KR101667542B1

KR101667542B1 - 누에 혈림프 유래 발효산물을 포함하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR101667542B1
Application number: KR1020140158643A
Authority: KR
Inventors: 조유영; 권해용; 이광길; 김현복; 이희삼; 여주홍
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2014-11-14
Filing date: 2014-11-14
Publication date: 2016-10-21
Also published as: KR20160058282A

Abstract

본 발명은 누에 혈림프 유래 발효산물을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 누에 혈림프 유래 발효산물을 포함하는 화장료 조성물의 제조방법은, 누에로부터 혈림프를 분리하는 제1단계, 바실러스 균주를 배양하여 바실러스 균주 배양액을 제조하는 제2단계, 상기 제 1단계에서 분리한 혈림프에 상기 제2단계에서 제조한 바실러스 균주 배양액을 접종한 후, 이를 35~37℃에서 2~4 주동안 발효시켜 발효산물을 제조하는 제3단계 및, 상기 발효산물을 유효성분으로 포함된 화장료 조성물을 제조하는 제4단계를 포함하여 항산화능 및 미백효과를 갖는 것이 특징이다.
본 발명에 의해, 인체 무해하면서 항산화능 및 미백효과가 우수한 누에 혈림프 유래 발효산물을 포함하는 화장료 조성물이 제공된다.

Description

누에 혈림프 유래 발효산물을 포함하는 화장료 조성물{Cosmetic composition including fermentation product from silkworm larvae hemolymph}

본 발명은 누에 혈림프 유래 발효산물을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 인체에 무해하면서 항산화능 및 미백효과가 우수한 누에 혈림프 유래 발효산물을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

종래 미용팩에 사용되는 화장료의 성분은 대개 인공으로 합성한 조성물을 사용하는 경우가 대부분이어서 연약한 피부에 손상을 주거나 건강하고 윤택한 피부로 재생시키는 효과는 뒤떨어지는 실정이다.

또한, 심한 경우 피부발진이나, 알레르기 등의 부작용을 일으킬 수 있는 매우 심각한 단점을 갖고 있다. 따라서, 최근에는 미용팩 제품에 보습효과가 있고 항산화효과가 우수한 천연물을 이용하려는 시도가 증가하고 있다. 그러나 현재까지 알려진 천연물들은 항산화효과가 그리 만족할 만한 특성을 나타내지 못하는 실정이다.

누에는 다른 농작물과 달리 사육시의 청결상태와 농약 등에 매우 민감하여 안정성 검정용 실험곤충으로서 주로 이용되는 등 재배에서부터 이미 무공해의 천연제품으로 알려져 있다.

이에, 현재 이러한 누에고치로부터 피부코팅효과, 보습, 항산화능, 피부친화력 등의 효과를 갖고 있는 세리신(sericin)과 피브로인(Fibroin) 단백질을 가수분해하여 화장품의 주재료로 사용되고 있다.

관련 선행기술로는 대한민국등록특허 제10-0494229호(등록일: 2005년 05월 31일, 명칭: 세리신의 제조방법 및 이를 이용한 마스크 팩)과 대한민국등록특허 제10-0542266호(등록일: 2006년 01월 03일, 명칭: 누에고치로부터 추출된 세리신 단백질을 함유하는 미용팩조성물)이 있다.

이와 같이 현재까지는 누에고치 또는 이들을 이루고 있는 세리신 또는 피브로인 단백질을 가지고 화장품의 주재료로 사용한 바는 있으나, 누에로부터 분리한 누에 체액은 화장품 주재료로 사용한 바 없으며 단지 그대로 폐기처분되어 오거나, 현재까지는 곤충세포배양을 위한 배지의 첨가물로만 사용되어 왔다.

이러한, 누에 체액은 누에 자신에게 영양을 공급하는 용액으로써, 일명 누에 혈림프(hemolymph)라고 한다. 이 혈림프는 곤충세포를 비롯한 동물세포의 성장에 필요한 영양성분을 갖추고 있다. 또한, 누에체액에 대하여는 내독소 등의 항목에서 안정성 허가를 받은바 있다.

이에, 본 발명에서는 상기와 같이 인체에 무해하며 활용가치가 있는 누에 유래 혈림프를 유휴자원으로 활용함으로써 양잠 농가의 소득증대 효과를 얻을 수 있도록 하기와 같은 발명을 도출해 낸다.

본 발명의 목적은 다양한 효능을 갖고 있음에도 불구하고 제대로 활용되지 못하고 폐기되어 왔던 누에 유래 혈림프를 화장품의 소재로 사용가능하도록 분리정제하며, 이를 발효시켜 얻은 발효산물을 이용하여 인체에 무해하면서 항산화능 및 미백활성이 우수한 누에 혈림프 유래 발효산물을 포함하는 화장료 조성물을 제공하기 위한 것이다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 화장료 조성물은 누에 혈림프 유래 발효산물을 포함하는 것을 특징으로, 상기 누에는 5령7일의 누에인 것이 특징이다.

상기 발효산물은 상기 화장료 조성물 1㎖를 기준으로 1.6~40 ㎍으로 포함되는 것이 특징이다.

또한, 상기 발효산물은 바실러스 균으로 발효시켜 얻은 것임을 특징으로, 상기 바실러스 균은 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis) 또는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)인 것이 특징이다.

또한, 상기 발효산물은 누에로부터 실샘을 제거하고 남은 혈림프에 NB 배지에서 배양된 바실러스 균주 배양액을 접종한 후, 이를 35~37℃에서 2~4 주동안 발효시켜 얻은 것이 특징이며, 상기 발효산물은 항산화능 및 미백효과를 갖는 것이 특징이다.

이러한 상기 화장료 조성물은 화장수, 에센스, 로션, 크림, 팩, 파운데이션, 젤, 연고 또는 스프레이 중 어느 하나의 제형을 갖는 것이 특징이다.

본 발명의 누에 혈림프 유래 발효산물을 포함하는 화장료 조성물의 제조방법은, 누에로부터 혈림프를 분리하는 제1단계, 바실러스 균주를 배양하여 바실러스 균주 배양액을 제조하는 제2단계, 상기 제 1단계에서 분리한 혈림프에 상기 제2단계에서 제조한 바실러스 균주 배양액을 접종한 후, 이를 35~37℃에서 2~4 주동안 발효시켜 발효산물을 제조하는 제3단계 및, 상기 발효산물을 유효성분으로 포함된 화장료 조성물을 제조하는 제4단계를 포함하여 항산화능 및 미백효과를 갖는 것이 특징이다.

본 발명에 의해, 인체에 무해하면서 항산화능 및 미백효과가 우수한 누에 혈림프 유래 발효산물을 포함하는 화장료 조성물이 제공된다.

도 1은 본 발명의 누에 혈림프 유래 발효산물에 의한 분자량 저하정도를 나타낸 도면이다.
1: 1% 혈림프(HL)
2: 실시예 1
3: 실시예 2
도 2는 본 발명인 실시예 2의 누에 혈림프 유래 발효산물의 발효기간에 따른 분자량 저하정도를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 누에 혈림프 유래 발효산물을 대상으로 피부 세포생존능을 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 누에 혈림프 유래 발효산물을 대상으로 항산화 효과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명인 실시예 2의 누에 혈림프 유래 발효산물의 발효기간에 따른 항산화 효과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 누에 혈림프 유래 발효산물을 대상으로 티로시나아제 억제활성을 나타낸 그래프이다.

본 명세서에 기재된 용어, 기술 등은 특별한 한정이 없는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 의미로 사용된다.

이하, 본 발명의 누에 혈림프 유래 발효산물을 포함하는 화장료 조성물의 제조방법을 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

1. 제1단계: 누에 혈림프 분리

(1) 누에 건조물 제조

누에를 동결건조하여 누에 건조물을 제조하며, 바람직하게는 액체질소를 처리한 후 동결건조하여 누에 건조물을 제조하는 것이 누에 혈림프를 분리하기에 용이하다.

상기 누에는 어떠한 종을 사용하여도 무관하나, 바람직하게는 숙잠을 사용하는 것이 좋다.

숙잠은 누에의 5령7일인 것으로, 몸이 노르스름하고 투명해지면 누에고치를 짓고 번데기가 될 준비를 하는 상태가 된다. 이에 다른 단계보다 다량의 혈림프 채취가 가능하며, 단백질이 산화되지 않아 별도의 산화제가 없이도 단백질 분리가 가능하다.

누에 혈림프는 통상적으로 손으로 채취한다. 그러나, 생누에에서 손으로 혈림프를 채취하면 누에가 토액(누에가 소화액을 토하는 현상)함으로써 혈림프가 파괴되어 불순물이 많이 포함되게 된다.

이에, 본 발명은 불순물 없이 다량의 누에 혈림프를 얻고자 누에를 동결건조하여 제조한 누에건조물을 통해 혈림프를 획득한다.

이때, 동결건조는 －40∼－70℃에서 60~80시간 동안 이루어지는 것이 불순물없이 가장 최적상태의 누에 혈림프를 얻을 수 있다.

(2) 혈림프 분리 단계

상기 누에 건조물로부터 실샘을 제거하고 남은 혈림프를 얻는다.

상기 혈림프는 볼밀(직경1~5cm)을 이용하여 실샘을 제거하고 남은 건조물 상태인 것을 회수하여 얻어진 것이다. 이때, 상기 누에 건조물 1mg당 0.5~1.0mg의 혈림프를 얻게 된다.

2. 제2단계; 바실러스 균주 배양액 제조

본 단계에서는 바실러스 균주를 배양하여 바실러스 균주 배양액을 제조한다.

이때, 상기 바실러스 균주는 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis) 또는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)를 사용하는 것이 좋다.

또한, 상기 바실러스 균주는 NB(Nutrient Broth)배지에서 35~38℃에서 15~18시간동안 배양함으로써, 상기 배양액 내에 상기 바실러스 균주가 1×10⁵~1×10⁷정도 생성되며, 이에 본 발명이 목적하는 효능을 갖는 하기 발효산물을 생성할 수 있게 된다.

3. 제3단계; 발효산물 제조

본 단계에서는 상기 제 1단계에서 분리한 혈림프에 상기 제2단계에서 제조한 바실러스 균주 배양액을 접종한 후, 이를 35~37℃에서 2~4 주동안 발효시켜 발효산물을 제조한다.

이때, 상기 발효 온도가 35℃미만이거나 발효 기간이 2주 미만일 경우에는 생성된 발효산물의 항산화 효능이 본 발명이 목적하는 효능보다 떨어지게 되며, 상기 발효 온도가 37℃ 초과하거나 발효 기간이 4주를 초과 할 경우에는 오히려 상기 바실러스 균주 성장에 문제가 되어 이 또한 본 발명이 목적하는 효능을 얻기 어렵게 될 우려가 있게 된다.

4. 제4단계; 화장료 조성물 제조

이렇게 수득된 상기 누에 혈림프 유래 발효산물은 인체무해함과 동시에 항산화능 및 미백효과가 우수하여 화장료 조성물의 주요소재로 사용가능하게 된다. 이에, 본 단계에서는 상기 발효산물을 유효성분으로 포함된 화장료 조성물을 제조하게 된다.

이때, 상기 누에 혈림프 유래 발효산물은 상기 화장료 조성물 1㎖를 기준으로 1.6~40 ㎍으로 포함되며, 나머지 잔량으로 그 외 화장료로 허용가능한 물질을 포함하는 것이 좋다. 이는, 상기 누에 혈림프 유래 발효산물이 상기 화장료 조성물 1㎖를 기준으로 1.6㎍미만 함유될 경우, 본 발명이 목적하는 항산화능 및 미백효과가 미흡하게 나타나고, 상기 화장료 조성물 1㎖를 기준으로 40㎍을 초과한 경우에는 티로시나아제 억제활성이 떨어져 미백용 화장료 조성물의 소재로 사용하기에 적합하지 않게 된다.

이렇게 조성된 상기 화장료 조성물의 제형은 사용방법 및 목적에 따라 달리 적용할 수 있다.

제형의 일예로는 로션제(lotion), 액제(液劑), 유제, 에멀션제, 현탁제(懸濁劑), 정제(錠劑) 및 캡슐제(capsule)가 있다.

화장료로 사용되는 경우 유연 화장수, 밀크로션, 영양크림, 맛사지 크림, 에센스, 클렌싱 폼, 클렌싱 워터, 팩 또는 보디오일 등의 기초 화장료 및 화운데이션, 립스틱, 마스카라 또는 메이크업 베이스 등의 색조 화장료 형태로 활용가능하며, 필요에 따라 피부 외용제에 일반적으로 사용하는 성분, 예를 들면 수성성분, 유성성분, 계면활성제, 보습제, 점증제, 방부제, 향료 색소 등과 함께 배합하는 것이 가능하다.

하기 실시예 및 실험예에 의해서 보다 구체적으로 설명하지만 보호범위가 하기 실시예 및 실험예에 국한되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 본 발명의 누에 혈림프 유래 발효산물1 제조

먼저 숙잠 1kg을 액체질소로 처리 후 동결건조(-50℃에서, 70시간 동안)하여 누에 건조물을 제조하였다.

상기 누에 건조물로부터 볼밀(직경1~5cm)을 이용하여 실샘을 제거하고 남은 건조물인 혈림프를 회수하여 분리해 내었다.

상기 분리된 혈림프를 바실러스 균(Bacillus subtilis 10854)를 이용하여 발효시켜 발효산물을 제조하였다.

설명하면, 상기 바실러스 균주는 NB(Nutrient Broth; Beef extract 3.0g, Peptone 5.0g/1ℓ)배지에서 37℃에서 16시간동안 배양하여 바실러스 균주 배양액을 제조하였다.

그 후 상기 미리 분리해둔 누에 혈림프 분말을 1% 농도로 녹인 뒤 주사기필터(0.2 ㎛ syringe filter, sartorius)를 사용하여 여과멸균한 후 여기에 상기 제조해 둔 바실러스 균주 배양액을 접종하여 37℃에서 2~4주동안 발효시켜 발효산물1을 제조하였다.

< 실시예 2> 본 발명의 누에 혈림프 유래 발효산물2 제조

상기 실시예 1과 같은 방법으로 제조하되, 상기 바실러스 균으로 Bacillus subtilis 10854 대신 Bacillus amyloliquefaciens M27을 사용하여 발효산물2를 제조하였다.

<실험예 1> SDS - PAGE 를 통한 분자량 확인

1. 실험방법

누에 혈림프 발효산물의 패턴을 알아보기 위해 하기와 같은 SDS-PAGE를 이용한 전기영동을 실시하였다.

설명하면, 본 발명의 누에 혈림프 유래 발효산물을 다시 원심분리하여 균체를 제거하고 주사기 필터(0.2㎛ syringe filter, Sartorius)를 이용하여 필터하였다. 이들 발효액의 분자량을 측정하기 위하여 NuPAGE Bis-Tris Mini gel(novex, USA)을 이용하여 제조사에서 제공한 메뉴얼에 따라 전기영동을 실시하였다. 전기영동이 완료된 젤은 Coomassie Blue R-250으로 염색하였다.

2. 실험결과

상기 실험결과 도 1에 나타나 있듯이, 누에 혈림프(1)가 본 발명의 발효과정을 거칠 경우(2, 3) 분자량이 현저히 저하되어 중간밴드들이 사라짐을 확인하였다.

또한, 도 2에 나타나 있듯이, 발효 산물 생성시 그 발효기간이 증가함에 따라 분자량 더 현저히 저하되어 중간밴드들이 사라짐을 확인하였다.

다시 말해, 분자량이 작다는 것은 화장료 소재로 사용시 피부에 스며드는 정도가 높다는 것이므로, 본 발명의 발효산물은 화장료 소재로 사용하기에 적합함을 알 수 있다.

<실험예 2> 본 발명의 누에 혈림프 유래 발효산물의 피부 세포독성

1. 실험방법

멜라닌세포(Melanocyte B16F1)을 이용하여 본 발명의 누에 혈림프 유래 발효산물의 세포독성을 평가하였다. 구체적으로 설명하면, 세포배양을 위한 배지는 10% (v/v) FBS (fetal bovine serum, GIBCO)와 100 U 스트렙토마이신과 100 μg/ml penicillin (GIBCO)이 함유된 DMEM 배지(Dulbecco’s modified Eagle’s medium-high glucose, WelGENE, Korea)를 사용하였다. 96well plate에 세포 (10,000 cells/well)를 접종하고 24시간 배양한 후에 누에 혈림프(대조구)와 본 발명의 누에 혈림프 유래 발효산물을 농도별로 첨가하고 이들의 세포 생존력을 MTT법을 이용하여 측정하였다.

2. 실험결과

상기 실험결과, 도 3에 나타나 있듯이 본 발명인 실시예 1(HL+10854) 및 실시예 2(HL+M27)의 누에 혈림프 유래 발효산물들은 대조구인 PBS보다 세포 생존율이 높음이 확인되었다. 이에, 본 발명의 누에 혈림프 유래 발효산물은 피부 세포에 독성이 없음을 의미한다.

<실험예 3> 본 발명의 누에 혈림프 유래 발효산물의 항산화 분석

1. 실험방법

본 발명의 누에 혈림프 유래 발효산물의 항산화 활성은 DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 자유라디칼 소거 활성 측정으로 확인하였다. 구체적으로 설명하면, 메탄올에 용해시킨 0.2 mM DPPH 용액 160 μl를 시료 40 μl와 혼합하여 30℃ 암소에 30분간 반응시킨 후 원심분리하여 상등액을 517 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 40 μg/ml의 비타민 C(Vitamin C) 를 사용하였다.

2. 실험결과

상기 실험결과 도 4에 나타나 있듯이, 본 발명의 실시예 1에서 제조된 발효산물의 항산화 효과가 누에 유래 혈림프 보다 높음을 확인하였다.

또한, 도 5에 나타나 있듯이, 발효 산물 생성시 발효기간 2주째 가장 항산화효과가 높게 나타났으며, 2주~4주까지는 항산화 효과가 높게 나타남음을 확인하였다.

<실험예 4> 본 발명의 누에 혈림프 유래 발효산물의 티로시나아네 억제활성 확인

1. 실험방법

멜라닌 생성 초기 단계에 관여하는 티로시나아제의 활성을 억제하는 미백 효과가 있는지 알아보기 위해 티로시나아제 활성 억제력을 측정하였다. 구체적으로 설명하면, 티로시나아제 활성 측정은 Choi et al.(1998)의 방법을 변형하여, 96well plate에 시료 40 μl를 넣고 8.3 mM L-DOPA(3,4-Dihydroxy-L-phenylalanine D9628-5G, Sigma-Aldrich Co.) 120 μl과 125 U(unit) 머쉬룸티로시나아제(tyrosinase from mushroom T3824, Sigma-Aldrich Co.) 40 μl를 혼합하였다. 37℃에서 30분 반응시킨 후 490 nm에서 흡광도를 측정하여 생성된 도파퀴논(dopaquinone)의 양을 계산하였다.

또한, 세포 내의 티로시나아제 활성을 측정하기 위하여, 24 well plate에 멜라닌 생성 세포(Melanocyte B16F1)를 100,000 cells/well을 분주하고 하루 정도 배양하였다. 배지를 걷어 내고 시료를 배지에 섞어 처리한 후 37℃, CO₂배양기에서 추가로 24시간 배양하였다. Trypsin-EDTA로 세포를 수집한 후 12,000 rpm에서 5분간 원심분리 후 상층을 제거하고 침전물을 단백질 추출액(Protein extraction solution NP-40)에 풀어준 뒤 10분간 얼음에 방치하였다가 14,000 rpm에서 10분간 다시 원심분리하였다. 펠렛을 0.2% L-DOPA가 첨가된 0.1 M 인산나트륨 완충용액(pH 6.8)에 용해시킨 뒤 37℃에서 15분 반응시킨 뒤 475 nm에서 흡광도를 측정하였다.

2. 실험결과

상기 실험결과 도 6에 나타나 있듯이, 실시예 1의 누에 혈림프 유래 발효산물(HL+10854, HL+M27)의 티로시나아제 억제 활성이 1.6~40 ㎍/㎖에서는 누에 유래 혈림프(HL) 보다 높게 나타남을 확인하였다. 이에, 미백효과를 갖는 화장료 조성물로 제조시 본 발명의 발효산물을 화장료 조성물 1㎖를 기준으로 1.6~40 ㎍으로 포함되도록 제조하는 것이 적합하다.

이와 같이 다양한 효능을 갖고 있음에도 불구하고 제대로 활용되지 못하고 폐기되어 왔던 누에 유래 혈림프를 화장품의 소재로 사용가능한지 그 여부를 확인함으로써 인체 무해하면서 우수한 항산화능 및 미백효과를 갖는 화장료 조성물을 제공할 수 있게 된다.

상기의 본 발명은 바람직한 실시예 및 시험예를 중심으로 살펴보았으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 본질적 기술 범위 내에서 상기 본 발명의 상세한 설명과 다른 형태의 실시예들을 구현할 수 있을 것이다. 여기서 본 발명의 본질적 기술범위는 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

누에 혈림프에 균을 접종한 후, 이를 발효시켜 얻은 발효산물을 포함하는, 화장료 조성물.
청구항 1항에 있어서,
상기 누에는 5령7일의 누에인 것이 특징인,
화장료 조성물.
청구항 1항에 있어서,
상기 발효산물은 상기 화장료 조성물 1㎖를 기준으로 1.6~40 ㎍으로 포함되는 것이 특징인,
화장료 조성물.
청구항 1항에 있어서,
상기 발효산물은 바실러스 균으로 발효시켜 얻은 것임을 특징으로 하는,
화장료 조성물.
청구항 4항에 있어서,
상기 바실러스 균은 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis) 또는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)인 것을 특징으로 하는,
화장료 조성물.
청구항 4항에 있어서,
상기 발효산물은 누에로부터 실샘을 제거하고 남은 혈림프에 NB 배지에서 배양된 바실러스 균주 배양액을 접종한 후, 이를 35~37℃에서 2~4 주동안 발효시켜 얻은 것임을 특징으로 하는,
화장료 조성물.
청구항 제 1항에 있어서,
상기 발효산물은 항산화능을 갖는 것이 특징인,
화장료 조성물.
청구항 제 1항에 있어서,
상기 발효산물은 미백효과를 갖는 것이 특징인,
화장료 조성물.
청구항 1항 내지 8항 중 어느 한 항의 화장료 조성물은 화장수, 에센스, 로션, 크림, 팩, 파운데이션, 젤, 연고 또는 스프레이 중 어느 하나의 제형을 갖는 것을 특징으로 하는,
화장료 조성물.
누에로부터 혈림프를 분리하는 제1단계;
바실러스 균주를 배양하여 바실러스 균주 배양액을 제조하는 제2단계;
상기 제 1단계에서 분리한 혈림프에 상기 제2단계에서 제조한 바실러스 균주 배양액을 접종한 후, 이를 35~37℃에서 2~4 주동안 발효시켜 발효산물을 제조하는 제3단계 및,
상기 발효산물을 유효성분으로 포함된 화장료 조성물을 제조하는 제4단계;를 포함하여 항산화능 및 미백효과를 갖는 것이 특징인,
화장료 조성물 제조방법.
청구항 10항에 있어서,
상기 제4단계에서 화장료 조성물 제조시 상기 발효산물은 상기 화장료 조성물 1㎖를 기준으로 1.6~40 ㎍으로 포함되는 것이 특징인,
화장료 조성물의 제조방법.
청구항 10항에 있어서,
상기 제2단계의 바실러스 균은 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis) 또는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)인 것을 특징으로 하는,
화장료 조성물의 제조방법.