CN101265474A - 产气荚膜梭菌甘油脱水酶激活因子基因及其1,3-丙二醇的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种全新的甘油脱水酶激活因子基因的克隆及其在相关宿主中的表达，该激活因子的基因系克隆自产气荚膜梭菌(clostridium perfringens)，它能够在正常的生化反应条件下将失活的甘油脱水酶激活，恢复甘油脱水酶的酶活力，也可以使甘油脱水酶在转化甘油的反应过程中不容易失活。在本发明的基础上，可进一步把甘油脱水酶激、1，3－丙二醇氧化还原酶等相关酶基因一起重组到大肠杆菌中，获得一个新的代谢工程菌，这个代谢工程菌可以通过发酵将淀粉、甘油或者葡萄糖转化为1，3－丙二醇。

Description

产气荚膜梭菌甘油脱水酶激活因子基因及其1，3-丙二醇的生产方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种生物转化法生产1，3-丙二醇的方法。

背景技术

1，3-丙二醇是生产聚对苯二甲酸丙二酯(PPT)的主要原料，也可用作合成增塑剂、洗涤剂、防腐剂、乳化剂的原料。特别是制造性能优异的PTT纤维，既具有聚对苯二甲酸乙二酯(PET)的性能，又具有尼龙良好的回弹性和抗污染性。在地毯、工程塑料、服装面料等领域应用广泛，成为目前国际上合成纤维开发的热点。目前1，3-丙二醇的生产方法主要是化学合成法，如以乙烯为原料，在高温(280℃)下用银作催化剂氧化成环氧乙烷，然后加氢和一氧化碳转化为3-羟基丙醛，最后氢化成产品1，3-丙二醇；或者以丙烯为原料，在350℃，0.2MPa下以钼作催化剂氧化为丙烯醛，再水化为3-羟基丙醛，然后氢化成1，3-丙二醇。这些方法都需要在高温和贵重催化剂作用下进行，产品除1，3-丙二醇外还有1，2-丙二醇及其二聚体、三聚体等性质相近的副产物，致使产品分离纯化较困难，生产成本较高，而且会照成环境的污染，因此现在人们把目光转移到生物法生产上。目前发现的能以甘油为底物发酵生产1，3-丙二醇的天然菌主要有乳杆菌属(Lactobacillus)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、梭菌属(Clostridium)等。

例如张晓梅、诸葛健(江南大学)在《生物工程学报》2007，23(5).-841-845发表了“含甘油脱水酶激活因子编码基因的产1，3-丙二醇新型重组菌的构建”，利用PCR技术扩增来源于弗氏柠檬杆菌(Citrobacter freundii)的甘油脱水酶编码基因dhaB以及甘油脱水酶激活因子编码基因dhaGdhaF，将其与1，3-丙二醇氧化还原酶同工酶的编码基因yqhD串联在温控表达载体pHsh上，构建重组菌E.coliJM109(pHsh-dhaB-dhaG-dhaF-yqhD)。SDS-PAGE分析显示，融合表达产物的分子量同核酸序列测定的推导值相符。与未串联甘油脱水酶激活因子编码基因的重组菌E.coliJM109(pHsh-dhaB-yqhD)相比，1，3-丙二醇的产量提高了28％。

广西大学的梁甜、齐向辉、韦旭钦、韦宇拓、黄日波在《广西农业生物科学》2007，26(B06).-12-15，21发表了【题名】丘状乳杆菌中二醇脱水酶激活因子pduGH的克隆与功能鉴定的文章，以丘状乳杆菌(Lactobacilluscollinoides)基因组DNA为模版，通过PCR方法得到二醇脱水酶激活因子基因pduGH，连接到表达载体pET30a上，得到重组质粒pET-pduGH。将此重组质粒转化到Escherichia.coliRosseta(DE3)中进行表达，重组菌株SDS-PAGE结果显示有明显的64.5ku和12.4ku两条特异性蛋白。表达的目的蛋白大多为不溶性的包涵体，经变性、复性后得到部分可溶性蛋白。在辅酶B12，ATP，Mg^2+或Mn^2+存在下，以Clostridiumpasteurianum甘油脱水酶为对象进行激活实验，结果证实，重组质粒pET-pduGH的表达产物具有甘油脱水酶激活活性。

广西大学的孟晓蕾、唐悦、齐向辉、韦宇拓、黄日波在《生物化学与生物物理进展》2007，34(1).-87-92也报道了【题名】Lactobacillus diolivorans二醇脱水酶激活因子基因的克隆、测序与功能鉴定，根据二醇脱水酶与甘油脱水酶的激活因子基因序列同源性分析，设计简并引物从L.diolivorans基因组DNA中扩增出了假定的二醇脱水酶激活因子基因(gldG、gldH)全序列，补全了GcnBank中该基因序列的未知部分，构建了表达质粒pSE.gldGH，以EcoliBL21为宿主，进行诱导表达.表达产物的变性与非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明：gldGH表达产生68ku、13ku两个蛋白质，它们经金属螯合亲和层析与凝胶过滤得到共纯化，纯化产物即假定的激活因子为分子质量约325ku的蛋白质聚合体，由这两个蛋白质以等摩尔量组成，因此假定的激活因子可能为α4β4亚基结构.以L.diolivorans二醇脱水酶为对象，进行激活实验，结果证实gldGH表达产物具备二醇脱水酶激活因子的功能.

郑艳、管艺飞等(沈阳农业大学)在《食品与发酵工业》2007，33(3).-12-14报道了“甘油脱水酶基因(gldABC)与1，3-丙二醇氧化还原酶基因(dhaT)的共表达”，将dhaT基因片段以顺反子的形式插入到重组质粒pMD19TS2中gldABC基因的下游，形成重组克隆质粒pMD19TS3，进而将gldABC与dhaT基因以多顺反子的形式亚克隆至pET-28a(+)表达载体上。终浓度为1mmol/LIPTG诱导重组大肠杆菌E.coli/pET-28a(+)/gldABC-dhaT2h，SDS-PAGE电泳分析结果表明分别在甘油脱水酶三个亚基分子量相对应的61ku、21ku、16ku和1，3-丙二醇氧化还原酶亚基分子量相对应的42ku的位置上出现了特异性条带。上清液中酶活性分别为甘油脱水酶23.7U/mL，1，3-丙二醇氧化还原酶30.4U/mL。

广西大学的黄日波、韦旭钦、陈发忠、罗兆飞、韦宇拓、周文广在《生物加工过程》2006，4(1).-39-43对产1，3-丙二醇基因工程菌发酵条件进行了研究，利用途径工程的方法，将来源于克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的甘油脱水酶基因dhaB和1，3-丙二醇氧化还原酶基因dhaT构建成多顺反子重组质粒pSE-dhaB-dhaT并在大肠杆菌JM 109中进行表达，在大肠杆菌中构建一条新的产1，3-丙二醇代谢途径.研究表明，重组菌株JM 109/pSE-dhaB-dhaT在微好氧条件下，尝试用廉价的乳糖为诱导物、维生素B12为辅酶，可以将甘油转化为1，3-丙二醇，产量达15.34g/L，甘油转化率为35.7％，对低成本生产1，3-丙二醇作了有益的探索.

清华大学的王宝光、刘铭等在《中国生物工程杂志》2006，26(6).-59-65报道了产1，3-丙二醇菌株的诱变和筛选，为提高克雷伯氏肺炎杆菌产1，3-丙二醇的能力，以离子束、紫外线和氯化锂为复合诱变法，建立了产酸圈和产物耐受相结合的平板筛选方法，获得可耐受高浓度1，3-丙二醇并且副产物中乙醇含量较少的优良突变菌株2株.与出发菌株相比，两株高产突变菌株Klebsiellapneumoniae LM 03和Klebsiella pneumoniae LM05的1，3-丙二醇产量分别提高了33％和30％，达到66.74g/L和65.12g/L；乙醇产量分别降低了38％和24％，降低为6.59g/L和8.05g/L.同时测定了诱变前后还原途径中甘油脱水酶(GDHt)和1，3-丙二醇氧化还原酶(PDOR)的酶活变化，研究表明诱变对GDHt有明显的促进作用，而对PDOR的影响不明显.该诱变和筛选方法目标明确、易操作、效率高，在1，3-PD工业规模的生物法生产中将具有良好的应用价值。

从上述公开文献看到，微生物在以甘油为底物转化生产1，3-丙二醇的过程中，起主要反应的关键酶为甘油脱水酶和1，3-丙二醇氧化还原酶。第一步，甘油脱水酶催化甘油转化成3-羟基丙醛和水(反应式1)，第二，3-羟基丙醛被NAD+偶联的氧化还原酶还原成1，3-丙二醇(反应式2)。

甘油→3-羟基丙醛+水                 (反应式1)

3-羟基丙醛+NADH+H⁺→NAD⁺+1，3-丙二醇(反应式2)

反应第一步的甘油脱水酶是1，3-丙二醇生产的限速酶，对1，3-丙二醇的转化率起着至关重要的作用，无疑，提高它的酶活力有助于提高生产效率和转化率。

甘油脱水酶容易失活，这是因为甘油或O₂会使与甘油脱水酶结合的辅酶B_12K中的C-Co键发生不可逆断裂，辅酶B₁₂失去腺苷使辅酶B₁₂变成没有活性的钴铵素衍生物，而没有活性的钴铵素衍生物还是紧紧的与甘油脱水酶结合，从而导致其活性的丧失，可见甘油既是甘油脱水酶的最适底物又是对甘油脱水酶的抑制剂。失活的甘油脱水酶能在体外和体内都能被其激活因子重新激活并能继续反应，可见激活因子在稳定脱水酶催化活力，提高产物生成效率上体现出了很大的重要性。激活因子有非常弱的ATP水解酶的活性，当激活因子水解ATP后，构象发生改变，其对甘油脱水酶的亲和力大大提高。此时激活因子与失活的酶形成复合物，导致失活酶的构象发生改变，使得没有活性的钴铵素衍生物从甘油脱水酶上脱落下来。然后ATP取代ADP再与激活因子结合，这样，激活因子的构象又发生了变化，使得它对脱辅基酶的亲和力降代，从脱辅基酶脱落下来，这时的脱辅基酶又可以重新结合辅酶B₁₂，变成有催化活力的全酶。因此，激活因子的功能类似于分子伴侣，它帮助失活的甘油脱水酶重新折叠。此外，没有活性的脱腺苷钴铵素衍生物在腺苷转移酶的作用下，还能再转变成辅酶B12，因此，我们可以把甘油脱水酶、激活因子、腺苷转移酶看成是催化甘油转变成3-羟基丙醛的一个复合酶系。因此研究甘油脱水酶激活因子能提高1，3-丙二醇工程菌生产1，3-丙二醇的产率。

公开文献报道有关产气荚膜梭菌(clostridium perfringens)的研究主要是医学上研究其毒素、毒素的检测、对毒素基因的克隆与表达，以及调控以及毒素的结构与功能等方面，还没有涉及将产气荚膜梭菌应用于1，3-丙二醇的生产中。

本专利申请人南宁中诺生物工程有限责任公司于2006年6月21日向国家知识产权局申请了“产气荚膜梭菌甘油脱水酶基因及其1，3-丙二醇的生产方法”的专利，申请号：200610019452.X，公开号：CN1935991，报道了一种全新的甘油脱水酶基因的克隆及其在相关宿主中的表达，该酶的基因系克隆自产气荚膜梭菌(clostridium perfringens)，它能够在正常的生化反应条件下将甘油转化为3-羟基丙醛。在本发明的基础上，可进一步把1，3-丙二醇氧化还原酶等相关酶基因一起重组到大肠杆菌中，获得一个新的代谢工程菌，这个代谢工程菌可以通过发酵将木薯淀粉的水解物、葡萄糖或甘油转化为1，3-丙二醇。

该专利申请公开了甘油脱水酶的基因，虽然其酶活力半衰期较目前公开的报道的甘油脱水酶长，但是在反应底物甘油存在的条件下会迅速失活，用于构建生产1，3-丙二醇工程菌在转化甘油过程中也容易失活，因此甘油脱水酶的活力成为限制甘油转化率的关键因素。

发明内容

本发明人在分析上百种微生物的基因组时，发现可以用生物信息学的方法在一系列未注释的脱氧核糖核酸中发现非常有用的信息。结合基因的克隆和异源基因表达技术，以及通过对表达的蛋白质进行特性特征鉴定，发现了在蛋白质的序列数据库Genbank中注释为“未知蛋白”或“推测是蛋白质”的极为有用基因，其中包括至今为止人们并未发现的甘油脱水酶激活因子基因，并把这种脱水酶激活因子基因经过克隆和培养，在宿主中表达出有激活能力的甘油脱水酶激活因子蛋白，使基因工程菌能以甘油、葡萄糖等碳源发酵得到1，3-丙二醇产率得到提高。

甘油脱水酶激活因子虽然不具有甘油脱水酶一样的活力能够转化甘油生成3-羟基丙醛，但其可以激活失活的甘油脱水酶使其恢复甘油脱水酶的活力，也可以使甘油脱水酶的活力在转化甘油的反应过程不容易失活，而甘油脱水酶激活因子能够和腺苷转移酶一起与甘油脱水酶形成一个复合酶系，提高了甘油脱水酶的稳定性及其转化甘油生成3-羟基丙醛的效率。将甘油脱水酶激活因子构建生产1，3-丙二醇工程菌，甘油脱水酶、激活因子、腺苷转移酶形成一个催化甘油转变成3-羟基丙醛的一个复合酶系，可以提高甘油的转化效率。本发明是在2006年6月21日向国家知识产权局申请的“产气荚膜梭菌甘油脱水酶基因及其1，3-丙二醇的生产方法”的专利，申请号：200610019452.X，公开号：CN1935991，的基础上进行改进的。技术方案如下：利用该激活因子可以提高甘油脱水酶的转化效率的特性，将该激活因子基因和甘油脱水酶基因一起用于构建生产1，3-丙二醇工程菌，可以提高工程的转化效率，降低生产成本。

本发明所述的甘油脱水酶激活因子基因克隆自产气荚膜梭菌(clostridium perfringensCVCC 2015)。该菌种可以从微生物菌种保藏中心购买，也可以通过野外采集和其他途径获得。

制备本发明的一种甘油脱水酶激活因子基因、重组载体及宿主细胞的方法包括如下步骤：

1、从产气荚膜梭菌CVCC 2015中提取基因组DNA，然后先设计以下引物：正向引物(Senseprimer)：5’-ATTCCATGGAAATCATAGCAGGAATTGATA-3’；反向引物(AntisensePrimer)：5’-ATTGGATCCTTAGTGTAAATATTCATGTT-3’

2、然后用聚合酶链式反应(PCR)技术从基因组里获得目的基因，然后用的专用试剂盒对PCR产物进行初步纯化。市售的PCR产物纯化试剂盒都可以用于纯化，如Takara，Promega，Invitrogen等公司的专用试剂盒都可以用于PCR产物的纯化。纯化后用NcoI和BamHI限制性内切酶对PCR产物进行双酶切，再与同样用NcoI和BamHI双酶切过的pSE380质粒连接，获得表达质粒pSE-dhaFG。

3、将甘油脱水酶激活因子基因(dhaFG)在大肠杆菌中表达的工艺是：制备大肠杆菌Rosettagami的感受态细胞，然后用重组质粒pSE-dhaFG转化Rosetta gami感受态细胞，得重组大肠杆菌Rosetta gami/pSE-dhaFG。

4、在可使甘油脱水酶激活因子基因表达的条件下培养该重组菌，然后进行然后诱导表达，离心收集菌体后，即可进行蛋白质变性聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳检测基因的表达，然后进一步纯化激活因子，用失活的甘油脱水酶来检测激活因子的激活功能。

产气荚膜梭菌甘油脱水酶激活因子核苷酸序列SEQ ID NO.1。产气荚膜梭菌甘油脱水酶激活因子基因全长2191bp，通过对这个序列的分析显示，存在大小分别为1848bp和351bp两个个读码框；这个基因和其它菌的相应基因比较，其最高相似性低于69％，根据核苷酸序列分析推测产气荚膜梭菌甘油脱水酶激活因子蛋白含有两个个不同的亚基，分为大亚基和小亚基。大亚基由616个氨基酸组成，分子量为65,859Da；小亚基由116个氨基酸组成，分子量为12,775Da，其氨基酸序列分别见SEQ ID NO2、SEQ ID NO3和。通过对本发明涉及的甘油脱水酶激活因子基因推导的氨基酸序列与其它菌的甘油脱水酶激活因子氨基酸序列进行对比分析，与其它报道的甘油脱水酶激活因子的氨基酸序列相比，其相同性小于70％。

编码本发明所述的甘油脱水酶激活因子基因，以前功能未确定的DNA片段，长度为2191个碱基对，其中包含2个ORF，分别编码两个亚基的氨基酸序列，基因的碱基组成是：

1   ATGAAAATCA TAGCAGGAAT TGATATAGGA AACTCTTCTA CAGAAACTGC

51  TTTAGGTAAG GTTTATGAAA ATAATGTTGA ATTTCTGTCT AGTGGGATAA

101 TTCCCACTAC AGGAATCAAA GGAACGGAAG AAAATATAAG TGGGGTAATA

151 GCTTCTTTAA ACCAAGCTTT AAAGAAAGCT AACTTAACTT TAGAAGATTT

201 AGATTTAGTT AGAATTAACG AAGCAGCACC TGTTATAGGG GATGTTGCTA

251 TGGAAACAAT AACTGAAACA ATAATAACTG AATCAACAAT GATAGGACAT

301 AACCCGTCTA CTCCAGGAGG ATTAGGTGTA GGAATAGGTA AAACTATAAG

351 ATTAGAAACT TTAGAAACTT TAAATATTAA TGAAATCAAA GAGGAAGATA

401 ATGCTTTTAT TCCATTGGTT TTAGGAAATA TAAGTTTTTT AGAGGCTGTA

451 TTTAGAATAA ATCAAGCAAC TAGAAGAGGT ATTAATATAA CTGCTGCCAT

501 TGTTCAAAAG GATGATGGAG TATTAATCAA TAACAGATTA GATAAAAAAA

551  TACCTATAGT TGATGAAGTT TCTCTTTTAG AAAAGGTTCC TGTAGATATG

601  AAAGCAGCTG TTGAAGTAGC ACCACAAGGT TCAGTAATAA GACAGCTATC

651  AAATCCATAT GGAATAGCTA CTGTTTTTGA CTTAAGTCCA GAAGAGACAA

701  AAATGATTGT TCCTGTATCA AGAGCCTTAA TAGGAAATAG ATCAGCTGTT

751  GTAATAAAAA CTCCTCAAGG GGATGTTAAG GAAAAGAAAA TACCAGCTGG

801  TAAGATTAAT ATAACAGGAA TGAGAAGAAA AGAGTCTGTG GATGTTGAAG

851  AGGGAGCAGA TAAAATAATG GAGGCTGTTA GCCTTTGTTC TCCAATAGAA

901  GATTTAAGAG GAGATGCTGG TTCTAATGTT GGAGGAATGC TTGAAAAAGT

951  TAGACAAGTT ATGGCTGATT TAACTAATCA AAGCATTTCA GATATAAAGA

1001 TTCAGGATTT ATTAGCAGTA GATACTTTTA TCCCTCAAAA GGTTAAGGGT

1051 GGACTTGCAA AAGAGTTTTC AATGGAGAAT GCTGTTGGAA TAGCAGCAAT

1101 GGTTAAAGCT CATAAACTTC AAATGCAAAT AATAGCTAAT AAACTTGAAG

1151 AAAAGTTAGG TGTTCCAGTA GAAGTTGGTG GAGTAGAAGC TGACATGGCA

1201 ATAAGAGGAG CCTTAACAAC TCCAGGTACA AATACTCCTT TAGCTATTTT

1251 AGATATGGGA GCTGGATCTA CAGATGCTTC TATTATAAAT AAAGAAGGTA

1301 AAATAACATC AATACATTTA GCTGGTGCAG GAAACATGGT AACTATGCTT

1351 ATTAAATCAG AATTAGGTAT AGAAGACTTT GGACTTGCAG AGGATATAAA

1401 GAAATATCCT TTAGCTAAGG TTGAGAGTTT GTTCCATATA AGACATGAAG

1451 ATGGAACTGT AGAGTTCTTT GAAAAACCTT TAGATTCTTC AGTTTTTGCT

1501 AAGATTGTAA TTATTAAAGA GGGAATGCTT ATTCCGGTAG ATGGACAGAA

1551 TTCTTTAGAA AAGATTAAAA ATGTTAGAAA AACTGCTAAG GAAAGAGTTT

1601 TTGTAATTAA CTGTTTAAGA GCATTAAAAA GTGTTTCACC TACAGGAAAT

1651 ATAAGAGATA TAGAATTCGT TGTTTTAGTT GGAGGATCAT CATTAGACTT

1701 TGAGGTTCCT GAATTAGTAA CAGATGCTTT ATCTCATTAT GGAGTAGTTG

1751 CAGGAAGAGG AAATATAAGA GGATGTGAAG GTCCAAGAAA TGCAGTTGCA

1801 ACTGGATTAG TATTAGCCTT TGACAGAAAG GGTGTCAAGG AAAATGATTA

1851 AGGATTATAA TCATCCAAGC ATATTTGTAT ATTGTTCTTT AGGAATAAAT

1901 GAAGTGGATA TAGAAGAAAT TCTATGGGGA ATAGAAGAAG AAGGAATCCC

1951 TTTCATATTA AAAAATAAAG ATTTAAATGA TGCTAAGGAA CTTGCTAATT

2001 TAGCTGCCAA TGATTCCAAA CTTTCAGTTG GAATAGGAGT TAATAGTAAA

2051 GGTGATGTAA GTTTAACTAT TAATAAGTTA AAGGAAGAAG AACCTTTATT

2101 CTTTATAAAC TTAGAAAAAG GAAATACCTG TTTAAGAAGT TTAGGAGCTA

2151 ATGGAGCAAG ATTAGTTAAG GGGATGCCTT TAAAAAATAT T

编码本发明所述的甘油脱水酶激活因子的氨基酸序列

第一个亚基为616个氨基酸

1   MKIIAGIDIG NSSTETALGK VYENNVEFLS SGIIPTTGIK GTEENISGVI

51  ASLNQALKKA NLTLEDLDLV RINEAAPVIG DVAMETITET IITESTMIGH

101 NPSTPGGLGV GIGKTIRLET LETLNIDEIK EEDNAFIPLV LGNISFLEAV

151 FIINQATRRG INITAAIVQK DDGVLINNRL DKKIPIVDEV SLLEKVPVDM

201 KAAVEVAPQG SVIRQLSNPY GIATVFDLSP EETKMIVPVS RALIGNRSAV

251 VIKTPQGDVK EKKIPAGKIN ITGMRRKESV DVEEGADKIM EAVSLCSPIE

301 DLRGDAGSNV GGMLEKVRQV MADLTNQSIS DIKIQDLLAV DTFIPQKVKG

351 GLAKEFSMEN AVGIAAMVKA HKLQMQIIAN KLEEKLGVPV EVGGVEADMA

401 IRGALTTPGT NTPLAILDMG AGSTDASIIN KEGKITSIHL AGAGNMVTML

451 IKSELGIEDF GLAEDIKKYP LAKVESLFHI RHEDGTVEFF EKPLDSSVFA

501 KIVIIKEGML IPVDGQNSLE KIKNVRKTAK ERVFVINCLR ALKSVSPTGN

551 IRDIEFVVLV GGSSLDFEVP ELVTDALSHY GVVAGRGNIR GCEGPRNAVA

601 TGLVLAFDRK GVKEND

第二个亚基为116个氨基酸

1   MIKDYNHPSI FVYCSLGINE VDIEEILWGI EEEGIPFILK NKDLNDAKEL

51  ANLAANDSKL SVGIGVNSKG DVSLTINKLK EEEPLFFINL EEGNTCLRSL

101 GANGARLVKG MPLKNI

以上所述的产气荚膜梭菌分离得到的甘油脱水酶激活因子具有以下特征：

1、有大、小两个亚基，分子量分别为：666kD、12.8kD。

2、能够激活经O₂失活的甘油脱水酶，不仅能激活已失活的甘油脱水酶，也能维持甘油脱水酶在催化过程中不失活。

3、不仅能激活失活的产气荚膜梭菌甘油脱水酶，也能激活其它来源的如克雷伯氏菌失活的甘油脱水酶。

4、激活因子的最适反应温度为35～50℃。

5、激活因子的最适反应的pH是8.0～10.0。

6、反应液在缺乏ATP或Mg²⁺时，该激活因子不能激活失活的甘油脱水酶。

本发明所述的甘油脱水酶激活因子生产1，3丙二醇代谢工程菌的构建，可以克隆到酿酒酵母的3-磷酸甘油脱氢酶和3-磷酸甘油脂酶基因，并在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行高效表达；构建得到能转化葡萄糖生产甘油的工程菌，把克隆得到的甘油脱水激活因子基因和甘油脱水酶、1，3-丙二醇氧化还原酶等相关酶基因一起重组到大肠杆菌中，进行多个基因共表达，获得生产1，3-丙二醇的代谢工程菌。

本发明所述的甘油脱水酶生产1，3丙二醇代谢工程菌的构建，也可以克隆到酿酒酵母的3-磷酸甘油脱氢酶和3-磷酸甘油脂酶基因，并在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行高效表达；构建得到能转化葡萄糖生产甘油的工程菌，把克隆得到的甘油脱水基因转化到上述工程菌进行多个基因共表达，获得生产1，3-丙二醇的代谢工程菌。

本发明的甘油脱水酶激活因子虽然不具有甘油脱水酶一样的活力能够转化甘油生成3-羟基丙醛，但其可以激活失活的甘油脱水酶使其恢复甘油脱水酶的活力，也可以使甘油脱水酶的活力在转化甘油的反应过程不容易失活。

甘油脱水酶激活因子能够和腺苷转移酶一起与甘油脱水酶形成一个复合酶系，提高了甘油脱水酶的稳定性及其转化甘油生成3-羟基丙醛的效率。

将甘油脱水酶激活因子构建生产1，3-丙二醇工程菌，甘油脱水酶、激活因子、腺苷转移酶形成一个催化甘油转变成3-羟基丙醛的一个复合酶系，可以提高甘油的转化效率。

本发明所述的利用工程菌制备1，3丙二醇的方法，包括以下工艺步骤：

1)对选定的菌种接种进行扩大培养；

2)从所获得的扩大菌种中克隆甘油脱水酶基因；

3)将甘油脱水酶基因及其它相关基因在大肠杆菌中表达；

4)以淀粉水解物、葡萄糖或甘油或其它碳源为底物发酵生产1，3-丙二醇。

本发明所述的利用工程菌制备1，3丙二醇的方法，可以用淀粉(包括谷类淀粉和薯类淀粉，例如木薯淀粉、马铃薯淀粉、玉米淀粉、大米粉、面粉等)，制造1.3丙二醇的工艺是：以葡萄糖浆或淀粉浆的水解物为原料，先加去离子水兑成含20-40％的溶液，然后用于工程菌发酵过程中流加，在35-38℃，pH 6.5-7的条件下发酵32-40个小时，同时流加氨水和柠檬酸维持pH的稳定。发酵液用高效液相进行测定其1，3丙二醇含量。

本发明所述的利用工程菌制备1，3丙二醇的方法，可以用该代谢工程菌可以通过发酵将甘油或者葡萄糖转化为1，3-丙二醇，其工艺步骤与上述相同，

本发明与现有技术相比，具有的实质性特点和显著的进步是：

1、有大、小两个亚基，分子量分别为：66.9kD，12.8kD。

2、甘油脱水酶激活因子虽然不具有甘油脱水酶一样的活力能够转化甘油生成3-羟基丙醛，但是能够激活经O₂失活的甘油脱水酶，不仅能激活已失活的甘油脱水酶，也能维持甘油脱水酶在催化过程中不失活。

3、激活因子的最适反应温度为35～50℃。

4、激活因子的最适反应pH是8.0～10.0。

5、反应液在缺乏ATP或Mg²⁺时，该激活因子不能激活失活的甘油脱水酶。

6、阻止在以甘油为底物时对甘油脱水酶的失活。

7、不仅能激活失活的产气荚膜梭菌甘油脱水酶，也能激活其它来源的如克雷伯氏菌失活的甘油脱水酶。

具体实施方式

以下是本发明的实验和实例，下述实验和实例所述内容属于本发明的主要内容，但并不仅仅限于这些内容。有些可以显而易见地扩展的内容虽然并未在本专利说明书中出现，但也应属于本发明的专利请求范围。

实施例1

一、产气荚膜梭菌基因组DNA的提取

采用产气荚膜梭菌CVCC 2015(购于中国中国兽医微生物菌种保藏管理中心)，接种产气荚膜梭菌在20ml疱肉培养基中，置于厌氧培养箱里37℃培养过夜。取1.5ml培养物离心2min，于沉淀物中加入567μl的TE缓冲液(TE缓冲液-100mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH 8.0)和20μl(100mg/ml)溶菌酶，重悬混匀后于37℃放置2小时；之后加入30μl10％的SDS(SDS是十二烷基硫酸钠)和3μl20mg/ml的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1小时。然后加入100μl5mol/L的NaCl，充分混匀，再加入80μlCTAB/NaCl溶液，混匀，于65℃温育10分钟。该溶液用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提一次，然后再用等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提一次，取上清用0.6倍体积的异丙醇沉淀，收DNA，70％乙醇洗涤2次，沉淀溶于100μl TE缓冲液中。

二、甘油脱水酶激活因子基因的克隆

设计以下引物：

1、正向引物(Senseprimer)：

5’-ATTCCATGGAAATCATAGCAGGAATTGATA-3’

2、反向引物(Antisense Primer)：

5’-ATTGGATCCTTAGTGTAAATATTCATGTT-3’

然后按PCR Cloning Protocols中所讲的步骤进行：首先94℃2分钟；然后按以下条件进行30个循环：94℃30秒，56℃30秒，72℃2分30秒；最后72℃10min。

用Takara的专用试剂盒对PCR产物进行初步纯化，然后用NcoI和BamHI对PCR产物进行双酶切，再与同样用NcoI和BamHI酶切过的pSE380质粒连接，获得重组质粒pSE-dhaFG。

三、甘油脱水酶激活因子基因(dhaFG)在大肠杆菌中的表达

重组质粒pSE-dhaFG构建完毕，先转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，大量制备pSE-dhaFG表达质粒，所得质粒可用一部分用于DNA测序以确认读码框的正确性，另一部分则可以用来进行甘油脱水酶基因表达试验。

按《分子克隆：实验室手册》(1989年第二版)所述的方法，制备大肠杆菌Rosetta gami的感受态细胞，然后用pSE-dhaFG转化Rosetta gami感受态细胞，于37℃培养10～16小时，挑出单菌落接入含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃、220rpm/min条件下振荡培养12小时，取培养物200μl接入20ml含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃、220rpm/min条件下振荡培养直到OD值为0.4～0.6，然后加入IPTG至终浓度为1mM，再继续于30℃培养6小时。离心收集菌体后，即可进行蛋白质变性聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳检测基因的表达，并进一步纯化激活因子用于激活功能的检测。

四、生产1，3-丙二醇代谢工程菌的构建

(1)克隆到酿酒酵母的3-磷酸甘油脱氢酶和3-磷酸甘油脂酶基因，并在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行高效表达；构建得到能转化葡萄糖生产甘油的工程菌。(2)把克隆得到的甘油脱水酶激活因子基因连同甘油脱水酶和1，3-丙二醇氧化还原酶等相关酶基因一起重组到大肠杆菌中，获得生产1，3-丙二醇的代谢工程菌。

五、利用工程发酵葡萄糖生产1，3-丙二醇

将获得的工程菌单菌落接种到5ml含有氨苄青霉素50μg/mlLB液体培养基中，在30℃培养12小时，然后接种到1升的下述培养基中：氨苄青霉素50μg/ml，葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠3g/L。在30℃培养13小时，然后按4％的接种量种子接种到含20升下述发酵培养基的30升发酵罐中，每升发酵培养基含有：氨苄青霉素50mg，K₂HPO₄g/L 7克，柠檬酸2克，7水硫酸镁2克，98％的硫酸2ml，柠檬酸铁铵，乳糖4克，葡萄糖25g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠20g/L，用氨水调节pH为6.7。在35℃，200rpm，通风量为0.9vvm的条件下发酵培养，8小时后开始流加葡萄糖，并通过流加氨水和柠檬酸来保持pH的稳定。连续发酵32-40小时后用高效液相来分析发酵液中的葡萄糖和1，3-丙二醇的含量，当发酵液中葡萄糖量不再减少及1，3-丙二醇的量不再增加时停止发酵。经HPLC检测，工程菌发酵32-40小时后消耗葡萄糖约2.5kg，1，3-丙二醇的产量量可以达到25～30克/每升发酵液，共得到约500克1，3-丙二醇，转化效率约为20％。

实施例2

克隆到酿酒酵母的3-磷酸甘油脱氢酶和3-磷酸甘油脂酶基因，并在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行高效表达；构建得到能转化葡萄糖生产甘油的工程菌，把克隆得到的甘油脱水基因转化到上述工程菌进行多个基因共表达，获得生产1，3-丙二醇的代谢工程菌。

实施例3

以木薯淀粉为出发原料，经α-淀粉酶液化后再由糖化酶作用后生成的葡萄糖，将获得的葡萄糖按实例1进行发酵生产1，3-丙二醇，实验表明每3公斤淀粉经α淀粉酶液化后再由糖化酶作用后生成葡萄糖用于工程菌的发酵，先加去离子水兑成含30％的溶液，然后用于工程菌发酵过程中流加，在38℃，pH 7.0的条件下发酵32-40个小时，同时流加氨水和柠檬酸维持pH的稳定，可以得到约500克的1，3-丙二醇。除去淀粉中水份和杂质，转化效率和直接用葡萄糖做底物的转化效率相同。

实施例4

以玉米淀粉为出发原料，经α-淀粉酶液化后再由糖化酶作用后生成的葡萄糖，将获得的葡萄糖按实例1进行发酵生产1，3-丙二醇，实验表明每3公斤淀粉经α淀粉酶液化后再由糖化酶作用后生成葡萄糖用于工程菌的发酵，先加去离子水兑成含30％的溶液，然后用于工程菌发酵过程中流加，在37℃，pH 6.7的条件下发酵32-40个小时，同时流加氨水和柠檬酸维持pH的稳定，可以得到约500克的1，3-丙二醇。除去淀粉中水份和杂质，转化效率和直接用葡萄糖做底物的转化效率相同。

实施例5

以甘油为出发原料，利用工程菌制备1，3丙二醇的方法，可以用该代谢工程菌可以通过发酵将甘油或者葡萄糖转化为1，3-丙二醇，每3公斤甘油或者葡萄糖加去离子水兑成含30％的溶液，然后用于工程菌发酵过程中流加，在38℃，pH 7.0的条件下发酵32-40个小时，同时流加氨水和柠檬酸维持pH的稳定，可以得到约500克的1，3-丙二醇。

产气荚膜梭菌甘油脱水酶激活因子基因序列电子表格

<110>南宁市科园大道60号，南宁中诺生物工程有限责任公司530003黄日波韦宇拓吴杰群杜丽琴韦旭钦王青艳卢福燊卢运琨

<120>产气荚膜梭菌甘油脱水酶激活因子及其1，3-丙二醇的生产方法

<160>3

<170>PatentIn Version 2.1

<210>1

<211>2191

<212>DNA

<213>产气荚膜梭菌(clostridium perfringens)

<220>

<221>gene

<222>(1)...(2191)

<223>

<400>1

1    ATGAAAATCA TAGCAGGAAT TGATATAGGA AACTCTTCTA CAGAAACTGC

51   TTTAGGTAAG GTTTATGAAA ATAATGTTGA ATTTCTGTCT AGTGGGATAA

101  TTCCCACTAC AGGAATCAAA GGAACGGAAG AAAATATAAG TGGGGTAATA

151  GCTTCTTTAA ACCAAGCTTT AAAGAAAGCT AACTTAACTT TAGAAGATTT

201  AGATTTAGTT AGAATTAACG AAGCAGCACC TGTTATAGGG GATGTTGCTA

251  TGGAAACAAT AACTGAAACA ATAATAACTG AATCAACAAT GATAGGACAT

301  AACCCGTCTA CTCCAGGAGG ATTAGGTGTA GGAATAGGTA AAACTATAAG

351  ATTAGAAACT TTAGAAACTT TAAATATTAA TGAAATCAAA GAGGAAGATA

401  ATGCTTTTAT TCCATTGGTT TTAGGAAATA TAAGTTTTTT AGAGGCTGTA

451  TTTAGAATAA ATCAAGCAAC TAGAAGAGGT ATTAATATAA CTGCTGCCAT

501  TGTTCAAAAG GATGATGGAG TATTAATCAA TAACAGATTA GATAAAAAAA

551  TACCTATAGT TGATGAAGTT TCTCTTTTAG AAAAGGTTCC TGTAGATATG

601  AAAGCAGCTG TTGAAGTAGC ACCACAAGGT TCAGTAATAA GACAGCTATC

651  AAATCCATAT GGAATAGCTA CTGTTTTTGA CTTAAGTCCA GAAGAGACAA

701  AAATGATTGT TCCTGTATCA AGAGCCTTAA TAGGAAATAG ATCAGCTGTT

751  GTAATAAAAA CTCCTCAAGG GGATGTTAAG GAAAAGAAAA TACCAGCTGG

801  TAAGATTAAT ATAACAGGAA TGAGAAGAAA AGAGTCTGTG GATGTTGAAG

851  AGGGAGCAGA TAAAATAATG GAGGCTGTTA GCCTTTGTTC TCCAATAGAA

901  GATTTAAGAG GAGATGCTGG TTCTAATGTT GGAGGAATGC TTGAAAAAGT

951  TAGACAAGTT ATGGCTGATT TAACTAATCA AAGCATTTCA GATATAAAGA

1001 TTCAGGATTT ATTAGCAGTA GATACTTTTA TCCCTCAAAA GGTTAAGGGT

1051 GGACTTGCAA AAGAGTTTTC AATGGAGAAT GCTGTTGGAA TAGCAGCAAT

1101 GGTTAAAGCT CATAAACTTC AAATGCAAAT AATAGCTAAT AAACTTGAAG

1151 AAAAGTTAGG TGTTCCAGTA GAAGTTGGTG GAGTAGAAGC TGACATGGCA

1201 ATAAGAGGAG CCTTAACAAC TCCAGGTACA AATACTCCTT TAGCTATTTT

1251 AGATATGGGA GCTGGATCTA CAGATGCTTC TATTATAAAT AAAGAAGGTA

1301 AAATAACATC AATACATTTA GCTGGTGCAG GAAACATGGT AACTATGCTT

1351 ATTAAATCAG AATTAGGTAT AGAAGACTTT GGACTTGCAG AGGATATAAA

1401 GAAATATCCT TTAGCTAAGG TTGAGAGTTT GTTCCATATA AGACATGAAG

1451 ATGGAACTGT AGAGTTCTTT GAAAAACCTT TAGATTCTTC AGTTTTTGCT

1501 AAGATTGTAA TTATTAAAGA GGGAATGCTT ATTCCGGTAG ATGGACAGAA

1551 TTCTTTAGAA AAGATTAAAA ATGTTAGAAA AACTGCTAAG GAAAGAGTTT

1601 TTGTAATTAA CTGTTTAAGA GCATTAAAAA GTGTTTCACC TACAGGAAAT

1651 ATAAGAGATA TAGAATTCGT TGTTTTAGTT GGAGGATCAT CATTAGACTT

1701 TGAGGTTCCT GAATTAGTAA CAGATGCTTT ATCTCATTAT GGAGTAGTTG

1751 CAGGAAGAGG AAATATAAGA GGATGTGAAG GTCCAAGAAA TGCAGTTGCA

1801 ACTGGATTAG TATTAGCCTT TGACAGAAAG GGTGTCAAGG AAAATGATTA

1851 AGGATTATAA TCATCCAAGC ATATTTGTAT ATTGTTCTTT AGGAATAAAT

1901 GAAGTGGATA TAGAAGAAAT TCTATGGGGA ATAGAAGAAG AAGGAATCCC

1951 TTTCATATTA AAAAATAAAG ATTTAAATGA TGCTAAGGAA CTTGCTAATT

2001 TAGCTGCCAA TGATTCCAAA CTTTCAGTTG GAATAGGAGT TAATAGTAAA

2051 GGTGATGTAA GTTTAACTAT TAATAAGTTA AAGGAAGAAG AACCTTTATT

2101 CTTTATAAAC TTAGAAAAAG GAAATACCTG TTTAAGAAGT TTAGGAGCTA

2151 ATGGAGCAAG ATTAGTTAAG GGGATGCCTT TAAAAAATAT T

<210>2

<211>616

<212>misc_feature

<213>产气荚膜梭菌(clostridium perfringens)

<400>2

1   MKIIAGIDIG NSSTETALGK VYENNVEFLS SGIIPTTGIK GTEENISGVI

51  ASLNQALKKA NLTLEDLDLV RINEAAPVIG DVAMETITET IITESTMIGH

101 NPSTPGGLGV GIGKTIRLET LETLNIDEIK EEDNAFIPLV LGNISFLEAV

151 FIINQATRRG INITAAIVQK DDGVLINNRL DKKIPIVDEV SLLEKVPVDM

201 KAAVEVAPQG SVIRQLSNPY GIATVFDLSP EETKMIVPVS RALIGNRSAV

251 VIKTPQGDVK EKKIPAGKIN ITGMRRKESV DVEEGADKIM EAVSLCSPIE

301 DLRGDAGSNV GGMLEKVRQV MADLTNQSIS DIKIQDLLAV DTFIPQKVKG

351 GLAKEFSMEN AVGIAAMVKA HKLQMQIIAN KLEEKLGVPV EVGGVEADMA

401 IRGALTTPGT NTPLAILDMG AGSTDASIIN KEGKITSIHL AGAGNMVTML

451 IKSELGIEDF GLAEDIKKYP LAKVESLFHI RHEDGTVEFF EKPLDSSVFA

501 KIVIIKEGML IPVDGQNSLE KIKNVRKTAK ERVFVINCLR ALKSVSPTGN

551 IRDIEFVVLV GGSSLDFEVP ELVTDALSHY GVVAGRGNIR GCEGPRNAVA

601 TGLVLAFDRK GVKEND

<210>3

<211>116

<212>misc_feature

<213>产气荚膜梭菌(clostridium perfringens)

<400>3

1   MIKDYNHPSI FVYCSLGINE VDIEEILWGI EEEGIPFILK NKDLNDAKEL

51  ANLAANDSKL SVGIGVNSKG DVSLTINKLK EEEPLFFINL EEGNTCLRSL

101 GANGARLVKG MPLKNI

Claims (6)

1、一种甘油脱水酶激活因子基因，其特征在于：甘油脱水酶激活因子基因是从产气荚膜梭菌(clostridium perfringens)克隆得到，是所述的核苷酸序列包含在SEQ IDNO.1所述的核苷酸序列中，其基因的DNA序列和氨基酸序列如下所示：

产气荚膜梭菌甘油脱水酶激活因子基因的DNA序列：

1    ATGAAAATCA TAGCAGGAAT TGATATAGGA AACTCTTCTA CAGAAACTGC

51   TTTAGGTAAG GTTTATGAAA ATAATGTTGA ATTTCTGTCT AGTGGGATAA

101  TTCCCACTAC AGGAATCAAA GGAACGGAAG AAAATATAAG TGGGGTAATA

151  GCTTCTTTAA ACCAAGCTTT AAAGAAAGCT AACTTAACTT TAGAAGATTT

201  AGATTTAGTT AGAATTAACG AAGCAGCACC TGTTATAGGG GATGTTGCTA

251  TGGAAACAAT AACTGAAACA ATAATAACTG AATCAACAAT GATAGGACAT

301  AACCCGTCTA CTCCAGGAGG ATTAGGTGTA GGAATAGGTA AAACTATAAG

351  ATTAGAAACT TTAGAAACTT TAAATATTAA TGAAATCAAA GAGGAAGATA

401  ATGCTTTTAT TCCATTGGTT TTAGGAAATA TAAGTTTTTT AGAGGCTGTA

451  TTTAGAATAA ATCAAGCAAC TAGAAGAGGT ATTAATATAA CTGCTGCCAT

501  TGTTCAAAAG GATGATGGAG TATTAATCAA TAACAGATTA GATAAAAAAA

551  TACCTATAGT TGATGAAGTT TCTCTTTTAG AAAAGGTTCC TGTAGATATG

601  AAAGCAGCTG TTGAAGTAGC ACCACAAGGT TCAGTAATAA GACAGCTATC

651  AAATCCATAT GGAATAGCTA CTGTTTTTGA CTTAAGTCCA GAAGAGACAA

701  AAATGATTGT TCCTGTATCA AGAGCCTTAA TAGGAAATAG ATCAGCTGTT

751  GTAATAAAAA CTCCTCAAGG GGATGTTAAG GAAAAGAAAA TACCAGCTGG

801  TAAGATTAAT ATAACAGGAA TGAGAAGAAA AGAGTCTGTG GATGTTGAAG

851  AGGGAGCAGA TAAAATAATG GAGGCTGTTA GCCTTTGTTC TCCAATAGAA

901  GATTTAAGAG GAGATGCTGG TTCTAATGTT GGAGGAATGC TTGAAAAAGT

951  TAGACAAGTT ATGGCTGATT TAACTAATCA AAGCATTTCA GATATAAAGA

1001 TTCAGGATTT ATTAGCAGTA GATACTTTTA TCCCTCAAAA GGTTAAGGGT

1051 GGACTTGCAA AAGAGTTTTC AATGGAGAAT GCTGTTGGAA TAGCAGCAAT

1101 GGTTAAAGCT CATAAACTTC AAATGCAAAT AATAGCTAAT AAACTTGAAG

1151 AAAAGTTAGG TGTTCCAGTA GAAGTTGGTG GAGTAGAAGC TGACATGGCA

1201 ATAAGAGGAG CCTTAACAAC TCCAGGTACA AATACTCCTT TAGCTATTTT

1251 AGATATGGGA GCTGGATCTA CAGATGCTTC TATTATAAAT AAAGAAGGTA

1301 AAATAACATC AATACATTTA GCTGGTGCAG GAAACATGGT AACTATGCTT

1351 ATTAAATCAG AATTAGGTAT AGAAGACTTT GGACTTGCAG AGGATATAAA

1401 GAAATATCCT TTAGCTAAGG TTGAGAGTTT GTTCCATATA AGACATGAAG

1451 ATGGAACTGT AGAGTTCTTT GAAAAACCTT TAGATTCTTC AGTTTTTGCT

1501 AAGATTGTAA TTATTAAAGA GGGAATGCTT ATTCCGGTAG ATGGACAGAA

1551 TTCTTTAGAA AAGATTAAAA ATGTTAGAAA AACTGCTAAG GAAAGAGTTT

1601 TTGTAATTAA CTGTTTAAGA GCATTAAAAA GTGTTTCACC TACAGGAAAT

1651 ATAAGAGATA TAGAATTCGT TGTTTTAGTT GGAGGATCAT CATTAGACTT

1701 TGAGGTTCCT GAATTAGTAA CAGATGCTTT ATCTCATTAT GGAGTAGTTG

1751 CAGGAAGAGG AAATATAAGA GGATGTGAAG GTCCAAGAAA TGCAGTTGCA

1801 ACTGGATTAG TATTAGCCTT TGACAGAAAG GGTGTCAAGG AAAATGATTA

1851 AGGATTATAA TCATCCAAGC ATATTTGTAT ATTGTTCTTT AGGAATAAAT

1901 GAAGTGGATA TAGAAGAAAT TCTATGGGGA ATAGAAGAAG AAGGAATCCC

1951 TTTCATATTA AAAAATAAAG ATTTAAATGA TGCTAAGGAA CTTGCTAATT

2001 TAGCTGCCAA TGATTCCAAA CTTTCAGTTG GAATAGGAGT TAATAGTAAA

2051 GGTGATGTAA GTTTAACTAT TAATAAGTTA AAGGAAGAAG AACCTTTATT

2101 CTTTATAAAC TTAGAAAAAG GAAATACCTG TTTAAGAAGT TTAGGAGCTA

2151 ATGGAGCAAG ATTAGTTAAG GGGATGCCTT TAAAAAATAT TTAA

编码本发明所述的甘油脱水酶激活因子的氨基酸序列：

第一个亚基为616个氨基酸

1   MKIIAGIDIG NSSTETALGK VYENNVEFLS SGIIPTTGIK GTEENISGVI

51  ASLNQALKKA NLTLEDLDLV RINEAAPVIG DVAMETITET IITESTMIGH

101 NPSTPGGLGV GIGKTIRLET LETLNIDEIK EEDNAFIPLV LGNISFLEAV

151 FIINQATRRG INITAAIVQK DDGVLINNRL DKKIPIVDEV SLLEKVPVDM

201 KAAVEVAPQG SVIRQLSNPY GIATVFDLSP EETKMIVPVS RALIGNRSAV

251 VIKTPQGDVK EKKIPAGKIN ITGMRRKESV DVEEGADKIM EAVSLCSPIE

301 DLRGDAGSNV GGMLEKVRQV MADLTNQSIS DIKIQDLLAV DTFIPQKVKG

351 GLAKEFSMEN AVGIAAMVKA HKLQMQIIAN KLEEKLGVPV EVGGVEADMA

401 IRGALTTPGT NTPLAILDMG AGSTDASIIN KEGKITSIHL AGAGNMVTML

451 IKSELGIEDF GLAEDIKKYP LAKVESLFHI RHEDGTVEFF EKPLDSSVFA

501 KIVIIKEGML IPVDGQNSLE KIKNVRKTAK ERVFVINCLR ALKSVSPTGN

551 IRDIEFVVLV GGSSLDFEVP ELVTDALSHY GVVAGRGNIR GCEGPRNAVA

601 TGLVLAFDRK GVKEND

第二个亚基为116个氨基酸

1   MIKDYNHPSI FVYCSLGINE VDIEEILWGI EEEGIPFILK NKDLNDAKEL

51  ANLAANDSKL SVGIGVNSKG DVSLTINKLK EEEPLFFINL EEGNTCLRSL

101 GANGARLVKG MPLKNI。

2、如权利要求1所述的甘油脱水酶激活因子，其特征在于：

(1)有两个亚基，分子量分别为：666、12.8kD；

(2)能够激活经O₂失活的甘油脱水酶，不仅能激活已失活的甘油脱水酶，也能维持甘油脱水酶在催化过程中不失活；

(3)不仅能激活失活的产气荚膜梭菌甘油脱水酶，也能激活其它来源的如克雷伯氏菌失活的甘油脱水酶；

(4)激活因子的最适反应温度为35～50℃；

(5)激活因子的最适反应的pH是8.0～10.0；

(6)反应液在缺乏ATP或Mg²⁺时，该激活因子不能激活失活的甘油脱水酶。

3、如权利要求1所述的甘油脱水酶激活因子生产1，3丙二醇代谢工程菌的构建，其特征在于：克隆到酿酒酵母的3-磷酸甘油脱氢酶和3-磷酸甘油脂酶基因，并在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行高效表达；构建得到能转化葡萄糖生产甘油的工程菌，把克隆得到的甘油脱水激活因子基因和甘油脱水酶、1，3-丙二醇氧化还原酶等相关酶基因一起重组到大肠杆菌中，进行多个基因共表达，获得生产1，3-丙二醇的代谢工程菌。

4、如权利要求1所述的甘油脱水酶生产1，3丙二醇代谢工程菌的构建，其特征在于：克隆到酿酒酵母的3-磷酸甘油脱氢酶和3-磷酸甘油脂酶基因，并在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行高效表达；构建得到能转化葡萄糖生产甘油的工程菌，把克隆得到的甘油脱水基因转化到上述工程菌进行多个基因共表达，获得生产1，3-丙二醇的代谢工程菌。

5、根据权利要求4所述的利用工程菌制备1，3丙二醇的方法，其特征在于：包括以下步骤：1)对选定的菌种接种进行扩大培养；2)从所获得的扩大菌种中克隆甘油脱水酶基因；3)将甘油脱水酶基因及其它相关基因在大肠杆菌中表达；4)以淀粉水解物、葡萄糖或甘油或其它碳源为底物发酵生产1，3-丙二醇。

6、根据权利要求4所述的利用工程菌制备1，3丙二醇的方法，其特征在于：用淀粉制造1.3丙二醇的工艺是：以葡萄糖浆或淀粉浆的水解物为原料，先加去离子水兑成含20-40％的溶液，然后用于工程菌发酵过程中流加，在35-38℃，pH6.5-7的条件下发酵32-40个小时，同时流加氨水和柠檬酸维持pH的稳定，发酵液用高效液相进行测定其1，3丙二醇含量。