KR101246266B1 - 발효 누에 분말의 제조방법 및 발효 누에 분말을 포함하는 고지혈증 및 지방간 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 누에 분말에 Bacillus subtilis(바실러스 서브틸리스) 또는 Aspergillus kawachii(아스페르길루스 카와치)균주를 첨가하여 발효시킨 발효 누에 분말 제조방법 및 발효 누에 분말을 포함하는 고지혈증 및 지방간 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 균주에 의해 누에 분말을 발효시킴으로써 비발효 누에 분말에 비해 뛰어난 고지혈증 및 지방간과 같은 각종 성인질환의 예방 및 치료 효과를 나타낸다.

Description

발효 누에 분말의 제조방법 및 발효 누에 분말을 포함하는 고지혈증 및 지방간 예방 또는 치료용 조성물{Method for preparing fermented silkworm powder and composition comprising fermented silkworm powder for the preventing or treating of hyperlipidemia and fatty liver}

본 발명은 누에 분말에 Bacillus subtilis(바실러스 서브틸리스) 또는 Aspergillus kawachii(아스페르길루스 카와치)균주를 첨가하여 발효시킨 발효 누에 분말 제조방법 및 발효 누에 분말을 포함하는 고지혈증 및 지방간과 같은 각종 성인질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

최근, 생활수준의 향상으로 인하여 식생활 형태의 변화 및 과도한 음주에 의해, 고지혈증 및 지방간 환자의 수가 급증하고 있는 것으로 보고되고 있으며, 특히 지방의 과다 섭취는 혈중 LDL 콜레스테롤을 상승시키고 체내 지방의 축적을 초래하며, 결국 동맥경화 등 심혈관계 질환을 유발한다. 따라서 고지혈증 및 지방간을 예방 및 치료하기 위하여, 새로운 물질을 개발하고자 하는 시도가 있어 왔다.

새로운 생물자원 소재로서 곤충 관련 산업이 주목받고 있는 가운데, 바이오신소재 개발을 위한 새로운 천연 소재로서 누에 및 그 관련 부산물에 대한 관심이 고조되고 있다.

고지혈증을 유발시킨 실험용 쥐에 누에 번데기에서 추출한 불포화 지방산을 먹인 결과 동맥 경화 지수를 30 % 정도 감소시키는 효과를 얻었다고 연구 결과가 있으며, 또 피부의 기름기를 제거해 피부 건조증을 유발시킨 뒤 불포화 지방산을 바른 결과 피부 보습도가 바르지 않은 것에 비해 50 % 이상 향상된다는 보고가 된 바 있다. 그리고 수컷 누에 번데기의 성분에서 남성의 발기 촉진 성분의 하나로 알려진 cGMP의 합성을 촉진하는 단백질을 추출 분리해 그 구조를 구명하고 발기 촉진 활성을 강화하는 성분이라는 사실을 실험적으로 입증한바 있다.

한편, 누에의 먹이인 뽕잎의 주성분은 수분, 단백질, 탄수화물, 지방, 무기염류, 비타민 등으로 뽕잎의 생리활성으로는 혈당강하효과, 그리고 비만에 원인이 되고 있는 중성지질의 함량도 낮추어주고,과산화지질의 함량도 낮추어 준다고 보고 되었으며, 노화에 원인이 되고 있는 활성산소 생성을 약 20 % 억제하고 동시에 활성산소 제거효소의 활성을 약 14 % 높여주고 있어 노화억제에도 효과가 있을 것으로 보고 되었다. 또한 누에의 성분 중 필수 아미노산이 풍부하게 함유되어 있으며, 식품개발연구원 보고에 따르면 필수아미노산 중 알라닌은 알코올 대사를 촉진하여 숙취해소와 간기능 개선에 도움을 준다고 보고되어 있다.

대한민국 등록특허 제10-0396986호는 누에분말로부터 식후 혈당상승에 대한 억제효과가 탁월한 혈당강하 물질을 제조하는 방법에 관한 것이고, 대한민국 등록특허 제10-0361085호는 누에분말의 에탄올추출물을 주성분으로하고, 상엽건조엑스, 가시오가피건조엑스, 실크푸로테인, 베타카로틴, 은행잎건조엑스, 비타민 B1, B6, C 및 E 그리고 달맞이 종자유를 보조성분으로 함유한 항당뇨효과를 갖는 건강보조식품의 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이며, 대한민국 등록특허 제10-0721644호는 누에 번데기 열수추출물을 유효성분으로 포함하는 숙취해소용 건강 기능성 식품에 대하여 기재하고 있으나, 주로 항당뇨 효능 또는 숙취해소 효능에 관한 것으로, 누에의 지방간 및 고지혈증 예방 및 치료 효능에 대하여는 더 많은 연구가 이루어져야 될 것으로 보인다.

본 발명은 상기와 같은 점들을 감안하여 안출한 것으로, 누에 분말에 Bacillus subtilis(바실러스 서브틸리스) 또는 Aspergillus kawachii(아스페르길루스 카와치) 균주를 첨가하여 발효시킨 발효 누에 분말 제조방법 및 발효 누에 분말을 포함하는 고지혈증, 지방간과 같은 각종 성인질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 상기 목적은 누에 분말에 Bacillus subtilis(바실러스 서브틸리스) 또는 Aspergillus kawachii(아스페르길루스 카와치) 균주를 첨가한 후 발효시켜 발효 누에 분말을 제조한 후 이의 구성 단백질 및 아미노산을 확인하고, 알코올 투여 동물의 간 및 혈중의 지질, 알코올, 알데하이드 등의 성분에 대한 상기 발효 누에 분말의 효과를 확인함으로써 달성하였다.

본 발명은 균주를 사용하여 누에 분말을 발효시킴으로써 기존의 비발효 누에 분말에 비해 개선된 고지혈증 및 지방간 예방 및 치료 효능을 나타내는 뛰어난 효과가 있다.

도 1은 Bacillus subtilis 및 Aspergillus kawachii 에 의해 발효된 누에 분말의 native-PAGE 전기영동 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 Bacillus subtilis 및 Aspergillus kawachii 에 의해 발효된 누에 분말의 SDS-PAGE 전기영동 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 Bacillus subtilis 및 Aspergillus kawachii 에 의해 발효된 누에 분말의 유리 아미노산 조성을 나타낸 것이다.
도 4는 Bacillus subtilis 및 Aspergillus kawachii 에 의해 발효된 누에 분말의 혈전용해 활성을 나타낸 것이다.
도 5는 Bacillus subtilis 및 Aspergillus kawachii 에 의해 발효된 누에 분말의 DPPH 자유 라디칼 소거능을 나타낸 것이다. BHT는 Butylated hydroxyl toluene의 약자이며 그외 약자들은 도 4와 동일하다. 데이터는 평균±SD (n=3)으로 나타냈다.
도 6은 Bacillus subtilis 및 Aspergillus kawachii 에 의해 발효된 누에 분말의 환원력을 나타낸 것이다. BHT는 Butylated hydroxyl toluene의 약자이고 AA는 Ascorbic acid의 약자이며, 그외 약자들은 도 4와 동일하다. 데이터는 평균±SD (n=3)으로 나타냈다.
도 7은 알코올 투여 랫의 간에서 ADH(alcohol dehydrogenase) 및 ALDH(acetaldehyde dehydrogenase)의 활성에 대한 SP, BFSP 및 AFSP의 효과를 나타낸 것이다. 다른 문자로 표시된 수치는 p〈 0.05에서 통계적으로 유의차가 있는 것이다. (평균±S.E., n=6).
도 8은 알코올 투여 랫의 간에서 ADH 및 ALDH 웨스턴 블롯 분석에 의한 SP, BFSP 및 AFSP의 효과를 나타낸 것이다.
도 9는 알코올 투여 랫의 간에서 Zn 및 Fe 농도에 대한 SP, BFSP 및 AFSP의 효과를 나타낸 것이다. 다른 문자로 표시된 수치는 p〈 0.05에서 통계적으로 유의차가 있는 것이다. (평균±S.E., n=6).
도 10은 알코올 투여 랫의 간 분획 및 혈청에서 TBARS에 대한 SP, BFSP 및 AFSP의 효과를 나타낸 것이다. 다른 문자로 표시된 수치는 p〈 0.05에서 통계적으로 유의차가 있는 것이다. (평균±S.E., n=6).
도 11은 알코올 투여 랫의 간 및 혈청에서 글루타치온 농도에 대한 SP, BFSP 및 AFSP의 효과를 나타낸 것이다. 다른 문자로 표시된 수치는 p〈 0.05에서 통계적으로 유의차가 있는 것이다. (평균±S.E., n=6).
도 12는 알코올 투여 랫의 간의 병리조직학적 변화에 대한 SP, BFSP 및 AFSP의 효과를 나타낸 것이다(magnification x 200). 간세포 염색을 H&E (hematoxylin and eosin) 염색 방법으로 실시하였다.
도 13은 알코올 투여 랫의 간의 병리조직학적 변화에 대한 SP, BFSP 및 AFSP의 효과를 나타낸 것이다(magnification x 200). 간세포 염색을 H&E 염색 방법으로 실시하였다.

본 발명은 누에 분말에 Bacillus subtilis(바실러스 서브틸리스) 또는 Aspergillus kawachii(아스페르길루스 카와치)균주를 첨가하여 발효시킨 발효 누에 분말 제조방법 및 발효 누에 분말을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 발효 누에 분말을 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 발효 누에 분말을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘, 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 발효 누에 분말을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구제제; 외용제; 좌제; 및 멸균 주사제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 발효 누에 분말의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 10 내지 35 mg/㎏ 체중, 바람직하게는 15 내지 25 mg/kg 체중의 양을 일일 1회 내지 3회 투여할 수 있다. 추출물 및 분획물의 투여량은 질환의 종류 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로써, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실험으로부터 얻어진 결과치는 one-way ANOVA 검정에 의한 평균치와 표준오차(mean± SE)로 표시하였으며, 각 실험군 간의 유의성 검증은 Duncan's multiple range test로 하였다.

실시예 1. 발효 누에 분말의 제조

실험 재료인 누에 분말은 열풍 건조시킨 것으로 순천영농법인(순천, 전남)에서 구입하였다. 열풍 건조 누에 분말의 경시적인 발효를 위하여 Bacillus subtilis KACC 91157 및 Aspergillus kawachii KCCM 32819 균주를 한국미생물보존센터로부터 분양받아 사용하였다. 열풍 건조 누에 분말 각 50 g씩을 500 ml 비이커에 넣고 중량 대비 1.5배의 증류수를 가하여 분말에 모두 흡수시킨 후 121℃에서 15분간 멸균하였다. 실온이 되었을 때 전배양시킨 Bacillus subtilis 배양액을 누에 분말에 1% (v/w) 수준으로 잘 섞은 다음 37℃에서 최대 12일간 발효시켰다. 또한 전배양 한 Aspergillus kawachii 균사체도 누에 분말에 5% (v/w) 수준으로 섞은 다음 37℃에서 최대 12일간 발효시켰다. 이때 발효과정 중에 건조를 막기 위하여 멸균된 증류수를 일정량씩을 뿌려주면서 발효를 진행시켰다. 두 균주로 최장 12일까지 발효시키면서 3일 간격으로 시료를 하나씩 취하여 완전히 건조시킨 후 분석에 사용하였다.

실시예 2. 경시적인 발효 누에의 pH 및 단백질 농도의 측정

경시적인 발효 누에를 각각 증류수에 1% (w/v) 농도로 첨가하여 교반한 후 pH meter (Methrohm 691, Swiss)로 직접 pH를 측정하였다. 경시적인 발효 누에의 단백질 농도는 Lowry 방법(Lowry, O. H., N. J. Rosebrogh, A. L. Farr and R. J. Randall. 1951. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol . Chem . 193, 265-271)으로 540 nm에서 흡광도를 측정하여 우혈청 알부민을 표준품으로 하여 측정하였다.

가잠 유래의 천연 단백질인 실크 피브로인과 누에 실크 유래의 세리신 단백질은 알코올성 간 독성 개선효과와 항산화 효과가 높은 것으로 보고되었다. 이전의 실험에서 고단백 식품소재로 각광받고 있는 누에를 단백질 분해력이 뛰어난 Bacillus 및 Aspergillus 속 미생물로 발효시켜 얻은 발효 누에에서 단백질 함량 증가, 항산화 작용, 혈전 용해 작용, 티로시나제 활성 저해와 같은 생리활성작용이 발효 전 누에보다 증가하는 경향을 보였다[Rahama, E. H. and M. S. Narasinga Rao. 1983. Effect of limitted proteolysis on the functional properties of cottonseed flour. J. Agric . Food Chem . 31, 356-361; Sekul, A. A., C. H. Vinnett and R. L. Ory. 2000. Some functional properties of peanut protein partially hydrolyzed with papain. J. Agric . Food Chem . 26, 855-859]. 또한 SDS-PAGE 상의 단백질 분해 패턴 분석에서도 97-66 kDa 정도 크기의 단백질이 분해되어 밴드상의 차이를 보이고 있어 단백질 분해 효소의 작용에 의해 아미노산과 펩타이드 조성에 영향을 미쳐 생리활성 작용에 차이를 보인 것으로 시사한 바 있다[Rahama et al., 1983; Sekul et al., 2000].

비발효 누에의 단백질 농도는 각각 48.6±0.28% 및 47.0±0.08% 이었다(표 1). Bacillus 균주에 의한 발효 누에의 단백질 농도는 발효 경과 시간과 더불어 지속적으로 높아지는 경향을 보였는데, 발효 12일째 55.6%로 최대 함량을 보였다. Bacillus sp. b01 균주를 이용한 청국장에서의 protease 효소 활성은 발효 9일까지 완만한 증가를 보였다는 실험 결과도 보고된 바 있다(In, J. P., S. K. Lee, B. K. Ahn, I. M. Chung and C. H. Jang. 2002. Flavor improvement of cheonggkukjang by addition of Yucca (Yucca shidigera) extract. Korean J. Food Sci Technol . 34, 57-64). 또한 Aspergillus 균주에 의한 발효 누에의 단백질 농도는 발효 9일째까지 큰 변화가 없다가 12일째 52.3%로 최대 함량을 보였으나, Bacillus 균주에 의한 발효 누에의 단백질 농도보다는 낮은 값을 나타내었다.

Bacillus sp. JH-209 균주 유래 단백질 분해 효소로 누에 번데기에 함유되어 있는 불용성 단백질을 가용성 단백질로 추출하기 위한 실험에서 pH 5.0에서 최저값을 보이다가 pH가 높아짐에 따라 단백질 추출량이 약간씩 증가하는 경향을 보였다고 하였다(Kwon, H. J., K. H. Lee, J. H. Kim, S. S. Chun, Y. J. Cho and W. S. Cha. 2006. Effect of protease on the extraction and properties of the protein from silkworm pupa. J. Korean Soc . Appl . Biol . Chem . 49, 304-308). 본 실험에서도 Bacillus 균주에 의한 발효에서 경시적으로 pH 값이 차츰 증가하면서 단백질 분해 효소의 작용이 활발하게 이루어져 단백질 함량이 경시적으로 증가한 것으로 보여진다(표 1). 또한 Aspergillus 균주에 의한 발효에서는 9일째까지 pH 값에서 큰 변화가 없다가 12일째 증가하면서 동시에 단백질 농도도 증가한 것으로 나타나 누에 번데기 단백질 농도 변화와 유사한 것으로 나타났다.

발효 시간에 따른 바실러스 서브틸리스 및 아스페르길루스 카와치에 의해 발효된 누에의 pH 및 단백질 농도

Sample	Time	pH	Protein content (%)
Silkworm powder (SP)	0 day	7.11	48.60±0.28
Bacillus subtilis	3 day	7.27	51.40±0.38
	6 day	7.43	52.51±0.12
	9 day	7.53	53.53±0.18
	12 day	7.97	55.60±0.08
Aspergillus kawachii	3 day	6.55	49.60±0.26
	6 day	6.56	49.60±0.28
	9 day	6.74	50.10±0.36
	12 day	7.26	52.32±0.38

실시예 3. 경시적인 발효 누에의 Native - PAGE 에 의한 단백질 패턴 비교

경시적인 발효 누에의 단백질 패턴은 Davis 방법[7]에 따라 slab-type native-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)의 겔 농도는 7.5%를 사용하였다. 즉 분리 겔은 30% 아크릴아미드, 0.8% bis-아크릴아미드, 1.5 M Tris-HCl 완충용액 (pH 8.8), 0.05% TEMED 및 10% 과산화암모늄을 혼합하여 1 mm 두께로 만들어 사용하였다. 분리 겔 위에는 5% 농축 겔 [30% 아크릴아미드, 0.8% bis-아크릴아미드, 0.5 M Tris-HCl 완충용액 (pH 6.8)을 만들어 5 × 샘플 완충용액 (312.5 mM Tris-HCl, pH 6.8), 50% 글리세롤, 0.05% bromophenol blue] 용액에 혼합한 시료를 농축 겔내에 성형된 wall에 일정량씩 주입하였다. 전기영동은 Tris-글리신 완충액 (25 mM Tris, 192 mM 글리신, pH 8.8) 하에서 1.5 mA/겔 (cm)의 정전류를 통하여 행하고, 4℃ 저온에서 2시간 통전시켰다. 전기영동이 완료된 겔은 7% 아세트산액에 용해한 1% 쿠마시 브릴리언트 블루(coomassie brilliant blue) R-250으로 염색한 후 7% 아세트산액으로 충분히 탈색시켜 건조 및 사진촬영을 행하였다.

경시적인 누에 단백질을 native-PAGE로 전기영동 하여 비교분석 한 결과 비발효 누에 단백질 상단부의 97-66 kDa 크기 밴드 농도가 짙은 것에 비해 Bacillus subtilis 발효 누에에서는 발효 3일째부터 대부분 분해되어 저분자화됨으로서 밴드의 윤곽이 잘 보이지 않는 것으로 나타났다(도 1). 그러나 Aspergillus kawachii 균주에 의한 발효 누에 단백질 밴드는 발효 시간이 경과하면서 밴드의 농도가 차츰 연해지는 경향을 보이고 있어 두 균주간에 큰 차이를 보였다. Kang 등의 문헌에서는 누에 장면과 단명 품종의 유충 체액 단백질(Major hemolymph protein)을 native-PAGE로 비교한 결과 5령 초기에 많은 종류의 밴드가 관찰되었고, 5령 일수가 증가할수록 새로운 단백질의 출현뿐만 아니라 전체적인 단백질량의 증대가 뚜렷하다고 하였다(Kang, P. D., H. J. Yoon, K. S. Ryu, B. H. Sohn and H. D. Sohn. 1999. Electrophoretic patterns of hemolymph proteins of varieties with long and short life span in the silkworm Bombyx mori L. Korean J. Seric . Sci . 41, 1-8).

실시예 4. 경시적인 발효 누에의 SDS - PAGE 에 의한 단백질 패턴비교

경시적인 발효 누에의 단백질 패턴 분석은 Weber 및 Osbom 방법(Weber, K. and M. Osborn. 1969. The reliability of molecular weight determination by sodium dodesyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis. J. Biol . Chem . 244, 4406-4412)에 따라 실행하였는데, SDS-PAGE의 조성은 10% 아크릴아미드, 1.5 M Tris-HCl 완충용액 (pH 8.8), 0.4% SDS(Sodium dodecyl sulfate), 10% 과산화암모늄 및 0.05% TEMED로 만들어 사용하였다. 농축 겔의 조성은 5% 아크릴아미드, 0.5M Tris-HCl 완충용액 (pH 6.8), 0.4% SDS, 0.05% TEMED 였다. 시료단백질의 SDS 처리는 최종농도 2% SDS, 14.4 mM β-머캅토에탄올, 60 mM Tris-HCl 완충용액 (pH 6.8), 25% 글리세롤 및 0.1% BPB 혼합액에서 100℃로 5분간 열처리 하였다. 전기영동은 Tris-글리신 완충액 (25 mM Tris, 192 mM 글리신, pH 8.3) 하에서 130-150 mA/gel (cm)의 정전류를 통하여 1시간 30분간 하였다. 전기영동 후 겔은 고정액 (메탄올 : 아세트산 : 물 = 10 : 10 : 80)에 1% 쿠마시 브릴리언트 블루 R-250을 첨가하고 10시간 염색한 후 탈색액(메탄올 : 아세트산 : 물 = 10 : 10 : 80)으로 충분히 탈색시켜 건조 및 사진촬영을 행하였다.

경시적인 발효 누에 단백질을 SDS-PAGE상의 전기영동 패턴을 비교분석 한 결과(도 2), 발효 시작 전 97-66 kDa 크기의 누에 단백질 밴드가 뚜렷이 있는 것에 비해 Bacillus subtilis 균주에 의한 발효 누에의 단백질에서는 발효 3일째부터 전혀 없는 것으로 보아 단백질 분해 효소에 의해 대부분 분해된 것으로 보여진다. 그러나 Aspergillus kawachii 균주에 의한 발효 누에의 97-66 kDa 크기의 단백질 밴드는 발효 시간이 경과하면서 차츰 없어지면서 최장 12일째에는 대부분이 분해가 일어난 것으로 보여 분해에 상당한 시간이 필요한 것으로 생각되어 진다. 따라서 누에 단백질로부터 아미노산이나 펩타이드와 같은 생리활성 물질을 산업적으로 얻기 위해서는 Aspergillus kawachii 균주에 의한 발효보다는 Bacillus subtilis 균주에 의한 발효가 더 경제적일 것으로 사료되어 진다.

실시예 5. 발효 누에의 구성 및 유리 아미노산 측정

구성 아미노산 분석은 12일째 발효 누에 시료 0.2 g에 15 ml 과산화포름산, 6 N HCl 15 ml를 가하여, 110℃ dry oven에서 24시간 이상 동안 산 가수분해시켰다. 분해된 시료를 55℃ Water bath에서 감압농축 한 후 pH 2.20 구연산 희석 완충용액로 25 ml에 volumetric flask에 정용하여 0.2 μm membrane filter로 여과시킨 시료 일정량을 아미노산 자동분석기 (Biochrom 30, Amersham Biosciences Ltd., Cambridge, UK)로 분석하였다. 유리 아미노산 분석은 12일째 발효 누에 시료를 이용하여 아미노산 자동분석기 (Biochrom 30, Amersham Biosciences Ltd., Cambridge, UK)로 분석하였다.

구성 아미노산의 총 함량은 비발효 누에의 354,610 ppm에 비해 Aspergillus kawachii 균주 발효 누에 661,692 ppm 및 Bacillus subtilis 균주 발효 누에 679,708 ppm으로 상당히 많은 량이 검출되었다(표 2). 비발효 누에의 구성 아미노산 농도는 글리신(48,519 ppm), 알라닌(46,349 ppm), 글루탐산(42,402 ppm), ㅇ아스파트산(32,798 ppm) 및 세린(29,882 ppm) 순으로 분석되었다[3]. 그러나 본 실험에서 이들 두 균주에 의한 발효누에의 구성 아미노산 중에서 가장 많이 함유된 아미노산은 글루탐산로 63.25%-63.51%를 차지하여 발효전과 다른 양상을 보였다. Aspergillus kawachii 발효 누에의 구성 아미노산 조성은 글루탐산 418,536, 아스파트산 32,335, 세린 30,190, 티로신 21,848, 루이신 21,145 ppm 순으로 나타났다. Bacillus subtilis 발효 누에의 구성 아미노산 조성은 글루탐산 431,660, 아스파트산 32,135, 세린 29,195, 리신 24,270, 히스티딘 23,857 ppm 순으로 나타나 두 균주에 의한 발효 누에의 구성 아미노산 조성에서도 차이가 있는 것으로 관찰되었다. 특히 비발효 누에의 글루탐산, 프롤린, 히스티딘은 두 균주의 발효에 의해 현저히 증가한 반면, 글리신, 알라닌, 발린은 현저히 감소한 것으로 나타났다. 지금까지 알코올성 간 독성 관련 연구에서 글리신, 글루탐산, 아르기닌, 세린, 아스파트산과 같은 단일 아미노산 처리에 의해서도 개선효과가 보고 되었다(Lee, J. H., N. K. Kim, D. Y. Lee and C. H. Lee. 1999. Protective effect of selected amino acids and food extracts on ethanol toxicity determent in rat liver. Korean J. Food Sci . Technol . 31, 802-808; Yin, M., K. Ikejima, G. E. Arteel, V. Seabra, B. U. Bradford, H. Kono and I. Rusyn and R. G. Thurman. 1998. Glycine accelerates recovery from alcohol-induced liver injury. J. Pharacol . Exp . Ther. 286, 1014-1019). 한편, 숙취해소에 널리 사용되고 있는 콩나물의 구성 아미노산 조성에서도 아스파트산, 글루탐산, 아르기닌이 많이 함유되어 있어 역시 간 보호 효과가 높았다고 하였다(Lee et al., 1999). 한편 세리신 단백질의 구성 아미노산 조성에서도 세린 31%, 아스파트산 17.8% 및 글리신이 19.1%를 차지하고 있었으며, 또한 알코올성 간 독성 개선효과가 보고된 바 있다(Kato, N., S. Sato, A. Yamanaka, H. Yamada, N. Fuwa and M. Nomura. 1998. Silk protein, sericin, inhibits lipid peroxidation and tyrosinase activity. Biosci . Biotechnol . Biochem . 62, 145-147). 따라서 간 보호 효과가 있는 글루탐산, 세린 및 아스파트산과 같은 아미노산을 많이 함유하고 있어 간 기능개선 건강보조식품 소재로서의 활용가치가 기대된다.

12일의 발효 기간 동안 Bacillus subtilis 및 Aspergillus kawachii 에 의해 발효된 누에의 아미노산 조성 (ppm)

Amino acids	Silkworm	Bacillus subtilis	Aspergillus kawachii
L-Aspartic acid	32,498	32,335	32,135
L-Threonine	15,930	16,341	15,108
L-Serine	29,882	30,190	29,195
L-Glutamic acid	42,402	418,536	431,660
L-Proline	9,359	13,831	13,629
L-Glycine	48,519	8,270	9,256
L-Alanine	46,349	7,818	8,021
L-Valine	17,027	3,059	3,493
L-Isoleucine	13,103	14,256	13,822
L-Leucine	18,820	21,145	20,369
L-Tyrosine	20,114	21,848	23,557
L-Phenylalanine	13,769	14,926	15,349
L-Histidine	9,373	20,708	23,857
L-Lysine	19,613	20,526	24,270
L-Arginine	17,553	17,905	15,987
Total	354,610	661,692	679,708

본 실험에서 Bacillus subtilis 및 Aspergillus kawachii 두 균주에 의한 발효 누에의 유리 아미노산 중에서 가장 많이 함유된 아미노산은 알라닌으로 각각 16.257% 및 16.198%를 함유하였으며, 그 다음으로 글루탐산이 12.540% 및 12.678%를 각각 함유하였다 (표 3 및 도 3). 그 다음으로 글리신, 발린, 루이신 및 이소루이신 순으로 많이 함유되었다. 그러나 두 균주의 발효에 의한 유리 아미노산 조성상의 큰 차이는 없는 것으로 나타났다.

12일의 발효 기간 동안 Bacillus subtilis 및 Aspergillus kawachii 에 의해 발효된 누에의 유리 아미노산

Free amino acids	Retention time	Bacillus subtilis (%)	Aspergillus kawachii (%)
Phosphoserine	4.333	0.47	0.48
Taurine	6.933	0.36	0.75
Urea	10.566	0.052	0.052
Aspartic acid	20.799	4.028	3.580
Threonine	26.665	4.935	4.921
Serine	28.632	5.283	5.781
Glutamic acid	34.264	12.540	12.678
AAAA(α-Aminoadipic acid)	42.264	0.085	ND
Proline	44.164	0.147	0.148
Glycine	45.964	8.048	8.533
Alanine	47.464	16.258	16.197
Citrulline	48.997	1.63	0.79
AABA (α-Aminobutyric acid)	50.830	0.164	0.063
Valine	53.697	6.470	6.611
Cystien	58.083	0.065	0.064
Methionine	60.563	0.624	0.776
Cystachionine	63.163	0.247	0.177
Isoleucine	65.296	4.137	4.096
Leucine	67.069	6.817	6.817
Tyrosine	70.196	2.793	2.750
β-Alanine	72.062	ND	ND
Phenylalanine	73.429	3.762	3.656
β-Aminoisobutylic acid	75.229	ND	ND
Homocysteine	77.395	ND	ND
GABA(γ-Aminobutyric acid)	80.062	0.930	0.906
Ethanolamine	83.761	0.499	0.389
Ammonia	87.128	8.026	6.958
Ornithine	94.427	0.822	0.939
Lysine	97.360	4.398	4.510
3-Methyl-histidine	99.127	0.047	ND
Histidine	100.560	2.338	2.460
Arginine	114.193	3.177	3.283

실시예 6. 경시적인 발효 누에의 혈전용해 효소 활성 측정

경시적인 발효 누에의 혈전용해 효소 활성은 fibrin plate 법(Astrup, T. and S. Mullertz. 1991. The fibrin plate method for estimating fibrinolytic activity. Arch. Biochem. Biophys 40, 346-351)을 변형하여 lysed zone으로 측정하였다. 혈전용해 활성 측정에 사용된 피브린, 피브리노겐, 트롬빈은 Sigma Co. (St. Louis MO, USA) 제품을 구입하여 사용하였다. 피브린 플레이트는 0.06% 피브리노겐을 0.2 M 브롬산염 완충용액 (pH 7.5)에 용해시킨 후 패트리 디쉬에 10 ml씩 분주하고 트롬빈 (5,000 unit) 40 unit를 균일하게 섞이도록 가하면서 균일한 두께의 피브린 클롯(clot) 형성시킨 후 실온에서 30분간 방치한 후 사용하였다. 시료를 증류수에 1% 농도로 용출시킨 후 여과(Whatman No. 2)하여 피브린 플레이트 상에 50 μl씩 점적하여 37℃에서 3시간 동안 반응시킨 후 생성된 투명환 부위의 직경을 측정하였다. 직경은 서로 수직인 두 개의 지름을 측정하여 투명대의 면적을 구하여 unit/ml로 표시하였다.

혈관에 혈전이 만들어지게 되면 혈액순환을 방해하여 고혈압, 동맥경화, 뇌졸중, 협심증 등을 일으키는데, 이 때 혈전 용해 효소가 활성화되면 혈전 생성이 억제되어 각종 순환기계 질병을 예방하는데 효과가 있다고 알려져 있다. 자연계에 존재하는 Bacillus subtilis , Fusarium pallidoroserum , Katsuwonus pelamis , Streptococcus aureus 미생물 유래나 청국장, 된장, 멸치젓갈, natto (nattokinase) 및 shiokara (katauwokinase)와 같은 전통 발효 식품 유래의 혈전 용해 효소의 활성을 위한 소재로 많이 연구개발되었으며, 주로 세린 프로테아제로 분류되고 있다. 또한 국내 자생곤충 76종으로부터 304종의 추출물 중에서 방아깨비, 왕잠자리, 비단노린재 등 10종에서 우수한 항혈전 활성이 있다고 할 정도로 극히 일부의 곤충에서만 관찰되는 것으로 보고되고 있다(Ryu, H. Y., J. C. Heo, J. S. Hwang, S. W. Kang, C. Y. Yun, S. H. Lee and H. Y. Sohn. 2008. Screening of thrombin inhibitor and its DPPH radical scavenging activity from wide insects. J. Life Sci . 18, 363-368). 냉동건조 누에분말의 70% 메탄올 추출물에서도 혈전용해 활성이 약간 있는 반면 열풍 건조 누에 추출물에서는 활성이 전혀 없는 것으로 나타나 누에 유충의 건조 방법에 따라 달라지는 것으로 관찰되었다(Cha, J. Y., Y. S. Kim, H. Y. Ahn, K. E. Eom, B. K. Park and Y. S. Cho. 2009. Biological activity of fermented silkworm powder. J. Life Sci . 19, 1468-1477). 이전의 실험에서 열풍 건조 누에에 B. subtilis 균주를 1% 접종하여 2일간 발효시킨 발효 누에에서 혈전용해 활성이 2.2 unit 였으나, A. kawachii 균주 5% 접종으로 12일간 발효한 발효 누에에서는 3.4 unit로 약간 높은 혈전용해 활성이 관찰되었다(Cha, J. Y., Y. S. Kim, P. D. Kang, H. Y. Ahn, K. E. Eom and Y. S. Cho. 2010. Biological activity and chemical characteritics of fermented silkworm powder by mold. J. Life Sci . 20, 237-244). 본 발명에서도 열풍 건조 누에에 B. subtilis 균주를 1% 접종하여 경시적인 혈전용해 활성을 조사한 결과 3일째 2.79 uint였으며, A. kawachii 균주 5% 접종으로 12일간 발효한 발효 누에에서는 5.83 unit로 이전의 발효 누에 결과와 비슷한 결과가 관찰되었다(도 4). 그러나 두 균주로 발효시킨 발효누에의 혈전용해 활성은 6일째 최대 활성을 나타내다가 이후부터 감소하는 경향을 보였다. Soybean grit를 이용한 B. subtilis HA 균주 발효에서 5일째 가장 높은 혈전용해 효소 활성을 보여 발효 기간에 따라 효소 활성에 영향을 미치는 것으로 보고되었다[Kim, J. E. and S. B. Lee. 2009. Production of bioactive components and anti-oxidative activity of soybean grit fermented with Bacillus subtilis HA according to fermentation time. Korean J. Food Sci . Technol. 41, 179-185]. 따라서 A. kawachii 균주로 발효시킨 발효 누에의 항혈전 작용은 발효 6일째 15.02 uint로 최대 활성을 보여 발효 누에의 혈전용해 효소 활성을 갖는 발효산물을 얻기 위해서는 5-6일 정도의 발효가 적절한 시간으로 사료된다.

실시예 7. 경시적인 발효 누에의 DPPH 법에 의한 항산화 활성 측정

경시적인 발효 누에의 항산화 활성은 Blois의 방법에 따라 측정하였다(Blois, M. S. 1958. Antioxidant determination by the use of a stable free radical. Nature 26, 1199-1204). 즉 DPPH(α,α'-diphenyl-β-picrylhydrazyl) 용액은 100 ml 에탄올에 DPPH 16 ㎎을 녹인 후 증류수 100 ml를 혼합하여 여과지(Whatman filter paper NO. 2)로 여과시켜 만들었다. DPPH 용액 5 ml에 0.1% (1 mg/ml) 시료 용액 1 ml을 혼합하여 실온에서 30분간 반응시킨 후 528 nm에서 흡광도의 감소를 측정하였다. 대조구인 시판항산화 BHT는 0.05%로 첨가하여 상기와 동일한 방법으로 흡광도 감소를 측정하였다. DPPH 자유 라디칼 소거능은 시료 첨가구와 무첨가구의 흡광도차를 백분율(%)로 표시하였다.

DPPH free radical scavenging activity(%) = 1 - (Abs/Abc) × 100

Abc : Absorbance of control treatment at 528nm

Abs : Absorbance of sample treatment at 528nm

식품에 함유되어 있는 폴리페놀계 물질은 히드록시기를 하나 이상 함유하고 있는 환구조와 메틸기 또는 비극성 탄화수소 사슬 구조와 같은 비극성기를 가진 분자구조적 특징을 가진 수소공여 항산화 물질로 알려져 있으며, 이를 측정하는 대표적인 방법이 DPPH 자유 라디칼 소거 항산화 활성 측정법이다(Blois, 1958). DPPH는 자유 라디칼(free radical)에서 특유의 색을 나타내다가 전자나 수소원자에 의해 전자가 쌍을 이루게 되면 비라디칼 형성으로 특유의 색이 사라지는 색도상의 차이를 측정하는 원리를 이용한 가장 일반적인 항산화 활성 측정 방법으로 실제 천연물의 항산화 활성과도 매우 연관성이 높은 것으로 잘 알려져 있다. 항산화 활성은 비발효 누에 물추출물(1 mg/ml)에서 42.12%를 나타내었고, 대조구로 사용한 시판 항산화제 BHT 1 mg/ml 농도에서는 95.96%의 높은 활성을 보였다(도 5). B. subtilis 발효 누에 물추출물(1 mg/ml)의 항산화 활성은 발효 기간이 길어지면서 비례적으로 증가하는 것으로 나타났다. 발효 전 42.12%에서 발효 9일째 75.90% 이상의 활성을 보인 이 후 완만하게 증가하는 경향을 나타내었다. A. kawachii 발효 누에 물추출물의 항산화 활성은 발효 9일째까지 큰 변화를 보이지 않다가 발효 12일째 73.99%의 높은 활성을 보였다(도 5). 우리나라 고유의 전통식품인 된장, 일본 Okara koji, 인도네시아 thempeh에서 발효과정 중에 단백질 분해가 일어나 이 때 생성되는 대사산물인 펩타이드나 아미노산 등의 화합물에 의해 항산화 활성이 증가하였다는 보고가 있었다(Matsuo, M. 1997. In vitro antioxidant activity of Okara koli, a fermented Okara, by Aspergillus oryzae. Biothechol . Biochem. Bioch . 61, 1968-1972; Matsuo, M. N. Nakamura, Y. Shidoji and T. Osawa. 1997. Antioxidative mechanism and apoptosis induction by 3-hydroxy anthranilic acid, an antioxidant in Indonesian food, tempeh, in the hyamn hepatoma derived cell line, HuH-7. J. Nutr . Sci . Vitaminol . 43, 249-259; Shon, M. Y., J. Lee, J. H. Choi and S. Y. Park. 2007. Antioxidant and free radical scavenging activity of methanol extract of chenoggkukjang. J. Food Compos . Anal. 20, 113-118). Marcuse의 문헌에서는 cystein을 제외한 대부분의 아미노산에서 항산화 활성이 있었다고 보고하였다(Marcuse, R. 1962. The effect of some amino acids on the oxidation of linoleic acid and its methyl ester. J. Am . Oil Chem . 39, 97-103). 발효 전 누에 물추출물에 비해 발효 누에의 물추출물에서 항산화 활성이 증가한 것은 발효 과정 중에 생성되는 대사산물에 의한 효과로 사료된다. 한편, 국내 자생곤충 76종의 304종 추출물 중 DPPH 소거능으로 항산화 활성을 측정한 결과 방아깨비, 가시길쭉바구미, 알락수엽노린재, 송장벌레과 유충 4종에서만 항산화 활성이 있었다고 하였다(Park, Y. J., J. C. Heo, S. M. An, E. Y. Yun, S. M. Han, J. S. Hwang, S. W. Kang, C. Y. Yun and S. H. Lee. 2005. High throughput-compatible screening of antioxidative substances by insect extract library. Korean J. Food Preserv . 12, 482-488). 이처럼 극히 일부 곤충에서만 항산화 활성이 있는 것에 비해 누에 자체에 항산화 활성이 있으면서 미생물 발효에 의해 더욱더 활성이 증가함으로서 누에의 생리활성 작용을 이용한 건강기능식품으로서 활용가치가 높은 것으로 사료된다.

실시예 8. 경시적인 발효 누에의 Fe 환원력 측정

경시적인 발효 누에의 Fe-환원력 측정은 Zhu 등의 방법[31]에 따라 측정하였다. 발효 누에 0.1% 물추출물 0.75 ml을 취하고, 0.2 M sodium phosphate 완충용액 (pH 6.6) 1.25 ml 및 1% (w/v) potassium ferricyanide [K₃Fe(CN)₆] 1.25 ml을 혼합하여 50℃에서 20분간 진탕반응시켰다. 이 반응액에 10% 트리클로로아세트산 (w/v)를 1.25 ml 가하여 산성화시키고, 3,000 rpm에서 20분간 원심분리시켰다. 상층액 2.5 ml를 취하고 증류수 2.5 ml 및 0.5% 염화제이철 (FeCl₃) 0.5 ml를 혼합한 후 실온에서 10분간 반응시켜 Spectrophotometer (HITACHI U-2900)의 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 환원력 비교를 위하여 시판 항산화제로 많이 사용되고 있는 아스코르브산, BHT를 각각 시료와 동일 농도로 만들어 동일한 방법에 의해 흡광도를 측정하였다. 환원력은 시료 반응액에서 흡광도가 증가된 만큼 강한 환원력을 나타내어 준다.

Fe 환원력(reducing power) 활성 정도는 수소 원자를 제공하는 자유 라디칼의 연쇄 반응으로 금속 이온을 환원시키는 정도를 흡광도 값으로 나타내는 것으로, 환원력의 효과는 반응 물질의 흡광도 수치가 높을수록 항산화 활성이 높다는 것을 나타내어 준다. Fe-환원력은 대조구로 사용한 시판 항산제인 BHT 및 ascorbic acid 0.1%의 농도에서 1.29 및 1.21의 흡광도를 나타내었다(도 6). 비발효 누에 물추출물(1 mg/ml)의 환원력은 0.41로 대조구로 사용한 시판 항산화제 BHT 또는 ascorbic acid 흡광도 보다 3배 정도 낮은 값을 보였다(도 6). 그러나 B. subtilis 발효 누에 물추출물(1 mg/ml)에서는 발효 6일째 0.56으로 증가하다가 차츰 낮아지는 경향을 보였으며, A. kawachii 발효 누에 물추출물(1 mg/ml)에서는 발효 9일째까지 큰 변화를 보이지 않다가 발효 12일째 0.47로 가장 높은 활성을 보였다. 더덕의 경우 열수 추출물(1 mg/ml)에서 환원력으로 측정한 흡광도는 0.34인데 비해 발효 더덕의 경우 0.65으로 발효에 의해 활성이 증가된 것으로 나타나 본 발명의 결과와는 일치하는 것으로 나타났다(Park, S. J., S. W. Song, D. H. Seong, D. S. Park, S. S. Kim, J. Gou, J. H. Ahn, W. B. Yoon and H. Y. Lee. 2009. Biological activities in the extract if fermented Codonopsis lanceolata. J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. 38, 983-988).

이상의 실험에서 B. subtilis 발효 누에에서 환원력과 혈전 분해 활성은 발효 6일째에 항산화 활성과 단백질 농도는 발효 12일째에 가장 높았고, SDS-PAGE상의 전기영동 분석에서는 발효 초기인 3일째 96-66 kDa 크기의 단백질이 대부분 분해가 일어났었다. A. kawachii 발효 누에의 환원력, 항산화 활성 및 단백질 농도는 발효 12일째에 가장 높았고, SDS-PAGE상의 전기영동 분석에서 96-66 kDa 크기의 단백질은 발효 3일째부터 차츰 분해되기 시작하여 12일째 분해가 대부분 이루어졌다. 따라서 미생물을 이용한 발효 누에에서 특정의 생리활성 작용을 기대하기 위해서는 사용하는 균종에 따라 발효 시간이 달라져야 한다는 것을 시사하였다.

실시예 9. 동물 실험

실험재료

전배양시킨 Bacillus subtilis 균주를 살균한 열풍건조 누에분말에 접종한 후 37℃에서 48시간 발효시킨 후 6시간 동안 열풍건조시켜 실험동물에 사용하였다. 또한 PD 액체배지에서 150 rpm, 30℃ 조건에서 72시간 전배양시킨 Aspergillus kawachi 균주도 살균한 열풍건조 누에분말에 접종하여 30℃에서 12일간 발효시킨 후 6시간 동안 열풍건조시켜 얻은 발효 누에분말 시료를 동물실험에 사용하였다.

식이조성 및 실험군

식이 조성은 표 4와 같으며, 정상군 (N), 알코올 투여 대조군 (C), 알코올+열풍건조 누에분말 투여군 (SP), 알코올+Bacillus subtilis 발효 누에분말 투여군 (BFSP), 알코올+Aspergillus kawachi 발효 누에분말 투여군 (AFSP)으로 나누어 실험을 진행하였다. 발효 누에분말의 식이 중 첨가량 결정은 Yoon 등의 문헌[Yoon JW, Rhee SK, Lee KB. Effects of silkworm extract powder on plasma lipids and glucose in rats. Korean J Food Nutr 18: 140-145 (2005)]의 방법에 준하였으며, 이때 식이 중에 첨가한 발효 누에분말은 단백질원인 카제인과 당질원인 설탕으로 대체하여 첨가하였다.

실험 식이 조성 (%)

Ingredients	Normal	Alcohol
		Control	SP1 )	BFSP2 )	AFSP3 )
Casein	20	20	17	17	17
Corn starch	15	15	15	15	15
Sucrose	55	55	53	53	53
Cellulose	5	5	5	5	5
Corn oil	10	10	10	10	10
Mineral mixture4 )	3.5	3.5	3.5	3.5	3.5
Vitamin mixture5 )	1	1	1	1	1
Choline bitartrate	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2
DL-Methionine	0.3	0.3	0.3	0.3	0.3
SP	0	0	5	0	0
BFSP	0	0	0	5	0
AFSP	0	0	0	0	5

¹⁾SP: Silkworm powder.

²⁾BFSP: Bacillus subtillis fermented silkworm powder.

³⁾AFSP: Aspergillus kawachii fermented silkworm powder.

⁴⁾AIN 93 M-MX mineral mix, MP Biomedicals, Illkirch, France.

⁵⁾AIN 93 VX vitamin mix, MP Biomedicals, Illkirch, France.

실험동물 및 사육조건

실험동물은 6주령의 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐를 구입하여 일주일간 시판 고형사료를 급여하면서 환경에 적응시킨 후 본 실험에 사용하였다. 본 실험은 체중이 동일하게 난괴법(randomized complete block design)으로 분류하여 사육실 온도(22±2℃)와 습도(50±5%) 및 명암주기(명주기: 07:00～19:00)가 조절되는 동물 사육실에서 사육하였다. 사육 기간 중 식이 섭취량은 매일 측정하였고, 체중은 매주 한번씩 일정한 시간에 측정하였다. 이 때 알코올 투여는 실험동물에서 알코올에 의한 급성독성을 막기 위하여 알코올 농도를 처음 10%로 시작해서 최종 30% 농도로 1주일마다 단계적으로 높이면서 본 실험을 시작하면서 시료를 함께 투여하였다.

동물실험, 시료 채취 및 분석시료 조제

동물실험은 4주간 각 군별로 조제사료를 급여하면서 사육한 후, 실험 최종일 12시간 이상 절식시킨 후 에테르로 가볍게 마취시켜 해부하였다. 개복 후 복부 대동맥으로부터 채혈하여 혈액을 채취하고, 약 30분간 실온에 방치시킨 후 3,000 rpm에서 20분간 원심분리 하여 얻은 혈청을 혈청 생화학적 분석에 제공하였다. 채혈 후 각 조직을 적출하여 차가운 0.9% 생리식염수로 세척하고 여과지로 물기를 제거한 후 무게를 측정하고 분석시료로 제공하였다.

실시예 10. 동물실험 결과 평가

체중, 식이 및 음료 섭취량 변화

4주 동안 알코올 급여에 의해 체중 증가량이 정상군에 비해 많이 증가하지 않은 것으로 보아 알코올에 의해 성장에 영향을 미친 것으로 보여지며, 식이 섭취량도 동시에 많이 줄어든 것으로 나타났다(표 5). 한편 알코올은 소화흡수 기관인 소장에서 영양소나 식이성분의 흡수를 떨어트려 영향불균형을 초래함으로서 체중 증가량의 감소를 가져온다. 그러나 알코올 급여 흰쥐에 SP, BFSP, AFSP의 첨가식이 투여는 식이섭취량의 증가에 의해 체중이 증가하는 것으로 나타났다(표 5).

알코올 투여 랫에서 체중, 식이 및 음료 섭취 및 상대적인 조직 무게에 대한 SP, BFSP 및 AFSP의 효과

Group	Body weight gain (g)	Food intake (g/day)	Water consumption (mL/day)
Normal	212.19±7.55a	19.83±0.17a	35.50±1.28a
Control	99.04±17.17b	13.00±0.63b	14.50±0.67b
SP	119.92±18.90b	12.83±0.40b	15.67±0.92b
BFSP	116.34±13.13b	12.83±0.54b	17.67±0.92b
AFSP	115.63±13.46b	12.50±0.43b	16.83±1.47b

SP: Silkworm powder.

BFSP: Bacillus subtillis fermented silkworm powder.

AFSP: Aspergillus kawachii fermented silkworm powder.

Values with different letters are significantly different at p〈 0.05. (mean±S.E., n=6).

NS: Not significant different.

각 장기의 절대 및 상대중량

체중에 대한 각 장기의 절대증량과 상대중량을 각각 표 6과 표 7에 나타내었다. 절대 중량에서는 정상군에 비해 모든 실험+군에서 유의적인 차이를 나타내었다(표 6).

알코올 투여 랫의 조직 무게에서 SP, BFSP 및 AFSP의 효과

Group	Liver	Kidney	Spleen	Heart	Testis	Epididymal WAT	Perirenal WAT
Normal	11.48 ±0.22a	3.31 ±0.10a	0.79 ±0.05a	1.57 ±0.04a	3.32 ±0.13a	8.12 ±0.39a	8.54 ±0.40a
Control	8.89 ±0.65b	2.84 ±0.09b	0.59 ±0.04b	1.31 ±0.05b	2.96 ±0.09b	4.57 ±0.66b	3.96 ±0.89b
SP	9.04 ±0.45b	2.63 ±0.05b	0.51 ±0.04b	1.23 ±0.06b	3.10 ±0.05ab	4.90 ±0.57b	4.10 ±0.75b
BFSP	9.71 ±0.60b	2.86 ±0.20b	0.56 ±0.03b	1.17 ±0.06b	3.10 ±0.06b	4.94 ±0.42b	3.97 ±0.53b
AFSP	9.23 ±0.37b	2.67 ±0.07b	0.54 ±0.03b	1.23 ±0.04b	3.01 ±0.10ab	4.64 ±0.27b	3.82 ±0.55b

SP: Silkworm powder.

BFSP: Bacillus subtillis fermented silkworm powder.

AFSP: Aspergillus kawachii fermented silkworm powder.

Values with different letters are significantly different at p〈 0.05. (mean±S.E., n=6).

또한 체중에 대한 각 장기의 상대중량은 간, 신장, 심장, 고환에서는 각 실험군간에 유의적인 차이가 없었으나, 비장, 신장주변 지방조직 및 고환주변 지방조직의 경우 군간에 약간의 차이를 보였다(표 7).

알코올 투여 랫의 상대적인 조직 무게에서 SP, BFSP 및 AFSP의 효과

Group	Liver	Kidney	Spleen	Heart	Testis	Epididymal WAT	Perirenal WAT
Normal	2.65 ±0.04NS	0.76 ±0.03NS	0.18 ±0.01a	0.75 ±0.40NS	0.78 ±003NS	1.87 ±0.08a	1.97 ±0.09a
Control	2.62 ±0.07	0.85 ±0.03	0.18 ±0.01a	0.39 ±0.01	0.88 ±0.07	1.33 ±0.14b	1.13 ±0.21b
SP	2.57 ±0.09	0.76 ±0.05	0.14 ±0.01b	0.35 ±0.03	0.92 ±0.06	1.37 ±0.11b	1.13 ±0.17b
BFSP	2.76 ±0.07	0.82 ±0.04	0.16 ±0.01ab	0.33 ±0.02	0.91 ±0.02	1.40 ±0.07b	1.12 ±0.13b
AFSP	2.66 ±0.05	0.77 ±0.03	0.16 ±0.01a b	0.36 ±0.01	0.85 ±0.06	1.34 ±0.08b	1.08 ±0.13b

Relative tissue weight means the percent of the liver weight in the body weight.

SP: Silkworm powder.

BFSP: Bacillus subtillis fermented silkworm powder.

AFSP: Aspergillus kawachii fermented silkworm powder.

Values with different letters are significantly different at p〈 0.05. (mean±S.E., n=6).

NS: Not significant different.

실시예 11. 간 조직 및 혈청 지질농도 및 생화학적 지표분석

간 조직으로부터 균질액 분획 조제는 간을 일정량 취해 ice-cold 인산칼륨 완충용액 용액(1 mmol/L sodium EDTA 및 1 mmol/L 디티오트레이톨을 포함하는 0.1 mol/L 인산칼륨, pH 7.4)을 9배량 첨가하여 IKA-ULTRA-TURRAX T25 basic homogenizer (IKA-WERKE GMBH & CO., KG, Staufen, Germany)를 이용하여 균질액을 제조하였다. 균질화 용액을 먼저 800 x g에서 10분간 원심분리하고, 상등액을 다시 고속원심분리기(VS-24SMTi, Vision Scientific Co., Ltd.)에서 10,000 × g로 20분간 원심분리 하여 침전된 펠렛은 미토콘드리아 분획으로 하였다. 이때 마이크로솜이 함유된 상층액을 105,000 x g에서 60분간 초원심분리하여 상층의 cytosol 분획과 침전된 마이크로솜 분획을 얻어 실험에 제공하였다. 균질화액, 미토콘드리아 및 마이크로솜 분획의 단백질 농도는 Lowry 방법에 준하여 우혈청 알부민을 표준품으로 하여 측정하였다(Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RS. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem 193: 265-275 (1951)).

혈청 중의 총 지질, 중성지질, 총-콜레스테롤, HDL-콜레스테롤, 유리지방산, 총 단백질, 알부민 농도 및 ALT, AST, γ-GTP, LDH 활성은 의료전문수탁검사기관인 네오딘의학연구소(서울, 한국)에 의뢰하여 분석하였다.

간 조직 및 혈중의 중성지질 농도

간은 많은 지질과 지질대사에 관련된 중요한 조직으로 알려져 있으며, 혈중 중성지질 농도는 간 중성지질 대사와 밀접한 관련성이 있다. 특히 간 지질 중에서 중성지질 축적은 비 알코올성 또는 알코올성 지방간 유발 원인 물질로 잘 알려져 있다. 본 발명에서 알코올 급여에 의해 간 중성지질 농도가 현저히 증가하여 알코올성 지방간의 특징을 잘 나타내어(표 8) 이전의 실험 결과와 일치하였다(Oliva L, Beauge F, Choquart D, Montet AM, Guitaoui M, Montet JC. Ursodeoxycholate alleviates alcoholic fatty liver damage in rats. Alcohol Clin Exp Res 22: 1538-1543 (1998)). 흰쥐에서 간 독성에 의한 간 지질의 축적은 글리신, 아르기닌, 타우린, 시스테인, 알라닌 등과 같은 항산화 및 간독성 개선 효과를 가지는 아미노산에 의해 어느 정도 개선되는 것으로 알려져 있다. 높은 항산화 활성을 가지고 있는 BFSP 투여에 의해서도 알코올에 의한 간 중성지질 축적을 현저하게 경감시키는 효능이 있는 것으로 밝혀졌으며(표 8), 특히 BFSP 투여군의 간 중성지질 수준이 정상군 수준까지 감소하는 것으로 나타났다. 한편 알코올 섭취는 혈중 중성지질 수준을 증가시키는 것으로 많이 보고되었으나(Oliva L, Beauge F, Choquart D, Montet AM, Guitaoui M, Montet JC. Ursodeoxycholate alleviates alcoholic fatty liver damage in rats. Alcohol Clin Exp Res 22: 1538-1543 (1998)), 본 발명의 결과에서는 이들 결과와 일치하지 않았다(표 8).

혈중 중성지질 농도가 정상군과 알코올 투여 대조군 사이에 큰 유의적인 차이가 없었다. AFSP 투여군에서 혈중 중성지질 농도는 감소경향을 보였고, BFSP 투여군에서는 현저한 감소를 보여 발효시 사용한 균주 간에 차이를 나타내었다. 이러한 BFSP 투여에 의한 혈중 중성지질의 감소는 유리지방산 감소에 기인하는 것으로 사료되어 진다.

알코올 투여 랫의 간 및 혈청의 중성지질 농도에서의 SP, BFSP 및 AFSP 효과

Serum Triglyceride (mg/100 mL)	Liver Triglyceride (mg/g)
46.67±3.38a	19.71±1.38a
51.33±9.74a	53.13±3.54b
52.80±13.14a	31.35±3.14ab
35.50±8.01ab	33.50±8.01ab
19.00±2.22b	21.10±1.22b

SP: Silkworm powder.

BFSP: Bacillus subtillis fermented silkworm powder.

AFSP: Aspergillus kawachii fermented silkworm powder.

혈중 지질 농도 변화

혈중 지질 농도는 동맥경화, 고혈압, 심장병, 고지혈증과 같은 심혈관계 질환인의 진단지표로 사용되고 있는 가운데, 고콜레스테롤혈증, 고중성지혈증, 저HDL-콜레스테롤혈증도 이들 질환의 위험 인자로 주목받게 되면서 유럽과 미국 등에서 새로운 임상 지침이 설정되었다. 최근 천연 식물자원을 대상으로 혈중 콜레스테롤 농도뿐만 아니라 중성지질 농도를 감소시키고 HDL-콜레스테롤 농도를 증가시키려는 시도가 활발하게 전개되고 있다. 한편 혈청 HDL-콜레스테롤 농도는 항 동맥경화의 지표로서 주로 간장에서 합성되고 다른 지단백질과는 달리 혈관 벽에 침착되어 있는 LDL-콜레스테롤을 분리해내어 간장으로 운반하여 에너지로 이용하거나 체외 배설을 촉진하는 작용을 함으로써 심혈관계 질환의 유발 위험성을 감소시킬 수 있는 유익한 콜레스테롤로 널리 알려져 있다. 혈중 총 콜레스테롤 농도의 증가는 알코올 투여 동물에서 나타나는 일반적인 현상 중의 하나로 받아들여지고 있다. 본 실험에서도 혈중 총 콜레스테롤 및 유리 지방산 농도가 정상군에 비해 알코올 투여군에서 유의적으로 증가하였으나, 혈중 총 지질 및 HDL-콜레스테롤 농도는 각 실험군간에 유의적인 차이는 관찰되지 않았다(표 9). 그러나 혈중 총 지질 농도는 알코올 대조군에 비해 누에분말 및 발효 누에분말 투여군에서 현저히 감소된 것으로 나타났다. 혈중 유리 지방산 농도는 BFSP 투여에 의해서는 유일하게 감소되었다. 따라서 발효 누에분말은 알코올에 의한 혈중 총 콜레스테롤 농도를 감소시키는 효과가 강한 것으로 관찰되었다.

알코올 투여 랫의 혈청 지질에서 SP, BFSP 및 AFSP의 효과

Group	Total lipid (mg/100 mL)	Free fatty acid (nmol/L)	Cholesterol (mg/100 mL)	HDL -cholsterol (mg/100 mL)
Normal	216.8±7.9NS	0.82±0.09a	52.00±1.93a	21.00±0.89NS
Control	249.0±21.7	1.12±0.12b	64.67±1.38b	21.33±0.76
SP	234.0±27.0	1.30±0.05b	51.00±4.85a	21.60±1.76
BFSP	211.0±24.4	0.87±0.06a	50.33±4.59a	21.00±1.39
AFSP	222.5±19.3	1.15±0.08b	48.83±1.78a	21.50±0.72

SP: Silkworm powder.

BFSP: Bacillus subtillis fermented silkworm powder.

AFSP: Aspergillus kawachii fermented silkworm powder.

Values with different letters are the significantly different statistically at p〈 0.05. (mean±S.E., n=6).

NS: Not significant different.

혈중 ALT , AST , γ- GTP 및 LDH 활성 변화

간 손상의 임상적 지표로 사용되고 있는 ALT, AST, γ-GTP 및 LDH 활성 측정을 통하여 간 기능 효능을 검증한 결과를 표 10에 나타내었다. 혈청 ALT 및 AST 활성은 간 손상으로 인한 간세포의 괴사와 간 조직의 파괴가 진행됨에 따라 transaminase가 혈중으로 유리되어 높은 활성을 나타내는 것으로 간 손상 지표의 중요한 단서가 된다.

본 실험에서 이전의 실험 결과[Cha JY, Heo JS, Cho YS. Effect of zinc-enriched yeast FF-10 strain on the alcoholic hepatotoxicity in alcohol feeding rats. Food Sci Biotechnol 17: 1207-1213 (2008); Cha JY, Kim HS, Kang SC, Cho YS. Alcoholic hepatotoxicity suppression in alcohol fed rats by glutathione-enriched yeast FF-8 strain. Food Sci Biotechnol 18: 1411-1416 (2009)]와 같이 AST, γ-GTP 활성은 알코올 투여군에서 유의적으로 증가하였으나, ALT 활성은 통계상의 유의적인 차이 없이 증가하는 경향을 보였다(표 10). 알코올 급여 대조군에서의 AST 및 γ-GTP 활성 증가는 BFSP 및 AFSP 투여에 의해 현저히 감소하는 것으로 나타났다(표 10). 이러한 효과는 AFSP 보다 BFSP 투여에 의해 간 보호 효과가 더욱 우수하다는 것을 암시하고 있다.

글루타치온, S-아데노실메티오닌, 아미노산, 아연을 많이 함유한 효모를 급여한 실험에서 혈중 ALT, AST, γ-GTP 활성을 감소시켜 강력한 간 보호효과를 나타내는 실험들이 수행되었다[Cha et al., 2008; Cha et al., 2009; Izu H, Shobayashi M, Manabe Y, Goto K, Iefuji H. S-adenosylmethionine (SAM)-accumulating sake yeast suppresses acute alcohol-induced liver injury in mice. Biosci Biotechnol Biochem 70: 2982-2989 (2006)]. 또한 글루타치온 고함유 효모 S. cerevisiae를 급여한 사염화탄소 유발 간독성 모델에서도 ALT 및 AST 활성을 감소시키는 결과가 이전 실험에서도 보고된 바 있다[40]. Sugimura 및 Yamamoto의 문헌[Sugiyama Y, Yamamoto K. The protective effect of glutathione-enriched yeast extract on acetaminophen-induced liver damage in rats. J. Jpn. Soc. Nutr. Food 51: 189-193 (1998)]에서는 아세트아미노펜 유발 간 독성 실험에서 glutathione 고함유 효모의 투여에 의해 AST 및 ALT 활성이 농도 의존적으로 감소되었으나, glutathione 저함유 빵효모 투여에 의해서는 이러한 효과가 없었다고 하였다. 이러한 효과는 glutathione 고함유 효모의 투여에 의해 간 세포내 글루타치온 농도가 높아지면서 간독성 개선효과가 나타난 것으로 보여지며, 본 실험에서도 발효 누에분말 투여에 의해 간 세포내 글루타치온 농도가 높아지는 결과를 얻음으로서 이를 뒷받침 하고 있다(도 10).

간 기능적 임상지표로 사용되고 있는 혈중 LDH 및 ALP 활성도 알코올 섭취에 의해 증가됨으로서 알코올성 간 독성 유발과 깊은 관련성을 가진 것으로 보고되고 있다[Cha et al., 2008; Sugiyama et al., 1998]. 본 실험에서도 LDH 활성은 알코올 섭취군에서 증가 경향을 보였으나, 이러한 알코올에 의한 증가는 BFSP 및 AFSP 투여에 의해 유의적으로 감소하였고 누에분말 투여에 의해서는 감소하는 경향을 나타내었다(Table 표 10). 따라서 BFSP 투여는 알코올에 의해 증가된 ALT, γ-GTP 및 LDH 활성을 유의적으로 감소시킴으로서 알코올성 간 질환을 개선할 수 있는 건강기능식품 소재로 활용할 수 있는 것으로 사료되어진다.

알코올 투여 랫에서 AST, ALT, γ-GTP 및 LDH 활성에서의 SP, BFSP 및 AFSP의 효과

Group	AST (IU/L)	ALT (IU/L)	γ-GTP (IU/L)	LDH (IU/L)
Normal	123.17±5.80a	36.50±1.93NS	0.28±0.05a	3191±348a
Alcohol	149.00±7.75b	42.33±3.66	0.60±0.09b	4243±532b
SP	118.97±6.16a	38.00±5.05	0.38±0.07ab	3096±183a
BFSP	103.33±9.58a	34.00±2.03	0.30±0.05a	1407±461c
AFSP	111.67±12.86a	40.00±3.30	0.65±0.30b	2100±613c

SP: Silkworm powder.

BFSP: Bacillus subtillis fermented silkworm powder.

AFSP: Aspergillus kawachii fermented silkworm powder.

AST: aspartate aminotransferase, ALT: alanine aminotransferase, γ-GTP: γ-glutamyltranspeptidase, LDH: lactate dehydrogenase.

Values with different letters are the significantly different statistically at p〈 0.05. (mean±S.E., n=6).

NS: Not significant different.

혈중 단백질, 알부민 및 글로부린 농도 변화

혈중 총 단백질 농도는 만성 감염증, 만성 간장애, 간경변 등에서 증가하는데, 정상군에 비해 알코올 투여 모든 실험군에서 유의적으로 감소하였다(표 11). 알부민은 간에서 합성되는 혈액 단백질로 혈장 총 단백의 60% 정도를 차지할 정도로 중요하며, 중증 간질환에서 감소되는 중요 간 질환 기능지표로 이용되고 있다. 본 실험에서 알부민 농도는 정상군에 비해 알코올 투여 모든 실험군에서 유의적으로 감소하였다(표 11). 또한 혈중 글로불린 농도는 혈중에서 알부민을 제외한 혈청 단백질의 대부분을 차지하며, 감염증, 염증성질환 및 악성종양 등에서 증가하는데, 정상군에 비해 알코올 대조군 및 누에분말과 발효 누에분말 투여군에서 유의적인 감소 또는 감소경향을 보이는 결과를 얻었다(표 11).

알코올 투여 랫의 혈청에서 총 단백질, 알부민 및 글로불린의 농도에 대한 SP, BFSP 및 AFSP의 효과

Group	Protein (g/100 mL)	Albumin (g/100 mL)	Globulin (g/100 mL)
Normal	6.02±0.13a	2.83±0.09a	3.18±0.05a
Control	5.57±0.12b	2.57±0.05b	3.00±0.08ab
SP	5.37±0.07b	2.48±0.03b	2.88±0.04b
BFSP	5.57±0.08b	2.57±0.03b	3.00±0.05ab
KWSP	5.30±0.09b	2.43±0.03b	2.87±0.08b

SP: Silkworm powder.

BFSP: Bacillus subtillis fermented silkworm powder.

AFSP: Aspergillus kawachii fermented silkworm powder.

Values with different letters are the significantly different statistically at p〈 0.05. (mean±S.E., n=6).

실시예 12. 혈중 알코올 및 아세트알데하이드 농도 측정

혈청에 함유된 알코올 및 아세트알데하이드 농도는 시판용 R-Biopharm사의 UV-Test kit (Darmstadt, Germany)를 이용하여 측정하였다. 즉 혈중 알코올 농도는 NAD와 인산염 완충용액(pH 9.0) 3 mL 혼합액에 혈청 0.1 mL를 첨가한 후 약 3분간 반응하여 340 nm 흡광도를 측정하고, 혼합액에 ADH 0.05 mL를 첨가하여 20℃에서 10분간 항온하고 흡광도 340 nm에서 생성된 NADH의 농도에 따른 흡광도의 변화를 관찰하였다. 이때 혈액중의 알코올 농도(%)는 표준용액을 이용하여 계산하였다.

혈청 아세트알데하이드 농도는 NAD와 인산염 완충용액(pH 9.0) 3 mL 혼합액에 혈청 0.2 mL를 첨가한 후 약 3분간 반응하여 340 nm 흡광도를 측정하고, 혼합액에 ALDH 0.05 mL를 첨가하여 20～25℃에서 5분간 반응시켜 흡광도 340 nm에서 생성된 NADH의 농도에 따른 흡광도의 변화를 관찰하였다. 이때 혈액 중의 아세트알데하이드 농도는 표준용액을 이용하여 계산하였다.

알코올과 그 일차 대사산물인 아세트알데하이드는 음주 후 숙취를 경험하게 하는 주요 원인 물질로서 강력한 독성물질로서 생체 내 활성 아민류와 축합반응을 거쳐 간 손상의 주요 매개체로 작용하는 동시에 숙취에 영향을 미치는데, ALDH에 의해 대사되어 아세트산을 형성한 후 이산화탄소와 물로 가수분해되어 완전히 분해과정을 거치게 된다. 아세트알데하이드의 독성으로는 미토콘드리아 기능저해로 인한 간경변과 심장 및 뇌 기능 저해 등이 보고되어 있다. 일반적으로 알코올에 과일즙이나 향신료, 그리고 여러 한방 약재를 혼합하여 음용시 취기가 다르게 나타나는데, 이는 알코올에 함유된 여러 물질들에 의해 알코올 대사가 촉진되었다고 고려 해 볼 수 있다. 최근에 알코올을 투여한 동물실험에서 홍국 추출물이 알코올 대사를 촉진시킨다는 보고가 있으며, 홍삼을 홍국으로 발효시킨 발효홍삼에서도 숙취 해소 효과가 확인되었다.

혈중 알코올 농도는 정상 대조군의 혈중에서는 검출되지 않았으나, 알코올을 투여한 모든 실험군에서는 혈중 알코올이 검출되었다(표 12). 혈중 알코올 농도는 정상군에 비해 알코올 대조군에서 유의적으로 증가하였고, 이러한 증가는 SP, BFSP, AFSP 투여군에서 동일한 농도로 유의적인 감소를 나타내었다. 혈중 아세트알데히드 농도는 정상군에 비해 알코올 대조군에서 유의적으로 증가하였으며, 이러한 알코올군에서의 증가는 누에분말 및 발효 누에분말 투여군에서 각각 정상군과 큰 차이없이 감소하는 경향을 보였다(표 12). 발효 누에분말은 혈중의 알코올 농도뿐만 아니라 아세트알데히드 농도도 감소시키는 효능을 가진 것으로 보여지는데, 이는 간 조직속의 알코올 대사 관련 효소 ADH 및 ALDH 활성 증가에 의한 것으로 나타났다. 이전의 연구에서 B. breve 균주로 발효시킨 두유 급여에 의해 ALDH 활성 증가로 아세트알데하이드 농도가 낮아지면서 알코올성 간독성을 개선시키는 것으로 보고된 바 있다(Kano M, Ishikawa F, Matsubara S, Kikuchi-Hayakawa H, Shimakawa Y. Soymilk products affect ethanol absorption and metabolism in rats during acute and chronic ethanol intake. J Nutr 132: 238-244 (2002)). 본 실험에서도 누에분말 또는 Aspergillus 발효 누에분말 보다는 Bacillus 발효 누에분말 투여에 의해 알코올성 간독성이 더욱 개선되는 것으로 나타나 특히 Bacillus 균주의 누에 발효에 의해 간 독성 개선 효능이 증가되는 것으로 나타났다.

알코올 투여 랫에서 알코올 및 아세트알데하이드의 혈청 내 농도에서의 SP, BFSP 및 AFSP의 효과

Group	Serum alcohol (mg/100 mL)	Serum acetaldehyde (mg/100 mL)
Normal	0.000±0.00a	2.63±0.44a
Control	0.055±0.01b	5.68±0.74b
SP	0.037±0.00c	3.03±0.56a
BFSP	0.037±0.00c	2.76±0.40a
AFSP	0.037±0.00c	2.84±0.39a

SP: Silkworm powder.

BFSP: Bacillus subtillis fermented silkworm powder.

AFSP: Aspergillus kawachii fermented silkworm powder.

Values with different letters are the significantly different statistically at p〈 0.05. (mean±S.E., n=6).

실시예 13. ADH 및 ALDH 효소 활성 측정

간 조직 유래의 ADH 활성 측정은 Bergmeyer's의 방법(Bergmeyer HU. Methods of Enzymatic Analysis. Academic Press, New York, pp. 28, (1974))을 약간 변형하여 흡광도 340 nm에서 NADH의 생성속도를 측정하였다. 즉, 반응액 조성은 증류수 1.5 ml, 1.0 M Tris-HCl 완충용액 (pH 8.8) 0.75 ml, 20 mM NAD⁺ 0.3 ml, ethanol 0.3 ml, 효소원 0.15 ml를 cuvette에 넣고 총 3 ml이 되도록 조절하여 30℃에서 5분간 전배양시킨 후 5분 동안 340 nm에서 흡광도의 변화를 측정하였다.

간 조직 유래의 ALDH 활성 측정은 Koivula 등의 방법(Koivula T, Koivusalo M, Lindros KO. Liver aldehyde and alcohol dehydrogenase activities in rat strains genetically selected for their ethanol preference. Biochem Pharmacol 24: 1807-1811 (1975))을 약간 변형하여 아세트알데하이드에서 아세트산염을 생성하는 효소로 NAD로부터 NADH를 생성하는 원리를 이용하였다. 즉 반응액의 조성은 증류수 2.2 ml, 1.0 M Tris-HCl 완충용액 (pH 8.0) 0.3 ml, 20 mM NAD⁺ 0.1 ml, 0.1 M 아세트알데하이드 0.1 ml, 3.0 M KCl 0.1 mL, 0.33 M 2-머캅토에탄올 0.1 ml, 효소원 0.1 ml를 총 3 ml이 되도록 조절하여 cuvette에 넣고 30℃에서 5분간 전배양한 후, 5분 동안 340 nm에서 흡광도의 변화를 측정하였다.

웨스턴 블롯 분석은 알코올성 간 질환에서 ADH 및 ALDH 효소 단백질의 발현에 대한 발효 누에분말 투여의 효과를 보기 위하여 실험하였다. 정량된 ADH 및 ALDH 효소 단백질을 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔의 각 웰 당 각각 20 및 100 μg을 전보와 같이 전기영동 하였다(Koivisto T, Eriksson CJ. Hepatic aldehyde and alcohol dehydrogenases in alcohol-preferring and alcohol-avoiding rat lines. Biochem Pharmacol 48: 1551-8155 (1994)). 분리된 단백질은 300/240 mA/cm2 조건으로 4℃에서 16시간 동안 니트로셀룰로오스 맴브레인으로 이동시켰다. 이 맴브레인을을 차단제인 10% 무지방 우유가 함유된 TBST 완충용액 (10 mM Tris pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.1% Tween 20)로 1시간 동안 실온에서 비-특이 결합 단백질을 차단한 후, TBST 완충용액로 5분 동안 세척하였다. 다시 차단시킨 맴브레인을 실온에서 1시간 동안 일차 및 이차 항체로 반응시킨 후 TBST 완충용액로 세척하였다. 세척된 맴브레인에 토끼 ADH 또는 ALDH1A1 접합 HRP 항체(1:5,000로 희석됨, Abcam, England)로 4℃에서 overnight하였다. 다시 TBST 완충용액로 세척시킨 후 goat anti-mouse IgG-HRP (diluted 1:2,000, DB USA)로 incuvation시켰다. Nitrocellulose membrane 상의 단백질은 SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate의 image analysis 방법으로 검출하였다. 각각 반응된 ADH 또는 ALDH 단백질 밴드의 상대적 밀도는 densitometer (Lumi-Imager F1, Roche, Switzerland)로 정량하였다.

체내로 흡수된 알코올은 대부분 위장과 소장에서 흡수되어 간으로 이동된 후 대사과정을 거쳐 분해되는데, 만성적인 알코올 섭취는 영양소의 흡수장애와 간 기능 손상을 초래할 수 있다. 간에서 대사되는 알코올 분해는 먼저 alcohol dehydrogenase(ADH)와 cytochrom P-450에 의해 알코올이 아세트알데하이드로 전환되는데, 이때 만성적 알코올 섭취로 인한 중독시에는 MEOS(microsomal ethanol oxidizing system)에 의해 아세트알데하이드가 증가하게 된다. 주로 만성적 알코올 섭취 후 간 조직에 축적되는 아세트알데하이드는 ADH 및 ALDH 활성에 의해 영향을 받게 된다. 이들 ADH 및 ALDH 효소 활성은 체내 알코올 대사에서 필수적인 역할을 하기 때문에 천연 생리활성 성분에 의해 활성증가를 기대할 수 있는 가능성이 제기되고 있다. 실험동물에서 만성적 알코올 투여시 ADH 활성은 증가하고 ALDH 활성은 오히려 감소하는데, 이는 알코올의 장기간 섭취에 의해 생체조직 내에 아세트알데하이드의 축적현상이 초래될 가능성을 시사해주고 있다. 본 동물 실험에서 간 조직 중의 ADH 활성은 정상군에 비해 알코올 대조군에서 약간의 증가 경향을 보였으나, SP, BFSP, AFSP 투여에 의해서는 유의적으로 활성이 증가하였다(도 7). ALDH 활성은 정상군과 알코올 대조군 사이에서는 차이가 없었으나, SP, BFSP, AFSP 투여군에서 모두 활성이 증가된 것으로 나타났다(도 7). 이러한 결과는 발효 누에분말이 알코올 투여 흰쥐의 혈중 알코올 및 아세트알데하이드 농도를 효과적으로 감소시키는 것은 간 조직 중의 알코올 대사 효소 ADH 및 ALDH 활성을 촉진시키기 때문인 것으로 나타났다. 특히 BFSP 투여군에서 ADH 및 ALDH 활성 모두 가장 높은 것으로 나타나 이러한 효소 활성의 증가로 체내 알코올이 기질로 사용됨으로서 혈중의 알코올 및 아세트알데하이드 농도가 감소한 것으로 보여진다.

ADH 및 ALDH 단백질 발현량은 도 8에서 보여주고 있다. BFSP 투여군에서 가장 높은 ADH 발현량을 보이고 있으며, AFSP 투여군에서도 비교적 높은 ADH 발현량을 보이고 있다. 이러한 결과는 ADH 효소 활성과 단백질 발현량에서 높은 정의 상관관계를 보여주는 것이다. 그러나 BFSP 투여군에서는 다른 알코올 대사관련 효소인 ALDH 발현량에는 큰 영향을 미치지 않는 것으로 나타나 효소활성과 단백질 발현량에서 반드시 일치하지 않는다는 것을 시사해준다. 이전의 결과에서와 같이 ADH 효소 활성과 단백질 발현량은 알코올이나 다른 식이성분에 의해 크게 변화되는 영향을 받는 것으로 보고되고 있으나, ALDH 효소의 경우는 알코올이나 다른 식이성분에 의해 크게 영향을 받지 않고 약간씩 변화되는 것으로 보고되었. 따라서 알코올 급여 흰쥐에서 BFSP 동시 투여는 알코올 대사에 관련된 ADH 효소 활성과 단백질 발현량에서는 누에분말 또는 AFSP 보다 많은 영향을 미친 것으로 나타났으나, ALDH 단백질 발현량에 대해서는 큰 영향을 미치지 못하는 것으로 나타났다.

아연(Zinc)은 필수 미량성분으로 생리학적으로나 생물학적으로 중요한 역할을 수행하는 식이성분으로 인식되고 있고, 알코올성 간 독성에 대해서도 개선효과가 있는 것으로 알려져 있다. 아연은 많은 효소에 결합된 미네랄 성분으로 ADH 효소도 아연에 대해 직접적인 의존성을 가진 것으로 알려져 있다. 이전의 실험에서 알코올 투여 흰쥐에 ADH 효소의 촉매 원소로서의 아연을 고함유한 효모를 투여한 결과 ADH 효소 활성이 촉진되는 결과를 얻은 봐 있다(Cha et al., 2008). 본 실험에서 이러한 이유 때문에 간 조직 중의 아연 농도를 측정한 결과, BFSP 투여군에서 통계상의 유의적인 차이는 없었지만 가장 높은 아연 농도를 나타내어 ADH 효소 활성과 높은 상관관계를 보였다(도 9).

알코올 대사에 관련한 ADH 및 ALDH 활성에 영향을 미치는 요인으로 미네랄 성분 이외도 아스파라긴, 아스파르트산, 아르기닌 등의 아미노산 성분도 시사되어 있다. 숙취해소 음료의 주요 소재로 사용되어지고 있는 매실즙과 그 주요 구성 아미노산인 아스파트산을 첨가하였을 경우 ADH 및 ALDH 활성이 많이 증가하였다(Hwang JY, Ham JW, Nam SH. Effect of Maesil (Prunus mume) juice on the alcohol metabolizing enzyme avtivities. Korean J Food Sci Technol 36: 329-332 (2004)). 이 실험에서도 매실즙은 ADH 활성을 증가시켜 알코올 분해를 촉진시킬 뿐 만 아니라 ALDH 활성 또한 증가시킴으로써 알코올 분해로 생성되는 아세트알데하이드의 분해를 촉진시키는 결과를 얻었으며, 매실즙의 주요 구성 아미노산인 아스파트산에 의해서도 비슷한 좋은 효과를 얻었다고 하였다. 특히 아미노산 중 아스파트산와 아르기닌은 NAD의 재생을 촉진시킴으로써 ADH 활성을 높여 알코올 분해를 촉진시켜 알코올의 독성을 낮추고, 아스파라긴은 아세트알데하이드와 반응하여 부가물을 생성하면서 아세트알데하이드의 농도를 낮추어 생물학적 독성을 약화시키는 것으로 시사되어 있다. 본 실험에서도 누에분말 또는 발효 누에분말에 이들 아미노산을 많이 함유하고 있어서 알코올성 간독성의 개선효과를 가질 가능성이 있으며, 특히 누에분말에 없는 황함유 아미노산이면서 혈중 알코올 농도를 낮추어 지방간 및 간독성 개선작용과 산화스트레스 억제작용을 가진 타우린, 시스테인, 메티오닌을 발효 누에분말에 많이 함유하고 있어서 이러한 가능성이 더욱 높아 보인다(표 13).

SP, BFSP 및 AFSP에서의 유리 아미노산 함량 (ppm)

Amino acids	SP	BSSP	AKSP
Phosphoserine	183	96	80
Taurine	-	74	125
Phosphoethanolamine	579	-	-
Urea	-	6	5
L-Aspartic acid	477	522	237
L-Threonine	1988	272	768
L-Serine	2003	970	496
Asparagine	1644	-	-
L-Glutamic acid	6294	2642	3056
L-α-Aminoadipic acid	-	105	57
L-Proline	774	608	380
L-Glycine	1904	583	426
L-Alanine	6602	1823	1751
L-Citrulline	-	334	132
L-α-Aminobutyric acid	42	-	-
L-Valine	2994	2174	1314
L-Cystine	-	74	37
L-Methionine	-	209	11
L-Isoleucine	2342	1549	1089
L-Leucine	3407	2368	1421
L-Tyrosine	2271	1477	925
L-Phenylalanine	2724	2163	1392
β-Alanine	-	-	-
DL-β-Aminoisobutyric acid	-	-	-
GABA(γ-Aminobutyric acid)	40	110	84
L-Orinithine	218	670	2269
L-Lysine	1071	337	46
1-Methyl-L-Histidine	-	1049	293
L-Histidine	1102	277	227
3-Methyl-L-Histidine	-	-	-
L-Carnosine	-	-	-
L-Arginine	3190	71	73
Total	41,809	20,447	16,606

-: Not detected.

실시예 15. 과산화지질 및 항산화 관련 물질 농도 변화

과산화지질 측정

분획한 균질액과 마이크로솜 생체막의 과산화지질 함량은 전보의 방법에 준하여 정량하였다(Ohkawa H, Ohishi N, Yagi K. Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction. Anal Biochem 95: 351-358 (1979)). 즉, 단백질 량으로 1 ㎎을 함유한 분획 용액 1 ml에 각각 TBA(thiobarbituric acid) 시약 2 ml을 가하여 잘 혼합하고, 끓는 물에서 30분간 반응시킨 후 실온에서 방냉하여 3,000 rpm으로 10분간 원심분리 한 상등액을 535 nm에서 흡광도를 측정하였다. 과산화지질 함량은 말론디알데하이드를 nmol/g으로 나타내었다.

미네랄 함량 측정

간조직의 미네랄 함량은 A.O.A.C. 분석 방법에 준하여 측정하였다(A.O.A.C. Official methods of analysis. 12th ed., Association of official analytical chemists. Washington, D.C., U.S.A. (1975)). 즉, 간 조직 1 g을 각 550℃ 회화로에서 3시간 회화시킨 후 6 N HCl에 용해시켜 완전히 산분해시켜 수욕(water bath)상에서 산을 완전히 제거하고, 여기에 3 N HCl를 가하여 Whatman No. 4 여과지로 여과하여 원소 종류에 따라 각각 일정비율로 희석하여 원자흡광 분광광도계(AAnalyst 300, Perkin Elmer, Norwalk CT, USA)를 이용하여 측정하였다.

글루타치온 함량 측정

간조직의 글루타치온 함량은 간 균질액 분획 0.2 ml에 3차 증류수 0.3 ml과 0.4% 술포살리실산 0.5 ml를 가하여 혼합하고 원심분리시킨 뒤 상등액 0.3 ml에 DTNB(5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)) 발색시약을 첨가하여 412 nm 흡광도에서 측정하여 글루타치온의 표준 검량 곡선에 의해 함량을 산출하였으며 간 조직 g당 mg으로 표시하였다(Beutler E, Duron O, Kelly BM. Improved method for the determination of blood glutathione. J Lab Clin Med 61: 882-888 (1963)).

초기 급성 간독성의 정도를 나타내는 지표인 ALT 및 AST 활성과 같이 간 조직 중의 과산화지질 농도도 간 독성의 지표로 사용되고 있다. 간 조직에서 산화스트레스의 측정 지표로 사용되고 있는 과산화지질 농도는 만성적인 알코올 섭취와도 밀접한 관련성을 가지는 것으로 알려져 있다. 만성적인 알코올 섭취는 조직 중의 과산화지질 및 자유 라디칼의 과잉 생산과 체내 항산화 물질인 글루타치온 농도의 감소를 가져 오는 것으로 알려져 있다. 이러한 결과는 알코올 섭취 후 간 조직의 균질액, 미토콘드리아 및 마이크로솜 분획에서 과산화지질 농도가 증가한 본 발명의 실험에서도 확인되었다(도 11).

알코올 섭취 흰쥐에 BFSP 투여로 간 조직의 분획들에서 과산화지질 농도가 현저히 감소하였고, AFSP 투여에 의해서는 미토콘드리아 및 마이크로솜 분획에서는 유의적으로 감소하였으나 균질액 분획에서는 감소하는 경향을 보였으며, 이러한 결과는 발효 누에분말에 간 조직에서 항산화 효과가 있다는 것을 의미하는 것이다. 혈중 과산화지질 농도 역시 알코올 섭취에 의해 현저히 증가하였는데, 발효 누에분말 투여에 의해 유의적으로 감소하는 것으로 나타났다(도 11).

필수 미량원소인 철은 지방산화를 촉진시키는 물질로 알려져 있으며, 체내 H₂O₂를 제거하는 카탈라아제의 구성 성분으로 체내의 비타민 C의 함량과 H₂O₂의 농도 차에 의해서 과산화지질 반응에 영향을 미침으로서 생체 내 과산화지질 반응을 조사하는데 있어서 비헴철 함량 측정은 중요한 요인으로 시사되어 있다. 간 조직 중의 비헴철 함량은 정상군에 비해 알코올 투여군에서 유의적으로 증가하였으나 BFSP 투여군에서는 유의적으로 감소하였다(도 9). 한편, 생체 내 항산화 물질로 잘 알려져 있는 간 조직 중의 아연 농도(Goel A, Dani V, Dhawan DK. Protective effects of zinc on lipid peroxidation, antioxidant enzymes and hepatic histoarchitecture in chlorpyrifos-induced toxicity. Chem Biol Interact 156: 131-140 (2005))는 각 실험 군 간에 통계상의 유의적인 차이는 없었지만 BFSP 투여군에서 약간 높게 나왔다(도 9).

간은 알코올 대사에서 중심적인 역할을 수행하고, 유리기 생산에 의해 조직 손상을 일으키는 동시에 세포내 항산화 방어 시스템이 작동함으로서 이를 경감시키는 작용도 함께 일어나는 조직이다. 간 조직에서 글루타치온은 L-글루타메이트, L-시스테인및 글리신으로 구성된 비단백성 thiol tripeptide의 항산화 물질로 최근의 연구에서 동물 간 조직에서 독성제거 반응을 통한 항산화 방어계에서 중요한 역할을 하는 것으로 잘 알려져 있다. 조직 내 글루타치온 수준은 지질과산화 농도, 활성 유리기 및 다른 산화기의 독성 작용으로부터 세포를 방어하는 항산화 시스템과 밀접하게 관련되어 있다. 흰쥐에서 알코올 섭취는 정상군에 비해 간 조직 및 혈중 글루타치온 농도를 낮춘다(도 10). 그러나 알코올 섭취에 의한 간 조직 및 혈중 글루타치온 농도의 감소는 BFSP 투여에 의해 정상군 수준으로 회복되는 것으로 나타났다(도 10). 이전의 연구에서도 글루타치온 고함유 효모 투여가 사염화탄소 및 알코올 투여로 인한 간 손상을 효과적으로 막는 것으로 보고한 봐 있다[Cha et al., 2009; Shon MH, Cha JY, Lee CH, Park SH, Cho YS. Protective effect of administrated glutathione-enriched Saccharomyces cerevisiae FF-8 against carbon tetrachloride (CCl₄)-induced hepatotoxicity and oxidative stress in rats. Food Sci Biochenol 16: 967-974 (2007)]. 알코올 섭취 흰쥐에 BFSP 투여로 인한 과산화지질 농도의 감소는 항산화 활성의 증가와 밀접한 관련성을 가지는 것으로 보였다. 비발효 누에 분말에 의한 간 보호 효과도 역시 아미노산과 같은 그의 구성 성분에 기인한 것으로 여겨진다. 간 조직에서 글루타치온 대사의 전구체로서 메티오닌 또는 시스테인은 내인성 글루타치온 합성에 중요한 역할을 수행하는 것으로 최근 보고되었으며[Peters TJ. Ethanol metabolism. Bri Med Bull 38: 17-20 (1982); Stipanuk MH, Coloso RM, Garcia RAG, Banks MF. Cysteine concentration regulates cysteine metabolism to glutathione, sulfate and taurine in rat hepatocytes. J Nutr 122: 420-427 (1992)], 시스테인 및 시스테인 함유 구성성분의 투여에 의해 간 및 신장 조직에 있어서 글루타치온 농도를 증가시키는 것으로 보고되었다[Hsu CC, Hiang CN, Hung YC, Yin MC. Five cysteine-containing compounds have antioxidative activity in Balb/cA mice. J Nutr 134: 149-152 (2004)].

최근 42% 글리신 및 32% 알라닌의 아미노산으로 구성된 실크 피브로인은 알코올성 간독성을 개선시키는 효과가 있다고 보고되었다[Kang GD, Lee KH, Do SG, Kim CS, Suh JG, Oh YS, Nham JH. Effect of silk fibroin on the protection of alcoholic hepatotoxicity in the liver of alcohol preference mouse. Int. J Indust Entomol 2: 15-18 (2001)]. 세린, 글리신, 히스티딘, 티로신과 같은 아미노산들도 갈락토스아민- 및 알코올-유발 간독성에 대해 개선효과가 있다고 알려져 있다[Lee JH, Kim NK, Lee DY, Lee CH. Protective effect of selected amino acids and food extracts on ethanol toxicity determent in rat liver. Korean J Food Sci Technol 31: 802-808 (1999); Ming Y, Ikejima K, Arteel GE, Seabra V, Bradford BU, Kono H, Rusyn I, Thurman RG. Glycine accelerates recovery from alcohol-induced liver injury. J Pharmacol Exp Ther 286: 1014-1019 (1998)]. 본 실험에서 Aspergillus- 및 Bacillus-발효 누에분말의 유리 아미노산 조성을 보면 주로 글루탐산 (3056~2642 ppm), 루이신 (1421~2368 ppm), 발린 (1314~2174 ppm), 알라닌 (1751~1823 ppm), 및 티로신(925~1477 ppm)으로 각각 구성되어 있으며(표 13), 이처럼 주로 이들 아미노산으로 구성된 발효 누에분말은 알코올 유발 산화스트레스를 감소시킬 가능성이 높은 것으로 사료되어 진다. 아미노산 L-세린, L-글리신 및 L-알라닌으로 구성된 세리신 단백질도 자유 라디칼에 의해 유발되는 간세포 독성을 경감시키는 것으로 보고되었다 [Ming Y, Ikejima K, Arteel GE, Seabra V, Bradford BU, Kono H, Rusyn I, Thurman RG. Glycine accelerates recovery from alcohol-induced liver injury. J Pharmacol Exp Ther 286: 1014-1019 (1998); Inkeles S, Eisenberg D. Hyperlipidemia and coronary atherosclerosis. Medicine (Baltimore) 60: 110-123 (1981); Petushok N. E., Miskevich D. The influence of the some amino acids on the antioxidant status in the liver of rats. Toxicology Letters 144: S116(2003)]. 한편 아스코르브산과 아르기닌, 히스티딘, 타우린, 리신 아미노산과의 조합은 간 조직 균질화 분획에서 글루타치온 농도가 70% 증가하였으며, 글루타치온 시스템 (글루타치온 리덕타아제/퍼옥시다아제) 활성도 거의 두 배 정도 증가하는 것으로 나타나 흰쥐 간 조직의 항산화 시스템을 크게 증가시키는 작용이 있는 것으로 드러났다(Petushok et al., 2003).

또한 세린 및 트레오닌과 같은 히드록시 아미노산들은 구리나 철과 같은 미량원소와 chelating을 형성함으로서 항산화 작용을 나타내는 것으로 알려져 있다[Kato N, Sato S, Yamanaka A, Yamada H, Fuwa N, Nomura M. Silk protein, sericin, inhibits lipid peroxidation and tyrosinase activity. Biosci Biotechnol Biochem 62: 145-147 (1998)]. 본 실험에서 Aspergillus-발효 누에분말 보다는 Bacillus-발효 누에분말에서 세린, 글리신, 알라닌, 티로신 및 히스티딘과 같은 아미노산을 보다 많이 함유함으로서 강한 항산화 작용을 가지는 것과 무관하지 않을 가능성이 높아 보인다(표 2). 따라서 본 실험에서는 Bacillus-발효 누에분말에서 항산화 작용과 관련성이 높은 아미노산을 많이 함유함으로서 간 조직과 혈중의 과산화지질 작용에 대한 보호 효과가 누에분말이나 Aspergillus-발효 누에분말보다 큰 것으로 보여진다.

실시예 16. 간조직의 병리조직학적 관찰

동물해부 직후 적출한 간을 냉각 생리식염수로 관류하여 혈액을 제거시킨 상태에서 조직의 일정한 부위의 일부를 취하여 10% 중성포르말린 용액에 고정하여 통상적인 조직처리인 파라핀 포매 과정을 거쳐 3~4 ㎛ 두께로 절편하여 H&E(hematoxylin and eosin) 염색 한 후 광학현미경(Olympus BX41, Olympus Co., Tokyo, Japan)으로 관찰하였다[Cha JY, Jun BS, Cho YS. Prevention of orotic acid-induced fatty liver in rats by capsaicin. Food Sci Biotechnol 13: 597-602 (2004)].

지방간은 과잉의 알코올 섭취로 인한 간 독성 유발의 시발점으로서 간 세포에 산소나 영양적인 측면의 불균형을 초래하는 것으로 알려져 있다. 간 세포에서의 지질의 축적인 지방간은 알코올성 간 독성 초기에 가장 흔하게 나타나는 증상이다. 실험동물을 해부한 직후 간 조직을 적출하여 조직학적 검사를 실시한 결과 대조군에서는 혈관을 중심으로 간 소엽 구조가 잘 유지되었으며, 간세포들은 풍부한 호산성 세포질과 둥근핵을 가지고 있었고 간세포판은 대부분 한 층으로 잘 유지되어 있었다(도 12). 발효 누에분말 투여군에서는 혈중 ALT 및 AST 활성의 감소와 간 조직의 과산화지질 농도의 감소에 의해 알코올성 간 독성이 개선되는 효과로 인해 조직학적 검사 결과에서도 정상군과 비슷한 모양을 보였다.

알코올 투여에 의해 대부분의 간 세포 내에 지방구의 증가에 의한 지방간 유발이 본 실험에서도 관찰되었으며, 이러한 모양은 전형적인 알코올성 지방간의 모습을 나타내는 것이다. 알코올은 탄수화물이나 단백질과 같은 영양소는 없으면서도 칼로리는 높아 결국은 간 조직에서 지방 축적의 원인이 될 수 있다. 한편 발효 누에분말 투여군들에서 알코올에 의한 간세포 내의 지방 축적은 개선되었으며, 간 조직학적 관찰에서도 정상군과 매우 유사한 모습을 보여 발효 누에분말의 간세포 보호 효과를 나타내는 증거가 되는 것이다(도 13).

Claims (11)

1. 누에분말에 증류수를 가한 후 멸균시키는 단계; 상기 누에분말에 발효용 균주배양액을 첨가한 후 37℃에서 3일 내지 12일간 발효시킨 후 건조시키는 단계를 포함하여 제조되는 발효누에분말 제조방법에 있어서,
   상기 발효용 균주배양액이 아스페르길루스 카와치(Aspergillus kawachii; KCCM 32819)균주의 배양액인 것이 특징인 발효누에분말 제조방법.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 제 1항의 방법에 의해 제조된 것을 특징으로 하는 발효누에분말
6. 제 5항의 발효누에분말을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 고지혈증 또는 지방간 예방 및 치료용 약학적 조성물.
7. 삭제
8. 제 5항의 발효누에분말을 유효성분으로 함유하는 것이 특징인 혈전 예방 및 치료용 약학적 조성물.
9. 제 5항의 발효누에분말을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 고지혈증 또는 지방간 개선용 건강기능성식품 조성물.
10. 제 5항의 발효누에분말을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로하는 항산화 기능성 건강기능성식품 조성물.
11. 제 5항의 발효누에분말을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 혈전용해 건강기능성식품 조성물.

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