CN114806974B - 一株盐单胞菌菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株盐单胞菌菌株及其应用，所述菌株为盐单胞菌属(Halomonas)中的新种，保藏编号为CGMCC NO.24977。本发明中分离获得的菌株C2‑1‑M8，是不同于Halomonas属已知种的新种，并且可在胞内合成四氢嘧啶(Ectoine)。菌株C2‑1‑M8可以利用D‑果糖、甘油、D‑果糖‑6‑磷酸、L‑丙氨酸、L‑组胺、L‑丝氨酸、D‑半乳糖醛酸、D‑葡糖醛酸、葡糖醛酰胺、L‑乳酸、D‑苹果酸、L‑苹果酸、吐温40等底物，具有底物广谱性。根据生理生化实验，菌株C2‑1‑M8的生长温度为4℃‑30℃，生长所需NaCl浓度为1.0％‑17.0％，生长pH值为5.0‑7.5。同时，菌株C2‑1‑M8在30℃、NaCl浓度为5.0％‑9.0％、pH5.5‑7.0的条件下合成四氢嘧啶的产量最佳。该菌株在生物制备四氢嘧啶中具有非常广泛的应用前景。

Description

一株盐单胞菌菌株及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株盐单胞菌菌株及其在合成四氢嘧啶中的应用。
背景技术
中度嗜盐菌是指能在NaCl浓度为0.1％-32.5％的环境中生长的微生物类群。它们为了抵御高渗透压逆境对自身的损害，维持细胞内外的渗透压平衡，会在体内合成有机渗透物，如谷氨酸、脯氨酸，甘氨酸，甜菜碱，海藻糖，四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶等。四氢嘧啶作为相容性溶质既可以作为核酸、酶、细胞膜等生物大分子的稳定剂，帮助细胞抵抗如高盐、高温、冰冻、干燥等逆境，也能作为分子伴侣，通过识别蛋白质的错误折叠来抑制蛋白质聚合体的形成。
四氢嘧啶是由Galinsk等于1985年从Ectothiorhodospira halochloris DSM1059中首次发现并鉴定出结构，是一种环化的氨基酸衍生物。性质稳定，不易分解，分子式为C6H10O2N2，分子量为142.16，溶于水、甘油、甲醇、乙醇、丙二醇等，不溶于二甲基亚砜、三氯甲烷。
目前，科学家己从分子水平阐明了在嗜盐海球菌Marinococcus halophilus、巴斯德氏盐水芽孢杆菌Salibacillus pasteurii和需盐色盐杆菌 Chromohalobactersalexigens中四氢嘧啶的合成途径。该过程由天冬氨酸- β-半醛开始，形成的产物依次是二氨基丁酸、乙酰二氨基丁酸和四氢嘧啶。依次由二氨基丁酸氨基转移酶(EctB)、二氨基丁酸乙酰转移酶(EctA) 和四氢嘧啶合成酶(EctC)催化完成。且ectA、ectB和ectC基因组成一个操纵子，受共同的启动子调控。
近年来，相容性溶质的渗透保护功能以及在不同领域内如化妆品领域、分子基因工程的应用越来越受到重视。四氢嘧啶能够作为稳定剂保护和稳定酶、DNA、膜等大分子，具有抗高盐、抗干燥、抗冷冻、防止热变性等功能，所以在食品、生物制药、酶制剂、农药以及化妆品等领域都具有广泛的应用前景。四氢嘧啶合成基因己经在烟草中得到表达，尽管其表达量比较低，但耐盐性还是有一定的提高。四氢嘧啶还被用来作为化妆品的保湿剂，防止皮肤干燥、衰老等。如德国默克公司最近推出一套新兴化妆品，包含的四氢嘧啶对胰岛细胞有免疫作用、能产生热激蛋白、保护膜的完整性、还可以减少皮肤因紫外线形成的晒斑。
化学合成四氢嘧啶的前体物(如二氨基丁酸)价格昂贵，且四氢嘧啶分子中有一个手性碳原子，很难用化学方法合成。四氢嘧啶的生产方法包括发酵法和酶催化法。目前，四氢嘧啶主要是从Halomonas elongata 中提取。嗜盐微生物中含有四氢嘧啶的合成途径，因此广泛用于发酵法生产四氢嘧啶。目前已发现有许多耐盐菌及嗜盐菌可合成四氢嘧啶，包括Halomonas elongata，Brevibacterium epidermis，Marinococcus strain M52，Halomonas boliviensis，Chromohalobacter salexigens，Halomonas venusta 等。可利用这些微生物采用“细菌挤奶”工艺生产四氢嘧啶，即高盐诱导下在细胞内合成四氢嘧啶，然后经低渗冲击细胞释放四氢嘧啶，维持细胞内外渗透压平衡。另外，有研究人员用重组工程菌如Escherichia coli 和Corynebacterium glutamicum，或嗜盐菌如Halomonas salina连续合成并分泌四氢嘧啶。可见，微生物合成方法生产四氢嘧啶具有较广的应用前景。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一株盐单胞菌(Halomonas sp.)菌株 C2-1-M8。
本发明提供的盐单胞菌菌株C2-1-M8，分离自西藏阿里地区龙木错潮岸土壤中，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏编号为CGMCC NO.24977，保藏日期为2022年5月26日。经过细菌菌种鉴定，发现其是盐单胞菌属Halomonas中的新种。
本发明的第二个目的在于提供该盐单胞菌菌株制成的发酵液及液体菌剂以及其制备方法。
其中，发酵液及液体菌剂的制备方法，包括：
1)菌株活化：挑取菌种划线接种至固体培养基(2216固体培养基：蛋白胨5.0g、酵母提取物1.0g、柠檬三铁0.1g、氯化钠19.45g、氯化镁 8.8g、亚硫酸钠3.24g、氯化钙1.3g、氯化钾0.55g、碳酸氢钠0.16g、溴化钾0.08g、氯化锶34.0mg、硼酸22.0mg、硅酸钠4.0mg、氟化钠 2.4mg、硝酸铵1.6mg、磷酸氢二钠8.0mg，琼脂15.0g，加蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌20min)，于恒温培养箱30℃下培养14～20h；
2)液体种子制备：挑取活化菌株接种于装有种子培养基(2216液体培养基：配方及制备同上述2216固体培养基，不添加琼脂)的大试管中，橡胶塞封口，于30℃的摇床上，160-200rpm下振荡培养24h，得种子液；
3)液体发酵：然后按照液体种子和发酵培养基(配方及制备同上述 2216液体培养基，补加NaCl至终浓度为5.0-9.0％，最佳盐浓度为9.0％ NaCl)以体积比5～10％的接种量进行扩大培养，培养条件为30℃，150 rpm；振荡培养48h得到的培养物即为发酵液；将发酵液以12000rpm离心10min，收集菌体。
采用上述方法制备得到的发酵液和液体菌剂中菌体总浓度为1.94× 109cfu/mL-1.99×109cfu/mL。
本发明的第三个目的在于提供一种从上述盐单胞菌发酵液及液体菌剂中提取和检测四氢嘧啶的方法，包括如下步骤：
1)按照前述方法制备发酵液并收集菌体；
2)用磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液洗涤菌体，12000rpm离心 15min，收集沉淀，在沉淀中加入2ml 80％的乙醇悬浮，室温振荡过夜后 12000rpm离心15min，取上清液。所述上清液中含有四氢嘧啶。
上述步骤中，优选地，所述磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液的pH值为7.0时效果最好。
本发明具有如下优点：
本发明的盐单胞菌C2-1-M8分离自西藏阿里地区龙木错盐湖岸边土壤，环境未受污染，无生态毒性、安全性高、稳定性强。
本发明的盐单胞菌C2-1-M8经过基因序列分析，系统发育学及生理生化特征分析，被鉴定为Halomonas属的新种。
本发明的盐单胞菌C2-1-M8培养简单、周期短、稳定性强，能够生物合成四氢嘧啶，在生物合成四氢嘧啶中有非常广泛的开发应用前景。
附图说明
图1：菌株C2-1-M8的电子透射显微镜下的形态图；
图2：菌株C2-1-M8的16S rRNA基因系统发育树；
图3：四氢嘧啶标准品HPLC检测绘制标准曲线；
图4：HPLC检测四氢嘧啶的特征峰图；
图5：HPLC检测菌株C2-1-M8不同盐浓度下四氢嘧啶产量比较。
具体实施方式
下面将通过具体实施例来对本发明进行进一步的解释，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
如无特殊说明，本发明所采用的各种材料和试剂均能通过商业方式获得。同样，所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1盐单胞菌菌株C2-1-M8的分离与鉴定
a.土壤样品采集：从西藏阿里地区龙木错岸边采集土壤，置于4℃中带回实验室，采用平板稀释涂布法进行分离。
b.分离菌株的培养基为2216固体培养基：蛋白胨5.0g、酵母提取物 1.0g、柠檬三铁0.1g、氯化钠19.45g、氯化镁8.8g、亚硫酸钠3.24g、氯化钙1.3g、氯化钾0.55g、碳酸氢钠0.16g、溴化钾0.08g、氯化锶34.0mg、硼酸22mg、硅酸钠4.0mg、氟化钠2.4mg、硝酸铵1.6mg、磷酸氢二钠 8.0mg，琼脂15g，加蒸馏水定容至1000mL，pH7.2-7.4，121℃灭菌20min。
c.采用平板稀释涂布法进行分离：将所采集土壤样品充分混匀，称取 10g，装入有适量玻璃珠和90mL无菌水的三角瓶中，将三角瓶置于摇床上，振荡20min，静置5min，10倍梯度稀释法依次进行稀释，取10-4、 10-5、10-6土壤稀释液各200μL，均匀涂布于2216固体培养基平板上。每个稀释度涂3个平板，倒置于20℃恒温培养箱中培养14天后，选取菌落形态不同的单菌落进一步划线纯化，将纯化后的菌株转接到2216斜面培养基上，4℃保存备用。
d.菌株的鉴定：划线纯化后的盐单胞菌菌株C2-1-M8在2216平板上划线，观察菌落形态：菌落圆形，乳白色，半透明，菌体杆状(图1)。进一步利用16S rRNA通用引物27F和1492R进行PCR扩增，扩增产物送北京睿博兴科生物技术有限公司进行测序，测序所得序列如SEQ ID No.1所示。所得序列与Genbank数据库中已知序列进行比对，发现其与盐单胞菌Halomonas korlensis XK1T的16S rRNA基因序列的相似性最高，为96.97％。根据《伯杰细菌鉴定手册》及多项分类学方法，对菌株表型特征和理化特征进行分析，并结合16S rRNA基因序列的系统发育树分析(图2)及基因组测序分析，确定C2-1-M8菌株为盐单胞菌属的新种(Halomonas sp.)。该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 24977，保藏日期为2022年5月26日。
经过对该菌株进行研究，发现该菌株C2-1-M8可以利用D-果糖、甘油、D-果糖-6-磷酸、L-丙氨酸、L-组胺、L-丝氨酸、D-半乳糖醛酸、D- 葡糖醛酸、葡糖醛酰胺、L-乳酸、D-苹果酸、L-苹果酸、吐温40等底物，具有底物广谱性。此外，根据生理生化实验，菌株C2-1-M8的生长温度为4℃-30℃，所需NaCl浓度为1.0％-17％，pH值范围为5.0-7.5；而在温度为30℃、NaCl浓度为5.0-9.0％、pH5.5-7.0的条件下生长的状态最好。
实施例2盐单胞菌C2-1-M8发酵液的制备
a.菌株活化：挑取菌种划线接种至2216固体培养基(蛋白胨5.0g、酵母提取物1.0g、柠檬三铁0.1g、氯化钠19.45g、氯化镁8.8g、亚硫酸钠3.24g、氯化钙1.3g、氯化钾0.55g、碳酸氢钠0.16g、溴化钾0.08g、氯化锶34.0mg、硼酸22mg、硅酸钠4.0mg、氟化钠2.4mg、硝酸铵1.6mg、磷酸氢二钠8.0mg，琼脂15g，加蒸馏水定容至1000mL，pH7.2-7.4，121℃灭菌20min)，于恒温培养箱30℃下培养14-20h；
b.种子液的制备：挑取活化菌株接种于2216液体培养基(2216液体培养基：配方及制备同上述2216固体培养基，不添加琼脂)中，于30℃下，150rpm振荡培养16-24小时后获得液体种子；
c.液体发酵：按照液体种子和发酵培养基(配方及制备同上述2216 液体培养基，补加NaCl至终浓度为9.0％)以体积比5～10％的接种量进行扩大培养，培养条件为30℃，150rpm；振荡培养48h得到的培养物即为发酵液。
d.用紫外分光光度计测量菌液在600nm波长条件下的吸光度，测得 OD600为0.991。
实施例3盐单胞菌菌株C2-1-M8无菌发酵液提取四氢嘧啶
a.将实施例2中的发酵液以12000rpm离心15min，弃去上清，收集沉淀菌体。
b.用磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液(pH 7.0)洗涤菌体。
c.将b中的液体在12000rpm离心15min，弃去上清，收集沉淀。
d.在c中所得沉淀中加入2ml 80％的乙醇悬浮，室温振荡过夜。
e.将d中振荡过夜的悬浮液在12000rpm的条件下离心15min，收集上清液，上清液中含有四氢嘧啶，所述上清液为下一步采用高效液相色谱 (HPLC)测定的样品。
实施例4：盐单胞菌菌株C2-1-M8合成四氢嘧啶的检测
a.高效液相色谱(HPLC)条件的选择：使用安捷伦高效液相色谱仪检测样品中四氢嘧啶。进样量为1.0μL，色谱柱为EClipse XDB C18反相色谱柱(150×4.6mm)，柱温为30℃，流动相为乙腈/水混合物(2∶98， v/v)，流速为1.0mL/min，紫外检测波长为210nm。
b.四氢嘧啶标准曲线的绘制：称取10mg四氢嘧啶标准品溶于1ml 超纯水中，配置成10mg/ml的四氢嘧啶标准品，并且利用梯度稀释，分别配置成2.5mg/ml、1.25mg/ml、0.625mg/ml、0.3125mg/ml、0.16125mg/ml、 0.080625mg/ml的标准品溶液，将它们用a中的条件进行HPLC检测，根据峰面积绘制标准曲线(图3)。
c.菌体中四氢嘧啶的检测：将实施例3中的上清液用a中的条件进行 HPLC测定，对比b中四氢嘧啶标准品检测的保留时间，并记录相应的峰面积，以及峰图(图4)。
d.菌体合成四氢嘧啶的产量计算：根据b中得出来的标准曲线以及c 中的峰面积，计算出菌体C2-1-M8的四氢嘧啶产量，结果为1.99×104 mg/g。
实施例5：盐单胞菌菌株C2-1-M8合成四氢嘧啶的培养条件及提取方法的优化
1)不同盐浓度培养基的检测：在2216液体培养基中补加相应的 NaCl，使得2216液体培养基的最终盐浓度为5.0％、7.0％、9.0％，按照种子液和发酵培养基(NaCl浓度为5.0％-9.0％的2216液体培养基：配方同上述2216液体培养基，添加NaCl使终浓度分别为5.0％，7.0％，9.0％) 以体积比5～10％的接种量进行扩大培养，培养条件为30℃，150rpm；振荡培养48h得发酵液。并按照上述方法收集菌体，并且用80％乙醇进行四氢嘧啶的提取，接着用HPLC进行四氢嘧啶浓度的检测，根据标准曲线计算相应的四氢嘧啶的浓度，结果表明：5.0％、7.0％、9.0％NaCl浓度下菌株C2-1-M8合成四氢嘧啶的产量分别为2.19×103mg/g、1.57×104 mg/g、1.99×104mg/g(图5)。其中，NaCl浓度为9.0％的条件下合成四氢嘧啶的产量为最高的。
2)提取方法的优化：在将同样的发酵液离心后收集菌体后采用两种不同的方法提取四氢嘧啶——超声波破碎法、80％乙醇抽提法。
a.超声波破碎法：将收集的菌体悬浮在3ml生理盐水中，用细胞破碎仪进行超声波破碎(工作条件：超声3s，间歇5s，工作30min)，破碎完成后，在12000rpm的条件下离心15min，弃去沉淀，收集上清，上清即为HPLC检测样品。
b.80％乙醇抽提法：在离心后的沉淀中加入2ml 80％的乙醇悬浮，室温振荡过夜后，12000rpm离心15min，上清液则为HPLC测定的样品。
c.将a、b中的样品按照上述的方法进行HPLC测定，根据峰面积以及标准曲线计算两种方法提取样品中四氢嘧啶的浓度，结果显示超声波提取的样品中四氢嘧啶的浓度为1.32×104mg/g，而80％乙醇抽提的样品中四氢嘧啶的浓度为1.99×104mg/g。由此可见，乙醇抽提法提取的四氢嘧啶的浓度高于超声波提取。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国科学院微生物研究所
<120> 一株盐单胞菌菌株及其应用
<130> 2022
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1420
<212> DNA
<213> Halomonas sp.
<400> 1
ggctacacat gcagtcgagc ggtacaggtc cagcttgctg gatgctgacg agcggcggac 60
gggtgagtaa tgcataggaa tctgcccgat agtgggggat aacctgggga aacccaggct 120
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gacgtcaagt catcatggcc cttacgggta gggctacaca cgtgctacaa tggccggtac 1200
aaagggacgc gaagccgcga ggtggagcca atcccgaaaa gccggtctca gtccggatcg 1260
gagtctgcaa ctcgactccg tgaagtcgga atcgctagta atcgtgaatc agaatgtcac 1320
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cagaagtggt tagcttaacc ctcgggggag cgatcaccac 1420

Claims (10)

1. 一株盐单胞菌菌株，其特征在于，所述菌株为盐单胞菌菌株（Halomonas sp.）C2-1-M8，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.24977。
2. 根据权利要求1所述的盐单胞菌菌株，其特征在于，所述菌株的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。
3.权利要求1所述的盐单胞菌菌株制成的发酵液或液体菌剂。
4.一种权利要求3所述的发酵液或液体菌剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
1）菌株活化：挑取菌种划线接种至2216固体培养基，置于恒温培养箱中，30 ℃下培养14~20 h；
2）种子液的制备：挑取活化的菌体接种至装有种子培养基的大试管中，橡胶塞封口，置于30℃的摇床上，160~200 rpm振荡培养16-24h，得种子液；
3）液体发酵：然后将种子液和发酵培养基以体积比5-10%的接种量进行扩大培养，培养条件为30℃，150 rpm；振荡培养48h得到的培养物即为发酵液；将发酵液以12000rpm离心10min，收集菌体。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述种子培养基为2216液体培养基，所述2216液体培养基配方为：蛋白胨5.0 g、酵母提取物1.0 g、柠檬三铁0.1 g、氯化钠19.45 g、氯化镁8.8 g、亚硫酸钠3.24 g、氯化钙1.3 g、氯化钾0.55 g、碳酸氢钠0.16 g、溴化钾0.08g、氯化锶34.0 mg、硼酸22.0 mg、硅酸钠4.0mg、氟化钠2.4 mg、硝酸铵1.6 mg、磷酸氢二钠8.0 mg，琼脂15.0 g，加蒸馏水定容至1000 mL，121℃灭菌20 min；所述2216固体培养基的配方是2216液体培养基的基础上添加琼脂15.0g；所述发酵培养基是在2216液体培养基的基础上添加NaCl 至浓度为5.0-9.0 %。
6. 权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基是在2216液体培养基的基础上添加NaCl至浓度为9.0 %。
7. 权利要求4所述的方法，其特征在于，制备所得发酵液或液体菌剂中活菌总浓度为1.94×109 cfu/mL-1.99×109 cfu/mL。
8.权利要求1所述的盐单胞菌菌株或权利要求3所述的发酵液或液体菌剂在生物合成四氢嘧啶中的应用。
9.权利要求3所述盐单胞菌发酵液或液体菌剂中四氢嘧啶的提取方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1）按照权利要求4所述的方法制备发酵液或液体菌剂；
2）将发酵液于12000 rpm离心10 min，收集菌体；用磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液悬浮菌体，12000 rpm离心10 min，弃上清，收集菌体；然后用2ml 80%的乙醇充分悬浮菌体，室温振荡过夜，再次12000rpm离心10min，取上清液，所述上清液中含有四氢嘧啶。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液的pH值为7.0。
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