CN101744093B - 一种茶叶蛋白多肽及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种茶叶蛋白多肽及其制备方法和用途。所述的茶叶蛋白多肽，以茶叶蛋白多肽总重量计，分子量在6000Da±100Da的组分占57-64w/w％，分子量在300-1000Da的组分占33-39w/w％；氮溶指数NSI为98.5-99.9％。所述的茶叶蛋白多肽以茶叶、茶渣或茶叶深加工废弃物为原料，通过复合酶A水解得到。所述的茶叶蛋白多肽具有多种生物功能。

Description

一种茶叶蛋白多肽及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及植物提取物，尤其涉及功能性茶叶蛋白肽及其制备方法和用途。

背景技术

茶叶中含有较多的营养成分和药用成分，但是，作为传统的饮料，我们所饮用的物质仅占茶叶一部分。

我国茶叶依其发酵程度可分为红茶(95％发酵)，黄茶(85％发酵)，黑茶(80％发酵)，乌龙茶(60-70％发酵)，包种茶(30-40％发酵)，青茶(15-20％发酵)，白茶(约5-10％发酵)，绿茶完全不发酵。而青茶之毛尖并不发酵，绿茶之黄汤反有部分发酵。在传统的茶发酵过程中，主要是茶叶中的多酚类物质发生显著性变化，而茶叶中的主要成分茶蛋白并没有明显的变化，因此茶汤中茶蛋白的溶出量仍然很小，而使得对人体具有高营养价值的茶蛋白不能被有效利用。

我国现阶段茶饮料的生产工艺为：水提→过滤→脱色→脱盐→浓缩→干燥，这种工艺所提取的物质主要是茶多酚、咖啡碱、糖分、水溶性灰分、氨基酸和维生素等，提取的物质总和也仅占茶叶干重的30％左右。在废弃的茶渣中，仍然残留较多的营养成分。经过提取的茶渣仍残留1％-2％的茶多酚，0.1％-0.3％的咖啡碱，17％-19％的粗蛋白，16％-18％的粗纤维，氨基酸中赖氨酸和蛋氨酸的组成分别为1.5％-2％和0.5％-0.7％，大部分的茶叶蛋白仍然没有被有效地利用，造成了严重的资源浪费，并且增加了茶饮料生产的成本。

茶叶中的蛋白质绝大多数是非水溶性的，只有1％-2％为水溶性的，而且在制茶过程中，由于蛋白质的变性凝固，使一些蛋白的水溶性进一步降低。茶叶中非水溶性蛋白质主要是谷蛋白，约占蛋白总量的80％，其次是白蛋白、球蛋白和精蛋白等。谷蛋白类不溶于水，只溶于稀酸、稀碱溶液。谷蛋白等非水溶性蛋白质难以直接被人体和动物消化吸收，且其功能性质也不佳，因此尚未被很好地研究和利用，从而使研究开发茶蛋白，尤其是工业化生产茶蛋白的进展很慢。

前人对茶叶蛋白质进行了一些研究。1954年布库恰瓦用纸上层析分离出茶叶蛋白质中17种氨基酸。1965年，Takashi Mizuno和Shizuo Kitagawa报道茶鲜叶中含蛋白质1.66％，白蛋白占3.5％，球蛋白占0.9％，醇溶蛋白占13.6％，谷蛋白占82.0％，含有16-18种氨基酸。1973年，俄国茶叶科学家Gogoberidze，M.K.和Pruidze，G N.测得格鲁吉亚茶叶白蛋白的分子量小于120000Da，球蛋白的分子量为65000Da和130000Da。1980年，Selvendran.R.R等用80％的乙醇浸提茶鲜叶的均浆后，将残渣在热水中提取6小时，分离得水溶性蛋白质，并从中分离出14种氨基酸。目前国内外对于茶叶蛋白功效的研究比较少。

由此可见，现阶段国内外对茶叶中蛋白质的研究仅限于茶叶蛋白的一些简单的活性，对茶叶蛋白的水解及茶叶蛋白肽的功能和活性的研究还无人涉及，并且由于茶叶蛋白抗性强、水溶性差及难提纯的特点，使得茶叶蛋白无法得到很好的利用，从而造成了茶叶蛋白资源的严重浪费。

因此，本领域迫切需要提供一种新的提取茶叶蛋白的方法，可以将茶叶、茶渣及茶叶深加工废弃物中的茶叶蛋白，制成多功能的茶叶蛋白肽，从而使其成为一种很好的食品及保健品的蛋白源，因而减少茶叶蛋白资源的浪费，缓解茶叶蛋白废弃物对环境的压力。

发明内容

本发明旨在提供一种茶叶蛋白多肽。

本发明的另一个目的是提供所述茶叶蛋白多肽的制备方法。

本发明的再一个目的是提供所述茶叶蛋白多肽的用途。

在本发明的第一方面，提供了一种茶叶蛋白多肽，以茶叶蛋白多肽总重量计，分子量在6000Da±100Da的组分占57-64w/w％，分子量在300-1000Da的组分占33-39w/w％；氮溶指数NSI为98.5-99.9％。

在另一优选例中，以茶叶蛋白多肽总重量计，粗蛋白含量90-95w/w％，灰分2-3w/w％，糖和水分含量6-8w/w％，酸溶性蛋白含量99.5-99.9w/w％，游离氨基酸含量为0±0.1w/w％。

在另一优选例中，所述的茶叶蛋白多肽粉末状固体呈淡黄褐色-淡红褐色；所述的茶叶蛋白多肽在所有pH下都能溶于水，溶液澄清，呈淡黄褐色-淡红褐色；显弱酸性；无异味，无苦味；对热很稳定，100℃煮沸无沉淀析出；在室温下保存3个月含量无明显变化。

在另一优选例中，所述的茶叶蛋白多肽通过下述步骤制备得到：

(I)将原材料和复合酶A在40-55℃，pH8-10混合3-6小时；以固形物的总重量计，复合酶A的量为0.5-2w/w％；所述的原材料选自下述的一种或多种：茶叶、茶渣、茶叶深加工废弃物；所述的复合酶A由下述成份构成：以复合酶A的干物的总重量计，角蛋白酶65-75w/w％，木瓜蛋白酶10-15w/w％，胰蛋白酶5-10w/w％，碱性蛋白酶5-10w/w％，和菠萝蛋白酶0.5-5w/w％。

(II)在5-25℃调节pH1-6使沉淀析出；和

(III)过滤除去不溶物得到茶叶蛋白多肽溶液。

在另一优选例中，在步骤(I)前还包括步骤：(I′)将原材料和水按料液比1∶4(w/v)混合后使成乳状物或混悬物；和/或在步骤(III)后还包括步骤：(IV)将茶叶蛋白多肽溶液浓缩、干燥得到茶叶蛋白多肽粉。

在另一优选例中，所述的茶叶蛋白多肽通过下述步骤制备得到：

(1)将原材料和水按料液比1∶4(w/v)混合后使成乳状物或混悬物；所述的原材料选自下述的一种或多种：茶叶、茶渣、茶叶深加工废弃物；

(2)将乳状物和复合酶A在40-55℃，pH8-10混合3-6小时；以固形物的总重量计，复合酶A的量为0.5-2w/w％；所述的复合酶A由下述成份构成：以复合酶A的干物的总重量计，其中角蛋白酶65-75w/w％，木瓜蛋白酶10-15w/w％，胰蛋白酶5-10w/w％，碱性蛋白酶5-10w/w％，菠萝蛋白酶0.5-5w/w％；

(3)在5-25℃调节pH1-6使沉淀析出；

(4)过滤除去不溶物得到茶叶蛋白多肽溶液a；

(5)将茶叶蛋白多肽溶液通过离子交换层析除盐、脱色，得到茶叶蛋白多肽溶液b；和

(6)将茶叶蛋白多肽溶液b浓缩、干燥得到茶叶蛋白多肽粉。

在本发明的第二方面，提供了一种如上所述的茶叶蛋白多肽的制备方法，所述的制备方法包括步骤：

(I)将原材料和复合酶A在40-55℃，pH8-10混合3-6小时；以固形物的总重量计，复合酶A的量为0.5-2w/w％；所述的原材料选自下述的一种或多种：茶叶、茶渣、茶叶深加工废弃物；所述的复合酶A由下述成份构成：以复合酶A的干物的总重量计，其中角蛋白酶65-75w/w％，木瓜蛋白酶10-15w/w％，胰蛋白酶5-10w/w％，碱性蛋白酶5-10w/w％，菠萝蛋白酶0.5-5w/w％；

(II)在5-25℃调节pH1-6使沉淀析出；和

(III)过滤除去不溶物得到茶叶蛋白多肽溶液。

在另一优选例中，在步骤(I)前还包括步骤：(I′)将原材料和水按料液比1∶4(w/v)混合后使成乳状物或混悬物；和/或在步骤(III)后还包括步骤：(IV)将茶叶蛋白多肽溶液浓缩、干燥得到茶叶蛋白多肽粉。

在另一优选例中，所述的制备方法包括步骤：

(1)将原材料和水按料液比1∶4(w/v)混合后使成乳状物或混悬物；所述的原材料选自下述的一种或多种：茶叶、茶渣、茶叶深加工废弃物；

(2)将乳状物和复合酶A在40-55℃，pH8-10混合3-6小时；以固形物的总重量计，复合酶A的量为0.5-2w/w％；所述的复合酶A由下述成份构成：以复合酶A的干物的总重量计，其中角蛋白酶65-75w/w％，木瓜蛋白酶10-15w/w％，胰蛋白酶5-10w/w％，碱性蛋白酶5-10w/w％，菠萝蛋白酶0.5-5w/w％；

(3)在5-25℃调节pH1-6使沉淀析出；

(4)过滤除去不溶物得到茶叶蛋白多肽溶液a；

(5)将茶叶蛋白多肽溶液通过离子交换层析除盐、脱色，得到茶叶蛋白多肽溶液b；和

(6)将茶叶蛋白多肽溶液b浓缩、干燥得到茶叶蛋白多肽粉。

在本发明的第三方面，提供了一种如上所述的茶叶蛋白多肽的用途，所述的茶叶蛋白多肽用于制备清除自由基、抗氧化的组合物；或用于制备用于清除亚硝酸根离子的组合物；或用于制备用于抗凝血及溶血的组合物；或用于预防和治疗非特异免疫功能低下的疾病的组合物。

在另一优选例中，所述的组合物选自保健品组合物、食品组合物、食品保鲜品组合物、化妆品或药物组合物。

在另一优选例中，所述的化妆品是具有护发和保湿作用的发乳剂或具有抗氧化作用的面霜。

在另一优选例中，所述的药物组合物可预防和治疗由于自由基损伤所引起的疾病。

在另一优选例中，所述的用于预防和治疗非特异免疫功能低下的疾病的组合物是药物组合物或保健品组合物。

据此，本发明提供了一种新的提取茶叶蛋白的方法，可以将茶叶、茶渣及茶叶深加工废弃物中的茶叶蛋白，制成多功能的茶叶蛋白肽，从而使其成为一种很好的食品及保健品的蛋白源，因而减少茶叶蛋白资源的浪费，缓解茶叶蛋白废弃物对环境的压力。

附图说明

图1显示了茶叶蛋白提取与精制工艺流程示意图。

图2显示了茶叶蛋白多肽制备工艺流程示意图。

图3显示了复合酶A中不同浓度的角蛋白酶对茶叶蛋白的水解能力。

图4显示了不同用量的复合酶A对茶叶蛋白的水解能力。

图5显示了实施例3所获得的茶叶蛋白多肽的凝胶色谱图。

图6显示了实施例3所获得的茶叶蛋白多肽与Vc对羟自由基清除效果的比较；其中

A是茶叶蛋白多肽对羟自由基清除的效果；B是Vc对羟自由基清除的效果。

图7显示了实施例3所获得的茶叶蛋白多肽与Vc对超氧阴离子自由基清除效果的比较。

图8显示了实施例3所获得的茶叶蛋白多肽与Vc对DPPH自由基清除效果的比较。

图9显示了实施例3所获得的茶叶蛋白肽与Vc对亚硝酸根离子清除效果的比较。

图10显示了实施例3所获得的茶叶蛋白多肽经胃、胰蛋白酶消化前后分子量分布的比较；其中

A是茶叶蛋白多肽未经胃、胰蛋白酶消化前的凝胶色谱图；B是茶叶蛋白多肽经胃蛋白酶消化后的凝胶色谱图；C是茶叶蛋白多肽经胃、胰蛋白酶消化后的凝胶色谱图。

图11显示了实施例3所获得的茶叶蛋白多肽经胃、胰蛋白酶消化前后对羟自由基清除效果的比较。

图12显示了实施例3所获得的茶叶蛋白肽经胃、胰蛋白酶消化前后对超氧阴离子自由基清除效果的比较。

图13显示了实施例3所获得的茶叶蛋白肽经胃、胰蛋白酶消化前后对DPPH自由基清除效果的比较。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，发现茶叶、茶渣和/或茶叶深加工的废弃物通过复合酶A水解，可以提取得到一种茶叶蛋白多肽，所述的茶叶蛋白多肽具有清除自由基、抗氧化、清除亚硝酸根离子、抗凝血及溶血、预防和治疗非特异免疫功能低下等多种功效。

同时，发明人还发现，茶叶、茶渣和/或茶叶深加工的废弃物通过复合酶B水解后得到的高纯度茶叶蛋白，再经过复合酶A水解，也可以得到上述的茶叶蛋白多肽。

定义

如本文所用，“复合酶A”是由下述成份构成的组合物，以复合酶A的干物的总重量计，角蛋白酶含量为65-75w/w％，木瓜蛋白酶含量为10-15w/w％，胰蛋白酶含量为5-10w/w％，碱性蛋白酶含量为5-10w/w％，和菠萝蛋白酶含量为0.5-5w/w％。复合酶A中所用的角蛋白酶地衣形芽孢杆菌L-25角蛋白酶及编码该角蛋白酶的DNA，对多种动物蛋白和植物蛋白均有很强的水解能力和很高的水解效率，在公开号为CN1361279A的中国专利申请中有详尽的描述描述，该专利中的有关内容并入本申请中。其余蛋白酶都可以从市售渠道获得。

如本文所用，“茶叶蛋白”是指茶叶、茶渣及茶叶深加工的废弃物中所含有的蛋白。如按其在不同的溶剂中的溶解状况，可以分为清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白。如按其功能来分，可以分为酶蛋白结构蛋白、贮存蛋白。如按其存在状态来分，可以分为单纯蛋白和结合蛋白两大类。

如本文所用，“茶叶”选自红茶、黄茶、黑茶、乌龙茶、包种茶、青茶、白茶和/或绿茶。

如本文所用，“茶渣”是指速溶茶或查饮料加工的废弃物

如本文所用，“茶叶深加工废弃物”是指茶叶深加工过程中所产生的诸如茶叶梗、碎茶叶、茶叶末等废弃物。

如本文所用，术语“药学上可接受的”或“食品学上可接受的”的成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。

茶叶蛋白多肽

本发明提供一种茶叶蛋白多肽，其分子量范围在6000Da以下，它含有少量的茶碱、茶多酚、茶多糖及茶氨酸。

本发明提供的茶叶蛋白多肽具有如下特征：

1)精制的茶叶蛋白多肽粉是一种淡黄褐色-淡红褐色的粉末，粗蛋白含量90％-95％，灰分2％-3％，糖、水分及其他含量6％-8％，其氮溶指数NSI为98.5％-99.9％，酸溶性蛋白含量99.5％-99.9％。

2)茶叶蛋白多肽是一种多肽混合物，混合物中各组分的分子量均在6000Da以下，以茶叶蛋白多肽总重量计，其中分子量在6000Da左右的组分占57-64w/w％，分子量在300-1000Da之间的组分占33-39w/w％，基本不含游离氨基酸；

3)茶叶蛋白多肽无异味，无苦味；

4)茶叶蛋白多肽在所有pH下都能溶液水，溶液澄清，呈淡黄褐色-淡红褐色，显弱酸性；

5)茶叶蛋白多肽对热很稳定，100℃煮沸无沉淀析出；

6)茶叶蛋白多肽在室温下保存3个月含量无明显变化。

本发明提供的茶叶蛋白多肽还具有以下功能：

1)具有强的抗氧化活性，对羟自由基、超氧阴离子自由基和DPPH自由基的清除能力均显著高于维生素C，对羟自由基、超氧阴离子自由基和DPPH自由基的清除率分别可达88％、100％和95％；

2)能够有效的清除亚硝酸根离子，清除率可达100％；

3)具有强的抗凝血活性，其效果显著优于柠檬酸钠；

4)具有非特异免疫活性，能显著增强机体的非特异免疫功能；

5)有强的胃蛋白酶和胰蛋白酶抗性，在体内消化吸收后仍有很强的活性，在体内消化吸收后仍有很强的活性，残余活性均在85％以上。

本发明提供的茶叶蛋白多肽可以是固体、液体或液体浓缩物。

制备方法

本发明提供一种茶叶蛋白多肽的制备方法，它包括步骤：以茶叶、茶渣或茶叶深加工废弃物为原料，加水浸泡并通过研磨或均质等方法制成乳状物或混悬物，然后加入复合酶A水解，水解产物经过微滤后，过离子交换树脂除盐、脱色，最终制成茶叶蛋白多肽。

在本发明的一个优选实施方案中，所说的乳状物或混悬物的固形物含量均在10％-20％之间(w/v)，复合酶A的加量按固形物含量的0.5-2％加入(w/w)。

在本发明的一个优选实施方案中，所采用的水解是在40℃-55℃，pH8-10条件下水解3-6小时。

本发明的另一优选实施例中，所述的制备茶叶蛋白多肽的方法包括以下步骤：

1)原材料预处理：与水，于室温下浸泡30min后，通过胶体磨磨碎成乳状液；

2)酶水解：将乳状液加入到反应罐中，然后用5N氢氧化钠调节乳状液或悬浊液的pH至9-10，加入复合酶A，于40℃-55℃，pH8-10条件下水解3-6小时；

3)酸化：通冰水冷却，使反应液的温度迅速降至15℃-20℃，然后用3-5N的稀盐酸调节溶液的pH至3-4之间，并置于15℃-20℃下静置30min；

4)板框过滤：将反应液压入板框过滤机中进行过滤，收集滤液；

5)微滤：将茶叶蛋白多肽溶液过0.1um的中空纤维微滤膜，进行进一步的澄清；

6)除盐和脱色：将茶叶蛋白多肽溶液过离子交换树脂进行除盐和脱色；

7)浓缩：用减压浓缩的方法将茶叶蛋白多肽溶液浓缩至固形物含量25％-30％；和

8)干燥：浓缩液经冷冻干燥、喷雾干燥或真空烘干制成茶叶蛋白多肽粉。

本发明的另一个制备茶叶蛋白多肽的方法是以提纯、精制后的茶叶蛋白为原料，加水使其重新悬浮后，再加入复合酶A水解，水解产物经过微滤、超滤后，过离子交换树脂除盐、脱色，最终制成茶叶蛋白多肽。

在另一优选例中，所述的制备方法包括步骤：

(I)将茶叶蛋白和复合酶A在40-55℃，pH8-10混合3-6小时；以固形物的总重量计，复合酶A的量为0.5-2w/w％；所述的复合酶A由下述成份构成：以复合酶A的干物的总重量计，其中角蛋白酶65-75w/w％，木瓜蛋白酶10-15w/w％，胰蛋白酶5-10w/w％，碱性蛋白酶5-10w/w％，菠萝蛋白酶0.5-5w/w％；

(II)在5-25℃调节pH1-6使沉淀析出；和

(III)过滤除去不溶物得到茶叶蛋白多肽溶液；

所述的茶叶蛋白是以茶叶、茶渣或茶叶深加工废弃物作为原料，在热的稀碱中浸泡，并加入复合酶B，使原料中的茶叶蛋白有效地溶出，在加入稀酸，使溶出的茶叶蛋白沉淀析出，然后洗涤蛋白沉淀，去除碳水化合物等非蛋白类的杂质和无机盐，最终得到高纯度的茶叶蛋白。

在另一优选例中，茶叶蛋白可通过下述步骤获得：

①将原材料和0.1N的氢氧化钠按照4∶1(v/w)的比例将茶叶、茶渣或茶叶深加工废弃物与水混合浸泡，使用研磨或均质等方法制成乳状物；所述的原材料选自下述的一种或多种：茶叶、茶渣、茶叶深加工废弃物；

②将步骤①中得到的乳状物和复合酶B在40-55℃，混合3-6小时，然后加入氢氧化钠，使其最终的浓度为0.1N，再于85℃-95℃保温1-2小时；以固形物的总重量计，复合酶B的量为0.05-0.5w/w％；所述的复合酶B由以下成份构成：以复合酶B干物的总重量计，其中木聚糖酶20-35w/w％，葡聚糖酶25-35w/w％，α-淀粉酶10-25w/w％，果胶酶15-25w/w％，纤维素酶0.01-1.0w/w％，酸性蛋白酶0.02-0.05w/w％；

③通冰水冷却，使温度迅速降至15℃-20℃，然后用3-5N的稀盐酸调节溶液的pH至3-4之间，并置于15℃-20℃下静置1小时，得到蛋白混悬液；

④将所得蛋白混悬液压入板框中进行过滤，然后向板框中压入2-3倍滤液体积的纯水洗涤滤渣；和

⑤收集滤渣，干燥，得到高纯度的茶叶蛋白。

用途

本发明提供的具有优良特性及多种生物活性的茶叶蛋白多肽可以用于各种技术领域，包括食品、饮料、化妆品、化装用品、医药保健和工业应用。

本发明提供的茶叶蛋白多肽可以在清除自由基、抗氧化方面应用，可以制备成具有抗氧化活性的保健食品、饮料、化妆品或医药品；可以用于食品保鲜；可以用于制备具有护发和保湿作用的发乳剂或具有抗氧化作用的面霜；可以用于制备预防和治疗由于自由基损伤所引起的疾病的药品。

本发明提供的茶叶蛋白多肽可以在清除亚硝酸根离子方面应用。

本发明提供的茶叶蛋白多肽可以在抗凝血及溶血方面应用。

本发明提供的茶叶蛋白多肽可以在非特异免疫功能方面的应用，可以制备具有预防和治疗非特异免疫功能低下的疾病的药品或保健品。

当将本发明提供的茶叶蛋白多肽应用于上述各项时，可以将茶叶蛋白多肽和“药学上可接受的”或“食品学上可接受的”载体混合得到组合物，所述的组合物选自药物组合物、食品组合物或化妆品。

对于本发明所述的组合物的剂型没有特别的限制，可以是任何适用于哺乳动物服用的剂型；优选的，所述的剂型可选自：颗粒剂、胶囊、片剂、粉末剂、口服液、混悬液、或乳剂。

使用药物组合物时，是将安全有效量的茶叶蛋白多肽施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约0.4g/千克体重，而且在大多数情况下不超过约5g/千克体重，较佳地该剂量是约0.6g/千克体重-约3.0g/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

本发明的主要优点在于：

1、本发明提供了一种高效、安全、经济、绿色、环保的制备茶叶蛋白多肽的技术；

2、本发明运用酶法提取并水解茶叶、茶渣及茶叶深加工废弃物中的茶叶蛋白，制成多功能的茶叶蛋白肽，可以实现茶叶蛋白的有效利用，从而可减少茶叶蛋白资源的浪费，缓解茶叶蛋白废弃物对环境的压力。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。

本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶质的重量。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实验条件：

1.材料

茶叶、茶渣及茶叶深加工废弃物均由福建漳洲大闽食品有限公司提供；昆明小鼠：18-22g，普通级，购于福建省福州市福建医科大学；胃蛋白酶(1∶3000)，胰蛋白酶(1∶250)，购自上海生工。

2.试剂

实验所用试剂均为市售的分析纯试剂。

3.本发明中所用到的生物化学技术均为本领域中的常规技术。在以下实施例中，除非特殊说明，所有实验操作均按照以下实验手册或文献中的相关章节或部分进行，包括：程瑾瑞等，中国食品工业标准汇编(第二版)；赵永芳等，生物化学技术原理及其应用(第二版)；朱检等，生物化学实验[M]。

实施例1

茶叶蛋白的提取和精制

茶叶蛋白的提取和精制按照以下步骤进行，工艺流程如图1所示。

1)称取6kg的茶叶、茶渣或茶叶深加工废弃物于50L配料槽中，加入24L水(料液比1∶4，w/v)，混合均匀后于室温下浸泡30min；

2)将混合液通过胶体磨磨碎成乳状液，将乳状液加入到50L的反应罐中，加入6g复合酶B(复合酶B的量按照固形物含量的0.1％加入，w/w)，混合均匀后，保温45℃-55℃下反应2-3小时；

3)加入600ml 5N的氢氧化钠溶液，是其最终浓度为0.1N，充分混合后，保温85℃-95℃下反应1-2小时；

4)通冰水冷却，使反应所得茶叶蛋白混合溶液的温度迅速降至15℃-20℃，然后静置沉降1-2小时，移取上清夜；

5)用3-5N的稀盐酸调节上清液的pH至3-4之间，并置于15℃-20℃下静置1小时；

6)将所得蛋白混悬液压入板框过滤机中进行过滤，过滤完后，向板框中压入2-3倍滤液体积的纯水洗涤滤渣，除去无机盐和可溶性的非蛋白有机物；

7)收集滤渣，干燥(干燥方式可以是真空烘干或喷雾干燥)，得到高纯度的茶叶蛋白。

由此所制备的茶叶蛋白为黄褐色-红褐色的粉末(颜色随原材料发酵程度的加深而加深)，无异味，其粗蛋白含量在90％以上(凯氏定氮法)，具有很高的纯度。用反相高压液相色谱法分析所制备茶叶蛋白的氨基酸组成，结果如表1所示。

表1  茶叶蛋白的氨基酸组成分

氨基酸种类	含量(％)	氨基酸种类	含量(％)
				天冬氨酸(Asp)	14.47	半胱氨酸(Cys)	0.39
丝氨酸(Ser)	5.32	酪氨酸(Tyr)	3.65
				谷氨酸(Glu)	13.14	*缬氨酸(Val)	6.40
甘氨酸(Gly)	5.97	*蛋氨酸(Met)	0.34
				组氨酸(His)	2.36	*赖氨酸(Lys)	6.10
精氨酸(Arg)	5.50	*异亮氨酸(Ile)	4.77
				*苏氨酸(Thr)	4.89	*亮氨酸(Leu)	9.53
丙氨酸(Ala)	6.44	*苯丙氨酸(Phe)	5.41
				脯氨酸(Pro)	5.32

注：表示*为必需氨基酸

由表1可以看出，茶叶蛋白各氨基酸组成平衡，天冬氨酸和谷氨酸含量较高，分别为14.47％和13.14％。茶叶蛋白含有人体必需的8种氨基酸，含量也较高，是一种较为理想的人体蛋白质补充源，特别是亮氨酸、缬氨酸和赖氨酸含量达到6％以上，因此，茶叶蛋白具有开发成为保健食品的独特优势。

实施例2

复合酶A对茶叶蛋白的水解

在50-90w/w％范围内，逐渐依次调整复合酶A中角蛋白酶的百分比浓度，然后按照实施例3中所述的步骤1)至步骤4)实施复合酶A对茶叶蛋白的水解(复合酶A的量按照原料量的1w/w％加入)，水解结束后，取酶解液5ml 12000rpm离心5分钟，取上清液用Folin-酚法测定可溶性蛋白含量，并按照下式计算水解度DH：

$\mathrm{DH}(\%)=\frac{(N_2-N_1)\×V}{N_0}\×100$

式中：N₂——酶解反应后酶解液的可溶性蛋白含量，mg/mL；

N₁——酶解反应前溶液的可溶性蛋白含量，mg/mL；

N₀——参加酶解反应的茶叶蛋白的总蛋白量(原料的粗蛋白含量×原料的加入量，原料的粗蛋白含量按照凯氏定氮法进行测定)，mg；

V——酶解反应液体积，mL。

再取2ml以上所得酶解液离心后上清，与2ml 20％TCA混合，振荡均匀，静置5分钟后，10000rpm离心10min，取上清液，用Folin-酚法测定可溶性蛋白含量，即为酶解液中酸溶性蛋白含量，酸溶性蛋白的百分比含量按照下式计算：

酸溶性蛋白百分比含量％＝Ns/N×100

式中：Ns——酶解液中酸溶性蛋白含量，mg/ml；

      N——酶解液中可溶性蛋白含量，mg/ml。

在0.5-2w/w％(复合酶A的量相对于原料量的百分比数)的范围内，逐渐依次改变复合酶A的添加量，然后按照实施例3中所述的步骤1)至步骤4)实施复合酶A对茶叶蛋白的水解(复合酶A中角蛋白酶的含量为70％)，水解结束后，按照以上同样的方法分别测定酶解液的水解度和酸溶性蛋白的百分比含量。

以上所得结果如图3和图4所示。从图3中可以看出，角蛋白酶对茶叶蛋白有很强的水解能力，复合酶A中角蛋白酶含量在65-75％范围内时，酶解液的水解度及酸溶性蛋白的百分比含量均可达到100％。当复合酶A中角蛋白酶的含量低于65％后，酶解液中酸溶性蛋白的含量迅速减少，角蛋白酶含量为50％时，酸溶性蛋白含量降低至60％左右，这说明角蛋白酶对茶叶蛋白多肽的产生有至关重要的作用。从图4中可以看出，在0.5-2％复合酶A添加量的范围内，均能够快速、有效、彻底的水解茶叶蛋白产生茶叶蛋白多肽。

实施例3

茶叶蛋白多肽的制备

茶叶蛋白多肽的制备按照以下步骤进行，工艺流程如图2所示。

1)称取6kg的茶叶、茶渣或茶叶深加工废弃物于50L配料槽中，加入24L水(料液比1∶4，w/v)，混合均匀后于室温下浸泡30min；

2)将混合液通过胶体磨磨碎成乳状液；

3)将乳状液加入到50L的反应罐中，

或于50L的反应罐中加入6kg茶叶蛋白与24L水(料液比1∶4，w/v；所用茶叶蛋白为实施例1所制备)，混合均匀制成悬浊液；

4)用5N氢氧化钠调节乳状液或悬浊液的pH至9-10，加入60g复合酶A(复合酶A的量按照固形物含量的0.5％-2％加入，w/w)，混合均匀后，于40℃-55℃，pH8-10条件下水解3-6小时；

5)通冰水冷却，使反应液的温度迅速降至15℃-20℃，然后用3-5N的稀盐酸调节溶液的pH至3-4之间，并置于15℃-20℃下静置30min；

6)将反应液压入板框过滤机中进行过滤，收集滤液得茶叶蛋白多肽溶液；

7)将所得茶叶蛋白多肽溶液过0.1um的中空纤维微滤膜，进行进一步的澄清；

8)将澄清后的茶叶蛋白多肽溶液依次过HZ016阳离子树脂交换柱和D345阴离子树脂交换柱，进行脱盐和脱色，得到茶叶蛋白多肽溶液；

9)用真空浓缩锅对脱盐、脱色后的茶叶蛋白多肽溶液进行浓缩，浓缩倍数的范围可在5-20倍之间；

10)对茶叶蛋白多肽浓缩液进行干燥，得到茶叶蛋白多肽粉，干燥方式可以为冷冻干燥、喷雾干燥或真空烘干中的任意一种。

由此所制备的茶叶蛋白多肽溶液为澄清的淡黄褐色-红褐色液体(颜色随原材料发酵程度的加深而加深)，无异味、无苦味，呈弱酸性(pH5-6)。

由此所制备的茶叶蛋白多肽粉淡黄褐色-红褐色粉末(颜色随原材料发酵程度的加深而加深)，无异味，粗蛋白含量90％-95％(凯氏定氮法)，灰分2％-3％，糖、水分及其他含量6％-8％，其氮溶指数NSI为98.5％-99.9％，酸溶性蛋白含量99.5％-99.9％，可完全溶于任意pH的水中，溶液为澄清的淡黄褐色-红褐色液体，亦呈弱酸性。

实施例4

茶叶蛋白多肽分子量分布的检测

采用凝胶过滤色谱法分析茶叶蛋白多肽的分子量分布。凝胶过滤色谱根据分子量大小对混合物组分进行分离，根据各组分的保留体积，对照标准谱图，可计算出被测样品中各组分的分子量大小。

以标准谱图中各标准蛋白的保留体积为横坐标，以各标准蛋白分子量的对数为纵坐标，绘制标准曲线，求得解析式lgY＝-0.1775X+6.4976，式中Y为组分的分子量(Da)，X为组分的保留体积。

取2ml实施例3所得的茶叶蛋白多肽溶液25℃，10000rpm离心10min，上清液用0.2um的微滤膜过滤后，取100ul进行HPLC分析。色谱条件为：0.05M磷酸盐缓冲液，0.15M NaCl，pH7.0；0.4ml/min，25℃；紫外检测器，220nm；上样100ul；Superdex^TM 75 10/300GL色谱柱。

所得色谱图如图5所示，根据谱图中各组分的保留体积计算出各组分的分子量，根据谱图中各组分的峰面积计算出各组分的百分比含量，结果如表2所示。

表2  茶叶蛋白多肽中各组分的分子量及百分比含量

分子量(Da)	百分比含量(％)
		6000	60.19
1000	25.72
		300	11.40

由表2可知，复合蛋白酶水解茶叶蛋白所产生的茶叶蛋白多肽分子量均在6000Da以下，其中分子量在6000Da左右的占60.19％，分子量在300-1000Da之间的占37.12％，基本无游离氨基酸产生。

实施例5

茶叶蛋白多肽的抗氧化活性

1)茶叶蛋白肽对羟基自由基(·OH)的清除作用

参考Fenton反应体系模型，利用H₂O₂与Fe²⁺混合产生·OH，但由于·OH具有很高的反应活性，存活时间短，若在体系中加入水杨酸，就能有效地捕捉·OH，并产生有色产物。该产物在波长510nm处有强吸收，若在反应体系中加入具有清除·OH功能的被测物，便会与水杨酸竞争·OH，而使有色产物生成量减少。采用固定反应时间法，因此，可以用来评价样品对·OH的清除效果(Sabu MC，Smitha K，et al.Anti-diabetic activity of green tea polyphenols and their role in reduceingoxidative stress in experimental diabetes[J].J.Ethnopharmacol，2002，83：109-116.)。

在试管中依次加0.5ml 9mM水杨酸-乙醇溶液，0.5ml的不同浓度的样品溶液(茶叶蛋白多肽溶液在0-0.4mg/ml浓度范围内，Vc溶液在0-10mg/ml浓度范围内，所用茶叶蛋白多肽为实施例3所制备)，0.5ml 9mM Fe²⁺溶液(现配)，3.5ml蒸馏水，最后加入5ml 8.8mM H₂O₂启动Fenton反应，摇匀后于510nm处测定吸光度A₁；取0.5ml的蒸馏水代替9mM Fe²⁺溶液所测得的吸光度为A₂；取0.5ml蒸馏水代替样品所测得的吸光度为A₃。羟基自由基的清除率P(％)可按照式(1)进行计算，所得结果如图6所示。

$p(\%)=\frac{A_3-(A_1-A_2)}{A_3}\×100$ 式(1)

式中：P——清除率，％；

A₁——样品溶液反应后的吸光值；

A₂——取0.5ml的蒸馏水代替9mM Fe²⁺溶液后的吸光值；

A₃——取0.5ml蒸馏水代替样品的吸光值。

从图6可以看出，茶叶蛋白多肽对羟基自由基有很强的清除效果，当茶叶蛋白肽浓度为0.2mg/mL时，其对羟基自由基的清除率达到85％。在0-0.1mg/mL浓度范围内，茶叶蛋白肽对·OH自由基的清除率随着浓度的升高而迅速增大。茶叶蛋白肽对羟基自由基的IC₅₀为0.06mg/mL。当样品浓度均为0.1mg/ml时，茶叶蛋白肽清除羟基自由基的效果比Vc高10倍，低浓度就能起到很好的清除羟基自由基的作用。

2)茶叶蛋白肽对超氧阴离子自由基(O₂ ^-·)的清除作用

邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化，释放超氧阴离子自由基，超氧阴离子自由基加速自氧化，同时生成有色中间产物。中间产物的积累在滞后40s到45s时与时间成良好线性关系，有色产物在420nm处有强烈光吸收，从而可用于评价受试物清除超氧阴离子自由基的能力(邹国林等.一种SOD的测活方法——邻苯三酚自氧化法的改进[J].生物化学与生物物理进展，1986，4：71-73)。

取4.5ml pH8.3的10Mm PBS缓冲液与100μl不同浓度的样品溶液(茶叶蛋白多肽与Vc溶液的浓度均在0—10mg/ml浓度范围内，所用茶叶蛋白多肽为实施例3所制备)混合，于25℃恒温15min，取混合液3ml加入45mM的邻苯三酚(用10mM HCl溶液配制)100μl，摇匀，反应3min，在波长420nm测定吸光值A₁。超氧阴离子自由基的清除率P(％)可按照式(2)进行计算，所得结果如图7所示。

$p(\%)=\frac{A_3-(A_1-A_2)}{A_3}\×100$ 式(2)

式中：P——清除率，％；

A₁——样品溶液反应后的吸光值；

A₂——4.5ml PBS溶液+100μl HCl(10mM)+100μl蒸馏水的吸光值；

A₃——4.5ml PBS溶液+100μl邻苯三酚溶液+100μl蒸馏水的吸光值。

从图7可以看出，茶叶蛋白多肽对超氧阴离子自由基也有很好的清除效果，当茶叶蛋白多肽浓度为3.2mg/mL时，其对超氧阴离子自由基的清除率达到100％。在0-1.0mg/mL浓度范围内，茶叶蛋白多肽对超氧阴离子自由基的清除率随着浓度的升高而迅速增大，茶叶蛋白多肽对超氧阴离子自由基的IC₅₀为0.2mg/mL。在相同浓度下其对超氧阴离子自由基的清除效果均比Vc高，当样品浓度均为1mg/ml时，茶叶蛋白肽清除羟基自由基的效果比Vc高1倍。由此可见，茶叶蛋白多肽具有比Vc更好的清除超氧阴离子自由基的作用。

3)茶叶蛋白肽对DPPH自由基的清除作用

DPPH(1，1-二苯-2-苦肼基)是一种稳定的自由基。其乙醇溶液呈紫色，在可见光区最大吸收峰为517nm。当DPPH溶液中加入自由基清除剂时，溶液颜色变浅，517nm处的吸光度变小，而吸光度变小的程度与自由基被清除的程度呈线性关系。因此，可用来检测自由基的清除情况，从而评价某物质的抗氧化能力。其能力用抑制率来表示，抑制率越大，抗氧化能力越强(陆冬莲等.太白山区23种中药抗氧化活性的研究[J].天然产物研究与开发，2001，13：20-22.)。

配制浓度为1×10^-4mol/L的DPPH乙醇溶液，避光保存。称取适量的茶叶蛋白多肽与Vc样品(所用茶叶蛋白多肽为实施例3所制备)，并用95％乙醇配置成不同浓度的溶液(在0-2.5mg/ml的浓度范围内)。在517nm处，按照如下计算公式(3)中的方法加样测定，室温下反应30min，每样重复3次，取平均值，并计算自由基清除率P，所得结果如图8所示。

$p(\%)=\frac{A_3-(A_1-A_2)}{A_3}\×100$ 式(3)

式中：P——清除率，％；

A₁——2ml DPPH溶液+2ml样品溶液的吸光值；

A₂——2ml待测溶液+2ml乙醇的吸光值；

A₃——2ml DPPH溶液+2ml乙醇的吸光值。

图8反映了茶叶蛋白多肽清除DPPH自由基的效果，可以看出，茶叶蛋白肽对DPPH自由基有着较强的清除效果，当茶叶蛋白肽浓度为1mg/mL时，其对DPPH自由基的清除率达到90％。在茶叶蛋白肽浓度为0-0.1mg/mL时，其对DPPH自由基清除率随着浓度的增大而迅速增大，茶叶蛋白肽对清除DPPH自由基的IC₅₀为0.10mg/mL。

茶叶蛋白肽体外抗氧化实验结果表明，茶叶蛋白肽对羟自由基、超氧阴离子自由基和DPPH自由基均有很强的清除能力，其IC50分别为0.06mg/mL、0.2mg/mL、0.10mg/mL，其最大清除率分别为88％、100％、95％，体外抗氧化作用明显。

通过与维生素C的体外抗氧化活性对比可以看出，茶叶蛋白肽对羟自由基、超氧阴离子自由基的清除能力明显高于Vc。当样品浓度为0.1mg/ml时，茶叶蛋白肽清除羟基自由基的效果比Vc高15倍；当样品浓度为1mg/ml时，茶叶蛋白肽清除超氧阴离子自由基的效果比Vc高1.5倍。茶叶蛋白肽对自由基的清除能力明显高于天然抗氧化剂维生素C。

实施例6

茶叶蛋白多肽对亚硝酸根离子的清除

在弱酸条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化，再与盐酸萘乙二胺偶合形成紫红色染料，其最大吸收波长在538nm，能够清除亚硝酸盐(NO₂-)的物质可使紫红色染料在538nm的吸光度值减弱，因此可通过测定在538nm的吸光值间接反应受试物清除亚硝酸盐的能力(赵二劳等.沙棘叶对亚硝酸盐清除能力的研究[J].食品工业科技，2006，27(3)：81-82)。

分别取1ml不同浓度(在0-3.5mg/ml范围内)的茶叶蛋白多肽样品溶液和Vc样品溶液于不同的25ml比色管中(所用茶叶蛋白多肽为实施例3所制备)，再分别加入5ug/ml的NaNO₂标准溶液1ml，置于37℃恒温水浴中反应30min。取出后立即加入1ml 0.4％的对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置5min后加入0.5ml 0.2％的盐酸萘乙二胺溶液，加水至10ml刻度，混匀，静置15min，以不加NaNO₂和样品溶液的试剂为空白，于538nm处测定吸光值。通过NaNO₂标准曲线得到相应的NaNO₂含量，然后再根据式(4)计算出亚硝酸根离子的清除率，结果如图9所示。

式(4)

从图9可以看出，茶叶蛋白多肽对亚硝酸根离子有很强的清除效果，当茶叶蛋白肽浓度为0.8mg/mL时，其对羟基自由基的清除率达到100％。在0-0.8mg/mL浓度范围内，茶叶蛋白肽对亚硝酸根自由基的清除率随着浓度的升高而迅速增大，茶叶蛋白肽对亚硝酸根离子的IC₅₀为0.2mg/mL。

实施例7

茶叶蛋白多肽的抗凝血活性

全血复钙时间是初步判断药物是否具有抗凝血活性的重要指标(王兆梅等.两种硫酸酯化纤维素钠的结构和抗凝血活性研究.林产化学与工业，2003，23(3)：23-27)。本实验通过加入不同样品后全血复钙时间的测定来初步判断茶叶蛋白肽的抗凝血活性。

(1)血浆的制备：

取鸡血置于预先放有3.8％柠檬酸钠溶液(水溶液，w/v)的容器中，柠檬酸钠与血液体积之比为1∶9(v/v)，边收集边轻轻振摇，收集完毕，迅速在2500rpw/win，25℃下离心10min，将血浆分成若干份注入容器内，-20℃冻结贮存，临用时置于37℃恒温水浴中融化后放入冰箱中备用。

(2)全血复钙时间(RT)的测定：

取管径均匀、清洁干燥的小试管若干支，分别加入相同浓度的茶叶蛋白多肽和柠檬酸钠样品溶液0.1ml(所用茶叶蛋白多肽为实施例3所制备)，另取制备的血浆，分别注入小试管内，每管1.0ml，立即混匀，避免有小气泡产生，将小试管置于恒温水浴(37℃±0.5℃)中，孵育1min后加入0.025mol/L的氯化钙0.1ml，立即启动秒表记录各管的血液凝固时间，以倾斜小试管液面不滑动记为复钙时间，每10s检查一次，每管重复实验3次(Alban S.Anticoagulant and antithrombotic action ofa semisynthetic gulcan sulfate.Thrombosis Research，1995，78：201-210；FangCao，Bingxiang Yuan.Experimental study about styptic action of didanmingmucapsule in animals[J].Archives of Traditional Chinese Medicine[J].2004，22(11)：1084.)。结果见表3所示。

表3茶叶蛋白多肽缓血液凝集的效果

	全血复钙时间(RT)
		对照	3min 40s
茶叶蛋白多肽	11min 20s
		柠檬酸钠	5min 20s

注：样品浓度均为3mg/ml。

从表3可以看出，茶叶蛋白多肽具有很好的抗凝血的作用，在相同浓度下，添加有茶叶蛋白多肽的全血复钙时间明显延长，且明显优于抗凝剂柠檬酸钠，这说明复合蛋白酶水解产生的茶叶蛋白多肽具有很高的抗血液凝集活性，对血液凝集过程有一定的抑制效果，这对于预防和治疗心血管疾病具有重要的意义。

实施例8

茶叶蛋白多肽的非特异性免疫活性

本实验采用研究影响非特异性免疫功能的指标来确定茶叶蛋白多肽对小鼠免疫功能的影响。影响非特异性免疫功能的实验方法，包括免疫器官重量法和单核吞噬细胞功能测定法。免疫器官包括脾和胸腺，而单核吞噬细胞功能可以通过小鼠碳粒廓清能力和腹腔巨噬细胞功能来测定(李仪奎.中药药理学实验方法学(第二版)[M].2006，722-741.)。

(1)小鼠免疫器官重量

取体重18-22g KM小鼠50只，同一性别(本次实验取雄性)，随机分成5组：生理盐水对照组、茶叶蛋白多肽高剂量组(0.75g/kg，所用茶叶蛋白多肽为实施例3所制备)、低剂量组(0.375g/kg)、阴性对照组(氢化可的松组20mg/kg)及茶叶蛋白多肽高剂量(0.75g/kg)+氢化可的松组(20mg/kg)。灌胃给药体积为0.5ml(氢化可的松采用腹腔注射0.1ml)，每日给药一次，连续给药10天后，末次给药后的次日，脱颈处死动物，称重，剥取脾脏、胸腺分别精确称量，按公式计算胸腺指数和脾脏指数：

随后进行组间t检验，比较组间差异的显著性。

连续给药14天，于末次给药后次日脱颈处死动物，取出脾脏及胸腺，分别精确称量小鼠脾脏和胸腺，计算胸腺指数和脾指数。结果如表4所示。

表4茶叶蛋白多肽对小鼠胸腺、脾脏重量的影响及对抗免疫抑制剂的作用

(x±s)

组别	剂量	胸腺指数(mg/10体重)	脾脏指数(mg/10体重)
				生理盐水对照组	0.5ml	18.13±4.67	39.16±4.08
茶叶蛋白多肽(低剂量组)	0.375g/kg	17.69±3.84	46.27±6.16*
				茶叶蛋白多肽(高剂量组)	0.75g/kg	21.97±8.55	50.73±10.64*
茶叶蛋白多肽	0.75g/kg+20mg/kg	10.19±1.95	38.46±7.13

+氢化可的松
				氢化可的松	20mg/kg	6.65±2.70**	36.86±5.13

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

由表4可见，茶叶蛋白多肽对小鼠脾脏的重量指数存在差异，在P＜0.05的水平下，对照组与高剂量组、低剂量组都存在显著性差异，其中高剂量组脾指数最大，低剂量组脾指数次之，说明茶叶蛋白多肽有利于小鼠脾指数的增大。

由表4还可以看出，茶叶蛋白多肽+氢化可的松组对小鼠脾指数及胸腺指数均无显著影响，与氢化可的松组间差异不明显，但茶叶蛋白多肽+氢化可的松组脾指数及胸腺指数均比氢化可的松组大，这说明在一定程度上茶叶蛋白多肽能对抗氢化可的松的免疫抑制作用。

(2)小鼠单核细胞的吞噬功能

取体重18-22g KM小鼠40只，同一性别(本次实验取雄性)，随机分成4组：生理盐水对照组、茶叶蛋白多肽高剂量组(0.75g/kg，所用茶叶蛋白多肽为实施例3所制备)、低剂量组(0.375g/kg)、阴性对照组(氢化可的松组20mg/kg)。灌胃给药体积为0.5ml(氢化可的松采用腹腔注射0.1ml)，每日给药一次，连续给药10天，于末次给药1h后，尾静脉注射刚果红0.1ml/20g体重，注射后不同时间(2min，10min)用吸管(预先用肝素溶液润湿)分别从小鼠眶后静脉丛取血20ul，溶于2ml 0.1％Na₂CO₃溶液中摇匀，置分光光度计上520nm比色，测定光密度(OD)。最后将小鼠脱颈处死，称重，剥取脾脏、肝脏分别精确称量。按下式计算廓清指数K或校正廓清指数A：

$K=\frac{\log O{D}_1-\log {\mathrm{OD}}_{21}}{t_2-t_1}$

随后进行组间t检验，比较组间差异的显著性。

连续给药14天，于末次给药30min后尾静脉注射刚果红，注射后不同时间(2min、10min)，用吸管(预先用肝素溶液润湿)分别从小鼠眶后静脉丛取血20ul，溶于2ml0.1％Na₂CO₃溶液中摇匀，置分光光度计上520nm比色，测定光密度(OD)。最后将小鼠脱颈处死，称重，剥取脾脏、肝脏分别精确称量，计算廓清指数K或校正廓清指数A(吞噬指数A)。结果如表5所示：

表5茶叶蛋白多肽对小鼠吞噬细胞廓清功能的影响(x±s)

组别	剂量	廓清指数K(×10-3)	吞噬指数A
				生理盐水对照组	0.5ml	9.6±4.4	3.90±0.58

茶叶蛋白多肽(低剂量组)	0.375g/kg	12.2±5.1	4.22±0.51
				茶叶蛋白多肽(高剂量组)	0.75g/kg	23.9±7.4*	4.78±0.83*

注：与对照组比较，*P＜0.05。

由表5可知，茶叶蛋白多肽对小鼠单核细胞的廓清指数K和吞噬指数A影响显著。其中高剂量组的K值和A值与对照组的差异显著，高剂量组单核细胞的廊清指数和吞噬指数均最大。

综合以上实验结果表明茶叶蛋白多肽能够增强小鼠的非特异性免疫功能，使碳廊清能力明显升高。

实施例9

茶叶蛋白多肽对胃蛋白酶和胰蛋白酶的抗性

本实验采用体外模拟消化来考察茶叶蛋白多肽对胃蛋白酶和胰蛋白酶的抗性。

(1)胃蛋白酶体外消化

于25ml具塞试管中，加入50mg茶叶蛋白多肽(所用茶叶蛋白多肽为实施例3所制备)，5ml蒸馏水，溶解后用盐酸调pH至2.5，然后按照2000U/g茶叶蛋白多肽的比例加入胃蛋白酶，置于37℃水浴中3小时，反应结束后加入2ml 20％TCA终止反应，将反应液于10000rpm，25℃下离心5min，取上清100ul进行HPLC分析(按实施例4中所叙的方法进行，采用Toyopearl HW-40s凝胶柱)，并以未经胃蛋白酶消化的茶叶蛋白多肽为对照，比较消化前后茶叶蛋白多肽分子量分布的变化，结果如图10所示。

将所得胃蛋白酶消化后的茶叶蛋白多肽样品，按照实施例5中所叙述的方法分析其对羟自由基、超氧阴离子自由基和DPPH自由基的去除率，并与消化前的样品进行比较，结果如图11、图12及图13所示。

(2)胰蛋白酶体外消化

于25ml具塞试管中，加入50mg茶叶蛋白多肽(所用茶叶蛋白多肽为实施例3所制备)，5ml蒸馏水，溶解后用盐酸调pH至8.0，然后按照2000U/g茶叶蛋白多肽的比例加入胰蛋白酶，置于37℃水浴中3小时，反应结束后加入2ml 20％TCA终止反应，将反应液于10000rpm，25℃下离心5min，取上清100ul进行HPLC分析(按实施例4中所叙的方法进行，采用Toyopearl HW-40s凝胶柱)，并以未经胰蛋白酶消化的茶叶蛋白多肽为对照，比较消化前后茶叶蛋白多肽分子量分布的变化，结果如图10所示。

将所得胃蛋白酶消化后的茶叶蛋白多肽样品，按照实施例5中所叙述的方法分析其对羟自由基、超氧阴离子自由基和DPPH自由基的去除率，并与消化前的样品进行比较，结果如图11、图12及图13所示。

通过图10的峰型对比可以看出，茶叶蛋白多肽体外消化前后各组分的保留时间及峰面积均没有明显的变化，这说明茶叶蛋白多肽不能被胃蛋白酶、胰蛋白酶继续降解。

由图11、图12及图13可以看出，茶叶蛋白多肽经胃蛋白酶体外消化后，其对·OH、超氧阴离子自由基及DPPH三种自由基的清除能力均有提高，再经胰蛋白酶消化后，其对·OH、超氧阴离子自由基及DPPH三种自由基仍然具有很强的清除能力。由此可知，茶叶蛋白多肽具有强的胃蛋白酶和胰蛋白酶抗性，经生物体吸收利用后，其抗氧化活性不会丧失，从而可成为一种很好的多功能保健肽。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。

Claims (4)

1.一种茶叶蛋白多肽，其特征在于，以茶叶蛋白多肽总重量计，分子量在6000Da±100Da的组分占57-64w/w％，分子量在300Da-1000Da的组分占33-39w/w％；氮溶指数NSI为98.5-99.9％；

所述的茶叶蛋白多肽通过下述步骤制备得到：

(1)将原材料和水按料液比1∶4(w/v)混合后使成乳状物；所述的原材料选自下述的一种或多种：茶叶、茶叶深加工废弃物；

(2)将乳状物和复合酶A在40-55℃，pH8-10混合3-6小时；以固形物的总重量计，复合酶A的量为0.5-2w/w％；所述的复合酶A由下述成份构成：以复合酶A的干物的总重量计，其中角蛋白酶65-75w/w％，木瓜蛋白酶10-15w/w％，胰蛋白酶5-10w/w％，碱性蛋白酶5-10w/w％，菠萝蛋白酶0.5-5w/w％；

(3)在5-25℃调节pH1-6使沉淀析出；

(4)过滤除去不溶物得到茶叶蛋白多肽溶液a；

(5)将茶叶蛋白多肽溶液a通过离子交换层析除盐、脱色，得到茶叶蛋白多肽溶液b；和

(6)将茶叶蛋白多肽溶液b浓缩、干燥得到茶叶蛋白多肽粉。

2.如权利要求1所述的茶叶蛋白多肽，其特征在于，所述的茶叶蛋白多肽粉末状固体呈淡黄褐色或淡红褐色；所述的茶叶蛋白多肽在所有pH下都能溶于水，溶液澄清，呈淡黄褐色或淡红褐色；显弱酸性；无异味，无苦味；对热很稳定，100℃煮沸无沉淀析出；在室温下保存3个月含量无明显变化。

3.一种如权利要求1或2任一所述的茶叶蛋白多肽的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括步骤：

(1)将原材料和水按料液比1∶4(w/v)混合后使成乳状物；所述的原材料选自下述的一种或多种：茶叶、茶叶深加工废弃物；

(2)将乳状物和复合酶A在40-55℃，pH8-10混合3-6小时；以固形物的总重量计，复合酶A的量为0.5-2w/w％；所述的复合酶A由下述成份构成：以复合酶A的干物的总重量计，其中角蛋白酶65-75w/w％，木瓜蛋白酶10-15w/w％，胰蛋白酶5-10w/w％，碱性蛋白酶5-10w/w％，菠萝蛋白酶0.5-5w/w％；

(3)在5-25℃调节pH1-6使沉淀析出；

(4)过滤除去不溶物得到茶叶蛋白多肽溶液a； 

(5)将茶叶蛋白多肽溶液a通过离子交换层析除盐、脱色，得到茶叶蛋白多肽溶液b；和

(6)将茶叶蛋白多肽溶液b浓缩、干燥得到茶叶蛋白多肽粉。

4.一种如权利要求1或2任一所述的茶叶蛋白多肽的用途，其特征在于，所述的茶叶蛋白多肽用于制备清除自由基、抗氧化的组合物；或用于制备用于清除亚硝酸根离子的组合物；或用于制备用于抗凝血及溶血的组合物；或用于制备预防和治疗非特异免疫功能低下的疾病的组合物。 

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