CN109022401A

CN109022401A - 一种嗜碱性蛋白酶及其基因工程菌的构建方法

Info

Publication number: CN109022401A
Application number: CN201811069869.6A
Authority: CN
Inventors: 牛丹丹; 谢爱连; 叶秀云
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2018-09-13
Filing date: 2018-09-13
Publication date: 2018-12-18

Abstract

本发明涉及一种嗜碱性蛋白酶及其基因工程菌的构建方法，属于基因工程和酶工程领域。本发明涉及一种来源于地衣芽胞杆菌（Bacilluslicheniformis）的碱性蛋白酶编码基因。其基因序列为序列表中的SEQ ID NO.2。利用该基因构建的重组微生物表达产生的重组碱性蛋白酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1。利用本发明获得的碱性蛋白酶构建重组菌，可实现碱性蛋白酶的高效生产，具有很好的工业应用前景。

Description

一种嗜碱性蛋白酶及其基因工程菌的构建方法

技术领域

本发明涉及一种嗜碱性蛋白酶基因工程菌及其构建方法，属于酶工程和基因工程领域。

背景技术

蛋白酶是水解蛋白质肽键的一类酶的总称。按其反应的最适pH值，分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。按其水解多肽的方式，可以将其分为外肽酶和内肽酶。

在工业酶中，蛋白酶是最重要的酶之一，约占酶总销售量的60%，其中碱性蛋白酶占有将近40%。与其它蛋白酶对比，碱性蛋白酶在酶活力、耐热、耐碱等方面性质都较强，并且具有酯酶的特性。正因这些优势使得碱性蛋白酶在食品加工、制药、洗涤剂领域和皮革工业有广泛的应用，此外，碱性蛋白酶的其它应用包括例如照相工业中的银回收，角蛋白残留物处理，隐形眼镜清洗，生物膜去除和脱胶。

发明内容

本发明的目的是提供一种嗜碱性蛋白酶及其基因工程菌的构建方法。

为实现上述目的，采用以下技术方案：

一种嗜碱性蛋白酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

编码所述嗜碱性蛋白酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述蛋白酶是由地衣芽胞杆菌中分离获得，所述的地衣芽胞杆菌（Bacillus licheniformis）BL236，其已于2018年8月14日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：M2018539，地址为武汉大学。其具体的分离筛选过程以pH 12为筛选条件对富含蛋白质的样本中微生物进行分离培养并发酵后评价其蛋白酶表达水平，鉴定产酶水平最高的分离物所属种属。

本发明的另外一个目的是提供了一种碱性蛋白酶基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：

1）将上述获得的分离物染色体基因组上相关基因进行解析，并克隆表达疑似基因，筛选获得产酶水平最高的目标基因；

2）将嗜碱性蛋白酶基因克隆到重组表达载体；

3) 将重组表达载体转化到宿主细胞中。

所述的重组表达质粒为pHY-WZX、pND-113中的任意一种，其中优选重组表达质粒载体为pND-113。

所述的宿主细胞是细菌，为是大肠杆菌或枯草芽胞杆菌。

所述大肠杆菌主要包括：E.coliJM109、E.coli BL21(DE3)、E.coli DH5α、E.coliJM109(DE3)、E.coliW3110中任意一种。

所述枯草杆菌为WB600。

本发明的优点在于：

利用本发明获得的碱性蛋白酶具有良好的pH稳定性，在37℃、pH12.0的缓冲液中保温1h后还有90%以上的酶活，编码基因构建重组微生物，可实现碱性蛋白酶的高效生产，摇瓶发酵60h后，重组碱性蛋白酶摇瓶发酵活力达到575U/mL，具有很好的工业应用前景。

附图说明

图1重组碱性蛋白酶摇瓶发酵产酶曲线。

图2重组碱性蛋白酶pH稳定性曲线。

图3 重组碱性蛋白酶温度稳定性曲线。

具体实施方式

实施例1：目标分离物的筛选

将蛋白含量较高的样本，包括猪肉，牛肉，羊肉，鸡蛋，牛奶，鱼等在pH为12的缓冲液中浸泡12 h后，采用酪蛋白筛选平板筛选获得透明圈较大的分离物，分离物经复筛发酵培养基发酵筛选并在pH为12条件下测定其蛋白酶活性，结果如表1所示。

筛选培养基：分别称取蛋白胨5g，牛肉膏10g，氯化钠5g，干酪素10g，于烧杯中，加入适量的蒸馏水溶解后，定容至1 L，调节培养基的pH为7.0，然后加入琼脂粉15 g，121℃灭菌20 min。

复筛发酵培养基：分别称取蛋白胨5g，酵母膏1g，氯化钠5.8g，葡萄糖1g，干酪素8g，柠檬酸三钠4.5g于烧杯中，加入适量的蒸馏水溶解后，定容至1 L，调节培养基的pH为7.0，121℃灭菌20 min。

选择活性最高的27号分离物进行菌种鉴定，确定为地衣芽胞杆菌。编号为地衣芽胞杆菌BL236。其已于2018年8月14日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：M2018539。

表1 不同分离物发酵液蛋白酶酶活水平

实施例2：目标基因的获得

解析其基因组中相关推定为蛋白酶编码基因的开放式阅读框，逐一在枯草芽胞杆菌中进行克隆表达(表2)。发酵液在pH为12条件下进行蛋白酶酶活检测，见表2。将酶活最高的aprE基因克隆入pHY-WZX或pND113中实现高效表达。

表2 地衣芽胞杆菌中不同预测蛋白酶基因经异源表达后发酵液蛋白酶酶活水平

实施例3：基因工程菌的构建

1、将PCR扩增得到的碱性蛋白酶基因片段aprE克隆到pND113载体上。

2、将经BamHI酶切后的PCR产物克隆入经BamHI/SmaI双酶切后的质粒pND113中，并转化到大肠杆菌JM109中。挑取若干个转化子，提取重组质粒经酶切及核酸电泳进行验证，获得重组质粒pND-aprE。

3、将阳性克隆子化转枯草芽胞杆菌WB600，利用筛选培养基筛选阳性重组菌WB600(pND-aprE)，并进一步通过限制性酶酶切验证重组质粒的正确性。

实施例4：含碱性蛋白酶基因工程菌的摇瓶发酵

将所述的基因工程菌在LB液体培养基中37℃过夜培养，后接入LB（含有2%的乳糖）发酵培养基中，摇床培养，转速200 rpm，37℃恒温发酵60h后，离心菌体，收集上清液测定酶活力，重组碱性蛋白酶摇瓶发酵酶活力达到575U/mL。重组碱性蛋白酶的产酶曲线见图1。

实施例5：重组碱性蛋白酶在碱性pH条件下的稳定性

将重组碱性蛋白酶按照1:9的方式加入到不同pH值的缓冲液里并在37 ℃恒温水浴下保温60min，取出酶样，调整pH至11，按照国标法（GB/T 23527 －2009蛋白酶制剂）测定方法，在pH11.0和60℃下进行酶活测定。结果表明该重组碱性蛋白酶具有良好的pH稳定性，在37℃、pH12.0下保温1h后还有90%以上的酶活，pH稳定性曲线如图2所示。

实施例6：重组碱性蛋白酶在碱性条件下的温度稳定性

首先将酶样置于不同温度下保温不同时间，每隔10 min取样测定酶活，其相对酶活，以未经水浴处理的酶活为100%，温度稳定性曲线如图3所示。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福州大学

<120> 一种嗜碱性蛋白酶及其基因工程菌的构建方法

<130> 2

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 350

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Ala Gln Pro Ala Lys Asn Val Glu Lys Asp Tyr Ile Val Gly Phe Lys

1 5 10 15

Ser Gly Val Lys Thr Ala Ser Val Lys Lys Asp Ile Ile Lys Glu Ser

20 25 30

Gly Gly Lys Val Asp Lys Gln Phe Arg Ile Ile Asn Ala Ala Lys Ala

35 40 45

Lys Leu Asp Lys Glu Ala Leu Lys Glu Val Lys Asn Asp Pro Asp Val

50 55 60

Ala Tyr Val Glu Glu Asp His Val Ala His Ala Leu Ala Gln Thr Val

65 70 75 80

Pro Tyr Gly Ile Pro Leu Ile Lys Ala Asp Lys Val Gln Ala Gln Gly

85 90 95

Phe Lys Gly Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr Gly Ile Gln

100 105 110

Ala Ser His Pro Asp Leu Asn Val Val Gly Gly Ala Ser Phe Val Ala

115 120 125

Gly Glu Ala Tyr Asn Thr Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His Val Ala

130 135 140

Gly Thr Val Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Gly Val Leu Gly Val Ala

145 150 155 160

Pro Ser Val Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asn Ser Ser Gly Ser

165 170 175

Gly Ser Tyr Ser Gly Ile Val Ser Gly Ile Glu Trp Ala Thr Thr Asn

180 185 190

Gly Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Ala Ser Gly Ser Thr

195 200 205

Ala Met Lys Gln Ala Val Asp Asn Ala Tyr Ala Arg Gly Val Val Val

210 215 220

Val Ala Ala Ala Gly Asn Ser Gly Ser Ser Gly Asn Thr Asn Thr Ile

225 230 235 240

Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr Asp Ser Val Ile Ala Val Gly Ala Val Asp

245 250 255

Ser Asn Ser Asn Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly Ala Glu Leu Glu

260 265 270

Val Met Ala Pro Gly Ala Gly Val Tyr Ser Thr Tyr Pro Thr Asn Thr

275 280 285

Tyr Ala Thr Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly

290 295 300

Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn Leu Ser Ala Ser Gln

305 310 315 320

Val Arg Asn Arg Leu Ser Ser Thr Ala Thr Tyr Leu Gly Ser Ser Phe

325 330 335

Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Glu Ala Ala Ala Gln

340 345 350

<210> 2

<211> 1053

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gctcagccgg cgaaaaatgt tgaaaaggat tatattgtcg gatttaagtc aggagtgaaa 60

accgcatctg tcaaaaagga catcatcaaa gagagcggcg gaaaagtgga caagcagttt 120

agaatcatca acgcggcaaa agcgaagcta gacaaagaag cgcttaagga agtcaaaaat 180

gatccggatg tcgcttatgt ggaagaggat catgtggccc atgccttggc gcaaaccgtt 240

ccttacggca ttcctctcat taaagcggac aaagtgcagg ctcaaggctt taagggagcg 300

aatgtaaaag tagccgtcct ggatacagga atccaagctt ctcatccgga cttgaacgta 360

gtcggcggag caagctttgt ggctggcgaa gcttataaca ccgacggcaa cggacacggc 420

acacatgttg ccggtacagt agctgcgctt gacaatacaa cgggtgtatt aggcgttgcg 480

ccaagcgtat ccttgtacgc ggttaaagta ctgaattcaa gcggaagcgg atcatacagc 540

ggcattgtaa gcggaatcga gtgggcgaca acaaacggca tggatgttat caatatgagc 600

cttgggggag catcaggctc gacagcgatg aaacaggcag tcgacaatgc atatgcaaga 660

ggggttgtcg ttgtagctgc agcagggaac agcggatctt caggaaacac gaatacaatt 720

ggctatcctg cgaaatacga ttctgtcatc gctgttggcg cggtagactc taacagcaac 780

agagcttcat tttccagtgt gggagcagag cttgaagtca tggctcctgg cgcaggcgta 840

tacagcactt acccaacgaa cacttatgca acattgaacg gaacgtcaat ggcttctcct 900

catgtagcgg gagcagcagc tttgatcttg tcaaaacatc cgaacctttc agcttcacaa 960

gtccgcaacc gtctctccag cacggcgact tatttgggaa gctccttcta ctatgggaaa 1020

ggtctgatca atgtcgaagc tgccgctcaa taa 1053

Claims

1.一种嗜碱性蛋白酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述嗜碱性蛋白酶基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的一种嗜碱性蛋白酶，其特征在于：所述蛋白酶是由地衣芽胞杆菌中分离获得，所述的地衣芽胞杆菌（Bacillus licheniformis）BL236，其已于2018年8月14日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：M2018539。

4.含有权利要求1所述嗜碱性蛋白酶的基因工程菌。

5.权利要求4所述基因工程菌的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：

1) 将嗜碱性蛋白酶基因克隆到重组表达载体；

2) 将重组表达载体转化到宿主细胞中。

6.根据权利要求5所述构建方法，其特征在于：所述重组表达质粒载体为pHY-WZX、pND-113中的任意一种。

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于：所述重组表达载体为pND113。

8.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：所述的宿主细胞包括：大肠杆菌或枯草杆菌。

9. 根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：所述细菌是大肠杆菌，包括E.coliJM109、E.coli DH5α。

10.如权利要求4所述碱性蛋白酶的基因工程菌的发酵生产方法，其特征在于：37℃，200rpm，摇瓶发酵60小时后，重组碱性蛋白酶摇瓶发酵酶活达到575U/mL。