升，且具有劑量依存的情形；又，D-半乳糖組的實驗鼠腦部SOD活性、CAT活性以及GPx活性都顯著低於對照組，而給予卵繫帶水解物後則會顯著提升三種酵素的活性(p＜0.05)。

表五

腦組織抗氧化分析
	對照組	D-半乳糖組	LCH組	MCH組	HCH組	AG組
TBARS (nmol MDA eq./mg-蛋白質)	6.45±0.37b	7.34±0.50a	6.76±0.18ab	5.96±0.11bc	5.52±0.22c	6.14±0.19bc
TEAC (μmol/mg-蛋白質)	463.34±16.70a	385.58±11.87c	399.82±7.88bc	440.84±17.00a	445.73±11.93a	469.85±9.88a
還原態GSH (nmol/mg-蛋白質)	376.34±14.06b	359.20±16.48b	371.63±10.04b	424.58±7.94a	425.99±8.51a	429.46±9.89a
SOD活性 (unit/mg-蛋白質)	2.87±0.20b	1.94±0.22c	4.55±0.02a	4.25±0.23a	4.15±0.12a	3.35±0.10b
CAT活性 (munit/mg-蛋白質)	4.33±0.21a	2.88±0.23c	3.67±0.19b	3.96±0.20ab	4.55±0.10a	4.37±0.24a
GPx活性 (munit/ mg 蛋白質)	151.85±3.79ab	128.38±2.79c	139.09±4.03bc	158.14±7.03a	156.11±2.41a	162.43±5.51a

(四)、糖化終端產物與抗發炎分析

接著參見第六圖(A)，以西方點墨法分析腦組織中糖化終產物(Advanced glycation end-product，簡稱AGEs)的表現量，D-半乳糖組中，AGEs的表現量顯著高於對照組(p＜0.05)，而給予卵繫帶水解物之後，則會明顯降低AGEs的表現量；再請參見第六圖(B)之定量分析結果，給予卵繫帶水解物的組別顯著降低實驗鼠腦部AGEs的表現量(p＜0.05)，且具有劑量依存的情形，在中、高劑量時與對照組AGEs的表現量無異(p＞0.05)。

另，再進一步分析腦組織內與發炎相關的基因表現情形，包含分析RAGE、NADPH氧化酶2(NADPH oxidase 2，簡稱Nox2)、NFκB、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)與腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，簡稱TNFα)基因的RNA表現量；請參見第七圖(A)，在D-半乳糖組中，RAGE、Nox2以及NFκB的基因表現量都顯著高於對照組(p＜0.05)，而給予卵繫帶水解物的組別，三個基因的表現量則顯著低於D-半乳糖組(p＜0.05)；再請參見第七圖(B)，D-半乳糖組中的IL-1β、IL-6與TNFα基因表現量也皆高於對照組，且給予卵繫帶水解物的組別，三個基因的表現量也有下降的趨勢；此結果顯示D-半乳糖組中的實驗鼠腦部確實有發炎的情形，而同時給予卵繫帶水解物之後，則能顯著降低發炎相關的基因表現。

此外，因本實驗實施例的實驗動物為實驗小鼠，可利用以下的公式推算，預將卵繫帶水解物應用於人體時的使用量，公式如下：

人體使用劑量=實驗小鼠劑量 X 3/37

因此，小鼠使用劑量為50 mg/kg BW-小鼠，換算的人類的使用劑量為4.05 mg/kg BW-人；又小鼠使用劑量為100 mg/kg BW-小鼠，換算的人類的使用劑量為8.11 mg/kg BW-人，以及小鼠使用劑量為200 mg/kg BW小鼠，換算的人類的使用劑量為16.21 mg/kg BW-人。

根據上述說明，本發明之卵繫帶水解物，確實具有改善實驗鼠認知功能的功效，並且減少實驗鼠腦部萎縮的神經元細胞以及降低Aβ與AGEs的表現與堆積；此外，本發明之卵繫帶水解物亦具有抗氧化與抗發炎之功效，包含可提高自由基的清除能力、降低脂質氧化的情形、以及回復SOD、CAT以及GPx等酵素的活性；再者，卵繫帶水解物亦可以降低發炎相關訊息路徑的活化，且降低發炎相關因子的表現；故本發明之卵繫帶水解物確實具有作為製備改善認知功能的保健組成物或是醫藥組成物的潛力。

綜上所述，本發明卵繫帶水解物用於製備改善認知行為組成物的用途，的確能藉由上述所揭露之實施例，達到所預期之使用功效，且本發明亦未曾公開於申請前，誠已完全符合專利法之規定與要求。爰依法提出發明專利之申請，懇請惠予審查，並賜准專利，則實感德便。

惟，上述所揭之說明，僅為本發明之較佳實施例，非為限定本發明之保護範圍；其；大凡熟悉該項技藝之人士，其所依本發明之特徵範疇，所作之其它等效變化或修飾，皆應視為不脫離本發明之設計範疇。

無

第一圖(A)：實驗鼠尋找逃脫平台時間分析圖。

第一圖(B)：實驗鼠游泳速度分析圖。

第二圖(A)：實驗鼠尋找逃脫平台所在象限時間分析圖。

第二圖(B)：實驗鼠越過逃脫平台所在象限次數分析圖。

第三圖：實驗鼠游泳路徑記錄圖。

第四圖：實驗鼠腦部組織切片H&E 染色與免疫螢光染色分析圖。

第五圖(A)：實驗鼠腦部β-澱粉樣蛋白質表現量之西方點墨法分析圖。

第五圖(B)：實驗鼠腦部β-澱粉樣蛋白質表現量之定量分析圖。

第六圖(A)：實驗鼠腦部AGEs表現量之西方點墨法分析圖。

第六圖(B)：實驗鼠腦部AGEs表現量之定量分析圖。

第七圖(A)：實驗鼠腦部發炎相關基因RNA表現分析圖(一)。

第七圖(B)：實驗鼠腦部發炎相關基因RNA表現分析圖(二)。

無

Claims (9)

1. 一種卵繫帶水解物用於製備改善認知行為組成物的用途，係以一有效劑量之一卵繫帶水解物施予一所需個體，以降低神經細胞退化、減少海馬迴齒狀區域的細胞萎縮以及減少β-澱粉樣蛋白與糖化終端產物在腦部的堆積；其中該卵繫帶水解物之製備方法係包含：將一冷凍之卵繫帶材料解凍後利用去離子水洗去雜質，並離心以保留下層之一第一產物；將該第一產物以95℃恆溫加熱10~30分鐘並冷卻，再加入去離子水均質以獲得一卵繫帶均質液；將該卵繫帶均質液，與一蛋白酶A(protease A)以一酵素受質比1：100~1：200(w/w)混合，水解一作用時間之後獲得一第一水解液；將該第一水解液於95℃恆溫加熱10~30分鐘並冷卻，離心後保留上層之一第二水解液；過濾並凍乾該第二水解液以獲得該卵繫帶水解物。
2. 如請求項1所述的用途，其中該卵繫帶水解物係包含10~20wt%之白胺酸(leucine)、10~20wt%之精胺酸(arginine)、5~15wt%之離胺酸(lysine)以及5~15wt%之苯丙胺酸(phenylalanine)。
3. 如請求項1所述的用途，其中該卵繫帶水解物係包含100~400mg/100g的甲肌肽。
4. 如請求項1所述的用途，其中該卵繫帶水解物之該有效劑量為4~200mg/kg-體重。
5. 如請求項4所述的用途，其中該卵繫帶水解物之該有效劑量為4~20mg/kg-體重。
6. 如請求項5所述的用途，其中該卵繫帶水解物之該有效劑量為20mg/kg-體重。
7. 如請求項1所述的用途，其中該卵繫帶水解物係降低腦部糖化終產物的表現。
8. 如請求項1所述的用途，其中該卵繫帶水解物降低AGEs受體(receptor for advanced glycation endproduct)、核因子活化B細胞κ輕鏈增強子(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)、NADPH氧化酶2(NADPH oxidase 2)、白介素-1 β(interleukin-1 β)、白介素-6(interleukin-6)或腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α)其中至少一基因的表現。
9. 如請求項8所述的用途，其中該卵繫帶水解物降低AGEs受體(receptor for advanced glycation endproduct)、核因子活化B細胞κ輕鏈增強子(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)、NADPH氧化酶2(NADPH oxidase 2)、白介素-1 β(interleukin-1 β)、白介素-6(interleukin-6)與腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α)的基因表現。

Images