CN110218735B

CN110218735B - 一种固定在枯草芽孢杆菌表面的重组乙酰胆碱酯酶

Info

Publication number: CN110218735B
Application number: CN201910437304.7A
Authority: CN
Inventors: 吕绍武; 王利武; 葛丹阳; 姜蒙蒙
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2019-05-23
Filing date: 2019-05-23
Publication date: 2022-05-10
Anticipated expiration: 2039-05-23
Also published as: CN110218735A

Abstract

本发明涉及一种固定在枯草芽孢杆菌表面的重组乙酰胆碱酯酶，属于分子生物学领域。设计筛选出突变位点并进行定点突变，然后以枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白Cot作为芽孢表面展示外源蛋白的一种蛋白载体，通过芽孢表面展示技术构建表面展示一种新型乙酰胆碱酯酶蛋白的重组芽孢。本发明通过分子对接及分子动力学模拟等技术，对黑腹果蝇乙酰胆碱酯酶基因进行定向化改造，突变后的AChE热稳定性显著增加，并将其固定在枯草芽孢杆菌芽孢表面，可一步完成酶的表达、纯化和固定化，操作过程简捷高效，利用枯草芽孢杆菌芽孢提高了重组AChE的稳定性，且枯草芽孢杆菌属于益生菌，对人体和环境不会造成影响，对提高其利用效率具有重要的意义。

Description

一种固定在枯草芽孢杆菌表面的重组乙酰胆碱酯酶

技术领域

本发明属于分子生物学领域，尤其涉及黑腹果蝇乙酰胆碱酯酶的定点突变和枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白Cot的应用。

背景技术

有机磷农药具有高效、广谱、对植物安全、价格低廉等特点，在我国被大量使用，直至21世纪初期，有机磷农药化学品几乎占到中国农药市场的70％。有机磷农药能够和乙酰胆碱酯酶(AChE)不可逆的结合，被世界卫生组织认定为对脊椎动物最具危险的杀虫剂之一，它广泛存在于环境中，并通过大气、水体、食物和生物富集等方式作用于人类。长期接触或食用含有有机磷农药残留物的物质，会造成慢性中毒，如神经系统失调、脏器毒性、癌症、出生缺陷、生殖毒性等。

在2010年至2018年之间，我国已经发生多起因误食有机磷农药残留超标的蔬菜引发的食物中毒事件，因此，对果蔬中的有机磷农药残留检测具有重要意义。国家标准中现行有效的测定各种食物中有机磷农药残留的方法是气相色谱法(GB 23200.93-2016等)、气相色谱-质谱连用法(GB 23200.97-2016等)以及快速检测的酶抑制法(GB/T18630-2002等)。其中气相色谱法和气相色谱-质谱连用法存在着分析周期长、分析过程繁琐、仪器价格昂贵、需要专业的操作人员等问题，不能应用于日常生活中，缺陷十分明显。酶抑制法是依据有机磷农药可特异性地不可逆抑制动物神经系统中AChE的活性，根据AChE活性受到抑制的情况，可判断出样品中是否含有超量的有机磷农药，酶抑制法主要包括速测卡和试剂盒两种。酶抑制法具有检测快速、设备和试剂简单、成本低等特点，适合水果蔬菜上市前农药残留毒性的检测，受到基层疾病预防控制机构的普遍欢迎。

不同来源的AChE对有机磷类农药的灵敏度不同，昆虫体内AChE对有机磷农药的敏感性要高于其他生物，Schulze,H等对来自不同生物体的AChE对8种有机磷农药的双分子速率常数进行测定，来自果蝇的AChE的数值普遍大于其他来源的酶2-10倍，因此具有与农药更高的亲和力。但果蝇体积小，很难取头部提取AChE，无法满足市场的需要。家蝇和果蝇都是嗜温生物，其头部的酶不具有较好的热稳定性，在使用和运输的过程中容易受到反应环境、温度等因素的影响，降低了其准确性和重复性，这也制约了速测卡法测量的可靠性。

芽孢展示技术是一种新兴的生物固定化技术，可以把外源蛋白和芽孢衣壳蛋白融合在一起并组装成芽孢最外层的衣壳。即通过和芽孢衣壳蛋白共表达，最终把外源蛋白固定在芽孢表面，实现了使外源蛋白不需通过跨膜运输就能定位在芽孢表面。使外源蛋白具有更高的稳定性，这种稳定性包括对温度、pH值和有机试剂的耐受性。

对于果蝇乙酰胆碱酯酶获取困难问题，论文“重组黑腹果蝇乙酰胆碱酯酶在甲醇酵母中表达的改善和基于此的新型农药残留快速检测传感器的改进”对黑腹果蝇乙酰胆碱酯酶进行密码子优化，以毕赤酵母作为宿主进行外源表达，成功得到了能够在培养液中表达718U/mL的酵母菌株，并应用于传感器当中。对一些农药检测灵敏度显著提高，如敌敌畏的检测限为0.04μg/L；克百威的检测限为0.1μg/L，远高于分光光度法的检测限10μg/L，但是其温度稳定性没有得到改善，在40℃时仅仅放置15min后就会导致13％的活性损失，30min后会导致20％的活性损失。

AChE是一种常温酶，反应环境、温度会对其酶活性造成一定的影响。郑言波探究了环境温度、反应温度、检测温度对AChE检测甲胺磷农药的影响，结果表明当环境温度过高(大于40℃)，导致酶的活性下降，因而甲胺磷的抑制率下降；反应温度在36＝40℃之间可以有较高的抑制率，超过40℃后，抑制率从14下降到10％；空白条件下检测温度不恒温的RSD值是恒温的2.5倍，1.9mg/L浓度下是1.31倍。AChE酶活性受温度影响较大，制约了其在有机磷农药快速检测中的应用。解决这一问题的方法是利用包被剂和载体来提高酶的耐热性，但这无疑会增加酶制剂的生产成本，而且采用包被处理酶制剂会严重影响其生物利用率。

发明内容

本发明提供一种固定在枯草芽孢杆菌表面的重组乙酰胆碱酯酶，以解决目前存在的乙酰胆碱酯酶AChE稳定性较差的问题。

本发明采取的技术方案是，是由下列步骤得到的：

(1)黑腹果蝇乙酰胆碱酯酶基因DMache获得：由化学合成法合成DMache，如SEQ IDNo.1所示；

引物设计F、R：

F：5'-AGCTTCTAGAATGGCCATCTCCTGTCGGCAGAGCAGAGT

R：5'-ATTACCCGGGTTATGGTGGTGGTGGTGGTGGGAAAACCCTT

以合成的DMache为模板，用上述引物扩增目的基因；PCR反应体系及反应条件如下：

(2)突变体构建：

设计以下引物，使用重叠延伸PCR获得突变体：

1-F：AGCTTCTAGAGCCATCTCCTGTCGGCAGAGCAGAGT

1-R：AGATCTCCTCGCCGGAGAAGGGGGGGAAGTACTCGTAACGCTCTTGGA

2-F：TCCAAGAGCGTTACGAGTACTTCCCCCCCTTCTCCGGCGAGGAGATCT

2-R：CTCGCGTTCCGCTTGCGTTGCCTTGGGAAAAATATTGTTC

3-F：GAACAATATTTTTCCCAAGGCAACGCAAGCGGAACGCGAG

3-R：ATCCATTCGGGCCACAATGAGGTGCTTGTGCGGTGTGTAAA

4-F：TTTACACACCGCACAAGCACCTCATTGTGGCCCGAATGGAT

4-R：ATTACCCGGGTTATGGTGGTGGTGGTGGTGGGAAAACCCTT

第一轮PCR：用引物1-F和1-R扩增出片段1、引物2-F、2-R扩增出片段2、引物3-F、3-R扩增出片段3、引物4-F、4-R扩增出片段4；

PCR体系：

PCR条件：

第二轮PCR：以1-F、2-R为引物将片段1和片段2连接，以3-F、4-R为引物将片段3和片段4连接，最后再以1-F、4-R为引物将两个片段连接到一起，使用片段纯化试剂盒将上述PCR产物纯化，获得突变体，如SEQ ID No.2所示；

PCR体系：

PCR条件同第一轮；

(3)表面展示载体的构建及转化

(i)芽孢衣壳蛋白基因的获得：

设计如下三组引物：

Cot b-F：5'-CGCGGATCCACGGATTAGGCCGTTTGTCCTCATGGACCCGT

Cot b-R：

5'-GATCTCTAGAAGGAGGTGGAAAACGACGAAGAGGAGGTGGGGATGATTGATC AT

Cot g-F：5'-CGCGGATCCAGTGTCCCTAGCTCCGAGAAAAAATCCAG

Cot g-R：

5'-GATCTCTAGAAGGAGGTGGAAAACGACGAAGAGGAGGTGGTTTGTATTTCTT TT

Cot z-F：5'-CGCGGATCCGACTGTGACCATCCGTTAGATGACAAAGATAAAG

Cot z-R：

5'-GATCTCTAGAAGGAGGTGGAAAACGACGAAGAGGAGGTGGCCATTGTGATGA T

使用细菌基因组提取试剂盒提取野生型枯草芽孢杆菌168DNA，以此为模板，扩增三种芽孢衣壳蛋白基因，PCR反应体系如下：

反应条件如下：

(ii)将上述三种芽孢衣壳蛋白基因与载体pHT43质粒分别用限制性内切酶BamH I和Sma I进行双酶切，纯化后的各片段和pHT43分别连接构建表达载体，分别转化至大肠杆菌中，在含有氨苄青霉素的平板筛选阳性转化子，分别提取质粒，分别用限制性内切酶XbaI和Sma I进行双酶切，分别与用限制性内切酶Xba I和Sma I进行双酶切的突变体连接后，分别转化至大肠杆菌DH5α中，在含有氨苄青霉素的平板筛选阳性转化子，分别提取表面展示质粒备用；

(iii)挑取WB800N单菌落接种于25mL GM I培养基中，30℃、180rpm过夜培养，将过夜培养的菌液按10％接种量接种于25mL新鲜的GM I中，在37℃、200rpm恒温震荡培养3.5h，按5％接种量接种于5mL GM II中，37℃、150rpm震荡培养90min，吸取1mL培养物，5000rpm室温离心5min，1/10体积上清液冲悬菌体，加入5μL表面展示质粒，混匀，37℃水浴1h，37℃培养4小时，涂在含有氯霉素抗性的平板上，37℃过夜培养；

(4)枯草芽孢杆菌的孢子化

在超净台内取50mL DSM培养基装入空锥形瓶内，加入0.5mL步骤(3)培养的菌液，37℃，180rpm培养72h，8000rpm离心10min收集沉淀。

本发明通过设计筛选出突变位点并进行定点突变，然后以枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白Cot作为芽孢表面展示外源蛋白的一种蛋白载体，通过芽孢表面展示技术构建表面展示一种新型乙酰胆碱酯酶蛋白的重组芽孢。

本发明通过分子对接及分子动力学模拟等技术，对黑腹果蝇乙酰胆碱酯酶基因进行定向化改造，突变后的AChE热稳定性显著增加，并将其固定在枯草芽孢杆菌芽孢表面，可一步完成酶的表达、纯化和固定化，操作过程简捷高效，此外，利用枯草芽孢杆菌芽孢稳定易于分离和抗逆性的特点，简便了后续分离过程，提高了重组AChE的稳定性，且枯草芽孢杆菌属于益生菌，对人体和环境不会造成影响。本发明通过定点突变改变了野生型AChE的76/402/473位点，将甘氨酸替换为脯氨酸，提高了其温度耐受性和pH耐受性，在70℃高温条件下和pH＝4的条件下相对酶活力提高约1倍；在芽孢表面展示后，这两种性质得到大幅提高约为野生型AChE的4倍，对提高其利用效率具有重要的意义。

附图说明

图1是本发明实验例1表达蛋白的western blot检测图，图中，1：蛋白marker；2：AChE；3：突变体；

图2是本发明实验例2孢子免疫荧光图，图中：

A：pHT43-WB800N孢子；

B：pHT43-cotB-ache-WB800N孢子；

C：pHT43-cotC-ache-WB800N孢子；

D：pHT43-cotG-ache-WB800N孢子；

E：pHT43-cotX-ache-WB800N孢子；

F：pHT43-cotY-ache-WB800N孢子；

G：pHT43-cotZ-ache-WB800N孢子；

图3是本发明实验例3不同温度对DmAChE相对酶活性的影响图；

图4是本发明实验例3不同pH对DmAChE相对酶活性的影响图；

图5是本发明实验例3在不同温度下DmAChE反应时间对相对酶活性的影响图，A：反应温度为30℃；B：反应温度为50℃；C：反应温度为70℃；

图6是本发明实验例3在不同pH条件下DmAChE反应时间对相对酶活性的影响图，A：pH值为4；B：pH值为7；C：pH值为9。

具体实施方式

是由下列步骤得到的：

引物设计F、R：

F：5'-AGCTTCTAGAATGGCCATCTCCTGTCGGCAGAGCAGAGT

R：5'-ATTACCCGGGTTATGGTGGTGGTGGTGGTGGGAAAACCCTT

(2)突变体构建：

选取了loop环区域的G76、G402以及G473位的氨基酸位点进行了定点突变,采用重叠延伸PCR方法将甘氨酸突变为脯氨酸；

设计以下引物，使用重叠延伸PCR获得突变体：

1-F：AGCTTCTAGAGCCATCTCCTGTCGGCAGAGCAGAGT

1-R：AGATCTCCTCGCCGGAGAAGGGGGGGAAGTACTCGTAACGCTCTTGGA

2-F：TCCAAGAGCGTTACGAGTACTTCCCCCCCTTCTCCGGCGAGGAGATCT

2-R：CTCGCGTTCCGCTTGCGTTGCCTTGGGAAAAATATTGTTC

3-F：GAACAATATTTTTCCCAAGGCAACGCAAGCGGAACGCGAG

3-R：ATCCATTCGGGCCACAATGAGGTGCTTGTGCGGTGTGTAAA

4-F：TTTACACACCGCACAAGCACCTCATTGTGGCCCGAATGGAT

4-R：ATTACCCGGGTTATGGTGGTGGTGGTGGTGGGAAAACCCTT

PCR体系：

PCR条件：

PCR体系：

PCR条件同第一轮；

(3)表面展示载体的构建及转化

(i)芽孢衣壳蛋白基因的获得：

设计如下三组引物：

Cot b-F：5'-CGCGGATCCACGGATTAGGCCGTTTGTCCTCATGGACCCGT

Cot b-R：

5'-GATCTCTAGAAGGAGGTGGAAAACGACGAAGAGGAGGTGGGGATGATTGATC AT

Cot g-F：5'-CGCGGATCCAGTGTCCCTAGCTCCGAGAAAAAATCCAG

Cot g-R：

5'-GATCTCTAGAAGGAGGTGGAAAACGACGAAGAGGAGGTGGTTTGTATTTCTT TT

Cot z-F：5'-CGCGGATCCGACTGTGACCATCCGTTAGATGACAAAGATAAAG

Cot z-R：

5'-GATCTCTAGAAGGAGGTGGAAAACGACGAAGAGGAGGTGGCCATTGTGATGA T

反应条件如下：

(4)枯草芽孢杆菌的孢子化

在超净台内取50mL DSM培养基装入空锥形瓶内，加入0.5mL步骤(3)培养的菌液，37℃，180rpm培养72h，8000rpm离心10min收集沉淀；

使用PBS缓冲液冲悬即为孢子悬液。

下边通过具体实验例来进一步说明本发明。

实验例1、野生型AChE和突变体在枯草芽孢杆菌WB800N中的表达

(1)DMache和突变体分别与载体pHT43质粒用限制性内切酶Xba I和Sma I进行双酶切，分别纯化后的片段和pHT43连接构建表达载体，转化至大肠杆菌中，在含有氨苄青霉素的平板筛选阳性转化子，分别提取质粒，分别使用两步法转化到枯草芽孢杆菌WB800N中，得到野生型DMache及突变体的枯草芽孢杆菌表达菌株；

(2)取1mL含有野生型DMache及突变体DMache的枯草芽孢杆菌菌液接种到含有氯霉素的50mL LB培养基中，37℃、180rpm摇床培养，培养至OD600值达到0.8以上时，加入0.5mL IPTG(1M)，37℃、180rpm培养24h；

(3)取出发酵液，置于50k分子量的透析袋内，用PEG20000进行浓缩，镍柱纯化蛋白，将收集到的蛋白进行真空冷冻干燥，称量质量，溶于100倍体积的0.1M磷酸盐缓冲液(pH＝8.0)即为酶液；

(4)取酶液进行SDS-PAGE实验，western blot验证所得酶液是否为AChE，参见图1。

实验例2、6种芽孢衣壳蛋白表面展示突变体的比较

(1)芽孢衣壳蛋白基因的获得

设计如下引物：

Cot b-F：5'-CGCGGATCCACGGATTAGGCCGTTTGTCCTCATGGACCCGT

Cot b-R：

5'-GATCTCTAGAAGGAGGTGGAAAACGACGAAGAGGAGGTGGGGATGATTGAT CAT

Cot c-F：5'-CGCGGATCCTGTAGGATAAATCGTTTGGGCCGATGAAAAAT

Cot c-R：

5'-GATCTCTAGAAGGAGGTGGAAAACGACGAAGAGGAGGTGGGTAGTGTTTTT TAT

Cot g-F：5'-CGCGGATCCAGTGTCCCTAGCTCCGAGAAAAAATCCAG

Cot g-R：

5'-GATCTCTAGAAGGAGGTGGAAAACGACGAAGAGGAGGTGGTTTGTATTTCT TTT

Cot x-F：5'-CGCGGATCCTTACTTTGTCTGCCGACGAGATAATAACCTTT

Cot x-R：

5'-GATCTCTAGAAGGAGGTGGAAAACGACGAAGAGGAGGTGGGAGGACAAGA GTG

Cot y-F：5'-CGCGGATCCAGTTATCACTCTTGTCCTCTAGGACCTAAAAG

Cot y-R：

5'-GATCTCTAGAAGGAGGTGGAAAACGACGAAGAGGAGGTGGATGATGATGTG TACGATT

Cot z-F：5'-CGCGGATCCGACTGTGACCATCCGTTAGATGACAAAGATAAAG

Cot z-R：

5'-GATCTCTAGAAGGAGGTGGAAAACGACGAAGAGGAGGTGGCCATTGTGATG AT

使用细菌基因组提取试剂盒提取野生型枯草芽孢杆菌168DNA，以此为模板，扩增六种芽孢衣壳蛋白基因；PCR反应体系及反应条件如下：

(2)将6种芽孢衣壳蛋白基因与与载体pHT43质粒分别用限制性内切酶BamH I和Sma I进行双酶切，纯化后的片段和pHT43连接构建表达载体，转化至大肠杆菌中，在含有氨苄青霉素的平板筛选阳性转化子；提取质粒，用限制性内切酶Xba I和Sma I进行双酶切，与DMache和突变体连接，转化至大肠杆菌DH5α中，在含有氨苄青霉素的平板筛选阳性转化子，提取质粒备用；

挑取WB800N单菌落接种于25mL GM I培养基中，30℃、180rpm过夜培养，将过夜培养的菌液按10％接种量接种于25mL新鲜的GM I中，在37℃、200rpm恒温震荡培养3.5h，按5％接种量接种于5mL GM II中，37℃、150rpm震荡培养90min，吸取1mL培养物，5000rpm室温离心5min，1/10体积上清液冲悬菌体，加入5μL质粒，混匀，37℃水浴1h，37℃培养4小时，涂在含有氯霉素抗性的平板上，37℃过夜培养；

(3)枯草芽孢杆菌的孢子化及免疫荧光检测

在超净台内取50mL DSM培养基装入空锥形瓶内，加入0.5mL培养的菌液，37℃，180rpm培养72h，8000rpm离心10min收集沉淀，使用PBS缓冲液冲悬即为孢子悬液；

将显微镜载玻片在磷酸盐缓冲盐水(pH7.4)中洗涤三次，在室温下用含3％脱脂牛奶的PBS封闭30分钟，然后用PBS洗涤5次备用；将六种芽孢在4℃下与多克隆抗His×6抗体孵育过夜，洗涤10次；然后与抗小鼠IgG-FITC在室温下孵育2小时，洗涤10次后，将盖玻片安装到显微镜载玻片上，并使用荧光显微镜观察。荧光强度越高，说明表面展示的突变体量越多，图2结果表明黑腹果蝇乙酰胆碱酯酶与CotB、CotG、CotZ衣壳蛋白连接后，在芽孢表面展示的效果较好，选用这三种为分子载体所构建的芽孢进行后续酶活性测定，参见图2。

实验例3.野生型AChE、突变体及表面展示突变体稳定性检测

(1)热稳定性检测。

(i)在试管中先后加入5mL 0.1mol/L pH7.5磷酸盐缓冲液和100μL野生型酶液、突变体酶液、孢子悬液，混匀后于分别于20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃水浴保温15min，然后加入100μL DTNB、50μL碘化硫代乙酰胆碱(ATCHI)，混匀后立即在412nm比色，在3min内每隔30s连续测定吸光度值，记3min前后的吸光度变化值△A，以在酶活力最高值为100％，分别计算其他组残留的相对酶活力，每组样品包括3个平行样品。

(ii)在试管中先后加入5mL 0.1mol/L pH7.5磷酸盐缓冲液和100μL野生型酶液、突变体酶液、孢子悬液，混匀后于分别于30℃、50℃、70℃水浴保温15min、30min、1h、2h，然后加入100μL DTNB、50μL碘化硫代乙酰胆碱(ATCHI)，混匀后立即在412nm比色，在3min内每隔30s连续测定吸光度值，记3min前后的吸光度变化值△A，以在酶活力最高值为100％，分别计算其他组残留的相对酶活力，每组样品包括3个平行样品。

(2)pH稳定性检测。

(iii)在试管中先分别加入5mL pH为4.0-6.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、pH为6.0-8.0的磷酸钠缓冲液，pH为8.0-9.0的Tris-HCl缓冲液，在加入100μL野生型酶液、突变体酶液、孢子悬液，混匀后于25℃水浴保温15min，然后加入100μL DTNB、50μL碘化硫代乙酰胆碱(ATCHI)，混匀后立即在412nm比色，在3min内每隔30s连续测定吸光度值，记3min前后的吸光度变化值△A。以酶活力最高值为100％，分别计算其他组残留的相对酶活力，每组样品包括3个平行样品。

(iv)在试管中先分别加入5mL pH为4.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、pH为7.0的磷酸钠缓冲液，pH为9.0的Tris-HCl缓冲液，在加入100μL野生型酶液、突变体酶液、孢子悬液，混匀后于25℃水浴保温15min、30min、1h、2h，然后加入100μL DTNB、50μL碘化硫代乙酰胆碱(ATCHI)，混匀后立即在412nm比色，在3min内每隔30s连续测定吸光度值，记3min前后的吸光度变化值△A。以酶活力最高值为100％，分别计算其他组残留的相对酶活力，每组样品包括3个平行样品，见图3、图4、图5和图6；

图3结果表明，在反应温度超过40℃后，野生型AChE酶活性下降趋势明显，在经过70℃水浴后，相对酶活性仅剩余20％左右，而突变体相对酶活性仍然保留了40％左右，三种融合蛋白相对酶活性都在50％以上。

图4结果表明，野生型AChE只有在pH值为7-8的范围下才能保持良好的酶活性，超过此范围相对酶活性有了明显的下降，在pH＝4的条件下相对酶活性不到20％。突变体的pH耐受性有了明显提高，在pH＝4的条件下，仍能够保持约50％的酶活性；三种融合蛋白相对酶活性能保持在60％。

图5结果表明，在50℃和70℃的高温下，在经过2h的反应后，野生型AChE相对酶活性分别为15％和0％；突变体相对酶活性为50％和20％；三种融合蛋白相对酶活性都在70％和40％以上。

图6结果表明，在pH＝7的条件下，在经过2h的反应后，野生型AChE相对酶活性在70％以上，突变体相对酶活性在85％以上，与三种融合蛋白相对酶活性相差不大。在pH＝4和pH＝9的条件下，野生型AChE酶活性损失较多，相对酶活性为10％和60％，突变体相对酶活性为25％和70％，三种融合蛋白相对酶活性都在50％和80％以上。

序列表

<110> 吉林大学

<120> 一种固定在枯草芽孢杆菌表面的重组乙酰胆碱酯酶

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1950

<212> DNA

<213> 黑腹果蝇(黑腹果蝇)

<400> 1

atggccatct cctgtcggca gagcagagtc ctgcccatgt ccttgcccct gcctctgacc 60

atcccgctgc ccctggtgct ggtgctatca ctgcacctgt ccggcgtctg cggcgtcatc 120

gatcgcctgg tcgtgcagac atcctccgga cctgtacgcg gtcgctccgt gacggtgcag 180

ggcagggagg tgcatgtcta cacgggcatc ccctacgcca agccgcccgt cgaggacctg 240

cgcttccgaa agccggttcc cgcggagcca tggcacggcg tcctcgacgc cacgcggtta 300

tccgccacct gcgtccaaga gcgttacgag tacttccccg gcttctccgg cgaggagatc 360

tggaacccca acaccaacgt gtccgaggac tgcctctaca taaatgtctg ggcgccggca 420

aaggcccgac ttcgccatgg gcggggtgcc aacgggggtg agcaccccaa tggcaaacag 480

gcggacactg accatctcat ccacaacgga aatccgcaga acacgaccaa cggactgccg 540

attctgatct ggatctatgg cggtggcttc atgaccggat cggccaccct ggacatctac 600

aatgcggata tcatggccgc cgtgggcaat gtaatagtgg cctccttcca gtatcgggtg 660

ggagcctttg ggttcttgca cctggcgccg gaaatgccgt cggaattcgc ggaagaggcg 720

cccggcaatg tgggcctatg ggatcaggca ctcgccattc gctggctgaa ggacaacgct 780

catgccttcg gcggaaatcc ggagtggatg acactgttcg gagagtcggc tggatccagt 840

tcggtgaatg cccagctcat gtcgccggtg acgaggggtc tggtcaagcg cggaatgatg 900

cagtcgggca ctatgaacgc cccctggagc cacatgacct ccgagaaggc cgtggagatc 960

ggcaaggcgc tgatcaacga ctgcaactgc aatgcatcta tgctgaagac caatcccgct 1020

cacgtgatga gctgcatgcg ttccgtggac gccaagacca tatcggtgca gcagtggaac 1080

tcctactcgg gcatcctcag ctttccctcg gcgcccacca ttgatggtgc gttcctgccg 1140

gcggatccca tgacgctgat gaagacggcg gatctgaagg actacgacat cctgatggga 1200

aatgtcaggg atgagggcac ttacttcttg ctgtacgatt tcatcgatta cttcgataag 1260

gacgatgcca cggccctgcc acgggacaaa tacctggaaa ttatgaacaa tatttttggc 1320

aaggcaacgc aagcggaacg cgaggccatc attttccagt ataccagttg ggaaggcaat 1380

cctggctatc agaaccagca gcaaatcgga cgcgccgtgg gcgatcactt cttcacctgc 1440

cccaccaacg agtatgccca ggctctggcg gagcgaggcg cttccgtgca ctactactac 1500

tttacacacc gcacaagcac ctcattgtgg ggcgaatgga tgggcgtgct gcacggcgat 1560

gagatcgaat acttctttgg ccagccgctg aacaactccc tgcagtatcg acctgtggag 1620

cgtgagctgg gcaagcgtat gctcagtgcg gtcatcgagt ttgctaagac gggaaatccc 1680

gctcaggatg gcgaggagtg gcccaacttc tccaaggagg atcccgtcta ctatattttc 1740

agcaccgacg ataagatcga gaaattggcc aggggtcctt tggcggctcg ctgctcgttc 1800

tggaatgatt acttgccaaa agtcaggagt tgggcaggta cttgcgatgg cgattcggga 1860

agtgcttcca tatccccgag gctccagctc cttggaatcg ctgctctgat ctacatctgc 1920

gccgcattgc gaaccaaaag ggttttctaa 1950

<210> 2

<211> 1950

<212> DNA

<213> 人工合成(人工合成)

<400> 2

atggccatct cctgtcggca gagcagagtc ctgcccatgt ccttgcccct gcctctgacc 60

atcccgctgc ccctggtgct ggtgctatca ctgcacctgt ccggcgtctg cggcgtcatc 120

gatcgcctgg tcgtgcagac atcctccgga cctgtacgcg gtcgctccgt gacggtgcag 180

ggcagggagg tgcatgtcta cacgggcatc ccctacgcca agccgcccgt cgaggacctg 240

cgcttccgaa agccggttcc cgcggagcca tggcacggcg tcctcgacgc cacgcggtta 300

tccgccacct gcgtccaaga gcgttacgag tacttccccc ccttctccgg cgaggagatc 360

tggaacccca acaccaacgt gtccgaggac tgcctctaca taaatgtctg ggcgccggca 420

aaggcccgac ttcgccatgg gcggggtgcc aacgggggtg agcaccccaa tggcaaacag 480

gcggacactg accatctcat ccacaacgga aatccgcaga acacgaccaa cggactgccg 540

attctgatct ggatctatgg cggtggcttc atgaccggat cggccaccct ggacatctac 600

aatgcggata tcatggccgc cgtgggcaat gtaatagtgg cctccttcca gtatcgggtg 660

ggagcctttg ggttcttgca cctggcgccg gaaatgccgt cggaattcgc ggaagaggcg 720

cccggcaatg tgggcctatg ggatcaggca ctcgccattc gctggctgaa ggacaacgct 780

catgccttcg gcggaaatcc ggagtggatg acactgttcg gagagtcggc tggatccagt 840

tcggtgaatg cccagctcat gtcgccggtg acgaggggtc tggtcaagcg cggaatgatg 900

cagtcgggca ctatgaacgc cccctggagc cacatgacct ccgagaaggc cgtggagatc 960

ggcaaggcgc tgatcaacga ctgcaactgc aatgcatcta tgctgaagac caatcccgct 1020

cacgtgatga gctgcatgcg ttccgtggac gccaagacca tatcggtgca gcagtggaac 1080

tcctactcgg gcatcctcag ctttccctcg gcgcccacca ttgatggtgc gttcctgccg 1140

gcggatccca tgacgctgat gaagacggcg gatctgaagg actacgacat cctgatggga 1200

aatgtcaggg atgagggcac ttacttcttg ctgtacgatt tcatcgatta cttcgataag 1260

gacgatgcca cggccctgcc acgggacaaa tacctggaaa ttatgaacaa tatttttccc 1320

aaggcaacgc aagcggaacg cgaggccatc attttccagt ataccagttg ggaaggcaat 1380

cctggctatc agaaccagca gcaaatcgga cgcgccgtgg gcgatcactt cttcacctgc 1440

cccaccaacg agtatgccca ggctctggcg gagcgaggcg cttccgtgca ctactactac 1500

tttacacacc gcacaagcac ctcattgtgg cccgaatgga tgggcgtgct gcacggcgat 1560

gagatcgaat acttctttgg ccagccgctg aacaactccc tgcagtatcg acctgtggag 1620

cgtgagctgg gcaagcgtat gctcagtgcg gtcatcgagt ttgctaagac gggaaatccc 1680

gctcaggatg gcgaggagtg gcccaacttc tccaaggagg atcccgtcta ctatattttc 1740

agcaccgacg ataagatcga gaaattggcc aggggtcctt tggcggctcg ctgctcgttc 1800

tggaatgatt acttgccaaa agtcaggagt tgggcaggta cttgcgatgg cgattcggga 1860

agtgcttcca tatccccgag gctccagctc cttggaatcg ctgctctgat ctacatctgc 1920

gccgcattgc gaaccaaaag ggttttctaa 1950

Claims

1.一种表面展示有重组乙酰胆碱酯酶的枯草芽孢杆菌，其特征在于，是由下列步骤得到的：

引物设计F、R：

F：5'-AGCTTCTAGAATGGCCATCTCCTGTCGGCAGAGCAGAGT

R：5'-ATTACCCGGGTTATGGTGGTGGTGGTGGTGGGAAAACCCTT

以合成的DMache为模板，用上述引物扩增目的基因；

(2)突变体构建：

设计以下引物，使用重叠延伸PCR获得突变体：

1-F：AGCTTCTAGAGCCATCTCCTGTCGGCAGAGCAGAGT

1-R：AGATCTCCTCGCCGGAGAAGGGGGGGAAGTACTCGTAACGCTCTTGGA

2-F：TCCAAGAGCGTTACGAGTACTTCCCCCCCTTCTCCGGCGAGGAGATCT

2-R：CTCGCGTTCCGCTTGCGTTGCCTTGGGAAAAATATTGTTC

3-F：GAACAATATTTTTCCCAAGGCAACGCAAGCGGAACGCGAG

3-R：ATCCATTCGGGCCACAATGAGGTGCTTGTGCGGTGTGTAAA

4-F：TTTACACACCGCACAAGCACCTCATTGTGGCCCGAATGGAT

4-R：ATTACCCGGGTTATGGTGGTGGTGGTGGTGGGAAAACCCTT

(3)表面展示载体的构建及转化

(i)芽孢衣壳蛋白基因的获得：

设计如下三组引物：

Cot b-F：5'-CGCGGATCCACGGATTAGGCCGTTTGTCCTCATGGACCCGT

Cot b-R：

5'-GATCTCTAGAAGGAGGTGGAAAACGACGAAGAGGAGGTGGGGATGATTGATCAT

Cot g-：5'-CGCGGATCCAGTGTCCCTAGCTCCGAGAAAAAATCCAG

Cot g-R：

5'-GATCTCTAGAAGGAGGTGGAAAACGACGAAGAGGAGGTGGTTTGTATTTCTTTT

Cot z-F：5'-CGCGGATCCGACTGTGACCATCCGTTAGATGACAAAGATAAAG

Cot z-R：

5'-GATCTCTAGAAGGAGGTGGAAAACGACGAAGAGGAGGTGGCCATTGTGATGAT

使用细菌基因组提取试剂盒提取野生型枯草芽孢杆菌168DNA，以此为模板，扩增三种芽孢衣壳蛋白基因；

(ii)将上述三种芽孢衣壳蛋白基因与载体pHT43质粒分别用限制性内切酶BamH I和Sma I进行双酶切，纯化后的各片段和pHT43分别连接构建表达载体，分别转化至大肠杆菌中，在含有氨苄青霉素的平板筛选阳性转化子，分别提取质粒，分别用限制性内切酶Xba I和Sma I进行双酶切，分别与用限制性内切酶Xba I和Sma I进行双酶切的突变体连接后，分别转化至大肠杆菌DH5α中，在含有氨苄青霉素的平板筛选阳性转化子，分别提取表面展示质粒备用；

(iii)挑取WB800N单菌落接种于25mL GM I培养基中，30℃、180rpm过夜培养，将过夜培养的菌液按10％接种量接种于25mL新鲜的GM I中，在37℃、200rpm恒温震荡培养3.5h，按5％接种量接种于5mL GMII中，37℃、150rpm震荡培养90min，吸取1mL培养物，5000rpm室温离心5min，1/10体积上清液冲悬菌体，加入5μL表面展示质粒，混匀，37℃水浴1h，37℃培养4小时，涂在含有氯霉素抗性的平板上，37℃过夜培养；

(4)枯草芽孢杆菌的孢子化

2.根据权利要求1所述的一种表面展示有重组乙酰胆碱酯酶的枯草芽孢杆菌，其特征在于，步骤(1)中PCR反应体系如下：

反应条件如下：

3.根据权利要求1所述的一种表面展示有重组乙酰胆碱酯酶的枯草芽孢杆菌，其特征在于，步骤(2)中第一轮的PCR体系如下：

PCR条件如下：

4.根据权利要求1所述的一种表面展示有重组乙酰胆碱酯酶的枯草芽孢杆菌，其特征在于，步骤(2)中第二轮的PCR体系如下：

PCR体系：

PCR条件如下：

5.根据权利要求1所述的一种表面展示有重组乙酰胆碱酯酶的枯草芽孢杆菌，其特征在于，步骤(3)中(i)芽孢衣壳蛋白基因的获得中，PCR反应体系如下：

反应条件如下：