CN116478838B - 一种多碳源利用且高蛋白合成的毕赤酵母及其应用 - Google Patents
一种多碳源利用且高蛋白合成的毕赤酵母及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116478838B CN116478838B CN202310707630.1A CN202310707630A CN116478838B CN 116478838 B CN116478838 B CN 116478838B CN 202310707630 A CN202310707630 A CN 202310707630A CN 116478838 B CN116478838 B CN 116478838B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- pichia pastoris
- pichia
- strain
- methanol
- carbon source
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 title claims abstract description 31
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 31
- 230000014616 translation Effects 0.000 title claims abstract description 9
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 title claims abstract description 8
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 123
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 27
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 23
- 108010027322 single cell proteins Proteins 0.000 claims abstract description 12
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 claims abstract description 5
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 claims abstract description 5
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 claims abstract description 5
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims abstract description 5
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims abstract description 5
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 claims abstract description 5
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 239000008101 lactose Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims abstract description 5
- 241000235648 Pichia Species 0.000 claims description 22
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 8
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 6
- 238000010564 aerobic fermentation Methods 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 241000235645 Pichia kudriavzevii Species 0.000 abstract description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 abstract description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 abstract description 5
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 abstract description 4
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 abstract description 4
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 abstract description 3
- 230000000050 nutritive effect Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 16
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 9
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 9
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 7
- 239000003245 coal Substances 0.000 description 5
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 4
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 4
- 235000019750 Crude protein Nutrition 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 3
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N nitrogen oxide Inorganic materials O=[N] MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000235342 Saccharomycetes Species 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 235000021120 animal protein Nutrition 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 108010025188 Alcohol oxidase Proteins 0.000 description 1
- 101710194180 Alcohol oxidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100036826 Aldehyde oxidase Human genes 0.000 description 1
- 235000017060 Arachis glabrata Nutrition 0.000 description 1
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 1
- 235000010777 Arachis hypogaea Nutrition 0.000 description 1
- 235000018262 Arachis monticola Nutrition 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 108010082495 Dietary Plant Proteins Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019733 Fish meal Nutrition 0.000 description 1
- 101000928314 Homo sapiens Aldehyde oxidase Proteins 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 235000019735 Meat-and-bone meal Nutrition 0.000 description 1
- 240000004658 Medicago sativa Species 0.000 description 1
- 235000017587 Medicago sativa ssp. sativa Nutrition 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 108010064851 Plant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 235000019779 Rapeseed Meal Nutrition 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 1
- 108010073771 Soybean Proteins Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 239000012159 carrier gas Substances 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 239000000498 cooling water Substances 0.000 description 1
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 238000007418 data mining Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000004146 energy storage Methods 0.000 description 1
- 210000003746 feather Anatomy 0.000 description 1
- 239000004467 fishmeal Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000005984 hydrogenation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021118 plant-derived protein Nutrition 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 239000004456 rapeseed meal Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 1
- 235000019710 soybean protein Nutrition 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
- C12N1/165—Yeast isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
- C12R2001/84—Pichia
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Botany (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供一种多碳源利用且高蛋白合成的毕赤酵母及其应用。该菌株可以利用糖源、低元醇等多元化碳源，以甲醇、甘油、乳糖、蔗糖、果糖、阿拉伯糖等为唯一碳源均可以快速生长。本发明首次发现库德里阿威兹毕赤酵母有两套稳定的遗传代谢途径。该菌株最适生长温度为37℃，耐受至45℃；甲醇耐受强度为3.5%，该菌株鲁棒性极强，具有完美的工业属性。库德里阿威兹毕赤酵母的菌体蛋白含量>56%，氨基酸组成>42%，含有8种必需氨基酸，营养价值明显。因此，本发明创制了高蛋白合成、多碳源利用的野生毕赤酵母菌株，未来将多种低值物料开发为单细胞蛋白方面具有应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及多碳源利用且高蛋白合成的毕赤酵母及其应用。
背景技术
随着我国蛋白饲料原料进口量的不断提高，蛋白饲料原料短缺已经成为限制我国畜牧养殖业和饲料业健康发展的瓶颈，寻找和开发新的蛋白质资源成为饲料工业急需解决的问题。
根据蛋白质饲料来源不同可分为植物性蛋白饲料、动物性蛋白饲料、微生物蛋白（SCP、单细胞蛋白）饲料和非蛋白饲料。植物性蛋白饲料原料以豆粕、棉籽粕、菜籽粕、花生粕、苜蓿、玉米加工的副产品玉米蛋白粉等草本饲料为主，动物性蛋白饲料原料有鱼粉、肉骨粉、羽毛粉等，微生物蛋白饲料是由单细胞生物个体组成的蛋白质含量较高的饲料，如酵母菌饲料和单细胞藻类饲料，非蛋白氮饲料一般指饲料用尿素等。以价格低廉、存量丰富的低值碳源开发新型单细胞蛋白，形成具有价格优势的替代蛋白产品，是未来替代蛋白市场研究开发的重点。
我国资源现状是富煤、少油，甲醇是一种煤化工副产物，可由劣质煤炭制取，我国煤炭储量丰富，因此甲醇原料价格低廉且来源充足。另外，甲醇可由CO2加氢大量制备，因此其被认为是“液态阳光”战略的理想能量储存载体。我国甲醇市场规模居世界第一，产能已达8000万吨/年，呈现过剩趋势，甲醇经济的发展急需配套的甲醇转化利用技术。近年来，随着合成生物学技术的不断发展及其应用领域的不断扩大，以价格低廉的甲醇为碳源，利用微生物生产单细胞蛋白的技术逐渐受到关注。
巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是自然界中存在的一种能够利用甲醇作为唯一碳源和能量来源的微生物，适合在学术或工业水平上分泌重组蛋白。相比与其他一些表达宿主，毕赤酵母具有很强的、甲醇诱导和严格调控的醇氧化酶启动子（AOX1），可以高效利用甲醇，在甲醇诱导作用下具有了高蛋白质分泌的能力，更适合表达高水平的外源基因。然而，巴斯德毕赤酵母属于商业菌株，知识产权不清晰。巴斯德毕赤酵母也属于转基因菌株，未能在饲用行业使用。亟待开发具有自主知识产权的、高效利用甲醇的野生型毕赤酵母菌株。
发明内容
本发明提供一株从白酒糟中筛选一株可以高效利用甲醇的酵母菌株，ITS鉴定为库德里阿威兹毕赤酵母，命名为库德里阿威兹毕赤酵母Kud-A。该菌株可以利用糖源、低元醇等多元化碳源，以甲醇、甘油、乳糖、蔗糖、果糖、阿拉伯糖等为唯一碳源均可以快速生长。本发明首次发现库德里阿威兹毕赤酵母Kud-A可以利用甲醇，通过组学数据挖掘，发现该菌株有两套稳定的遗传代谢途径。该菌株最适生长温度为37℃，耐受至45℃；甲醇耐受强度为3.5%，该菌株鲁棒性极强，具有完美的工业属性。库德里阿威兹毕赤酵母Kud-A菌体蛋白含量>56%，氨基酸组成>42%，含有8种必需氨基酸，营养价值明显。因此，本发明创制了高蛋白合成、多碳源利用的野生毕赤酵母菌株，由此完成本发明。
本发明提供一种多碳源利用且高蛋白合成的毕赤酵母，其是库德里阿威兹毕赤酵母（Pichia kudriavzevii），保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号为：CGMCC NO. 26899，保藏时间为：2023年2月24日，其分类命名为库德里阿威兹毕赤酵母Pichia kudriavzevii
进而本发明提供所述的毕赤酵母的培养方法，其在含有氮源和碳源的培养基中进行有氧发酵培养。
优选地，其以甲醇、甘油、乳糖、蔗糖、果糖或阿拉伯糖为唯一碳源进行培养。
更优选地，培养温度不超45℃，例如培养温度为35-39℃。
进一步地，当以甲醇为唯一碳源时，甲醇浓度不超过3.5%（v/v）。
具体地，所述培养为在下述培养基中进行有氧发酵培养：42 g/L甘油，1.2 g/LKH2PO4，18 g/L NH4H2PO4，6.5 g/L MgSO4·7H2O；培养条件：培养温度 30 ℃，pH值 4.5~ 5.0，空气流量 4~8 m3/ h，甘油按照0.5-1.0 rpm/30min/次补料，维持DO≥20%；连续发酵 24h 后，补料甲醇0.1 rpm/h/次，维持DO≥25%。
本发明提供所述的培养方法得到单细胞蛋白。进一步提供所述的毕赤酵母在生产单细胞蛋白中的应用。
本发明首次发现该库德里阿威兹毕赤酵母有两套稳定的遗传代谢途径。该菌株最适生长温度为37℃，耐受至45℃；甲醇耐受强度为3.5%，该菌株鲁棒性极强，具有完美的工业属性。发酵得到的菌体蛋白含量>56%，氨基酸组成>42%，含有8种必需氨基酸，营养价值明显。因此，本发明创制了高蛋白合成、多碳源利用的野生毕赤酵母菌株，未来将多种低值物料开发为单细胞蛋白方面具有应用前景。
附图说明
图1：库德里阿威兹毕赤酵母Kud-A在不同糖源培养情况。
图2：库德里阿威兹毕赤酵母Kud-A在不同甲醇浓度下生长情况。
图3：库德里阿威兹毕赤酵母Kud-A有两套完整的遗传背景。
图4：库德里阿威兹毕赤酵母Kud-A单细胞蛋白氨基酸组成分析。
生物材料保藏信息
本发明的Kud-A菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号为：CGMCC NO. 26899，保藏时间为：2023年2月24日。其分类命名为库德里阿威兹毕赤酵母Pichia kudriavzevii。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明做进一步的阐述，以期更好的理解本发明，但不构成对本发明的限制。
实施例1
本发明通过筛选分离白酒糟放入盛有95 mL无菌水和10粒玻璃珠的三角瓶中，于30℃、180 rpm振荡30 min。取菌悬液1 mL进行10-1-10-7 系列浓度梯度稀释，然后取10-5、10-6、10-7三个稀释度涂布至以甲醇为唯一碳源的培养基平板上，于30℃倒置培养5d。
纯化：菌落在以甲醇为唯一碳源的培养基平板形成后，挑取单菌落于1.5%甲醇为唯一碳源的96孔板，30℃，180rpm培养2d，测定OD600nm。最终筛选甲醇为唯一碳源中生长最快的一株酵母菌，将获得菌落4℃保存。
该筛选获得菌株，经过一对通过ITS引物‘‘进行PCT扩增，扩增产物经过测序，和序列对比结果显示，该菌株鉴定为库德里阿威兹毕赤酵母，命名为库德里阿威兹毕赤酵母Kud-A。
以葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、阿拉伯糖、甘露糖为唯一碳源时，库德里阿威兹毕赤酵母Kud-A均可以正常生长（图1），说明其可以利用的碳源存在广谱性。
尤其是甲醇为唯一碳源时，该毕赤酵母Kud-A仍可以正常生长；甲醇耐受性极强，当甲醇浓度为3.5%时，菌株生长情况没有受到影响，培养36小时时，菌体的积累量达到最大，说明该菌株可以利用甲醇。
实施例2
按照前期文献报道，库德里阿威兹毕赤酵母是没有AOX1启动子的，是无法代谢甲醇的。我们将库德里阿威兹毕赤酵母Kud-A在甲醇和葡萄糖培养下，进行比较转录组学分析。发掘库德里阿威兹毕赤酵母Kud-A有两套遗传操作系统，以巴斯德毕赤酵母为参考基因组时，具有巴斯德毕赤酵母完整的甲醇代谢途径；当以库德里阿威兹毕赤酵母为参考基因组时，仍然具有库德里阿威兹毕赤酵母代谢途径。当两套背景系统重叠后发现，库德里阿威兹毕赤酵母Kud-A具有比普通库德里阿威兹毕赤酵母更为完善的甲醇代谢途径（图3）。
实施例3
为了验证，比传统的巴斯德毕赤酵母相比，库德里阿威兹毕赤酵母Kud-A在菌株工业属性方面更具优势。将库德里阿威兹毕赤酵母Kud-A与巴斯德毕赤酵母X33，在不同甲醇浓度，不同培养温度条件下培养，比较两个菌株的生长情况。结果显示：库德里阿威兹毕赤酵母Kud-A可以耐受45℃高温，最适生长温度为37℃，而37℃条件下，巴斯德毕赤酵母X33已经无法正常生长。
实施例4
为了检测库德里阿威兹毕赤酵母Kud-A生产单细胞蛋白质量，我们将利用5L补料分批发酵的方式培养库德里阿威兹毕赤酵母Kud-A菌体。
种子培养基及培养条件选择 YPD 复合培养基为种子培养基:1% 酵母浸粉、2%蛋白胨、2% 葡萄糖、 pH 自然。培养条件：在 250 mL 摇瓶中装入 50 mL 种子培养基，毕赤酵母接种量为 1%，于 30℃，200 r/ min 摇床培养 24 h。
5L 发酵罐发酵培养基及培养条件选择毕赤酵母5L发酵罐发酵培养基：42 g/L甘油，1.2 g/L KH2PO4，18 g/L NH4H2PO4，6.5 g/L MgSO4·7H2O。培养条件：5L发酵罐装液量为3 L，毕赤酵母接种量为 1%，培养温度 30 ℃，pH值 4. 5~ 5. 0，空气流量 4~8 m3/ h，甘油按照0.5-1.0 rpm/30min/次补料，维持DO≥20%；连续发酵 24 h 后，补料甲醇0.1 rpm/h/次，维持DO≥25%。
粗蛋白测定：
（1）收集菌体；
（2）用ddH2O洗涤菌体3次除去固体盐；
（3）处理好的菌体在硫酸的情况下，通过热催化高温氧化反应进行消解反应：通过这种途径，即便是非常稳定、复杂的含氮的化合物都可以在一定数量上被消解；样品直接进入填充的反应管中高温区，在这个区域中样品在载气流中发生高温催化和氧化反应生成NO；经高温分解的气体在一个旋管冷凝器中冷却，然后冷却水在接下来的TIC冷凝管中与测定气体分离，在进一步的干燥并除去腐蚀性气体之后，NO测定用气体通过CLD检测器；氮氧化物的浓度每秒被测定几次，可以得到信号随时间变化的峰图；
（4）峰面积与测定溶液中氮的浓度成比例；
（5）通过使用先前确定的标准曲线可以计算样品中含氮的含量；
（6）在测定出总氮量后，菌体中粗蛋白质含量的计算公式如下: 蛋白质(g/100g)=总氮量(g/100g)×6.25。
库德里阿威兹毕赤酵母Kud-A菌体组成成分检测后发现，粗蛋白含量为56.21g/100g, 氨基酸含量为40.45g/100g, 核苷酸含量9.8g/100g, 脂肪含量>3.3g/100g。Kud-A菌体组成中含有8种必需氨基酸，其中赖氨酸含量为0.61g/100g干重，色氨酸含量为4.41g/100g，苯丙氨酸含量为1.17g/100g，甲硫氨酸含量为1.71g/100g，苏氨酸含量为1.08g/100g，异亮氨酸含量为1.60g/100g，亮氨酸含量为3.21g/100g，缬氨酸含量为2.67g/100g，其营养价值明显。在多种低值碳源开发为单细胞蛋白方面，极具产业化市场前景。利用煤炭工业副产物甲醇为碳源，以车间发酵制造单细胞产品，突破以不依赖耕地的、突破时空生产效率的方式，可以与传统大豆蛋白相竞争，为保障我国粮食安全和缓解蛋白原料短缺具有重要作用。
Claims (8)
1.一种多碳源利用且高蛋白合成的毕赤酵母，其特征在于，其是库德里阿威兹毕赤酵母（Pichia kudriavzevii），其保藏号为：CGMCC NO. 26899。
2.如权利要求1所述的毕赤酵母的培养方法，其特征在于，在含有氮源和碳源的培养基中进行有氧发酵培养。
3.如权利要求2所述的毕赤酵母的培养方法，其特征在于，以甲醇、甘油、乳糖、蔗糖、果糖或阿拉伯糖为唯一碳源进行培养。
4.如权利要求2所述的毕赤酵母的培养方法，其特征在于，培养温度不超45℃。
5.如权利要求4所述的毕赤酵母的培养方法，其特征在于，培养温度为35-39℃。
6.如权利要求3所述的毕赤酵母的培养方法，其特征在于，当以甲醇为唯一碳源时，甲醇浓度不超过3.5%（v/v）。
7.如权利要求2所述的毕赤酵母的培养方法，其特征在于，所述培养为在下述培养基中进行有氧发酵培养：42 g/L甘油，1.2 g/L KH2PO4，18 g/L NH4H2PO4，6.5 g/L MgSO4·7H2O。
8.如权利要求1所述的毕赤酵母在生产单细胞蛋白中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310707630.1A CN116478838B (zh) | 2023-06-15 | 2023-06-15 | 一种多碳源利用且高蛋白合成的毕赤酵母及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310707630.1A CN116478838B (zh) | 2023-06-15 | 2023-06-15 | 一种多碳源利用且高蛋白合成的毕赤酵母及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116478838A CN116478838A (zh) | 2023-07-25 |
| CN116478838B true CN116478838B (zh) | 2023-08-18 |
Family
ID=87218091
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310707630.1A Active CN116478838B (zh) | 2023-06-15 | 2023-06-15 | 一种多碳源利用且高蛋白合成的毕赤酵母及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116478838B (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2019023034A2 (en) * | 2017-07-27 | 2019-01-31 | Locus Agriculture Ip Company, Llc | EFFICIENT PRODUCTION OF PICHIA YEASTS AND USE THEREOF TO IMPROVE PLANT AND ANIMAL HEALTH |
| CN113215006A (zh) * | 2020-12-28 | 2021-08-06 | 西南大学 | 一株毕赤酵母菌及其应用 |
| CN113913309A (zh) * | 2021-09-17 | 2022-01-11 | 中国科学院成都生物研究所 | 一株耐碱酵母及在利用沼液产单细胞蛋白中的应用 |
-
2023
- 2023-06-15 CN CN202310707630.1A patent/CN116478838B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2019023034A2 (en) * | 2017-07-27 | 2019-01-31 | Locus Agriculture Ip Company, Llc | EFFICIENT PRODUCTION OF PICHIA YEASTS AND USE THEREOF TO IMPROVE PLANT AND ANIMAL HEALTH |
| CN113215006A (zh) * | 2020-12-28 | 2021-08-06 | 西南大学 | 一株毕赤酵母菌及其应用 |
| CN113913309A (zh) * | 2021-09-17 | 2022-01-11 | 中国科学院成都生物研究所 | 一株耐碱酵母及在利用沼液产单细胞蛋白中的应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Protein Sources Alternative to Meat: State of the Art and Involvement of Fermentation;Mariagrazia Molfetta等;Foods;第1-30页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116478838A (zh) | 2023-07-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2613365C1 (ru) | Штамм метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus ГБС-15 для получения микробной белковой массы | |
| CN106701606B (zh) | 一种能降解利用餐厨废弃物的基因工程产朊假丝酵母及其构建方法 | |
| CN114480173B (zh) | 一株大肠埃希氏菌及其在发酵生产l-色氨酸中的应用 | |
| Ahmed et al. | Production of microbial biomass protein by sequential culture fermentation of Arachniotus sp. and Candida utilis | |
| CN112226373B (zh) | 一株产蛋白的菌株及其应用 | |
| CN115216414B (zh) | 一种高甲醇转化率且高蛋白的毕赤酵母菌株及其制备方法 | |
| CN101575580B (zh) | 一种富锌酵母及其生产方法 | |
| CN114686386B (zh) | 一种生产甲醇菌体蛋白联产纤维素酶的毕赤酵母及其应用 | |
| US20200109428A1 (en) | Process for producing high protein biomass from starch-containing cereal materials by yeast strains | |
| CN107257851A (zh) | 正面影响天然或工程化的真核细胞的生理学的细菌伴侣蛋白的组合 | |
| RU2706074C9 (ru) | Штамм бактерий Methylococcus capsulatus CONCEPT-8 - продуцент белковой биомассы | |
| JP6966096B2 (ja) | 微生物タンパク質を得るための共棲菌 従属栄養細菌Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｇｉｌａｒｄｉｉ ＧＢＳ−１５−１菌株 | |
| CN116478838B (zh) | 一种多碳源利用且高蛋白合成的毕赤酵母及其应用 | |
| RU2687137C1 (ru) | Штамм гетеротрофных бактерий Klebsiella pneumonia - ассоциант для получения микробной белковой массы | |
| CN105779317B (zh) | 一株高产甲醇蛋白的毕赤酵母菌株及应用 | |
| CN112646740B (zh) | 甲酸基单细胞蛋白菌株ma5及其应用 | |
| CN102226163A (zh) | 一株丙酮丁醇梭杆菌菌株及其应用 | |
| RU2745093C1 (ru) | Штамм метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus BF19-07 - продуцент для получения микробной белковой массы | |
| CN112226380B (zh) | 一株降解纤维素生防芽孢杆菌及其应用和制剂 | |
| CN107177517B (zh) | 高效耐受和利用甲醇的酵母菌株及应用 | |
| RU2720121C1 (ru) | Способ получения микробного белка на основе углеводородного сырья | |
| CN114410486A (zh) | 一株米曲霉菌株及其在饲用蛋白开发方面的应用 | |
| CN113122461A (zh) | 单细胞蛋白生产菌及其应用 | |
| CN109929853A (zh) | 嗜热菌来源的热激蛋白基因的应用 | |
| CN118006516A (zh) | 一种可利用甲醇作为唯一碳源高产菌体蛋白的甲基营养杆菌及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |