CN109929853A - 嗜热菌来源的热激蛋白基因的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供嗜热菌来源的热激蛋白基因的应用，特别是在核黄素发酵生产方面的应用。首先通过生物信息学分析找到与枯草芽孢杆菌近源的嗜热菌热激蛋白，然后将嗜热菌热激蛋白编码基因以质粒的形式导入到枯草芽孢杆菌(B.subtilis 446)中，在不同温度和耐受条件下进行发酵，检测工程菌株生长情况、菌株活力、温度耐受、渗透压耐受等指标，从而筛选到合适的热激蛋白元件和性能提高的工程菌株。实验结果表明，在枯草芽孢杆菌(B.subtilis 446)中异源表达嗜热菌来源的热激蛋白，可以提高发酵温度，减少能耗，提高核黄素的产量，同时缩短了发酵周期。

Description

嗜热菌来源的热激蛋白基因的应用

技术领域

本发明属于微生物工程技术领域，具体地说，涉及嗜热菌来源的热激蛋白基因的应用。

背景技术

核黄素(Riboflavin)又称维生素B₂(Vitamin B₂)，是维持人和动物机体正常物质代谢所必须的维生素，在人体内以FAD和FMN两种形式存在，参与体内的氧化还原反应，起到递氢作用。因动物和人类不能自身合成核黄素，需要适量补充核黄素，故核黄素可用做食品工业中的色素和食品添加剂以及饲料工业中的饲料添加剂。

目前，工业上生产核黄素的方法主要是化学半合成法和微生物发酵法。与化学合成法相比，微生物发酵法具有生产成本低，工艺相对简单，环境友好等优点，利用微生物发酵法生产核黄素已成为一种趋势。工业上微生物发酵的菌种主要为棉囊阿舒氏酵母(Ashbya gossypii)、解朊假丝酵母(Candida famata)、阿舒氏假囊酵母(Eremotheciumashbyii)、酿酒酵母(Saccharomy cescerevisiae)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等。但利用真菌进行核黄素生产时，存在原料成分配比复杂，菌体粘度大，后期分离困难，需加入不饱和脂肪酸来促进核黄素合成等问题。随着基因工程技术的发展，已利用枯草芽孢杆菌成功构建了产核黄素的工程菌。枯草芽孢杆菌具有具有发酵周期短(2-3天)、原料要求简单、产量高、成熟的原核细胞基因工程技术等优点，迅速替代了利用真菌的生产技术。

工业上利用枯草芽孢杆菌生产核黄素的过程中，容易受到环境波动以及发酵过程中代谢不平衡的影响。如热，渗透压，培养基酸化，毒性代谢物的产生等。目前工业上主要用枯草芽孢杆菌来生产核黄素，存在以下缺陷：一是耗能高。目前工业生产中枯草芽孢杆菌发酵温度是37℃，需要大量的冷却水来缓解发酵过程的生物热。二是菌株耐受性差。目前工业上的枯草芽孢杆菌在发酵前期受到高的底物浓度，发酵中后期受到高的产物浓度形成的高渗环境影响。发酵过程中由于热、渗透压、培养基酸化，毒性代谢物的产生等各种不利条件导致菌株中的蛋白质变性，极大影响核黄素的产量。

发明内容

本发明的目的是提供嗜热菌来源的热激蛋白基因的应用。

本发明构思如下：通过增加微生物体内嗜热菌来源的热激蛋白的含量，促进菌体内蛋白质的复性、折叠，从而提高菌体内蛋白质的稳定性，进而提高核黄素产量。

为了实现本发明目的，首先通过生物信息学分析找到与枯草芽孢杆菌近源的嗜热菌热激蛋白，然后将嗜热菌热激蛋白编码基因以质粒的形式导入到枯草芽孢杆菌(B.subtilis 446)中，在不同温度和耐受条件下进行发酵，检测工程菌株生长情况、菌株活力、温度耐受、渗透压耐受等指标，从而筛选到合适的热激蛋白元件和性能提高的工程菌株。

第一方面，本发明提供嗜热菌来源的热激蛋白基因的以下任一应用：

1)在微生物发酵生产中的应用；

2)提高微生物耐热性中的应用；

3)提高微生物耐盐性中的应用。

本发明中，所述嗜热菌来源的热激蛋白基因来自于Geobacillus和Parageobacillus，进一步地，所述基因选自PtDnaJ、PtDnaK、PtGroEL、PtGroES、PtGrpE、GtGrpE、HSP20-1、HSP20-2、HSP20-3、HSP20-4、HSP20-5、PtHSP33、基因模块PtGroEL-PtGroES、基因模块PtDnaK-PtDnaJ-PtGrpE中的至少一种，它们的基因序列分别如SEQ IDNO:1-14所示。其中，PtDnaJ、PtDnaK、PtGrpE、GtGrpE、PtGroEL、PtGroES、HSP20-1、HSP20-2、HSP20-3、HSP20-4、HSP20-5、PtHSP33的GenBank登录号分别为AOT13_16985、AOT13_16990、AOT13_16995、GTNG_2441、AOT13_04590、AOT13_04585、AOT13_04695、AOT13_09800、AOT13_15330、AOT13_15390、GTNG_2094、AOT13_02680。

所述嗜热菌来源的热激蛋白基因，通过质粒导入微生物中或通过基因工程手段整合到微生物染色体上。

所述微生物包括细菌、真菌和古细菌，优选酵母、芽孢杆菌属(Bacillus)、埃希氏菌属(Escherichia)中的菌种，更优选枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)。

所述微生物为核黄素生产菌，优选枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)446，保藏号CGMCC NO.17280。

优选地，所述嗜热菌来源的热激蛋白基因为HSP20-2基因、HSP20-3基因或PtDnaK-PtDnaJ-PtGrpE基因模块。

第二方面，本发明提供嗜热菌来源的热激蛋白基因在核黄素发酵生产中的应用。

第三方面，本发明提供产核黄素的工程菌，所述工程菌的构建方法如下：

A、弱化原始菌株中与核黄素代谢途径相关的基因，获得基因弱化菌株；

所述弱化包括敲除或降低基因的表达；

B、增强原始菌株中与核黄素生物合成途径相关的基因和/或反馈抑制脱敏相关的基因，或者增强步骤A基因弱化菌株中与核黄素生物合成途径相关的基因和/或反馈抑制脱敏相关的基因，获得基因增强菌株。

所述增强的途径选自以下1)～6)，或任选的组合：

1)通过导入具有所述基因的质粒而增强；

2)通过增加染色体上所述基因的拷贝数而增强；

3)通过改变染色体上所述基因的启动子序列而增强；

4)通过将强启动子与所述基因可操作地连接而增强；

5)通过导入增强子而增强；

6)通过使用具有编码高活性的相应酶或蛋白质的基因或等位基因而增强；

C、构建携带嗜热菌来源的热激蛋白基因的质粒；

D、将步骤C中所述携带嗜热菌来源的热激蛋白基因的质粒导入步骤A中所述基因弱化菌株和/或步骤B中所述基因增强菌株中，获得产核黄素的工程菌。

优选地，所述原始菌株选自酵母、芽孢杆菌属(Bacillus)、埃希氏菌属(Escherichia)中的菌种，更优选枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)。

第四方面，本发明提供高温产核黄素的工程菌，所述工程菌为具有核黄素生产能力，且携带有表达嗜热菌来源的热激蛋白基因的质粒。

优选地，出发菌株为B.subtilis 446。

优选地，所述工程菌携带有HSP20-2基因、HSP20-3基因或PtDnaK-PtDnaJ-PtGrpE基因模块，或者相应的基因表达盒。

优选地，所述质粒的出发载体为pUCG3.8，所述质粒包含来自枯草芽孢杆菌的复制子repA以及来自枯草芽孢杆菌的启动子p43。

在本发明的一个具体实施方式中，所述高温产核黄素的工程菌为菌株B.s446-HSP20-3、B.s446-HSP20-2和B.s446-PtDnaK-PtDnaJ-PtGrpE，它们的构建方法具体如下：

1、载体的构建

以pUCG3.8(Reeve et al.2016)为载体骨架。以pDB1s质粒(Lin et al.2015)为模板，利用addA引物aadA-F:TCTAAAATTATCTGAAAAGGGAATGAGGGAAGCGGTGATCGC aadA-R:AACGCGCGAGCGATCGCTCATTTGCCGACTACCTTGGTG，PCR扩增得到含有aadA壮观霉素抗性片段。利用Gibson组装(Gibson et al.2009)将pUCG3.8载体骨架和aadA壮观霉素抗性片段组装成质粒pUCG3.8-spe。以pHCMC04(Reeve et al.2016)质粒为模板，利用引物repA-F:TGATCTTTTCTACCTCGAGGAGAATTAAGAAAGACATGG,repA-R:TCTTCATCGGCGGCGCGCCAAACAAGCCTCAGATGTG，扩增来自于枯草芽孢杆菌的复制子repA作为插入片段。以pUCG3.8-spe为模板，利用引物pucG3.8-spe-F:AACACATCTGAGGCTTGTTTGGCGCGCCGCCGATGAAGATG,pucG3.8-spe-R:TTCCCATGTCTTTCTTAATTCTCCTCGAGGTAGAAAAGATC,扩增载体作为质粒骨架，然后利用Gibson组装(Gibson et al.2009)将repA片段和质粒骨架组装成质粒puBS4.4-spe。以质粒pBE2-p43-kmy(Wang and Doi 1984b)为模板，利用引物P43-F:AGTGAATTCGAGCTCGGTGAACATACGGTTGATTTAATAAC,P43-R:ATCCCCGGGTGAATTCTCCTCCTTTCCTATAATGGTACCGCTATC扩增得到组成型启动子p43作为插入片段，以puBS4.4-spe为模板，利用引物puBS4.4-p43-F:ACCATTATAGGAAAGGAGGAGAATTCACCCGGGGATCCTCTAGAG,puBS4.4-p43-R:ATTAAATCAACCGTATGTTCACCGAGCTCGAATTCACTGG扩增得到质粒骨架，且引物P43-F和引物puBS4.4-p43-R上包含RBS序列aaaggaggagaattc，然后利用Gibson组装(Gibson et al.2009)将启动子p43和质粒骨架组装成质粒puBS4.4-p43(图1)。

根据GenBank中公布的来自于Geobacillus和Parageobacillus的嗜热菌来源的热激蛋白基因序列，人工合成HSP20-2基因、HSP20-3基因、PtDnaK-PtDnaJ-PtGrpE基因模块的DNA片段，然后将DNA片段分别构建到质粒puBS4.4-p43上，得到puBS4.4-HSP20-2、puBS4.4-HSP20-3、puBS4.4-PtDnaK-PtDnaJ-PtGrpE。

2、重组菌的制备

将质粒puBS4.4-HSP20-2、puBS4.4-HSP20-3、puBS4.4-PtDnaK-PtDnaJ-PtGrpE电转到B.subtilis 446中，得到重组菌B.s446-HSP20-2、B.s446-HSP20-3、B.s446-PtDnaK-PtDnaJ-PtGrpE。

第五方面，本发明提供核黄素的生产方法，包括在发酵培养基中对所述核黄素基因工程生产菌或高产核黄素的工程菌进行培养以生产核黄素。包括步骤：(1)培养所述核黄素基因工程生产菌或高产核黄素的工程菌；(2)从步骤(1)得到的菌液或菌体中收集核黄素。

可采用常规方法进行培养，采用典型培养基，其中含有碳源、氮源、矿物质、以及所需要的诸如氨基酸、维生素等微量有机营养物。另外，合成或天然的培养基均可采用。只要菌株可以利用以进行培养，任何碳源和氮源均可采用。

就碳源而言，诸如葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、淀粉水解糖，糖蜜等糖类，以及诸如醋酸、柠檬酸等有机酸均可采用。另外，乙醇等醇类也可以单独或者与其他碳源组合使用。

就有机营养而言，氨基酸、维生素、脂肪酸、核酸，酵母提取物，玉米浆、大豆蛋白分解产物等物质均可采用。当某种营养缺陷型突变株的生长需要一种氨基酸或类似的物质时，优先添加该需要营养物。

就矿物质而言，磷酸盐、镁盐、铁盐、锰盐等均可采用。

培养温度控制在35-50℃，pH6.5-7.4。用上述方法培养4-72h后，培养基中就会积累大量的核黄素。

培养结束后，可以采用常规方法从发酵培养基中收集核黄素。

第六方面，本发明提供一株核黄素生产菌--枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)446，保藏号CGMCC NO.17280。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明通过将嗜热菌来源的热激蛋白基因导入枯草芽孢杆菌，一方面显著提高了菌株的发酵温度，减少冷却水的使用，提高经济效益；另一方面，提高了菌株的耐受性，克服了包括渗透压在内的很多不利因素对菌株的影响，促进菌株体内蛋白质的复性、折叠，从而提高菌株体内蛋白质的稳定性，进而提高核黄素产量。具体如下：

(一)提高了枯草芽孢杆菌(B.subtilis 446)的发酵温度，最高可达50℃，并且提高细胞对温度的耐受和存活率。

(二)提高了菌株对高渗透压的耐受。含有热激蛋白的菌株B.s446-HSP20-3,B.s446-HSP20-2和B.s446-PtDnaK-PtDnaJ-PtGrpE，培养在37℃且含有10％氯化钠高渗培养基中，通过流式细胞仪测定细胞存活情况，培养60min后，3个菌株都显示细胞死亡率下降，并且细胞存活率最好的菌株B.s446-HSP20-3在培养60～180min情况下，相较对照菌株，细胞存活率提高57％～200％。

(三)菌株B.s446-HSP20-3,B.s446-HSP20-2和B.s446-PtDnaK-PtDnaJ-PtGrpE的核黄素的产量都显著提高，并且细胞密度也略有增加。3个菌株在发酵8～24h之后，发酵温度43℃对应的细胞密度相较发酵温度35℃，降低18％-34％，但是3个菌株的核黄素产量在两个温度下基本持平。

(四)缩短了发酵周期。与对照相比，达到相同的产量，菌株B.s446-HSP20-3、B.s446-HSP20-2和B.s446-PtDnaK-PtDnaJ-PtGrpE总耗时更短，进而缩短了发酵周期。

附图说明

图1为本发明实施例1中质粒puBS4.4-p43构建的流程图。

图2为本发明实施例2中14个工程菌株(B.s446中的质粒puBS4.4-p43上表达不同的热激蛋白)和对照菌株(B.s446中仅有空质粒puBS4.4-p43)在44、46、48和50℃的生长情况。

图3为本发明实施例2中菌株B.s446-HSP20-3、B.s446-HSP20-2和B.s446-PtDnaK-PtDnaJ-PtGrpE在44、46、48℃下细胞存活情况。

图4为本发明实施例3中菌株B.s446-HSP20-3、B.s446-HSP20-2和B.s446-PtDnaK-PtDnaJ-PtGrpE在10％NaCl高渗环境下细胞存活情况。

图5为本发明实施例4中菌株B.s446-HSP20-3、B.s446-HSP20-2和B.s446-PtDnaK-PtDnaJ-PtGrpE在35、39和43℃培养72h的细胞密度(a-c)和核黄素产量(d-f)。

图6为本发明本发明实施例2中3个工程菌株(B.s446所含质粒puBS4.4-p43上表达不同的热激蛋白)和对照菌株(B.s446中仅含空质粒puBS4.4-p43)在39℃、41℃、43℃、45℃、47℃和49℃的生长情况。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1高温产核黄素的工程菌的构建

1、载体的构建

以pUCG3.8(Reeve et al.2016)为载体骨架。以PDB1s(Lin et al.2015)为PCR扩增模板，用primer 6.0软件设计扩增addA引物aadA-F:TCTAAAATTATCTGAAAAGGGAATGAGGGAAGCGGTGATCGC aadA-R:AACGCGCGAGCGATCGCTCATTTGCCGACTACCTTGGTG，PCR扩增得到含有aadA壮观霉素抗性片段。利用Gibson组装(Gibson et al.2009)将pUCG3.8载体骨架和aadA壮观霉素抗性片段组装成质粒pUCG3.8-spe。以pHCMC04(Reeve et al.2016)质粒为模板，用primer 6.0软件设计扩增repA引物，repA-F:TGATCTTTTCTACCTCGAGGAGAATTAAGAAAGACATGG,repA-R:TCTTCATCGGCGGCGCGCCAAACAAGCCTCAGATGTG,扩增来自于枯草芽孢杆菌的复制子repA作为插入片段。以pUCG3.8-spe为模板，用primer 6.0软件设计扩增pucG3.8-spe引物，pucG3.8-spe-F:AACACATCTGAGGCTTGTTTGGCGCGCCGCCGATGAAGATG,pucG3.8-spe-R:TTCCCATGTCTTTCTTAATTCTCCTCGAGGTAGAAAAGATC,扩增载体作为质粒骨架，然后利用Gibson组装(Gibson et al.2009)将repA片段和质粒骨架组装成质粒puBS4.4-spe。以质粒pBE2-p43-kmy(Wang and Doi 1984b)为模板，用primer 6.0软件设计扩增P43引物，P43-F:AGTGAATTCGAGCTCGGTGAACATACGGTTGATTTAATAAC,P43-R:ATCCCCGGGTGAATTCTCCTCCTTTCCTATAATGGTACCGCTATC扩增得到组成型启动子p43作为插入片段，以puBS4.4-spe为模板，用primer6.0软件设计扩增puBS4.4-p43引物，puBS4.4-p43-F:ACCATTATAGGAAAGGAGGAGAATTCACCCGGGGATCCTCTAGAG,puBS4.4-p43-R:ATTAAATCAACCGTATGTTCACCGAGCTCGAATTCACTGG扩增得到质粒骨架，且引物P43-F和引物puBS4.4-p43-R上包括RBS序列aaaggaggagaattc，然后利用Gibson组装(Gibson et al.2009)将启动子p43和质粒骨架组装成质粒puBS4.4-p43(图1)。

以菌株P.thermoglucosidasius DSM 2542的基因组为模板，以引物PtDnaJ-F/R,PtDnaK-F/R,PtGrpE-F/R,PtGroEL-F/R,PtGroES-F/R,HSP20-1-F/R,HSP20-2-F/R,HSP20-3-F/R,HSP20-4-F/R,PtH SP33-F/R,PtDnaK-PtDnaJ-PtGrpE-F/R,PtGroEL-PtGroES-F/R扩增得到相应的热激蛋白片段；以含有相应嗜热菌来源的热激蛋白基因的菌株G.thermodenitrificans NG80-2为模板，以引物GtGrpE-F/R,HSP20-5-F/R扩增得到相应的热激蛋白片段(引物序列见表1)。然后，以质粒puBS4.4-p43为模板，分别以引物puBS4.4-PtDnaJ-F/R,puBS4.4-PtDnaK-F/R,puBS4.4-PtGrpE-F/R,puBS4.4-GtGrpE-F/R,puBS4.4-PtGroEL-F/R,puBS4.4-PtGroES-F/R,puBS4.4-HSP20-1-F/R,puBS4.4-HSP20-2-F/R,puBS4.4-HSP20-3-F/R,puBS4.4-HSP20-4-F/R,puBS4.4-HSP20-5-F/R,puBS4.4-PtHSP33-F/R,puBS4.4-PtDn aK-PtDnaJ-PtGrpE-F/R,puBS4.4-PtGroEL-PtGroES-F/R(引物序列表1)进行PCR扩增得到相应的载体片段。利用Gibson组装得到相应的表达热激蛋白的质粒puBS4.4-PtDnaJ,puBS4.4-PtDnaK,puBS4.4-PtGrpE,puBS4.4-GtGrpE,puBS4.4-PtGroEL,puBS4.4-PtGroES,puBS4.4-HSP20-1,puBS4.4-HSP20-2,puBS4.4-HSP20-3,puBS4.4-HSP20-4,puBS4.4-HSP20-5,puBS4.4-PtHSP33,puBS4.4-PtDnaK-PtDnaJ-PtGrpE,puBS4.4-PtGroEL-PtGroES。

表1构建表达热激蛋白的质粒所用引物

2、重组菌的制备

将质粒puBS4.4-PtDnaJ，puBS4.4-PtDnaK，puBS4.4-PtGrpE，puBS4.4-GtGrpE，puBS4.4-PtGroEL，puBS4.4-PtGroES，puBS4.4-HSP20-1，puBS4.4-HSP20-2，puBS4.4-HSP20-3，puBS4.4-HSP20-4，puBS4.4-HSP20-5，puBS4.4-PtHSP33，puBS4.4-PtDnaK-PtDnaJ-PtGrpE，puBS4.4-PtGroEL-PtGroES分别电转到枯草芽孢杆菌B.subtilis 446中，枯草芽孢杆菌由河北河北圣雪大成制药有限责任公司提供，得到菌株B.s446-PtDnaJ，B.s446-PtDnaK，B.s446-PtGrpE，B.s446-GtGrpE，B.s446-PtGroEL，B.s446-PtGroES，B.s446-HSP20-1，B.s446-HSP20-2，B.s446-HSP20-3，B.s446-HSP20-4，B.s446-HSP20-5,B.s446-PtHSP33,B.s446-PtDnaK-PtDnaJ-PtGrpE,B.s446-PtGroEL-PtGroES。

本发明中，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)446为具有核黄素生产能力的工程菌，是对枯草芽孢杆菌168菌株进行基因工程改造得到的。菌株446现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCC NO.17280，保藏日期2019年3月4日。

实施例2高温对重组菌的影响

1、细胞浓度的测定

为了更加精确的测定高温对菌株的影响，采取了两种方案来测定细胞浓度。方案A：将单克隆接种到含有50mL LB培养基的250mL锥形瓶中，39℃,220rpm培养12h，然后取发酵液转接到含有50mL LB培养基的250mL锥形瓶中，以接种后的培养基初始OD值为0.1的接种量进行转接。转接后首先41℃,220rpm培养12h，然后每隔12h培养温度提升2℃，直到培养60h培养温度达到49℃。在这个过程中，每隔12h取一次样，使用分光光度计测定OD₆₀₀值，空白对照是不含细胞的培养基。方案B与方案A不同之处为以接种后的培养基初始OD值为0.1的接种量进行转接后，分别用44℃、46℃、48℃、50℃恒温培养，培养60h后测定四个温度下OD₆₀₀值。

相比对照(含有质粒puBS4.4-p43的B.subtilis 446)，除了B.s446-HSP33和B.s446-PtGroES，其他的菌株都不同程度地提高了细胞密度，其中菌株B.s446-HSP20-3、B.s446-HSP20-2和B.s446-PtDnaK-PtDnaJ-PtGrpE细胞密度最高，选择这3个菌株在44、46、48、50℃培养条件下进行培养，流式细胞仪测定细胞活性表明在四个温度下细胞活性都有增加，其中菌株B.s446-HSP20-3活性最高。热激蛋白HSP20-3、HSP20-2或PtDnaK-PtDnaJ-PtGrpE在较高的温度44-50℃情况下，细胞密度增加，细胞死亡减少，这些结果表明热激蛋白HSP20-3、HSP20-2或PtDnaK-PtDnaJ-PtGrpE能够增加B.subtilis 446对温度的耐受(图2)。

方案A结果如图6所示，使用分光光度计测量菌株B.s446-HSP20-3、B.s446-HSP20-2和B.s446-PtDnaK-PtDnaJ-PtGrpE的OD₆₀₀值，3个菌株在39℃、41℃、43℃、45℃、47℃和49℃培养条件下，细胞密度增加。可见，该结果也表明热激蛋白HSP20-3、HSP20-2或PtDnaK-PtDnaJ-PtGrpE能够增加B.subtilis 446对温度的耐受。

2、流式细胞仪测定细胞活力

为测定菌株B.s446-HSP20-3、B.s446-HSP20-2和B.s446-PtDnaK-PtDnaJ-PtGrpE在高温发酵条件下的细胞活力，将过夜培养的发酵液按1％转接到含有50mL LB培养基的250mL锥形瓶中，分别放置在44℃、46℃、48℃下恒温培养，使用流式细胞仪测定12、24、36、48、60h的发酵液中菌株的细胞活力。样品处理：首先取100μl样品，用300μl PBS重悬，加入2μl PI。流式细胞仪上机流程为：设定仪器的激发光为488nm,最大发射光为580nm，使用较低的流速直到收集20000个细胞，使用软件FlowJo FC 7.6.1版本进行数据分析。结果见图3。

实施例3高渗透压对重组菌的影响

B.subtilis 446在发酵过程中生长容易受到发酵产物核黄素带来的高渗透压的影响。将含有热激蛋白的菌株B.s446-HSP20-3、B.s446-HSP20-2和B.s446-PtDnaK-PtDnaJ-PtGrpE培养在37℃且含有10％氯化钠高渗培养基中，模拟菌株发酵过程中的高渗环境。

为了测定菌株B.s446-HSP20-3、B.s446-HSP20-2和B.s446-PtDnaK-PtDnaJ-PtGrpE在高渗条件下的细胞活力，将单克隆接种到含有50mL LB培养基的250mL锥形瓶中，37℃，220rpm培养12h，然后取发酵液转接到含有50mL LB培养基的250mL锥形瓶中，以接种后的培养基初始OD值为0.1的接种量进行转接，转接后继续37℃，220rpm培养12h后在指数生长期在培养基中加入NaCl保证终浓度为10％(w/v)，在培养0,30,60、90、120、150和180min后依次取样，用0.9％的NaCl溶液稀释，然后用流式细胞仪测定细胞活力。

通过流式细胞仪测定细胞存活情况，在培养60min的情况下，3个菌株都显示细胞死亡率下降，并且细胞存活率最好的菌株B.s446-HSP20-3在培养60m～180min后，相较对照菌株，细胞存活率提高57％～200％。这些结果表明热激蛋白HSP20-3、HSP20-2或PtDnaK-PtDnaJ-PtGrpE能显著提高B.subtilis 446对高渗透压的耐受(图4)。

实施例4生物量和核黄素产量的测定

通过测定OD₆₀₀的值来反应细胞生长状况，为比较导入了热激蛋白的工程菌株和未导入热激蛋白的菌株在不同发酵温度的生长状况，将含有热激蛋白的菌株以及不含热激蛋白的菌株过夜培养后按1％转接到300mL LB液体培养基中，当OD₆₀₀的值达到1.0，将300mL培养基平均分装到250mL容量的三角瓶中，分别在35℃、39℃和43℃下培养。在4、8、12、24、36、48、60和72h测定OD₆₀₀值的菌株核黄素的产量。分别在35℃、39℃、43℃发酵条件下，取4、8、12、24、36、48、60和72h的发酵液测定核黄素的产量。样品先用0.05M NaOH溶液稀释，16,000g离心2min取上清进行HPLC检测。检测波长为370nm,根据吸收峰值估算发酵液内核黄素的产量。流动相组成：60％水，10％甲醇，20％乙腈，10％磷酸(2mM)，流速为1mL/min。

将菌株B.s446-HSP20-3、B.s446-HSP20-2和B.s446-PtDnaK-PtDnaJ-PtGrpE在35、39和43℃下进行发酵。HPLC测定核黄素产量，结果表明，3个菌株都显著地提高了核黄素的产量并且细胞密度也有少量的增加。其中，菌株B.s446-HSP20-3在发酵温度为39℃和43℃的情况下，核黄素产量分别增加38％-59％和41％-66％，菌株B.s446-HSP20-2核黄素产量分别增加23％-43％和23％-50％，菌株B.s446-PtDnaK-PtDnaJ-PtGrpE核黄素产量分别增加21％-36％和21％-33％。(图5，d-f)

细胞密度方面，菌株B.s446-HSP20-3的细胞密度分别提高了13％-27％和12％-26％，菌株B.s446-HSP20-2的细胞密度分别提高了8％-20％和4％-15％，菌株B.s446-PtDnaK-PtDnaJ-PtGrpE的细胞密度分别提高了8％-20％和4％-15％。而且，这3个菌株在发酵8～24h，43℃下的细胞密度相比于在35℃情况下降低18％-34％(图5，a-c)。但3个菌株的产量在这两个温度下基本持平。可见，在较高温度下，不仅由于细胞密度的增加，同时也因为增加了核黄素的生物合成效率，这两方面的因素最终使核黄素的产量有显著提高。与对照相比，达到相同的产量，菌株B.s446-HSP20-3、B.s446-HSP20-2和B.s446-PtDnaK-PtDnaJ-PtGrpE用时更短，进而缩短了发酵周期(图5，d-f)。

实施例5 qPCR测定目的基因的表达

在指数生长中期收集菌体后立即冻存到液氮中，使用天根公司RNAprep PureCell/Bacteria Kit试剂盒，按说明书操作得到总RNA。使用Takara公司试剂盒PrimeScript^TMRT Reagent kit得到单链cDNA。以cDNA为模板，使用ABI7500进行PCR扩增，引物如表2所示。PCR扩增所用试剂盒为Premix Ex Taq^TMII(Tli RNaseH Plus)和ROX plus(TaKaRa,Japan).按照说明书进行操作。扩增完毕使用软件7500software(v2.0.4)进行结果分析，使用管家基因gap作为参考基因。

该实验结果说明构建在载体上的嗜热菌来源的热激蛋白基因能够在枯草芽孢杆菌中表达。不同热激蛋白的相对转录水平如表3所示。

表2 qPCR测定基因表达所用引物

表3不同热激蛋白及其在枯草芽孢杆菌446中45℃热激12h后的转录情况

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

参考文献

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序列表

<110> 中国科学院微生物研究所

河北圣雪大成制药有限责任公司

<120> 嗜热菌来源的热激蛋白基因的应用

<130> KHP191111080.2

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1143

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggcgaaac gagattatta tgaaattctc ggagttagca aaaacgcgac aaaagaagag 60

ataaaaaaag cgtatcggaa actttcgaaa aaatatcatc cagatattaa taaagaaccg 120

gatgcggcag aaaagttcaa agaaattaaa gaagcgtacg aagtgctaag cgatgaccaa 180

aagcgggcgc attacgatca gtttgggcat gcggatccga accaaggttt cggcgggttt 240

cgcagcgatg attttgactt tggcggtttc agcggtttca gtggcttcga tgatattttc 300

agcacctttt ttggcggcgg gcgccggcgt gatccaaatg cgccaagagc tggcgccgat 360

ttgcaatata cgatgacatt gacgtttgaa gaggcggtat tcggcaaaga aacggatatt 420

gaaattccaa gggaagaaac atgcaatact tgccatggca caggagctaa gccaggcacg 480

aaaaaagaaa catgttcata ttgccatgga acagggcaaa tcagcacaga gcaatcgaca 540

ccgtttggcc gcatcgtcaa tcgccgcaca tgcccatatt gcggcggaac cgggcaatac 600

attaaggaaa gatgcacaac atgcggcggc actggccgcg taaaacggcg gaaaaaaatc 660

catgtgaaaa ttccggctgg aatcgatgat ggtcagcaat tacgtgtcgc tggccaagga 720

gaaccgggca ttaacggcgg gcctccgggg gatttatata tcgttttcca cgtagagccg 780

catgaatttt ttgagcgcga tggcgacgac atttattgtg aaatcccgct tacatttgct 840

caagctgcgc ttggcgacga aattgaagtg ccgacacttc atggaaaagt gagactgaaa 900

ataccggcag gcacgcaaac aggcacaaaa ttccgcttga aaggaaaggg agtgccgaat 960

gtccgcggct acggctatgg cgaccagcat gtgattgtcc gtgttgtgac accgacaaaa 1020

ctgacggaaa agcagaagca attgttgcgc gaatttgatc aattaggcgg ttcaagcatg 1080

catcaaggac cacacggccg cttttttgaa aaagtaaaaa aagcgtttaa aggggaatca 1140

tga 1143

<210> 2

<211> 1833

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgagtaaaa ttatcgggat tgacttagga acaaccaact catgcgtcgc tgtccttgag 60

ggcggtgagc caaaagtaat tccaaacccg gaaggaagcc ggacaactcc ttctgttgtg 120

gcgtttaaaa acggggaacg tctagtcggg gaagtcgcga aacgccaagc aatcacaaac 180

ccaaacacga tcatttcgat taaacgccat atgggaacgg actataaagt agagatcgaa 240

ggcaaaaaat atacgccgca agaaatttct gcgattattt tacaatactt aaaatcgtat 300

gcggaagact atttgggcga gccggtgaca agagcggtta ttaccgttcc agcttacttt 360

aatgatgcgc aacgtcaagc aacaaaagac gctggacgta tcgccggttt acaagtagag 420

cgcatcatta acgagccgac agccgctgcg cttgcgtacg gtttggataa agaagaagat 480

caaacgatcc tcgtttatga cttgggaggc ggtacgtttg acgtatcgat tcttgagctt 540

ggcgacggcg tgtttgaagt aaaagcgacg gccggcgata accatcttgg cggggatgac 600

ttcgaccaag tgattatcga ctacttagtg gaacaattca aacaagaaca cggcattgat 660

ttatccaaag acaaaatggc gctgcaacgt cttaaagacg ctgcggaaaa ggcgaaaaaa 720

gaactttctg gcgtaacgca aacgcaaatt tcgctgccgt ttatcagcgc gaacgaaaca 780

gggccgctgc acattgaaac aacattaaca agagcgaaat ttgaagagct gtctgcccat 840

cttgttgaac ggacaatggg accggtccgc caggcgttgc aagatgcggg cttgactcct 900

gccgatatcg acaaagtgat ccttgtcggc ggttcgacac gcattccggc tgtgcaggaa 960

gcgattaaac gtgagcttgg aaaagagccg cataaagggg ttaacccgga tgaagttgta 1020

gcgattggcg cggcgatcca aggcggtgtg atcgctggag aagtgaaaga tgttgttctg 1080

cttgacgtca ctccgctgtc gcttggcatt gaaacaatgg gcggcgtgtt cacaaaatta 1140

attgaacgca acacgacgat tccgacaagc aaatcgcaaa ttttcactac cgcggcggat 1200

aaccagacga cggtcgatat tcatgtactg caaggcgaac gtccgatggc agccgacaac 1260

aaaacgctcg gccgtttcca attaaccgat attccgccgg caccgcgcgg cgtaccacaa 1320

atcgaagtaa catttgatat cgacgccaac ggtattgttc atgtccgcgc aaaagattta 1380

gggacaaaca aagagcaatc gataacgata aaatcgtcat caggtctttc cgaagaagaa 1440

atccagcgca tgattaaaga agcggaagaa aatgccgaag cggacagaaa acggaaagaa 1500

gcggcagaac tccgcaatga agcggatcac ttagtgttca caacggaaaa aacgttgaaa 1560

gaagtggaag gaaaagtaga cgaagcggaa gtgaaaaaag cgcgcgaagc aaaagacgcg 1620

ttaaaagcgg cgcttgagaa aaacgacatc gatgacattc gcaaaaagaa agaagcgctt 1680

caggaaatcg tgcagcagct ttccgttaag ctgtacgaac aagcagcaaa acaagcgcaa 1740

gcccaacaac agacgggagc cggcgacgct gcgaaaaaag acgataatgt tgtcgatgcg 1800

gaattcgaag aagtgaaaga cgacaacaaa taa 1833

<210> 3

<211> 1620

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggcaaaag aaattaaatt cagcgaagaa gctcgtcgtg cgatgctgcg cggtgttgac 60

aaactagctg atgcagtaaa agtaacgtta ggtccaaaag gccgtaacgt tgtattagag 120

aaaaaattcg gttctccatt aattacaaac gacggtgtta cgatcgcgaa agaaatcgaa 180

ttagaagacc catttgaaaa catgggtgcg aagcttgttg ctgaagttgc aagcaaaaca 240

aacgatgttg ctggggacgg tacaacaaca gcgacagttt tagctcaagc gatgatccgt 300

gaaggcttaa agaacgtaac agctggcgca aacccaatgg gaatccgcaa aggtattgaa 360

aaagcggttg ctgtagcggt agaagaatta aaagcaatct ccaaaccaat ccaaggaaaa 420

gaatcgatcg cgcaagttgc ggctatttct gcggctgacg aagaagttgg ccaattaatt 480

gcagaagcaa tggaacgcgt cggcaacgac ggtgttatca cattagaaga atcaaaaggt 540

ttcacaacag aattagatgt tgtggaaggt atgcaatttg accgcggtta tgcgtctcca 600

tacatgatca cagatacaga aaaaatggaa gcagtgcttg aaaatccata tatcttaatc 660

actgacaaaa aaatctcgaa cattcaagac atcttgccta tcttagaaca agttgttcaa 720

caaggcaaac cattgttaat catcgcggaa gacgtcgaag gcgaagcgct tgcaacatta 780

gttgttaaca aacttcgcgg cacgttcact gcggtagcgg ttaaagcgcc tggcttcggt 840

gatcgccgta aagcaatgtt ggaagacatc gcaatcttaa ctggcggtga agtcatctcc 900

gaagaattag gacgcgaatt aaaatcaaca acaattgcat cacttggccg cgcttcgaaa 960

gttgttgtaa cgaaagaaaa tacaacaatc gttgaaggcg ctggcgattc tgaacgcatt 1020

aaagctcgca tcaaccaaat ccgcgctcaa ttagaagaaa ctacttctga attcgaccgc 1080

gaaaaattac aagaacgttt ggcaaaactt gctggcggcg tagcggtcat caaagttggt 1140

gcagcgacag aaacagaatt gaaagaacgc aaattgcgca ttgaagacgc gctcaactct 1200

actcgtgcgg ctgtcgaaga aggtatcgta gccggcggtg gtacggcatt aatgaacgta 1260

tataacaaag ttgctgcgat cgaagcagaa ggcgacgaag caactggtgt gaaaatcgtt 1320

cttcgcgcaa tcgaagagcc agttcgccaa atcgcgcaaa acgctggttt ggaaggctct 1380

gtcattgttg aacgcttaaa atccgaaaaa cctggcatcg gcttcaacgc tgctactggc 1440

gaatgggtaa acatgatcga agctggtatt gttgacccaa cgaaagtaac tcgctccgct 1500

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aaaccagaag aaaacaaagg cggcaatagc ggaatgcctg acatgggcgg aatgatgtaa 1620

<210> 4

<211> 285

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtgataaagc cattaggtga tcgcgttgtc attgaaatcg ttgaaacgga agaaaaaact 60

gcaagcggta tcgtattgcc agatactgca aaagaaaaac cgcaagaagg caaagttgtt 120

gccgttggaa aaggacgcgt acttgacaac ggtcaacgcg tagctccaga agtggaagtt 180

ggcgatcgca ttatcttctc gaaatatgcg ggtacagaag tgaaatatga cggcaaagaa 240

tacttaattt tgcgtgaaag cgatattttg gctgtgattg gttaa 285

<210> 5

<211> 675

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggagaaag aacgcgatgt ggcgcaagaa caagctacat acgaacagga gtcgccaaat 60

gcagagcggc aagaggaact aaaggagaat gagcatcagg agaaaaacgc gccagaagag 120

caggaaaagg tccgggaaga aaacggccgg caggatgcgc aaaaagatga aataggcgat 180

ccggaaaaag cgaaagaaga acaaaacgaa gaattggcgg cggcaaacgc caaaattgcc 240

gaattggaag cgaaaataaa agagatggaa aaccgctatc ttcgtttata tgctgatttt 300

gaaaatttcc gccgccgcac gcgacgagaa atggaagcgg cagaaaaata ccgcgcccag 360

agcttagtta gcgatctttt gcctgttttg gacaactttg aacgcgcgtt aaaaataaag 420

gcggaagacg aacaagccaa atcgattttg caaggaatgg aaatggtgta ccgttccgta 480

ttggacgcgc tgaaaaaaga aggagtcgaa gcgatcgaag cggtcggcaa accgttcgac 540

ccgcatttgc atcaggcggt gatgcaagtg gaagacagca actatgagcc gaacacggtt 600

gtggaagagc tgcaaaaagg ctataagcta aaagatcgcg tcattcgtcc agcaatggtc 660

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<210> 6

<211> 663

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttattggctc acttttacca tagcgggacg gagaatgcgg tcttttaact tatagccttt 60

ttgcagctcc tccacgaccg tattcggctc atagccgcct tcatccgtct gcataactgc 120

ttggtgtaaa tggggatcaa acggtttgcc aaccgcttca atcacctcga caccttcttt 180

tcttaacgcg tcaaggagcg aacggtacac catttctacc ccttgcaaaa tcgattttgc 240

ttgttcgttt tccgtctcta ttttcaacgc acgctcaaag ttgtcgagca caggaagcaa 300

atcgctcgcc aaactttggg cgcggtattt ttcagccgct tccatctctt gacgtgcccg 360

gcggcggaag ttttcaaaat cagcgtacag gcgaagatag cgcttttcca tctcagctaa 420

cttctcttcc aattcagcaa cttgcgcctt ggctttggcc agttcttccg cctcaaccga 480

cgtttgctcg gcaggatcag ctgtcgtaga agctgcctcc ggattctcgc cggcttgtgc 540

atctgcatgc tccgaagcgg cgccaatggc ttcgtcttcc ggttgcgaat ctgccccttc 600

tttcgaaacc ggctgttccg tttccagctc attgtatgta gcttgtttgt ctccttgttc 660

cat 663

<210> 7

<211> 447

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gtgaagtcaa atccatttga tccgtttttc gactggacaa aacatttgga gcattttttt 60

caaggagatt tttggagcag ctttcaaccg ttcctgccgc cagcaaaaaa gcaatctggt 120

atatctggta taaatatata taaaaaagat aatgagttat taatcgttgt cagtttgcct 180

ggattagaaa aaatggaaga tgttgaactt tacgtgtact ataaaacgtt ggaaattaaa 240

gcgaatatca atttgcagtt taaagggttc gaattaattg aagaaggaat ttttcaagga 300

acatgggaaa aaacgatccc aattcctttt gcgataaagg aagaccgaat tgaagcgaca 360

tatcacaacg gtctattgtt tattcatctt catcgtctca tccctgacga aacaaaaaag 420

aaaatcgaaa taaaaaaagg ggaatag 447

<210> 8

<211> 384

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ttggaaaaca ggaaaaaaac agaacaacat gagttgcgta agtggcttga tttgttatgc 60

ggtgaatcgt tcacatgcga attagatgaa aagacattcc ggattgacgt ttttgaaacg 120

gatactcatt acattatcga agcagaaatt cccaactgtc ttaaagaaca actaaccgtt 180

ctttgtgaaa caaacgcgat catcatccaa attcataaag aaaaagcgct ttggaaacag 240

cgggctgttc ctttgccgtt tccgcttcaa cataaacaaa tttgcgctta tttttccgat 300

ccaacattag aaatccatat aagtaaagcc gaaaatgcaa acaatacaaa ccggtatgcg 360

atcatgataa acgagagaaa ctga 384

<210> 9

<211> 444

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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atggctttaa ttccttacga tccatttcac catctcgaaa caatgcgtag agatctgaac 60

cgatttttcg caacagattt tccgtctctc ttttcgcata tggaagatca tatcagaatg 120

ccgcgcatgg atatgcacga aacagaaacc gaatatgtcg tctcctgcga tcttccgggc 180

ttggagaaaa aagaagacgt gcatatcgac gtacacaaca atattttaac cattagcgga 240

actgtccagc gccaccaaaa cataaaagaa gaacaaatgc atcgccggga acgctttttc 300

ggccgttttc aacgttctat tacgctgcca tccgatgcag cgacagacaa cataaaagcg 360

acatataaaa acggcgtgct cgatattcac atcccaaaaa caacatccgg tccgaaaaag 420

cgcgtcgata tcgaatttca ttaa 444

<210> 10

<211> 474

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atgagcgatc attttcagcc gccgatgaaa aaagaaggga atcatcataa cccgttccaa 60

catttatggg agatggtcgg ccaatttttt gatgaacggc cattaaaaaa catgatggaa 120

acgttggatg aatactttca gcaaacgttt tcccatgcgt atatcccggt ggatttccgc 180

gaaacgaaag atgaattcgc aatgatcgtt catcttcccg atgatgttaa gcggcatcaa 240

cttcagttgc aatttgccaa tgaccatctg caactagtca ttcaaaataa cgaaataatc 300

gaaacggcgg atgagcaaaa tcatttgtac caacagcgcc gaatgcgcca gcagattgtc 360

cgaacgatcc cattgcctta ccgcgtcagc gaaaaagaag tgaaagcgtc atggcaaaac 420

ggcaaacttg tcatccgtct gccgcaaaaa cgaaaatata tcgatattga ataa 474

<210> 11

<211> 465

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atgaatgaac cgtttcagcc gccagccggc aggggaggag atcacccatt ccaccattta 60

cggaaaatgg taaatcaatg gtttgatgaa cggccgctgc aaaaattatt tgaaacactt 120

gacgactact tcgcgcaaac atttgctgaa gcatatatcc cgatcgaagt gaaagaaacg 180

aaacacgatt accaactcat cgtccggctg cccgacatca aacgggagca aatcagccta 240

caatggcacg aagacgggct gcagcttatc atcgatcatc aggaaatgat cgaatcagcc 300

gacgccaacg gtcatgtata cgagcgacag caagcgcggc ggcgcgtgac gagggtgatc 360

ccgtttccgt atccggttgc cgaacatgaa gtgaaagcgt cgttccaaaa cggcacgctc 420

atcatccgac tgccgcaaaa gcggaaatac attgacattg agtga 465

<210> 12

<211> 891

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atgtcagact acttagtaaa ggctttagct tatgatggac aagtaagagc gtatgctgct 60

cgaacaacag atacagtaag cgaggcgcag cgccgccatc aaacatggcc gactgcttcc 120

gcggcgcttg gccgggctat tacggcggga gtcatgatgg gagccatgtt aaagggtgat 180

gataaattaa cgattaaaat tgatggcggc ggtccgattg gcaccatcct cgtcgacagc 240

aatgcgaagg gagaggtgcg tgggtacgta acaaatccac acgtccactt tgatttaaac 300

gaacatggga aattggacgt cgccaaagcg gtaggcacaa acggcatgtt aacggtcgta 360

aaagatttag ggctgcgcga ttttttcaca gggcaagtgc cgattgtctc aggagaactt 420

ggtgaagatt ttacgtatta ttttgcttct tctgagcaag ttccatcttc tgtcggcgtc 480

ggtgtgcttg tcaatcccga taacacgatc ttggcggcgg gaggctttat catccagctg 540

atgccgggaa cggaagagaa gacaattgat gagattgaaa aacgcttgcg gactattcca 600

cctgtctcga aaatggtaga gagtggattg acgccagaag agattttgga agagttgctt 660

ggaaaaggaa atgtcaaagt gctagaaaca attccagtcg cgtttgtttg ccgctgttcg 720

cgggagcgaa ttgcggatgc gttgatcagt ttaggcgcgc aggaaattca agacattatc 780

gacaaagaag ggtatgctga agcgtcatgc catttctgca atgaaacgta ccatttcagc 840

aaagaggaac tccagcagct gaaacagctt gctgatgcga aagaagaata a 891

<210> 13

<211> 1976

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gtgataaagc cattaggtga tcgcgttgtc attgaaatcg ttgaaacgga agaaaaaact 60

gcaagcggta tcgtattgcc agatactgca aaagaaaaac cgcaagaagg caaagttgtt 120

gccgttggaa aaggacgcgt acttgacaac ggtcaacgcg tagctccaga agtggaagtt 180

ggcgatcgca ttatcttctc gaaatatgcg ggtacagaag tgaaatatga cggcaaagaa 240

tacttaattt tgcgtgaaag cgatattttg gctgtgattg gttaatatat agcgttgata 300

acatagatgt gcaaaaaaat acttaacgat ttcattttac aaggaggtaa cggggtatgg 360

caaaagaaat taaattcagc gaagaagctc gtcgtgcgat gctgcgcggt gttgacaaac 420

tagctgatgc agtaaaagta acgttaggtc caaaaggccg taacgttgta ttagagaaaa 480

aattcggttc tccattaatt acaaacgacg gtgttacgat cgcgaaagaa atcgaattag 540

aagacccatt tgaaaacatg ggtgcgaagc ttgttgctga agttgcaagc aaaacaaacg 600

atgttgctgg ggacggtaca acaacagcga cagttttagc tcaagcgatg atccgtgaag 660

gcttaaagaa cgtaacagct ggcgcaaacc caatgggaat ccgcaaaggt attgaaaaag 720

cggttgctgt agcggtagaa gaattaaaag caatctccaa accaatccaa ggaaaagaat 780

cgatcgcgca agttgcggct atttctgcgg ctgacgaaga agttggccaa ttaattgcag 840

aagcaatgga acgcgtcggc aacgacggtg ttatcacatt agaagaatca aaaggtttca 900

caacagaatt agatgttgtg gaaggtatgc aatttgaccg cggttatgcg tctccataca 960

tgatcacaga tacagaaaaa atggaagcag tgcttgaaaa tccatatatc ttaatcactg 1020

acaaaaaaat ctcgaacatt caagacatct tgcctatctt agaacaagtt gttcaacaag 1080

gcaaaccatt gttaatcatc gcggaagacg tcgaaggcga agcgcttgca acattagttg 1140

ttaacaaact tcgcggcacg ttcactgcgg tagcggttaa agcgcctggc ttcggtgatc 1200

gccgtaaagc aatgttggaa gacatcgcaa tcttaactgg cggtgaagtc atctccgaag 1260

aattaggacg cgaattaaaa tcaacaacaa ttgcatcact tggccgcgct tcgaaagttg 1320

ttgtaacgaa agaaaataca acaatcgttg aaggcgctgg cgattctgaa cgcattaaag 1380

ctcgcatcaa ccaaatccgc gctcaattag aagaaactac ttctgaattc gaccgcgaaa 1440

aattacaaga acgtttggca aaacttgctg gcggcgtagc ggtcatcaaa gttggtgcag 1500

cgacagaaac agaattgaaa gaacgcaaat tgcgcattga agacgcgctc aactctactc 1560

gtgcggctgt cgaagaaggt atcgtagccg gcggtggtac ggcattaatg aacgtatata 1620

acaaagttgc tgcgatcgaa gcagaaggcg acgaagcaac tggtgtgaaa atcgttcttc 1680

gcgcaatcga agagccagtt cgccaaatcg cgcaaaacgc tggtttggaa ggctctgtca 1740

ttgttgaacg cttaaaatcc gaaaaacctg gcatcggctt caacgctgct actggcgaat 1800

gggtaaacat gatcgaagct ggtattgttg acccaacgaa agtaactcgc tccgctctgc 1860

aaaacgcagc ttctgttgcc gctatgttct taacaacaga agcagttgtc gctgacaaac 1920

cagaagaaaa caaaggcggc aatagcggaa tgcctgacat gggcggaatg atgtaa 1976

<210> 14

<211> 3819

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

atggagaaag aacgcgatgt ggcgcaagaa caagctacat acgaacagga gtcgccaaat 60

gcagagcggc aagaggaact aaaggagaat gagcatcagg agaaaaacgc gccagaagag 120

caggaaaagg tccgggaaga aaacggccgg caggatgcgc aaaaagatga aataggcgat 180

ccggaaaaag cgaaagaaga acaaaacgaa gaattggcgg cggcaaacgc caaaattgcc 240

gaattggaag cgaaaataaa agagatggaa aaccgctatc ttcgtttata tgctgatttt 300

gaaaatttcc gccgccgcac gcgacgagaa atggaagcgg cagaaaaata ccgcgcccag 360

agcttagtta gcgatctttt gcctgttttg gacaactttg aacgcgcgtt aaaaataaag 420

gcggaagacg aacaagccaa atcgattttg caaggaatgg aaatggtgta ccgttccgta 480

ttggacgcgc tgaaaaaaga aggagtcgaa gcgatcgaag cggtcggcaa accgttcgac 540

ccgcatttgc atcaggcggt gatgcaagtg gaagacagca actatgagcc gaacacggtt 600

gtggaagagc tgcaaaaagg ctataagcta aaagatcgcg tcattcgtcc agcaatggtc 660

aaagtgagcc aataacgcgt tataggaggg tgatattgat atgagtaaaa ttatcgggat 720

tgacttagga acaaccaact catgcgtcgc tgtccttgag ggcggtgagc caaaagtaat 780

tccaaacccg gaaggaagcc ggacaactcc ttctgttgtg gcgtttaaaa acggggaacg 840

tctagtcggg gaagtcgcga aacgccaagc aatcacaaac ccaaacacga tcatttcgat 900

taaacgccat atgggaacgg actataaagt agagatcgaa ggcaaaaaat atacgccgca 960

agaaatttct gcgattattt tacaatactt aaaatcgtat gcggaagact atttgggcga 1020

gccggtgaca agagcggtta ttaccgttcc agcttacttt aatgatgcgc aacgtcaagc 1080

aacaaaagac gctggacgta tcgccggttt acaagtagag cgcatcatta acgagccgac 1140

agccgctgcg cttgcgtacg gtttggataa agaagaagat caaacgatcc tcgtttatga 1200

cttgggaggc ggtacgtttg acgtatcgat tcttgagctt ggcgacggcg tgtttgaagt 1260

aaaagcgacg gccggcgata accatcttgg cggggatgac ttcgaccaag tgattatcga 1320

ctacttagtg gaacaattca aacaagaaca cggcattgat ttatccaaag acaaaatggc 1380

gctgcaacgt cttaaagacg ctgcggaaaa ggcgaaaaaa gaactttctg gcgtaacgca 1440

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aacattaaca agagcgaaat ttgaagagct gtctgcccat cttgttgaac ggacaatggg 1560

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ccttgtcggc ggttcgacac gcattccggc tgtgcaggaa gcgattaaac gtgagcttgg 1680

aaaagagccg cataaagggg ttaacccgga tgaagttgta gcgattggcg cggcgatcca 1740

aggcggtgtg atcgctggag aagtgaaaga tgttgttctg cttgacgtca ctccgctgtc 1800

gcttggcatt gaaacaatgg gcggcgtgtt cacaaaatta attgaacgca acacgacgat 1860

tccgacaagc aaatcgcaaa ttttcactac cgcggcggat aaccagacga cggtcgatat 1920

tcatgtactg caaggcgaac gtccgatggc agccgacaac aaaacgctcg gccgtttcca 1980

attaaccgat attccgccgg caccgcgcgg cgtaccacaa atcgaagtaa catttgatat 2040

cgacgccaac ggtattgttc atgtccgcgc aaaagattta gggacaaaca aagagcaatc 2100

gataacgata aaatcgtcat caggtctttc cgaagaagaa atccagcgca tgattaaaga 2160

agcggaagaa aatgccgaag cggacagaaa acggaaagaa gcggcagaac tccgcaatga 2220

agcggatcac ttagtgttca caacggaaaa aacgttgaaa gaagtggaag gaaaagtaga 2280

cgaagcggaa gtgaaaaaag cgcgcgaagc aaaagacgcg ttaaaagcgg cgcttgagaa 2340

aaacgacatc gatgacattc gcaaaaagaa agaagcgctt caggaaatcg tgcagcagct 2400

ttccgttaag ctgtacgaac aagcagcaaa acaagcgcaa gcccaacaac agacgggagc 2460

cggcgacgct gcgaaaaaag acgataatgt tgtcgatgcg gaattcgaag aagtgaaaga 2520

cgacaacaaa taataattca ggaaaaagtc aaagtcaggc ctgtcttggc tttgactttt 2580

tttctaatag ggagatggcg gttaaattta ttgcaatgaa aaagaaataa gtgataaaat 2640

tacccttatg tgagtgatcg ggagtggatg atgattatgg cgaaacgaga ttattatgaa 2700

attctcggag ttagcaaaaa cgcgacaaaa gaagagataa aaaaagcgta tcggaaactt 2760

tcgaaaaaat atcatccaga tattaataaa gaaccggatg cggcagaaaa gttcaaagaa 2820

attaaagaag cgtacgaagt gctaagcgat gaccaaaagc gggcgcatta cgatcagttt 2880

gggcatgcgg atccgaacca aggtttcggc gggtttcgca gcgatgattt tgactttggc 2940

ggtttcagcg gtttcagtgg cttcgatgat attttcagca ccttttttgg cggcgggcgc 3000

cggcgtgatc caaatgcgcc aagagctggc gccgatttgc aatatacgat gacattgacg 3060

tttgaagagg cggtattcgg caaagaaacg gatattgaaa ttccaaggga agaaacatgc 3120

aatacttgcc atggcacagg agctaagcca ggcacgaaaa aagaaacatg ttcatattgc 3180

catggaacag ggcaaatcag cacagagcaa tcgacaccgt ttggccgcat cgtcaatcgc 3240

cgcacatgcc catattgcgg cggaaccggg caatacatta aggaaagatg cacaacatgc 3300

ggcggcactg gccgcgtaaa acggcggaaa aaaatccatg tgaaaattcc ggctggaatc 3360

gatgatggtc agcaattacg tgtcgctggc caaggagaac cgggcattaa cggcgggcct 3420

ccgggggatt tatatatcgt tttccacgta gagccgcatg aattttttga gcgcgatggc 3480

gacgacattt attgtgaaat cccgcttaca tttgctcaag ctgcgcttgg cgacgaaatt 3540

gaagtgccga cacttcatgg aaaagtgaga ctgaaaatac cggcaggcac gcaaacaggc 3600

acaaaattcc gcttgaaagg aaagggagtg ccgaatgtcc gcggctacgg ctatggcgac 3660

cagcatgtga ttgtccgtgt tgtgacaccg acaaaactga cggaaaagca gaagcaattg 3720

ttgcgcgaat ttgatcaatt aggcggttca agcatgcatc aaggaccaca cggccgcttt 3780

tttgaaaaag taaaaaaagc gtttaaaggg gaatcatga 3819

Claims (10)

1.嗜热菌来源的热激蛋白基因的以下任一应用：

1)在微生物发酵生产中的应用；

2)提高微生物耐热性中的应用；

3)提高微生物耐盐性中的应用；

其中，所述嗜热菌来源的热激蛋白基因选自PtDnaJ、PtDnaK、PtGroEL、PtGroES、PtGrpE、GtGrpE、HSP20-1、HSP20-2、HSP20-3、HSP20-4、HSP20-5、PtHSP33、基因模块PtGroEL-PtGroES、基因模块PtDnaK-PtDnaJ-PtGrpE中的至少一种，它们的基因序列分别如SEQ ID NO:1-14所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述嗜热菌来源的热激蛋白基因，通过质粒导入微生物中或通过基因工程手段整合到微生物染色体上。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述微生物包括细菌、真菌和古细菌，优选酵母、芽孢杆菌属(Bacillus)、埃希氏菌属(Escherichia)中的菌种，更优选枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述微生物为核黄素生产菌，优选枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)446，保藏号CGMCC NO.17280。

5.嗜热菌来源的热激蛋白基因在核黄素发酵生产中的应用，其中，所述嗜热菌来源的热激蛋白基因的定义同权利要求1中所述。

6.产核黄素的工程菌，其特征在于，所述工程菌的构建方法如下：

A、弱化原始菌株中与核黄素代谢途径相关的基因，获得基因弱化菌株；

所述弱化包括敲除或降低基因的表达；

B、增强原始菌株中与核黄素生物合成途径相关的基因和/或反馈抑制脱敏相关的基因，或者增强步骤A基因弱化菌株中与核黄素生物合成途径相关的基因和/或反馈抑制脱敏相关的基因，获得基因增强菌株；

所述增强的途径选自以下1)～6)，或任选的组合：

1)通过导入具有所述基因的质粒而增强；

2)通过增加染色体上所述基因的拷贝数而增强；

3)通过改变染色体上所述基因的启动子序列而增强；

4)通过将强启动子与所述基因可操作地连接而增强；

5)通过导入增强子而增强；

6)通过使用具有编码高活性的相应酶或蛋白质的基因或等位基因而增强；

C、构建携带嗜热菌来源的热激蛋白基因的质粒；

D、将步骤C中所述携带嗜热菌来源的热激蛋白基因的质粒导入步骤A中所述基因弱化菌株和/或步骤B中所述基因增强菌株中，获得产核黄素的工程菌；

其中，所述嗜热菌来源的热激蛋白基因的定义同权利要求1中所述；

优选地，所述原始菌株选自酵母、芽孢杆菌属(Bacillus)、埃希氏菌属(Escherichia)中的菌种，更优选枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)。

7.高温产核黄素的工程菌，其特征在于，所述工程菌为具有核黄素生产能力，且携带有表达嗜热菌来源的热激蛋白基因的质粒；

优选地，出发菌株为保藏号CGMCC NO.17280的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)446；

其中，所述嗜热菌来源的热激蛋白基因的定义同权利要求1中所述。

8.根据权利要求7所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌携带有HSP20-2基因、HSP20-3基因或PtDnaK-PtDnaJ-PtGrpE基因模块，或者相应的基因表达盒。

9.根据权利要求7所述的工程菌，其特征在于，所述质粒的出发载体为pUCG3.8，所述质粒包含来自枯草芽孢杆菌的复制子repA以及来自枯草芽孢杆菌的启动子p43。

10.核黄素的生产方法，其特征在于，包括在发酵培养基中对权利要求6或权利要求7-9任一项所述的工程菌进行培养以生产核黄素。