CN113564193B - 一种微生物基因表达命运共同体及其构建方法和应用 - Google Patents

一种微生物基因表达命运共同体及其构建方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113564193B
CN113564193B CN202111132136.4A CN202111132136A CN113564193B CN 113564193 B CN113564193 B CN 113564193B CN 202111132136 A CN202111132136 A CN 202111132136A CN 113564193 B CN113564193 B CN 113564193B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
genes
microorganism
expression
product
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202111132136.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113564193A (zh
Inventor
陈国强
王子瑜
纪梦珂
王欢
胡启跳
赵翠环
张李湛
林艺娜
马悦原
黄悟哲
郑陶然
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Micro Structure Factory Biotechnology Co ltd
Tsinghua University
Original Assignee
Beijing Micro Structure Factory Biotechnology Co ltd
Tsinghua University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Micro Structure Factory Biotechnology Co ltd, Tsinghua University filed Critical Beijing Micro Structure Factory Biotechnology Co ltd
Priority to CN202111132136.4A priority Critical patent/CN113564193B/zh
Publication of CN113564193A publication Critical patent/CN113564193A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113564193B publication Critical patent/CN113564193B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C12P7/625—Polyesters of hydroxy carboxylic acids

Landscapes

  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种微生物基因表达命运共同体及其构建方法和应用，所述微生物基因表达命运共同体至少包括细胞必需基因和编码产物合成途径相关的基因，必需基因与产物合成途径相关基因共表达，可实现生物细胞与产物生死与共，实现了产品的稳定生产，提高了生产效率。通过将微生物必需基因与编码产物合成路径的基因串联表达，减小了微生物对环境变化的抗逆性，实现了更稳定的目的基因表达，使得生物制造的限制性和制约条件降低，更有利于以后的放大生产和提高产品的产率。该方法将在生物制造和生物工业技术方面发挥重要作用，大幅度降低产品的制造成本。

Description

一种微生物基因表达命运共同体及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及微生物基因工程技术领域，尤其涉及一种微生物基因表达命运共同体及其构建方法和应用。
背景技术
近代以来，生物工程技术的诞生和发展对人类的生产、生活产生了非常巨大的影响。作为一门新兴的综合性应用技术，生物工程技术以生物学为基础，结合了化工、机械和电子计算机等先进工程技术，实现了对细胞工厂的遗传物质操作和定向改造，再通过适当的生物反应器进行大规模培养，以实现生产大量代谢产物或发挥其生理功能（Muhammad etal, 2020; Otero et al, 2010）。因其温和的反应条件和环境友好的发展趋势，工业生物技术将在二十一世纪的高科技时代大放光彩（Chen et al, 2020）。
工业生物技术是以微生物“细胞工厂”为基础，在生物反应器中进行放大生产。生物反应器中的微生物数目数以亿万计，是一个非常庞大的微生物群落。从微生物生命活动层次的角度看，微生物群落存在着广泛的多样性，包括遗传多样性、生理多样性、物种多样性和生态多样性（Sara et al, 2013）。生物反应器中的“细胞工厂”有着非常突出的生理多样性，即生理结构和生理功能的多样性。处于生长不同时期的微生物细胞即处于不同的生理状态，有着“前、中、后”期的细胞结构（Moser A, 1988）。在原核生物中，一个完整的基因包括启动子、核糖体结合位点、起始密码子、蛋白编码区、终止密码子和转录终止子等多个原件（Zhao et al., 2017）。在群体多样性背景下，细菌菌落会有参差不齐的基因表达情况，使得产物合成途径的基因表达水平产生巨大差异，微生物对目的产物的积累情况也就存在巨大差异（Guodong et al, 2013; Paolo et al, 2006）；而巨大的群体差异性不利于获取最大产量的生物制品。
因此，开发一种在群体差异下可以稳定表达产物合成路径基因的方法具有迫切的应用需要。虽然复杂的微生物群落生理多样性会影响基因的表达，但值得注意的是，微生物存在一些“必需基因”，即生物生存所必需表达的基因，不论处于停滞期、对数生长期、还是平台期的微生物，都会表达一些必需基因来维持基本的生理功能（Yu et al, 2017）。因此，通过将微生物生长必需基因和产物合成路径的串联表达而构建的“微生物命运共同体”可以实现产物合成途径的可靠表达。
发明内容
本发明的目的是提供一种微生物基因表达命运共同体及其构建方法和应用，其能利用微生物必需基因保证与其相连的内源或/和外源基因（尤其是编码产物合成路径的基因）可靠表达。
为此，本发明技术方案如下：
第一方面，本发明提供一种微生物基因表达命运共同体，所述微生物基因表达命运共同体至少包括细胞必需基因和编码产物合成途径相关的基因，必需基因与产物合成途径相关基因共表达，可实现生物细胞与产物生死与共，实现了产品的稳定生产，提高了生产效率。
优选的，编码产物合成途径相关的基因位于细胞必需基因启动子的后面，且位于细胞必需基因的前面和/或后面。
优选的，所述的编码产物合成路径的基因是天然和/或非天然产物的合成路径的基因，例如可以包括但不限于各种聚羟基脂肪酸酯PHA、氨基酸、四氢嘧啶或维他命中的任意一种或至少两种的组合。
优选的，所述细胞必需基因为一个或多个，使所需要表达的基因（即编码产物合成途径相关的基因）可在一个或者多个不同必需基因带动下表达。
优选的，所述细胞必需基因为所有生物生存所必需表达的基因，包括但不限于细胞呼吸、合成细胞膜、细胞壁、DNA合成基因：如ompW（编码外膜蛋白），porin（编码孔蛋白），cydA（细胞色素氧化酶基因），rpoC（RNA聚合酶基因），rpoB（RNA聚合酶基因），rpsU（编码核糖体蛋白亚基），ftsA（编码细胞分裂蛋白），ftsZ（细胞形态控制基因），zipA（细胞分裂蛋白基因），pyk2（编码丙酮酸激酶），prsA（蛋白合成质量控制相关），RBA50（RNA聚合酶组装相关基因），GPN2（RNA聚合酶组装相关基因），prs（核苷酸合成相关基因），pyrG（核苷酸合成相关基因），edd（编码磷酸葡糖酸脱水酶），hom（高丝氨酸脱氢酶基因）等。
优选的，必需基因为细胞生存过程中从生到死一直表达的基因，包括但不限于ompW（编码外膜蛋白），porin（编码孔蛋白），cydA（细胞色素氧化酶基因），rpoC（RNA聚合酶基因），rpoB（RNA聚合酶基因），rpsU（编码核糖体蛋白亚基），ftsA（编码细胞分裂蛋白），ftsZ（细胞形态控制基因），zipA（细胞分裂蛋白基因），pyk2（编码丙酮酸激酶），prsA（蛋白合成质量控制相关），RBA50（RNA聚合酶组装相关基因），GPN2（RNA聚合酶组装相关基因），prs（核苷酸合成相关基因），pyrG（核苷酸合成相关基因），edd（编码磷酸葡糖酸脱水酶），hom（高丝氨酸脱氢酶基因）等。
优选的，所述微生物为真核和/或原核微生物。
优选的，所述原核微生物可以是大肠杆菌、罗氏真养杆菌、芽孢杆菌、谷棒菌或嗜盐菌中的任意一种或至少两种的组合。其中，所述嗜盐菌包括但不限于嗜盐单胞菌，包括但不限于Halomonas bluephagenesis TD01 CGMCC. No. 4353, Halomonas campaniensis LS21 CGMCC No.6593 和 Halomonas aydingkolgenesis M1 CGMCC NO.19880。
优选的，所述真核微生物可以是酵母、真菌或者藻类中的任意一种或至少两种的组合。
第二方面，本发明提供如第一方面所述的微生物基因表达命运共同体的构建方法。
第三方面，本发明提供如第一方面所述的微生物基因表达命运共同体在微生物基因工程领域的应用，尤其是合成途径相关产品生产领域的应用；从而实现更稳定的目的基因的表达，实现所述合成途径相关产品的稳定生产，提高生产效率，有利于合成途径相关产品的放大生产，降低制造成本。
与现有技术相比，本发明提供的微生物基因表达命运共同体通过将必需基因与编码产物合成路径的基因串联表达，以实现后者的可靠和可持续表达，实现了合成途径相关产品的稳定生产，提高了生产效率。更重要地，通过将微生物必需基因与编码产物合成路径的基因串联表达，减小了微生物对环境变化的抗逆性，实现了更稳定的目的基因表达，使得生物制造的限制性和制约条件降低，更有利于以后的放大生产和提高产品的产率。本发明提供的方法将在生物制造和生物工业技术方面发挥重要作用，大幅度降低产品的制造成本。
附图说明
图1为实施例1中验证基因插入设计的野生型引物示意图（以在ompW基因后面插入phaCAB基因为例）。
图2为实施例1中验证基因插入设计的突变型引物示意图（以在ompW基因后面插入phaCAB基因为例）。
图3为实施例1中插入效果的PCR验证结果图（以在ompW基因后面插入phaCAB基因为例）。
图4为实施例2中在必需基因前面插入合成途径基因的设计示意图（以在edd基因、ftsZ基因、rpsU基因前面插入ectB基因为例）。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
1、嗜盐单胞菌（Halomonas bluephagenesis）TD01：
发明人通过筛选得到的一株耐盐、耐碱、天然生产PHB的革兰氏阴性嗜盐细菌，此菌自身即可积累较高含量的聚羟基脂肪酸，具有好的工业化生产应用前景。记载于“TanDan, Wu Qiong, Chen, Jin-Chun and Chen GQ. Engineering Halomonas TD01 for LowCost Production of Polyhydroxyalkanoates. Metabolic Engineering 26 (2014) 34–47”一文，公众可从发明人处获得，仅可用于重复本发明实验使用。
2、培养基配方：
1）LB培养基含：5g/L酵母提取物（英国OXID公司，产品目录号LP0021），10g/L蛋白胨（英国OXID公司，产品目录号LP0042），10 g/L NaCl，其余为水。调pH值至7.0-7.2，高压蒸汽灭菌。LB60培养基为LB培养基含有60g/L NaCl，其余成分和制备条件与LB培养基相同。
2）MM50培养基含：50g/L NaCl，1g/L酵母提取物（英国OXID公司，产品目录号LP0021），35 g-55 g葡萄糖（根据微生物摄取糖源的情况），其余为水。实验所用嗜盐单胞菌最适pH在8-9左右，用NaOH调节pH。
3、pSEVA341质粒和pQ08质粒：
记载在如下文献中：”Qin Qin, Ling Chen, Zhao Yiqing, Yang Tian, YinJin, Guo Yingying, Chen GQ. CRISPR/Cas9 editing genome of extremophileHalomonas spp. Metabolic Engineering 47 (2018) 219-229”。公众可从发明人处获得，仅可用于重复本发明实验使用。
4、基因编辑技术：
本发明所采用的基因编辑技术均为CRISPR-Cas9基因编辑技术，具体操作方法记载在如下文献中：”Qin Qin, Ling Chen, Zhao Yiqing, Yang Tian, Yin Jin, GuoYingying, Chen GQ. CRISPR/Cas9 editing genome of extremophile Halomonas spp.Metabolic Engineering 47 (2018) 219-229”。公众可从发明人处获得，仅可用于重复本发明实验使用。
实施例1、通过在嗜盐菌Halomonas bluephagenesis外膜蛋白基因ompW后面插入phaCAB基因获得生产PHA的命运共同体菌株
在Halomonas bluephagenesis TD01菌株的ompW基因（编码一种外膜蛋白，是一种强表达的必需基因）的后面插入phaC基因、phaA基因、phaB基因，实现了phaCAB的高强度稳定表达，实现了高浓度PHA的积累，构建了PHA生产的命运共同体菌株。
具体操作过程如下：
用CRISPR-Cas9技术在嗜盐单胞菌Halomonas bluephagenesis TD01基因组中ompW基因后插入phaC基因、phaA基因、phaB基因，获得PHA合成途径相关基因可靠表达的菌株。具体如下：
1）插入基因
用于表达sgRNA以及donor DNA的原始表达载体为pSEVA341质粒（含卡那霉素和壮观霉素抗性基因），sgRNA插入在启动子J23119(SpeI)之后，上下游同源臂及插入基因（phaC、phaA、phaB）插入在sgRNA之后得到相应的重组质粒。
sgRNA的DNA序列为：5’- gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtg-3’（SEQ ID No.1）；
上游同源臂的DNA序列为：SEQ ID No.2；
下游同源臂的DNA序列为：SEQ ID No.3。
表达sgRNA的pSEVA341质粒和表达Cas9的pQ08质粒，两种质粒通过大肠杆菌S17-1接合转化至嗜盐单胞菌Halomonas bluephagenesis TD01。
通过菌落PCR设计引物筛选基因插入的突变株，并且通过基因测序确认。设计验证引物如图1、2所示，ompW（图中标记为TD01GL001544）为目的基因，HR为同源臂。Wild type验证引物Y1396 + Y1397 = 1122 BP（图1）。Mutant验证引物：Y1398 + Y1383 = 1356 BP，Y1384 + Y1397 = 1204 BP（图2）。菌落PCR为常规操作，使用上述验证引物验证结果如图3所示。
最终，经过菌落PCR和基因测序确认，证实嗜盐单胞菌（Halomonas bluephagenesis）TD01基因组中ompW基因后面已经插入phaC基因、phaA基因、phaB基因。
2）验证phaCAB基因的高强度可靠表达
将不同培养时期的菌株进行RNA提取，并且通过RT-qPCR进行表达水平的检测。实验结果发现，在ompW后面表达的phaCAB基因与ompW有着同样的表达水平。
3）摇瓶发酵检测该命运共同体菌株的PHA积累情况
将获得的命运共同体菌株接种至LB60培养基（LB培养基含有60 g/L NaCl），培养12-16 h后按1%比例（体积比）转接于LB60培养基中，继续培养。
菌液培养10 h后，将2.5 mL菌液接种至47.5 mL MM50培养基中，进行摇瓶实验。摇床转速200 rpm，发酵48 h后，分析细胞干重及PHA积累量。
经过冰干、称重、酯化和气相色谱分析发现，该命运共同体细胞经过48 h摇瓶发酵获得了17 g/L的细胞干重，PHA含量有75%以上。
结果说明，经过在必需基因后面插入PHA合成基因phaCAB可以保证产物合成途径的可靠表达，从而提高产物产量。
实施例2、通过在嗜盐菌Halomonas campaniensis LS21的孔蛋白基因porin前面插入phaCAB基因获得生产PHA的命运共同体菌株
在Halomonas campaniensis LS21菌株的porin基因（编码一种孔蛋白，是一种强表达的必需基因）的前面插入phaC基因、phaA基因、phaB基因，实现了phaCAB的高强度稳定表达，实现了高浓度PHA的积累，构建了PHA生产的命运共同体菌株。
具体操作过程如下：
用CRISPR-Cas9技术在嗜盐单胞菌Halomonas campaniensis LS21基因组中porin基因前面插入phaC基因、phaA基因、phaB基因，获得PHA合成途径相关基因可靠表达的菌株。具体如下：
1）插入基因
用于表达sgRNA以及donor DNA的原始表达载体为pSEVA341质粒（含卡那霉素和壮观霉素抗性基因），sgRNA插入在启动子J23119(SpeI)之后，上下游同源臂及插入基因（phaC、phaA、phaB）插入在sgRNA之后得到相应的重组质粒。
表达gRNA的pSEVA341质粒和表达Cas9的pQ08质粒，两种质粒通过大肠杆菌S17-1接合转化至嗜盐单胞菌Halomonas campaniensis LS21。
通过菌落PCR设计引物筛选基因插入的突变株，并且通过基因测序确认。菌落PCR为常规操作。
最终，经过菌落PCR和基因测序确认，证实嗜盐单胞菌（Halomonas campaniensis）LS21基因组中porin基因前面已经插入phaC基因、phaA基因、phaB基因。
2）验证phaCAB基因的高强度可靠表达
将不同培养时期的菌株进行RNA提取，并且通过RT-qPCR进行表达水平的检测。实验结果发现，在porin前面表达的phaCAB基因与porin有着同样的表达水平。
3）摇瓶发酵检测该命运共同体菌株的PHA积累情况
将获得的命运共同体菌株接种至LB60培养基（LB培养基含有60 g/L NaCl），培养16 h后按1%比例（体积比）转接于LB60培养基中，继续培养。
菌液培养10 h后，将2.5 mL菌液接种至47.5 mL MM50培养基中，进行摇瓶实验。摇床转速200 rpm，发酵48 h后，分析细胞干重及PHA积累量。
经过冰干、称重、酯化和气相色谱分析发现，该命运共同体细胞经过48 h摇瓶发酵获得了16 g/L的细胞干重，PHA含量有80%以上。
结果说明，经过在必需基因前面插入PHA合成基因phaCAB可以保证产物合成途径的可靠表达，从而提高产物产量。
实施例3、将四氢嘧啶合成途经中关键基因插入至Halomonas aydingkolgenesisM1的必需基因前，使得生产基因与必需基因共表达，构成命运共同体菌株
在必需基因ftsZ（细胞分裂相关，中度表达），rpsU（核糖体相关基因，强表达）和edd（ED途经中的关键基因，弱表达）的前面分别插入四氢嘧啶合成途径中的关键基因ectB（图4），使得ectB基因分别与三个必须基因同时高强度稳定表达，实现了四氢嘧啶的稳定生产，构建了四氢嘧啶生产的命运共同体菌株。
具体操作过程如下：
用CRISPR-Cas9技术分别在嗜盐单胞菌Halomonas aydingkolgenesis M1基因组中ftsZ基因、rpsU基因、edd基因前面插入ectB基因，获得四氢嘧啶合成途径相关基因可靠表达的菌株。
1）插入基因
用于表达sgRNA以及donor DNA的原始表达载体为pSEVA341质粒（含卡那霉素和壮观霉素抗性基因），sgRNA插入在启动子J23119(SpeI)之后，上下游同源臂及插入基因（ectB）插入在sgRNA之后得到相应的重组质粒。
表达gRNA的pSEVA341质粒和表达Cas9的pQ08质粒，两种质粒通过大肠杆菌S17-1接合转化至嗜盐单胞菌Halomonas aydingkolgenesis M1。
通过菌落PCR设计引物筛选基因插入的突变株，并且通过基因测序确认。菌落PCR为常规操作。
最终，经过菌落PCR和基因测序确认，证实分别在嗜盐单胞菌（Halomonas aydingkolgenesis）M1基因组中ftsZ基因、rpsU基因、edd基因的前面已经插入ectB基因。
2）验证ectB基因的高强度可靠表达
将不同培养时期的菌株进行RNA提取，并且通过RT-qPCR进行表达水平的检测。实验结果发现，在ftsZ基因、rpsU基因、edd基因前面表达的ectB基因分别与ftsZ基因、rpsU基因、edd基因有着同样的表达水平。
3）摇瓶发酵检测该命运共同体菌株的四氢嘧啶积累情况
将获得的命运共同体菌株接种至LB60培养基（LB培养基含有60 g/L NaCl），培养12-16 h后按1%比例（体积比）转接于LB60培养基中，继续培养。
菌液培养10 h后，将2.5 mL菌液接种至47.5 mL MM50培养基中，进行摇瓶实验。摇床转速200 rpm，发酵48 h后，分析细胞干重及四氢嘧啶积累量。
经过冰干、称重、液相色谱分析发现，该命运共同体细胞经过48 h摇瓶发酵获得了11 g/L的细胞干重，四氢嘧啶产量达到7 g/L以上。
结果说明，经过在必需基因前面插入四氢嘧啶合成关键基因ectB可以保证产物合成途径的可靠表达，从而提高产物产量。
实施例4、通过在嗜盐菌Halomonas bluephagenesis TD01的NDA复制相关的必须基因后面插入phaCAB基因获得共产PHA和赖氨酸的命运共同体菌株
在Halomonas bluephagenesis TD01菌株的rpoC和rpoB基因的后面分别插入phaC基因、phaA基因、phaB基因，均实现了phaCAB的高强度稳定表达，均实现了高浓度PHA和赖氨酸的积累，构建了两个PHA和赖氨酸共产的命运共同体菌株。
具体操作过程如下：
用CRISPR-Cas9技术在嗜盐单胞菌Halomonas bluephagenesis TD01基因组中rpoC和rpoB基因后插入phaC基因、phaA基因、phaB基因，获得PHA合成途径相关基因可靠表达的菌株。具体如下：
1）插入基因
用于表达sgRNA以及donor DNA的原始表达载体为pSEVA341质粒（含卡那霉素和壮观霉素抗性基因），sgRNA插入在启动子J23119(SpeI)之后，上下游同源臂及插入基因（phaC、phaA、phaB）插入在sgRNA之后得到相应的重组质粒。
上游同源臂的DNA序列为：SEQ ID No.2；下游同源臂的DNA序列为：SEQ ID No.3。
表达gRNA的pSEVA341质粒和表达Cas9的pQ08质粒，两种质粒通过大肠杆菌S17-1接合转化至嗜盐单胞菌Halomonas bluephagenesis TD01。
通过菌落PCR设计引物筛选基因插入的突变株，并且通过基因测序确认。菌落PCR为常规操作。
最终，经过菌落PCR和基因测序确认，证实嗜盐单胞菌（Halomonas bluephagenesis）TD01基因组中rpoC和rpoB基因后面已经分别插入phaC基因、phaA基因、phaB基因。
2）验证phaCAB基因的高强度可靠表达
将不同培养时期的菌株进行RNA提取，并且通过RT-qPCR进行表达水平的检测。实验结果发现，在rpoC和rpoB基因后表达的phaCAB基因均与前者有着同样的表达水平。
3）摇瓶发酵检测该命运共同体菌株的PHA和赖氨酸积累情况
将获得的命运共同体菌株接种至LB60培养基（LB培养基含有60 g/L NaCl），培养12-16 h后按1%比例（体积比）转接于LB60培养基中，继续培养。
菌液培养10 h后，将2.5 mL菌液接种至47.5 mL MM50培养基中，进行摇瓶实验。摇床转速200 rpm，发酵48 h后，分析细胞干重及PHA和赖氨酸积累量。
经过冰干、称重、酯化、气相色谱和液相色谱分析发现，该命运共同体细胞经过48h摇瓶发酵获得了8 g/L的细胞干重，PHA含量有40%以上，赖氨酸产量有2.25 g/L。
结果说明，经过在必需基因后面插入PHA合成基因phaCAB可以保证产物合成途径的可靠表达，从而实现PHA和赖氨酸的高效联产。
实施例5、将PHBHHx合成途经中关键基因插入至Halomonas aydingkolgenesis M1的必需基因前，使得生产基因与必需基因共表达，构成命运共同体菌株
在必需基因zipA（细胞分裂相关）和cydA（细胞呼吸相关基因）的后面分别插入PHBHHx合成途经phaC和phaJ，使得phaC和phaJ基因分别与两个必须基因同时高强度稳定表达，实现了PHBHHx的稳定生产，构建了PHBHHx生产的命运共同体菌株。
具体操作过程如下：
用CRISPR-Cas9技术分别在嗜盐单胞菌Halomonas aydingkolgenesis M1基因组中phaC和phaJ基因后面分别插入phaC和phaJ基因，获得PHHx合成途径相关基因可靠表达的菌株。
1）插入基因
用于表达sgRNA以及donor DNA的原始表达载体为pSEVA341质粒（含卡那霉素和壮观霉素抗性基因），sgRNA插入在启动子J23119(SpeI)之后，上下游同源臂及插入基因（phaC和phaJ）插入在sgRNA之后得到相应的重组质粒。
表达gRNA的pSEVA341质粒和表达Cas9的pQ08质粒，两种质粒通过大肠杆菌S17-1接合转化至嗜盐单胞菌Halomonas aydingkolgenesis M1。
通过菌落PCR设计引物筛选基因插入的突变株，并且通过基因测序确认。菌落PCR为常规操作。
最终，经过菌落PCR和基因测序确认，证实分别在嗜盐单胞菌（Halomonas aydingkolgenesis）M1基因组中zipA和cydA基因的前面已经插入phaC和phaJ基因。
2）验证phaC和phaJ基因的高强度可靠表达
将不同培养时期的菌株进行RNA提取，并且通过RT-qPCR进行表达水平的检测。实验结果发现，在zipA和cydA基因前面表达的phaC和phaJ基因分别与zipA和cydA基因有着同样的表达水平。
3）摇瓶发酵检测该命运共同体菌株的四氢嘧啶积累情况
将获得的命运共同体菌株接种至LB60培养基（LB培养基含有60 g/L NaCl），培养12-16 h后按1%比例（体积比）转接于LB60培养基中，继续培养。
菌液培养10 h后，将2.5 mL菌液接种至47.5 mL MM50培养基中，进行摇瓶实验。摇床转速200 rpm，发酵48 h后，分析细胞干重及四氢嘧啶积累量。
经过冰干、称重、液相色谱分析发现，该命运共同体细胞经过48 h摇瓶发酵获得了10 g/L的细胞干重，PHBHHx产量达到7 g/L以上。
结果说明，经过在必需基因前面插入PHHx合成关键基因phaC和phaJ可以保证产物合成途径的可靠表达，从而提高产物产量。
实施例6、将ALA（5-氨基乙酰丙酸）合成途经中关键基因hem1插入至大肠杆菌的必需基因zipA前，使得hem1与必需基因共表达，提高ALA产量
在大肠杆菌E. coli BL21的必需基因zipA（细胞分裂蛋白基因）的前面插入ALA合成途经中关键基因hem1，使其与必须基因同时高强度稳定表达，实现了ALA的稳定生产，构建了ALA生产的命运共同体菌株。
具体操作过程如下：
用CRISPR-Cas9技术在大肠杆菌E. coli BL21中zipA基因后面插入hem1基因，获得ALA合成途径相关基因可靠表达的菌株。
1）插入基因
用于表达sgRNA以及donor DNA的原始表达载体为pSEVA341质粒（含卡那霉素和壮观霉素抗性基因），sgRNA插入在启动子J23119(SpeI)之后，上下游同源臂及插入基因（hem1）插入在sgRNA之后得到相应的重组质粒。
表达gRNA的pSEVA341质粒和表达Cas9的pQ08质粒，两种质粒转化至大肠杆菌E. coli BL21。
通过菌落PCR设计引物筛选基因插入的突变株，并且通过基因测序确认。菌落PCR为常规操作。
最终，经过菌落PCR和基因测序确认，证实分别在大肠杆菌E. coli BL21基因组中zipA基因的前面已经插入hem1基因。
2）验证hem1基因的高强度可靠表达
将不同培养时期的菌株进行RNA提取，并且通过RT-qPCR进行表达水平的检测。实验结果发现，在zipA基因前面表达的hem1基因与zipA基因有着同样的表达水平。
3）摇瓶发酵检测该命运共同体菌株的ALA积累情况
将获得的命运共同体菌株接种至LB培养基，培养12-16 h后按1%比例（体积比）转接于LB培养基中，继续培养48 h。经过分析发现，该命运共同体细胞经过48 h摇瓶发酵获得了2 g/L的ALA。
结果说明，经过在必需基因前面插入ALA合成关键基因hem1可以保证产物合成途径的可靠表达，从而提高产物产量。
实施例7、将赖氨酸合成途经中关键基因插入至谷棒杆菌的必需基因hom后，使得赖氨酸生产基因与必需基因共表达，提高赖氨酸产量
在谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）中，高丝氨酸脱氢酶（由hom基因编码）参与高丝氨酸和苏氨酸的代谢合成，高丝氨酸和苏氨酸是蛋白质的基本组成成分，对生物的正常生命活动起重要作用，敲除hom基因会严重影响菌的正常生长。因此，高丝氨酸脱氢酶是谷氨酸棒杆菌生长过程中的必需基因。
赖氨酸合成通路中天冬氨酸激酶（由lysC编码）催化天冬氨酸磷酸盐的形成，控制碳通量流入到赖氨酸通路，是赖氨酸合成途径中的关键基因。在谷氨酸棒杆菌中，四氢吡啶二羧酸合酶（由dapA编码）、四氢吡啶二羧酸还原酶（由dapB编码）、二氨基甲酸脱氢酶（由ddh编码）、二氨基庚二酸脱羧酶（由lysA编码）是合成赖氨酸的关键催化酶，也是赖氨酸合成通路的重要组成部分。
利用命运共同体的概念，以高丝氨酸脱氢酶（由hom基因编码）作为必需基因，在谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）的hom基因的后面分别插入lysC、dapA、dapB、 ddh、lysA合成赖氨酸的关键，构建表达lysC-dapA-dapB-ddh-lysA基因的命运共同体菌株，在谷氨酸棒杆菌实现高强度表达赖氨酸关键合成基因。
具体操作过程如下：
用CRISPR-Cas9技术在谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）基因组中hom基因后插入lysC、dapA、dapB、ddh、lysA，获得赖氨酸合成途径相关基因可靠表达的菌株。具体如下：
1）插入基因
在hom 基因上设计的sgRNA并构建donor载体，经过菌落PCR和基因测序确认谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）基因组中hom基因后面已经分别插入lysC、dapA、 dapB、ddh、lysA基因。
2）验证phaCAB基因的高强度可靠表达
将不同培养时期的菌株进行RNA提取，并且通过RT-qPCR进行表达水平的检测，发现lysC、dapA、dapB、ddh、lysA基因与hom具有同样的表达水平。
3）摇瓶发酵检测该命运共同体菌株的赖氨酸积累情况
将获得的命运共同体菌株接种到培养基中，培养12-16 h后按1%比例（体积比）转接到新的培养基中，继续培养。
菌液培养10 h后，菌液接种至发酵培养基中，进行摇瓶实验，摇瓶发酵48 h后，赖氨酸积累量达到了130 g/L。
结果说明，经过在必需基因后面插入赖氨酸合成关键基因，可以保证产物合成途径的可靠表达，从而提高赖氨酸的产量。
实施例8、将PHBV合成途经中关键基因插入至罗氏真养杆菌的必需基因pyk2后，提高PHBV产量
在Ralstonia eutropha H16菌株的pyk2基因（编码丙酮酸激酶，是一种强表达的必需基因）的后面插入phaC基因、phaA基因、phaB基因、scpA基因和scpB基因，实现了phaCAB和scpAB基因簇的高强度稳定表达，实现了高浓度PHBV的积累，构建了PHBV高产的命运共同体菌株。
具体操作过程如下：
用CRISPR-Cas9技术在罗氏真养杆菌Ralstonia eutropha H16基因组中pyk2基因前面插入phaC基因、phaA基因、phaB基因、scpA基因和scpB基因，获得PHBV合成途径相关基因可靠表达的菌株。具体如下：
1）插入基因
用于表达sgRNA以及donor DNA的原始表达载体为pSEVA341质粒（含卡那霉素和壮观霉素抗性基因），sgRNA插入在启动子J23119(SpeI)之后，上下游同源臂及插入基因（phaC、phaA、phaB、scpA和scpB）插入在sgRNA之后得到相应的重组质粒。
表达gRNA的pSEVA341质粒和表达Cas9的pQ08质粒，两种质粒通过大肠杆菌S17-1接合转化至罗氏真养杆菌Ralstonia eutropha H16。
通过菌落PCR设计引物筛选基因插入的突变株，并且通过基因测序确认。菌落PCR为常规操作。
最终，经过菌落PCR和基因测序确认，证实罗氏真养杆菌Ralstonia eutropha H16基因组中pyk2基因后面已经插入phaC基因、phaA基因、phaB基因、scpA基因和scpB基因。
2）验证phaCAB基因和scpAB的高强度可靠表达
将不同培养时期的菌株进行RNA提取，并且通过RT-qPCR进行表达水平的检测。实验结果发现，在pyk2基因后面表达的phaCAB基因和scpAB基因与pyk2有着同样的表达水平。
3）摇瓶发酵检测该命运共同体菌株的PHA积累情况
将获得的命运共同体菌株接种至LB培养基（LB培养基含有10 g/L NaCl），培养16h后按1%比例（体积比）转接于LB培养基中，继续培养。
菌液培养10 h后，将2.5 mL菌液接种至47.5 mL MM基本培养基中，进行摇瓶实验。摇床转速200 rpm，发酵48 h后，分析细胞干重及PHBV积累量。
经过冰干、称重、酯化和气相色谱分析发现，该命运共同体细胞经过48 h摇瓶发酵获得了16 g/L的细胞干重，PHA含量有80%以上。
结果说明，经过在必需基因后面插入PHBV合成基因phaCAB和scpAB可以保证产物合成途径的可靠表达，从而提高产物PHBV产量。
实施例9、将淀粉酶合成基因插入至芽孢杆菌的必需基因prsA后，使淀粉酶产量提高
在芽孢杆菌Bacillus subtilis的必需基因prsA基因（蛋白合成质量控制相关）后面插入来自芽孢杆菌Bacillus licheniformis来源的淀粉酶合成基因amyL,使得amyL基因与必需基因同时高强度稳定表达，实现淀粉酶的稳定生产，提高淀粉酶的活性和产量，构建淀粉酶表达生产的命运共同体菌株。
具体操作过程如下：
用CRISPR-Cas9技术在芽孢杆菌Bacillus subtilis 基因组中prsA基因后面插入amyL基因，获得淀粉酶稳定表达生产的菌株。
1）插入基因
用于表达sgRNA以及donor DNA的原始表达载体为pSEVA341质粒（含卡那霉素和壮观霉素抗性基因），将相应的sgRNA置于在启动子J23119(SpeI)之后，插入位点的上下游同源臂及插入基因amyL基因置于sgRNA之后，得到相应的重组质粒pSEVA341-sgRNA-amyL。
将重组质粒pSEVA341-sgRNA-amyL和表达Cas9的pQ08质粒通过大肠杆菌S17-1接合转化至芽孢杆菌Bacillus subtilis。
设计引物通过菌落PCR筛选基因插入的突变株，并且通过基因测序确认。菌落PCR为常规操作。
最终，经过菌落PCR和基因测序确认，证实分别在芽孢杆菌Bacillus subtilis基因组中prsA基因的后面已经插入amyL基因。
2）验证amyL基因的高强度稳定表达
将不同培养时期的菌株进行RNA提取，并且通过RT-qPCR进行表达水平的检测。实验结果发现，在prsA基因后面表达的amy基因和prsA基因有着同样的表达水平。
3）Western-Blot验证淀粉酶的表达
为了分析淀粉酶amyL表达，将储存于细胞沉淀物悬浮在BugBuster®Master MixLysis Solution（美国马萨诸塞州诺瓦根）中，并根据制造商的说明进行处理。在4°C下以16000×g离心后制备细胞的可溶性级成分和不溶级成分。使用安装在Mini Gel Tank（LifeTechnologies）中的12％Bis-Tris凝胶（Life Technologies，NP0342Box，USA）进行SDS-PAGE分析。可溶性蛋白质的浓度用BCA蛋白质分析试剂盒（Thermo Scientific）确定。用Fluro-ChemTM FC3系统（ProteinSample）扫描凝胶泳道。
通过Western-Blot实验也显示连接必须基因的淀粉酶表达量比没有连接必需基因的淀粉酶高2倍。
4）酶活实验检测该命运共同体菌株的淀粉酶活性
淀粉酶活性测试是基于二硝基水杨酸法进行测试的，包括两部分溶液，反应溶液和终止溶液。其中反应溶液是将0.5%可溶性淀粉溶于20 mM的乙酸钠溶液中；终止溶液是0.4M氢氧化钠, 22 mM 二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid）, 1.1 M KCl (+)-tartrate tetrahydrate （钾钠(+)-酒石酸四水合物）混合溶液，以上提及的试剂均购买于sigma。实验步骤是将200uL的反应溶液和50 uL的粗酶（即细菌培养的上清液）混合，在37度下孵育5 min, 加入200 uL的终止溶液，在100度下加热5 min, 测542 nm处测其吸光度。酶活定义是单位体积内每分钟释放的葡萄糖的摩尔数，相当于淀粉酶释放的葡萄糖的量。
通过酶活实验，测得淀粉酶活性是650 U/mL，和对照（没有连接必需基因）相比，提升了3倍。
结果说明，经过在必需基因后面插入淀粉酶合成基因amyL可以保证淀粉酶高强度的稳定表达。
实施例10、将beta-胡萝卜素合成基因插入至酿酒酵母的必需基因RBA50和GPN2后，提高beta-胡萝卜素的产量
在酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae的必需基因RBA50和GPN2（RNA聚合酶组装相关基因）的后面分别插入beta-胡萝卜素合成途经idi、crtE、crtB、crtI和crtY，使得idi、 crtE、crtB、crtI和crtY五个基因分别与两个必须基因同时高强度稳定表达，实现了beta-胡萝卜素的稳定生产，构建了beta-胡萝卜素生产的命运共同体菌株。
具体操作过程如下：
用CRISPR-Cas9技术分别在酿酒酵母基因组中RBA50和GPN2基因后面分别插入idi、crtE、crtB、crtI和crtY基因，获得beta-胡萝卜素合成途径相关基因可靠表达的菌株。
1）插入基因
用于表达sgRNA以及donor DNA的原始表达载体为pSEVA341质粒（含卡那霉素和壮观霉素抗性基因），sgRNA插入在启动子J23119(SpeI)之后，上下游同源臂及插入基因（idi、 crtE、crtB、crtI和crtY）插入在sgRNA之后得到相应的重组质粒。
表达gRNA的pSEVA341质粒和表达Cas9的pQ08质粒，两种质粒转化至酿酒酵母。
通过菌落PCR设计引物筛选基因插入的突变株，并且通过基因测序确认。菌落PCR为常规操作。
最终，经过菌落PCR和基因测序确认，证实分别在酿酒酵母基因组中RBA50和GPN2基因的后面已经插入idi、crtE、crtB、crtI和crtY基因。
2）验证idi、crtE、crtB、crtI和crtY基因的高强度可靠表达
将不同培养时期的菌株进行RNA提取，并且通过RT-qPCR进行表达水平的检测。实验结果发现，在RBA50和GPN2基因后面表达的idi、crtE、crtB、crtI和crtY基因分别与RBA50和GPN2基因有着同样的表达水平。
3）摇瓶发酵检测该命运共同体菌株的beta-胡萝卜素积累情况
将获得的命运共同体菌株接种至YPD培养基，培养12-16 h后按1%比例（体积比）转接于YPD培养基中，继续培养。
菌液培养10 h后，将2.5 mL菌液接种至47.5 mL MM培养基中，进行摇瓶实验。摇床转速200 rpm，发酵48 h后，分析细胞干重及beta-胡萝卜素积累量。
经过冰干、称重、液相色谱分析发现，该命运共同体细胞经过48 h摇瓶发酵获得了5.4mg/g细胞干重的beta-胡萝卜素。
结果说明，经过在必需基因后面插入beta-胡萝卜素合成关键基因idi、crtE、 crtB、crtI和crtY可以保证产物合成途径的可靠表达，从而提高产物产量。
实施例11、将苹果酸合成基因插入至黑曲霉的必需基因edd后，使得苹果酸产量提高。
在黑曲霉Aspergillus niger的必需基因edd（编码磷酸葡糖酸脱水酶）的后面分别插入苹果酸合成途径ASPNIDRAFT_48680，使得ASPNIDRAFT_48680基因分别与两个必须基因同时高强度稳定表达，实现了苹果酸的稳定生产，构建了苹果酸生产的命运共同体菌株。
具体操作过程如下：
用CRISPR-Cas9技术在黑曲霉基因组中edd基因后面插入ASPNIDRAFT_48680基因，获得苹果酸合成途径相关基因可靠表达的菌株。
1）插入基因
用于表达sgRNA以及donor DNA的原始表达载体为pSEVA341质粒（含卡那霉素和壮观霉素抗性基因），sgRNA插入在启动子J23119(SpeI)之后，上下游同源臂及插入基因（ASPNIDRAFT_48680）插入在sgRNA之后得到相应的重组质粒。
表达gRNA的pSEVA341质粒和表达Cas9的pQ08质粒，两种质粒转化至酿酒酵母。
通过菌落PCR设计引物筛选基因插入的突变株，并且通过基因测序确认。菌落PCR为常规操作。
最终，经过菌落PCR和基因测序确认，证实分别在酿酒酵母基因组中edd基因的后面已经插入ASPNIDRAFT_48680基因。
2）验证ASPNIDRAFT_48680基因的高强度可靠表达
将不同培养时期的菌株进行RNA提取，并且通过RT-qPCR进行表达水平的检测。实验结果发现，在edd基因后面表达的ASPNIDRAFT_48680基因与edd基因有着同样的表达水平。
3）摇瓶发酵检测该命运共同体菌株的苹果酸积累情况
将获得的命运共同体菌株接种至LB培养基，培养12-16 h后按1%比例（体积比）转接于LB培养基中，继续培养。
菌液培养10 h后，将2.5 mL菌液接种至47.5 mL MM培养基中，进行摇瓶实验。摇床转速200 rpm，发酵48 h后，分析细胞干重及苹果酸积累量。
经过冰干、称重、液相色谱分析发现，该命运共同体细胞经过48 h摇瓶发酵获得了103 g/L细胞干重的苹果酸。
结果说明，经过在必需基因后面插入苹果酸合成关键基因ASPNIDRAFT_48680可以保证产物合成途径的可靠表达，从而提高产物产量。
实施例12、将虾青素合成基因插入至海洋蓝藻Synechococcus sp. PCC7002的必需基因prs和pyrG后，使得虾青素产量提高。
在必需基因prs和pyrG（核苷酸合成相关基因）的后面分别插入虾青素合成途经idi、crtE、crtB、crtI、crtY、crtZ和crtW，使得idi、crtE、crtB、crtI、crtY、crtZ和crtW七个基因分别与两个必须基因同时高强度稳定表达，实现了虾青素的稳定生产，构建了虾青素生产的命运共同体菌株。
具体操作过程如下：
用CRISPR-Cas9技术分别在海洋蓝藻Synechococcus sp. PCC7002基因组Prs和PyrG基因后面分别插入idi、crtE、crtB、crtI、crtY、crtZ和crtW基因，获得虾青素合成途径相关基因可靠表达的菌株。
1）插入基因
用于表达sgRNA以及donor DNA的原始表达载体为pSEVA341质粒（含卡那霉素和壮观霉素抗性基因），sgRNA插入在启动子J23119(SpeI)之后，上下游同源臂及插入基因（idi、 crtE、crtB、crtI、crtY、crtZ和crtW）插入在sgRNA之后得到相应的重组质粒。
表达gRNA的pSEVA341质粒和表达Cas9的pQ08质粒，两种质粒转化至海洋蓝藻Synechococcus sp. PCC7002。
通过菌落PCR设计引物筛选基因插入的突变株，并且通过基因测序确认。菌落PCR为常规操作。
最终，经过菌落PCR和基因测序确认，证实分别在酿酒酵母基因组中prs和pyrG基因的后面已经插入idi、crtE、crtB、crtI、crtY、crtZ和crtW基因。
2）验证idi、crtE、crtB、crtI、crtY、crtZ和crtW基因的高强度可靠表达
将不同培养时期的菌株进行RNA提取，并且通过RT-qPCR进行表达水平的检测。实验结果发现，在prs和pyrG基因后面表达的idi、crtE、crtB、crtI、crtY、crtZ和crtW基因分别与prs和pyrG基因有着同样的表达水平。
3）摇瓶发酵检测该命运共同体菌株的虾青素积累情况
将获得的命运共同体菌株接种至LB培养基，培养12-16 h后按1%比例（体积比）转接于LB培养基中，继续培养。
菌液培养10 h后，将2.5 mL菌液接种至47.5 mL MM培养基中，进行摇瓶实验。摇床转速200 rpm，发酵48 h后，分析细胞干重及虾青素积累量。
经过冰干、称重、液相色谱分析发现，该命运共同体细胞经过48 h摇瓶发酵获得了4.8 mg/g细胞干重的虾青素。
结果说明，经过在必需基因后面插入虾青素合成关键基因idi、crtE、crtB、crtI、 crtY、crtZ和crtW可以保证产物合成途径的可靠表达，从而提高产物产量。
综上所述，本发明通过将必需基因与编码产物合成路径的基因串联表达，以实现后者的可靠和可持续表达，实现了产品的稳定生产，提高了生产效率。更重要地，通过将微生物必需基因与编码产物合成路径的基因串联表达，减小了微生物对环境变化的抗逆性，实现了更稳定的目的基因表达，使得生物制造的限制性和制约条件降低，更有利于以后的放大生产和提高产品的产率。该方法将在生物制造和生物工业技术方面发挥重要作用，大幅度降低产品的制造成本。
应该注意到并理解，在不脱离后附的权利要求所要求的本发明的精神和范围的情况下，能够对上述详细描述的本发明做出各种修改和改进。因此，要求保护的技术方案的范围不受所给出的任何特定示范教导的限制。
申请人声明，以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 清华大学
北京微构工场生物技术有限公司
<120> 一种微生物基因表达命运共同体及其构建方法和应用
<130> P0102021090713W
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60
g 61
<210> 2
<211> 1032
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tggcaacaac gccgctcaat taacattctg ccgtattttc tccataggtt gttgttttta 60
aatattaaaa ttaaatatgg cacgcagttc gctaaatgtt aagtaagaag caaatgaaca 120
gagttccaga cgataaatag ggtgctcttc cttctttgct atatcgcccc gacagagatt 180
ggtaagcgat acactgagtg agctggcgtg ctccacctgg gtccccttcg ggggactttt 240
tttatgcctg tcatttgtac ctgactttta taactgatgc tgttggccgg ctgtgcttga 300
tatgtaaaac ttatattaaa ataacacaac aagtttggaa acgctgttcg attggtatat 360
attgtatagg tagctggagt taccggcacc aatccccagt aagatgtaag aggatgaccc 420
tgatgagtaa attaaaatta gtatctgctg ctgttctttc cgctagcgcc ttgatcgcca 480
gccaagcagc attcgcttac gaagcaggtg acgttttcgt acgtggtggt gtcgcccaaa 540
cggatacggg ttctggaaat ggcaatgttg gcgcggcaga tctaaacgta caaagcgcgc 600
gaggatttac gtttggcgcg ggttacctgt tcactgataa gcttggtgct gaacttaaca 660
gctccgagaa gtttgaacac gacctcaaca ccagtcctgg tggcgacgca ggtagcgtag 720
atcgtttgcc aattaatctg atggttaact actatccgat gggcggtttg gactctaaag 780
ttcagcccta tgtcggcgtt ggcttgaact acactcgctt ctcaggcgag cccactggcc 840
taagcgttga tgaaagctat ggcgcgatag gtcaggcggg ggttgattta gcggttaccg 900
ataacgtcat gctgaatggt tacgttagct acgcagacgt gaacgccgac attaatgcaa 960
gtggtaacaa ggtcggtgaa gtaaacatgg aaccagtcac tatcggtggt ggcgttacct 1020
accgcttcta ac 1032
<210> 3
<211> 1027
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgttttgctt atcagggggt caagtttttg aagccactct ctgtgacgac aacgttatct 60
tcaatacgga tgccgccaca gttggctaac gaatcaacgg ctctccagtt aatcggcagt 120
gccttgtcgc gcaatggttt cagcaacata gggatatagt agaatccagg ctctatggtt 180
actaccatgc ctgggcgcag tgtacgggtt aaacgtagcg ctgggtgttg ttcaggagca 240
ggtgagggcg ttccgtctgg atgacgaagc cctgccacat catgaacctg tagccccaac 300
gaatgcccta atccgtgtgg gcaaaaggcc cgcgtaatcc cctcatcaac tgcctgttct 360
gcactaccct gaaaaagatc attggcaata agaatatctg ccaacaaacg atgcatttgc 420
tcatgtagcg caatgaactc cacgcctgga gcaacgcttc cgacaagcgt gtcttttaac 480
tggtggatac cgtcaattaa atcgcgatag agggctggcg cgtcaggacc tgcataagtg 540
cgtgtaatgt cagcgcagta gccgcgaaaa cggcgaccag cgtcaaccag taggctatgt 600
cgttgcgtgg gactttttag gccatagtgt tggtaatgca agacacctgc atgttcattt 660
agcccaatga tgttctgata ggggacatcg gattcacgct gtctgctggc agccaggtag 720
gccagttgaa tatctaactc cgccgacgcg ccaataaaag ccgcctgtgc ggcttgatga 780
cctgccatgg cgagtcggtt agcttcgctc aaacaagcaa tttcataagc agtcttgaac 840
atgcgcagtt cgtctagagc cttaaccagc ggttcgggct ggtactgtgc gtctaatgcg 900
aggcacgtgg tggcctcaat atcgccgatc acggcagcgc gaccggctaa cgttggcatg 960
gttttttcac tacatagatg aatatcaaac tcagtcaccc atggctcttc aggaaggcga 1020
gtaggca 1027

Claims (9)

1.一种重组微生物，其特征在于，所述重组微生物的基因组中包括细胞必需基因和编码产物合成途径相关的基因，编码产物合成途径相关的基因位于细胞必需基因启动子的后面，且位于细胞必需基因的前面或后面，所述的细胞必需基因选自ompW，porin，cydA，rpoC，rpoB，rpsU，ftsZ，zipA，pyk2，prsA，RBA50，GPN2，prs，pyrG，edd或hom。
2.根据权利要求1所述的重组微生物，其特征在于，所述的编码产物合成途径相关的基因是天然或非天然产物的合成路径的基因。
3.根据权利要求1所述的重组微生物，其特征在于，所述重组微生物为真核微生物或原核微生物。
4.根据权利要求3所述的重组微生物，其特征在于，所述原核微生物是大肠杆菌、罗氏真养杆菌、芽孢杆菌、谷棒菌或嗜盐菌中的任意一种。
5.根据权利要求3所述的重组微生物，其特征在于，所述真核微生物是真菌或者藻类中的任意一种。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的重组微生物的构建方法，其特征在于，所述的重组微生物为真核微生物或原核微生物。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述的原核微生物为嗜盐单胞菌。
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述的嗜盐单胞菌是Halomonas bluephagenesis TD01 CGMCC. No. 4353、Halomonas campaniensis LS21 CGMCC No.6593和Halomonas aydingkolgenesis M1 CGMCC NO.19880。
9.一种权利要求1-5任一所述的重组微生物在生产聚羟基脂肪酸PHA中的应用。
CN202111132136.4A 2021-09-27 2021-09-27 一种微生物基因表达命运共同体及其构建方法和应用 Active CN113564193B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111132136.4A CN113564193B (zh) 2021-09-27 2021-09-27 一种微生物基因表达命运共同体及其构建方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111132136.4A CN113564193B (zh) 2021-09-27 2021-09-27 一种微生物基因表达命运共同体及其构建方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113564193A CN113564193A (zh) 2021-10-29
CN113564193B true CN113564193B (zh) 2022-03-11

Family

ID=78174706

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111132136.4A Active CN113564193B (zh) 2021-09-27 2021-09-27 一种微生物基因表达命运共同体及其构建方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113564193B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114806974B (zh) * 2022-06-10 2023-08-08 中国科学院微生物研究所 一株盐单胞菌菌株及其应用
CN116286931B (zh) * 2023-04-03 2023-11-28 北京蓝晶微生物科技有限公司 用于富养罗尔斯通氏菌快速基因编辑的双质粒系统及应用
CN117363554B (zh) * 2023-12-08 2024-04-09 清华大学 一种工程改造的嗜盐微生物及其构建方法和应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101525599B (zh) * 2008-03-07 2011-07-27 中国科学院微生物研究所 一种与聚羟基丁酸戊酸共聚酯合成相关的酶及其编码基因与应用
CN102120973B (zh) * 2010-12-08 2012-10-10 清华大学 一株盐单胞菌及其应用
CL2016001661A1 (es) * 2016-06-29 2017-03-03 Univ Chile Promotor hibrido de ß-actina (de cricetulus griseus) y citomegalovirus (cmv), con región rica en dinucleótidos, citosina-guanina, vectores, líneas celulares, procedimiento para producir proteínas recombinantes.
CN110857449B (zh) * 2018-08-24 2021-12-14 清华大学 一种改进的生产聚羟基脂肪酸酯的方法
CN111235173B (zh) * 2020-01-22 2021-10-08 清华大学 一种生产短中链聚羟基脂肪酸酯pha及其功能衍生物的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN113564193A (zh) 2021-10-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113564193B (zh) 一种微生物基因表达命运共同体及其构建方法和应用
US20220162653A1 (en) Preparation of (R)-3-Hydroxybutyric Acid or Its Salts by One-Step Fermentation
CN111197021B (zh) 一种l-赖氨酸产量提高的重组谷氨酸棒杆菌及其构建方法
CN114480240B (zh) 一种产岩藻糖基乳糖的基因工程菌及生产方法
CN111019878B (zh) L-苏氨酸产量提高的重组大肠杆菌及其构建方法与应用
JP2024026179A (ja) バイオレチノールを生産する微生物及びそれを用いたバイオレチノールの生産方法
CN109536428A (zh) 一种产l-异亮氨酸的基因工程菌及其构建方法和应用
WO2023097975A1 (zh) 一株产d-阿洛酮糖3-差向异构酶的菌株及其应用
CN104928272A (zh) 融合多肽、编码它的核酸分子以及使用它产生衣康酸的方法
CN111286520B (zh) 用于发酵生产l-赖氨酸的重组dna、菌株及其应用
CN109055417B (zh) 一种重组微生物、其制备方法及其在生产辅酶q10中的应用
CN107460152A (zh) 产红景天苷及其类似物的重组菌、构建方法及用途
CN116769808A (zh) 一种专一生产2′-岩藻糖基乳糖的菌株及应用
CN116676243A (zh) 产2&#39;-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌的构建方法及其应用
CN114806991A (zh) 一种提高岩藻糖基乳糖产量的工程大肠杆菌及生产方法
CN108913732B (zh) 一种莫纳可林j异源生产的方法及应用
CN114672525A (zh) N-乙酰基-5-甲氧基色胺的生物合成方法及其应用
CN113913355A (zh) 一种产辅酶q10的基因工程菌及其应用
CN112899314A (zh) 一种促进重组解脂亚罗酵母菌合成根皮素的方法
CN101265474A (zh) 产气荚膜梭菌甘油脱水酶激活因子基因及其1,3-丙二醇的生产方法
CN111304105A (zh) 利用甲醇和木糖共底物产脂肪酶的基因工程菌及其应用
CN111094570A (zh) 具有稳定的功能dna序列的拷贝数的微生物及相关方法
US20240060056A1 (en) Modified beta-1,3-n-acetylglucosaminyltransferase polypeptides
KR100853891B1 (ko) 피에프1022 물질 유도체를 생산하는 형질전환체, 그의제조법, 및 신규 생합성 유전자
CN110872595B (zh) 抗酸表达盒及其在发酵产有机酸中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant