CN111979256A

CN111979256A - 一种修饰的乙酰胆碱酯酶Ache基因及其应用

Info

Publication number: CN111979256A
Application number: CN202010914500.1A
Authority: CN
Inventors: 乔想金; 白丽娟; 郭润芝; 李文新; 王晓旋; 薄瑞; 孙尚琛
Original assignee: Lanzhou Ls Energy Equipment Engineering Research Institute Co ltd
Current assignee: Lanzhou Ls Energy Equipment Engineering Research Institute Co ltd
Priority date: 2020-09-03
Filing date: 2020-09-03
Publication date: 2020-11-24

Abstract

本发明涉及一种修饰的乙酰胆碱酯酶Ache基因，该基因具有序列表中SEQ ID NO.1第1位到1770位所示的核苷酸序列。本发明还公开了该基因在制备重组乙酰胆碱酯酶方法的应用。本发明利用基因工程手段，将家蝇Ache基因编码区插入到酵母表达载体中，并转化毕赤酵母表达菌株，筛选出了高表达的基因工程菌株，用甲醇进行诱导后实现了Ache蛋白在毕赤酵母中的过量表达，从而为工业发酵生产乙酰胆碱酯酶提供了高效方法。

Description

一种修饰的乙酰胆碱酯酶Ache基因及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种修饰的乙酰胆碱酯酶Ache基因及其应用。

背景技术

我国是农业生产大国，同时也是世界上农药使用量最大的国家。据统计，我国平均每年生产化学农药约100万吨，仅次于美国居世界第二。我国又是农药使用大国，平均每年防治面积为49亿亩次。然而，由于农药滥用及监管的不到位，农副产品中农药残留问题普遍存在，严重影响了人类身体健康，直接降低了我国食品安全水平和大宗农产品出口的国际竞争力。由于病虫害耐药性的产生，农药的品种和用量也与日俱增，这对土壤、大气和水体的污染、对环境质量影响与破坏是严重的。

农药残留已成为环境和食品污染的主要原因之一，特别是有机磷和氨基甲酸酯类农药对人类具有高毒性。有机磷、氨基甲酸酯类农药因具有防治谱广、价格低廉、种类多等特点而被广泛用于各种农作物的生产。这两类农药残留的危害主要有以下几点：

①危害人体健康。有机磷、氨基甲酸酯类农药具有致畸性、致癌性、致突变性，对人类和其它哺乳动物危害大，可以降低免疫能力并诱发肿瘤，对胎儿的发育有明显的抑制作用，损害神经系统等。近年来，有机磷、氨基甲酸酯类农药导致男性不育率明显增加。

②严重污染环境。对环境的污染途径主要是田间施用，有机磷、氨基甲酸酯类农药施到田间，只有1%~2%的农药作用于病虫害，10%~20%的农药附着在农作物表面，其余部分进入环境，对土壤、水体和空气造成污染。其次，未使用农药和农药包装物的随意丢弃、农药工厂意外泄露和废水排放都会造成周围环境的污染。

③影响出口经济贸易。农药残留是很多国家设置贸易“绿色壁垒”的重要手段。由于我国农产品有机磷农药残留超标，我国农产品出口严重受阻。近几年欧盟对我国茶叶中农药残留的规定项目不断增多，有机磷类农药已被许多国家列为最先接受登记和残留限量再评价的一类农药，这些规定严重阻碍了我国农产品的出口贸易。

④破坏生态平衡。有机磷和氨基甲酸酯类农药的大量施用，破坏了天敌与害虫之间的生态平衡，其导致害虫耐药性不断增加及天敌数量下降。农药残留导致土壤中生物多样性降低，使生产能力下降。农药进入水体后会在水生生物体内富集，严重时会引起生物大面积死亡。

目前，有机磷、氨基甲酸酯类农药残留的检测主要分为仪器分析法和生物法两大类。这两类方法对设备及相应操作要求极高、检测过程复杂、周期长、成本高、不能及时显示结果，难以普及至日常民用。而且，食品中很多是鲜活农产品，这就需要一种更快、更精准的快速的农药残留筛查方法。

国外利用酶抑制法快速检测农产品中农药残留，其原理是基于有机磷、氨基甲酸酯类农药可特异性地抑制昆虫中枢神经系统中乙酰胆碱酯酶的活性而使昆虫中毒致死。因此，可以通过农药对乙酰胆碱酯酶活性的抑制来检测农药的残留情况，一般是通过抑制率判断样品中有机磷或氨基甲酸酯类农药的存在及其含量的多少。酶抑制法能在10 min~30min内快速测定蔬菜中有机磷、氨基甲酸酯类农药残留，现已成为国内外快速检测农药残留的主流技术。因此，提高乙酰胆碱酯酶表达效率对酶抑制法检测农残有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种修饰的乙酰胆碱酯酶Ache基因。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供该修饰的乙酰胆碱酯酶Ache基因的应用。

为解决上述问题，本发明所述的一种修饰的乙酰胆碱酯酶Ache基因，特征在于：该基因具有序列表中SEQ ID NO.1第1位到1770位所示的核苷酸序列。

该基因作为酵母重组表达载体的一部分。

所述酵母重组表达载体为pPIC9K-ache。

以所述酵母重组表达载体转化得到酵母重组细胞，该酵母重组细胞为毕赤酵母细胞（Pichic pastoris）SMD1168/pPIC9K-ache。

如上所述的一种修饰的乙酰胆碱酯酶Ache基因在制备重组乙酰胆碱酯酶方法的应用，特征在于：利用甲醇对所述酵母重组细胞进行诱导表达，经离心去除菌体，收集上清后，再用切向流膜进行纯化、浓缩，最后经磷酸缓冲液稀释即得重组乙酰胆碱酯酶。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、本发明利用基因工程手段，将家蝇Ache基因编码区插入到酵母表达载体中，并转化毕赤酵母表达菌株，筛选出了高表达的基因工程菌株，用甲醇进行诱导后实现了Ache蛋白在毕赤酵母中的过量表达，从而为工业发酵生产乙酰胆碱酯酶提供了高效方法。

2、本发明重组乙酰胆碱酯酶在50 L发酵罐中的表达量达到6.5 g/L，具有较高的酶活性，纯化后的重组乙酰胆碱酯酶对不同有机磷和氨基甲酸酯类农药具有很高的敏感性，这为工业生产重组有机磷和氨基甲酸酯类农药检测酶开辟了一条新途径。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1为本发明酵母重组质粒构建双酶切验证电泳图。其中：M为DNA分子标准，1为酶切样品，2为酶切样品。

图2为本发明酵母重组质粒酶切线性化电泳图。其中：M为DNA分子标准，1~5为酶切样品。

图3为本发明SMD1168-pPIC9K-ache表达的重组蛋白的电泳图。其中：M为蛋白分子标准量，CT为对照组不同时间诱导，SY为实验组不同时间诱导。

图4为本发明乙酰胆碱酯酶重组质粒图谱。

图5为本发明不同温度对重组乙酰胆碱酯酶酶活的影响。

图6为本发明不同pH对重组乙酰胆碱酯酶酶活的影响。

具体实施方式

下述实施例中所用试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径获得材料、试剂。

实施例1 一种修饰的乙酰胆碱酯酶Ache基因，该基因具有序列表中SEQ ID NO.1第1位到1770位所示的核苷酸序列。

该基因的合成方法如下：根据NCBI数据库公布的家蝇Ache基因序列为模板，在基因两端添加限制性内切酶XhoⅠ和KpnⅠ识别位点，在XhoⅠ和Ache基因序列之间添加组氨酸标签基因序列：CATCACCATCATCACCAC。在Ache基因序列末端和XhoⅠ之间添加终止密码子TAA。Ache基因序列由上海生工生物工程股份有限公司合成。

实施例2 一种修饰的乙酰胆碱酯酶Ache基因作为酵母重组表达载体的一部分。酵母重组表达载体为pPIC9K-ache。

【酵母重组质粒构建】分别将puc-ache载体质粒和表达载体质粒pPIC9K同时用限制性内切酶XhoⅠ、KpnⅠ进行双酶切，酶切反应液用琼脂糖凝胶电泳进行纯化、鉴定；将表达载体片段和目的基因序列片段进行回收后，表达载体片段和目的基因序列片段按照1：3的比例用T4 DNA连接酶20 ℃连接过夜，酵母重组质粒图谱见图4；通过化学转化法将连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞DH5ɑ，筛选获得阳性克隆。

具体步骤如下：

从-80 ℃取出感受态细胞DH5ɑ和连接产物迅速置于冰上，向感受态细胞DH5ɑ中加入10uL连接产物，冰浴30 min；42 ℃热激60 s，置于冰上2 min；加入800 uL LB培养液，37 ℃振荡培养45 min；取100 uL菌液涂布于LB平板（含氨苄青霉素），37 ℃培养过夜，挑取阳性克隆；用质粒DNA提取试剂盒抽提阳性克隆质粒，用限制性内切酶XhoⅠ和KpnⅠ进行双酶切验证。由图1可以看出，双酶切目的片段大小为1800 bp与Ache基因大小完全一致，因此，表明Ache基因片段已成功插入到表达载体质粒pPIC9K。双酶切验证正确的阳性克隆送由上海生工生物工程股份有限公司进行进一步测序鉴定，正确的阳性克隆命名为DH5ɑ-pPIC9K-ache。

实施例3 以酵母重组表达载体转化得到酵母重组细胞，该酵母重组细胞为毕赤酵母细胞（Pichic pastoris）SMD1168/pPIC9K-ache。

【重组质粒转化酵母】将构建好的重组质粒pPIC9K-ache用限制性内切酶SalⅠ线性化，通过电穿孔法转化至毕赤酵母感受态细胞SMD1168中，筛选获得阳性克隆SMD1168-pPIC9K-ache。

具体步骤如下：

用质粒DNA提取试剂盒抽提阳性克隆DH5ɑ-pPIC9K-ache的质粒，将重组质粒酶切线性化，线性化条件如下：10×Buffer 30 uL，限制性内切酶Sal Ⅰ 2 uL，重组质粒200 uL，ddH₂O 68 uL，37 ℃10 h；将酶切反应液进行琼脂糖凝胶电泳确定是否酶切完全，回收纯化线性化目的片段。如图2可以看到具有11kb的条带，因此，表明pPIC9K-ache质粒已线性化。取10 uL线性化DNA溶解于5 uL dd H₂O ，与100 uL SMD1168感受态细胞混匀，转至预冷的电转化杯中，冰浴5 min；用电转化仪进行电转化：电压2500 V；电击后加入1 mL预冷的1 mol/L山梨醇溶液，混匀后转至1.5 mL离心管，30 ℃静置培养2 h后，5000 r/min，离心5 min；弃上清，加入1 mL YPD，30 ℃振荡培养2 h，取100 uL菌体悬液涂布于MD平板，30 ℃静置培养，挑取单菌落进行PCR鉴定，结果显示目的基因已整合到毕赤酵母的基因组DNA中，获得重组载体命名为SMD1168-pPIC9K-ache。

实施例4 该修饰的乙酰胆碱酯酶Ache基因在制备重组乙酰胆碱酯酶方法的应用：利用甲醇对酵母重组细胞进行诱导表达，经离心去除菌体，收集上清后，再用切向流膜进行纯化、浓缩，最后经磷酸缓冲液稀释即得重组乙酰胆碱酯酶。具体步骤如下：

⑴乙酰胆碱酯酶的发酵：

挑取毕赤酵母阳性克隆SMD1168-pPIC9K-ache单菌落，接种到YPD培养基（YPD培养基：2%细菌用胰化蛋白胨，1%细菌用酵母提取物，2%葡萄糖，pH 7.0）中进行培养。培养30 h后以1:100的接种量转接至新鲜YPD液体培养基摇床培养过夜。将菌种以10%的接种量转接至25L BSM发酵培养基（BSM发酵培养基：85% H₃PO₄ 26.7 mL，CaSO₄·2 H₂O 0.93 g/L，K₂SO₄18.2 g/L，MgSO₄·7 H₂O 14.9 g/L，KOH 4.14 g/L）中进行培养，流加氨水使发酵液pH值为6.0~6.2，监测溶氧曲线，等培养基中初试碳源耗尽时，流加500 g/L的葡萄糖溶液2.5 L，流加时间为18 h。碳源全部耗尽时，饥饿2 h后开始流加含有PTM和维生素的甲醇（PTM和维生素：CuSO₄6 g/L，NaI 0.08 g/L，MnSO₄ 3 g/L，NaMoO₄0.2 g/L，H₃BO₃ 0.02 g/L，CoCl₂·6H₂O 0.5 g/L，ZnCl₂20 g/L，FeSO₄65 g/L，维生素0.2 g/L，H₂SO₄5 mL/L），流加速率为2mL/h，适应2 h后将甲醇流速调为5 mL/h开始诱导，保持溶氧量不低于20%。诱导时间为120h。将发酵液离心后收集上清，获得Ache粗酶液。

【对Ache粗酶液进行SDS-PAGE电泳实验】

分别取发酵后0 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h的发酵液10 uL粗酶液进行12%的SDS-PAGE蛋白电泳，以转化了pPIC9K空载的SMD1168菌株为对照。SDS-PAGE蛋白电泳结果显示如图3所示：重组Ache酵母工程菌表达产物约在66kD处有一条与阴性对照菌株表达产物存在明显区别的条带，这表明Ache酵母工程菌已成功分泌表达出Ache。本发明毕赤酵母表达的重组乙酰胆碱酯酶在发酵液中含量占总分泌蛋白的90%以上，通过SDS-PAGE仅看到少量杂蛋白的存在，因此只需要将诱导后的发酵液经过脱盐纯化处理，无需进一步处理即可得到比较纯的重组乙酰胆碱酯酶。

⑵制备重组乙酰胆碱酯酶：

将发酵后的Ache粗酶液1000 rpm，5 min离心处理，收集上清，用300 kD的切向流膜进行纯化；所得纯化液用30 kD的切向流膜进行浓缩，体积浓缩10倍后，用pH值为7.5的磷酸缓冲液稀释至原体积；重复上述步骤三次即可达到脱盐纯化目的，获得纯度为95%的重组乙酰胆碱酯酶。

【对所得重组乙酰胆碱酯酶进行酶活测试】

试剂准备：

0.1mol/L pH=7.5的磷酸缓冲液、5，5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)溶液（DTNB）、碘化硫代乙酰胆碱（ATCH）。

测定方法：

在3.00 mL磷酸缓冲液中依次加入20 uL磷酸缓冲液和100 uL DTNB溶液（终浓度1.0mmol/L），混匀后37 ℃水浴15 min；水浴后加入20 uL ATCH溶液（终浓度1.0 mmol/L），充分混匀，反应体积为3.14 mL。在412 nm处用1 cm比色皿，在3 min内每隔30 s连续测定吸光值，3 min前后的吸光度变化值为△A，每组三次重复取平均值。以磷酸缓冲液代替酶液作为空白对照，进行酶活测定。酶活（U）定义：37 ℃，0.1mol/L pH7.5的磷酸缓冲液中，每分钟分解1 umol ATCH的酶量，为一个酶活单位。每毫升酶液所含的酶单位数，按以下公式计算：

；

式中：V为反应总体积，本体系为3.14 mL；△A为3 min前后的吸光度变化值，本法为2.75；t为反应时间，本法为3 min；ɛ为黄色产物摩尔消光系数，1.36×10⁴L /（moL·cm）；v为酶液体积，本体系为0.02 mL；l为比色皿光程（1 cm）。

测得重组乙酰胆碱酯酶酶活为10.6 U/mL，说明本发明重组乙酰胆碱酯酶具有很好的活性。

【对所得重组乙酰胆碱酯酶进行农药敏感性测试】

分别以0.0025 mg/kg敌敌畏、4 mg/kg马拉硫磷、0.05 mg/kg克百威、0.02 mg/kg氧化乐果、0.0025 mg/kg呋喃丹、0.002 mg/kg敌百虫、2 mg/kg甲胺磷、0.6 mg/kg久效磷、0.02mg/kg甲萘威对乙酰胆碱酯酶进行农药敏感性测试。

测定方法如下：

在3.00 mL磷酸缓冲液中依次加入20 uL酶液、100 uL DTNB溶液（终浓度1.0 mmol/L）和10 uL 农药，混匀后37 ℃水浴15 min；水浴后加入20 uL ATCH溶液（终浓度1.0 mmol/L），充分混匀。在412 nm处用1 cm比色皿，每隔30 s读数一次，连续测定3 min。以磷酸缓冲液代替农药作为空白对照，测定农药对重组乙酰胆碱酯酶的抑制率，根据以下公式求得抑制率：

抑制率( %) = （△A₀-△A₁）/△A₀×100%；

式中：△A₀为对照溶液反应3 min吸光度的变化值；△A₁为含有农药溶液反应3 min吸光度的变化值。

测试结果如表1所示。由表1可以看出，本发明纯化后的重组乙酰胆碱酯酶酶对不同有机磷和氨基甲酸酯类农药具有很高的敏感性。

表1 重组乙酰胆碱酯酶对几种有机磷、氨基甲酸酯类农药敏感性测试

【温度对重组乙酰胆碱酯酶酶活影响】

在3.00 mL磷酸缓冲液中依次加入20 uL酶液和100 uL DTNB溶液（终浓度1.0 mmol/L），混匀后分别在20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃水浴15min后测定重组乙酰胆碱酯酶酶活（具体步骤同酶活测定）。结果如图5所示：反应温度为40℃时重组乙酰胆碱酯酶酶活达到最高，酶活为13.0 U/mL。

【pH对重组乙酰胆碱酯酶酶活影响】

分别配置pH值为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5磷酸缓冲液，各取3 mL磷酸缓冲液，加入20 uL酶液和100 uL DTNB溶液（终浓度1.0 mmol/L），混匀后40 ℃水浴15 min后测定重组乙酰胆碱酯酶酶活（具体步骤同酶活测定）。结果如图6所示：反应磷酸缓冲液pH=8.0时重组乙酰胆碱酯酶酶活达到最高，酶活为11.02 U/mL。

<110>兰州兰石能源装备工程研究院有限公司

<120>一种修饰的乙酰胆碱酯酶Ache基因及其应用

<160>1

<210>1

<211>1770

<212>DNA

1 AAAAGACACC ATCATCATCA TCATGTCATC GATCGCCTGG TCGTGCAGAC ATCCTCCGGA

61 CCTGTACGCG GTCGCTCCGT GACGGTGCAG GGCAGGGAGG TGCATGTCTA CACGGGCATC

121 CCCTACGCCA AGCCGCCCGT CGAGGACCTG CGCTTCCGAA AGCCGGTTCC CGCGGAGCCA

181 TGGCACGGCG TCCTCGACGC CACGCGGTTA TCCGCCACCT GCGTCCAAGA GCGTTACGAG

241 TACTTCCCCG GCTTCTCCGG CGAGGAGATC TGGAACCCCA ACACCAACGT GTCCGAGGAC

301 TGCCTCTACA TAAATGTCTG GGCGCCGGCA AAGGCCCGAC TTCGCCATGG GCGGGGTGCC

361 AACGGGGGTG AGCACCCCAA TGGCAAACAG GCGGACACTG ACCATCTCAT CCACAACGGA

421 AATCCGCAGA ACACGACCAA CGGACTGCCG ATTCTGATCT GGATCTATGG CGGTGGCTTC

481 ATGACCGGAT CGGCCACCCT GGACATCTAC AATGCGGATA TCATGGCCGC CGTGGGCAAT

541 GTAATAGTGG CCTCCTTCCA GTATCGGGTG GGAGCCTTTG GGTTCTTGCA CCTGGCGCCG

601 GAAATGCCGT CGGAATTCGC GGAAGAGGCG CCCGGCAATG TGGGCCTATG GGATCAGGCA

661 CTCGCCATTC GCTGGCTGAA GGACAACGCT CATGCCTTCG GCGGAAATCC GGAGTGGATG

721 ACACTGTTCG GAGAGTCGGC TGGATCCAGT TCGGTGAATG CCCAGCTCAT GTCGCCGGTG

781 ACGAGGGGTC TGGTCAAGCG CGGAATGATG CAGTCGGGCA CTATGAACGC CCCCTGGAGC

841 CACATGACCT CCGAGAAGGC CGTGGAGATC GGCAAGGCGC TGATCAACGA CTGCAACTGC

901 AATGCATCTA TGCTGAAGAC CAATCCCGCT CACGTGATGA GCTGCATGCG TTCCGTGGAC

961 GCCAAGACCA TATCGGTGCA GCAGTGGAAC TCCTACTCGG GCATCCTCAG CTTTCCCTCG

1021 GCGCCCACCA TTGATGGTGC GTTCCTGCCG GCGGATCCCA TGACGCTGAT GAAGACGGCG

1081 GATCTGAAGG ACTACGACAT CCTGATGGGA AATGTCAGGG ATGAGGGCAC TTACTTCTTG

1141 CTGTACGATT TCATCGATTA CTTCGATAAG GACGATGCCA CGGCCCTGCC ACGGGACAAA

1201 TACCTGGAAA TTATGAACAA TATTTTTGGC AAGGCAACGC AAGCGGAACG CGAGGCCATC

1261 ATTTTCCAGT ATACCAGTTG GGAAGGCAAT CCTGGCTATC AGAACCAGCA GCAAATCGGA

1321 CGCGCCGTGG GCGATCACTT CTTCACCTGC CCCACCAACG AGTATGCCCA GGCTCTGGCG

1381 GAGCGAGGCG CTTCCGTGCA CTACTACTAC TTTACACACC GCACAAGCAC CTCATTGTGG

1441 GGCGAATGGA TGGGCGTGCT GCACGGCGAT GAGATCGAAT ACTTCTTTGG CCAGCCGCTG

1501 AACAACTCCC TGCAGTATCG ACCTGTGGAG CGTGAGCTGG GCAAGCGTAT GCTCAGTGCG

1561 GTCATCGAGT TTGCTAAGAC GGGAAATCCC GCTCAGGATG GCGAGGAGTG GCCCAACTTC

1621 TCCAAGGAGG ATCCCGTCTA CTATATTTTC AGCACCGACG ATAAGATCGA GAAATTGGCC

1681 AGGGGTCCTT TGGCGGCTCG CTGCTCGTTC TGGAATGATT ACTTGCCAAA AGTCAGGAGT

1741 TGGGCAGGTA CTTGCGATGG CGATTCGTAA

Claims

1.一种修饰的乙酰胆碱酯酶Ache基因，特征在于：该基因具有序列表中SEQ ID NO.1第1位到1770位所示的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的一种修饰的乙酰胆碱酯酶Ache基因，特征在于：该基因作为酵母重组表达载体的一部分。

3.如权利要求2所述的一种修饰的乙酰胆碱酯酶Ache基因，特征在于：所述酵母重组表达载体为pPIC9K-ache。

4.如权利要求3所述的一种修饰的乙酰胆碱酯酶Ache基因，特征在于：以所述酵母重组表达载体转化得到酵母重组细胞，该酵母重组细胞为毕赤酵母细胞SMD1168/pPIC9K-ache。

5.如权利要求4所述的一种修饰的乙酰胆碱酯酶Ache基因在制备重组乙酰胆碱酯酶方法的应用，特征在于：利用甲醇对所述酵母重组细胞进行诱导表达，经离心去除菌体，收集上清后，再用切向流膜进行纯化、浓缩，最后经磷酸缓冲液稀释即得重组乙酰胆碱酯酶。