CN108977477B - 一种利用海洋产毒甲藻共栖细菌发酵制备西加毒素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及海洋微生物发酵技术领域，尤其涉及一种利用海洋产毒甲藻共栖细菌发酵制备西加毒素的方法，包括以下步骤：(1)摇瓶种子液；(2)种子液的准备；(3)发酵培养；(4)发酵液的萃取提纯；(5)粗提物的纯化：经制备液相色谱洗脱，收集，旋转蒸发，获得白色粉末，即得西加毒素。本发明使用海洋甲藻共栖细菌株Haliea sp.LZ16‑2为生产菌种，该菌种发酵西加毒素产率较高，可达21.1～25.3μg/L，其发酵时间为60～64小时，节省能耗；方法步骤简单、工作量小，周期较短，所用试剂与材料均为微生物发酵试验常用试剂，对人体无害，对环境友好，成本低，具有较高的市场前景与经济价值。
Description
技术领域
本发明涉及海洋微生物发酵技术领域，尤其涉及一种利用海洋产毒甲藻共栖细菌发酵制备西加毒素的方法。
背景技术
西加毒素(Ciguatoxin，CTX)是一种热稳定的大分子聚醚神经毒素，毒性强，比河豚毒素强100倍以上，是已知的危害性较严重的赤潮生物毒素之一。CTX是电压依赖性Na+通道激动剂，对神经系统、消化系统及心血管系统均有重要作用。可作为研究兴奋细胞膜结构与功能以及局麻药作用收缩机理的分子工具。此外，CTX在有害赤潮检测、神经生物学、医学诊断、生化战剂等研究中均有重要应用。
目前，西加毒素的获得主要通过甲藻的规模培养及产物提取制备而来。该方法不仅培养周期长、成本高，且需要特殊的藻培养设备。与甲藻相比，海洋细菌具有易培养、代谢调控相对简单等特性，因此，利用产毒海洋微生物菌株发酵与产物分离制备西加毒素，是一条行之有效的替代方案。
发明内容
本发明为了克服现有技术的不足，提供了一种产量高、周期短、成本低的利用海洋产毒甲藻共栖细菌发酵制备西加毒素的方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种利用海洋产毒甲藻共栖细菌发酵制备西加毒素的方法，包括以下步骤：
(1)摇瓶种子液：取保存于固体斜面的海洋甲藻共栖细菌株(Haliea sp.)LZ16-2菌种接种于装液量为200mL的1L容积三角瓶中，28℃培养12小时，光镜观察菌体生长良好，无杂菌污染，即可接种于种子罐中；
(2)种子液的准备：按摇瓶种子液的培养基配方配制培养液1L，加入5L容积种子罐中，蒸汽加热，121℃灭菌30分钟，冷却至28℃，用火焰法接种，将摇瓶种子液接种于种子罐中的种子培养基上，进行培养，光镜观察菌体生长良好，无杂菌污染，即可接种于发酵罐中；
(3)发酵培养：按发酵罐的配方，配制培养液20L，加入50L的发酵罐中，通蒸汽加热，121℃灭菌30分钟，冷却至28℃，将种子液通过管道接种于发酵罐中的发酵培养基上，进行发酵培养，得到含有西加毒素的发酵液；
(4)发酵液的提取：将步骤(3)所得的发酵液经板框过滤后得细胞沉淀，加入提取溶剂进行产物提取，将提取液通过0.45微米滤膜过滤，对沉淀进行二次提取，得到二次提取液；将二次提取液经0.45微米滤膜过滤后，加入提取溶剂进行三次提取，合并三次提取液，旋蒸浓缩，得到粗提物；
(5)粗提物的纯化：将步骤(4)所得的粗提物通过制备色谱进行梯度洗脱，通过与西加毒素标准品进行比对，收集西加毒素组分，旋转蒸发干溶剂，获得白色粉末，即得西加毒素。
本发明方法中所用的Haliea sp.LZ16-2菌株(CCTCC AB 2017229)购买自中国典型培养物保藏中心，分离自产西加毒素的东海冈比毒甲藻(Gambierdiscus toxicus)。
作为优选，步骤(2)中，所述种子培养基的成分为：酵母膏5g，蛋白胨4g，葡萄糖1g和天然海水1000mL。
作为优选，步骤(2)中，所述种子培养基的pH为6.8。
作为优选，步骤(2)中，培养条件为：通气量50～60L/min，搅拌转速170～180转/min；培养温度为28℃；培养时间为16小时。
作为优选，步骤(3)中，所述发酵培养基的成分为：酵母膏8g，蛋白胨7g，葡萄糖5g，氯化铵0.045g，氯化钾0.02g，氯化锶0.05g，维生素复合物0.005g和天然海水1000mL。
作为优选，步骤(3)中，所述发酵培养基的pH为6.8。
作为优选，步骤(3)中，发酵培养的条件为：维持通气量60-70L/min，搅拌转速160～180转/min；培养温度为28℃，培养时间为60～64h。
作为优选，步骤(4)中，所述提取溶剂为体积分数为95％的甲醇溶液；所述提取溶剂加入量为6L。
因此，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明方法使用海洋甲藻共栖细菌株Haliea sp.LZ16-2为生产菌种，该菌种发酵西加毒素产率较高，可达21.1～25.3μg/L，其发酵时间为60～64小时，节省能耗；
(2)本发明方法步骤简单、工作量小，周期较短，所用试剂与材料均为微生物发酵试验常用试剂，对人体无害，对环境友好，成本低，具有较高的市场前景与经济价值。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。
在本发明中，若非特指，所有设备和原料均可从市场购得或是本行业常用的，下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域常规方法。
实施例1
(1)摇瓶种子液：取保存于固体斜面的海洋甲藻共栖细菌株(Haliea sp.)LZ16-2菌种接种于装液量为200mL的1L容积三角瓶中，28℃培养12小时，光镜观察菌体生长良好，无杂菌污染，即可接种于种子罐中；
(2)种子液的准备：按摇瓶种子液的培养基配方配制培养液1L，加入5L容积种子罐中，蒸汽加热，121℃灭菌30分钟，冷却至28℃，用火焰法接种，将摇瓶种子液接种于种子罐中的种子培养基上，种子培养基的成分为：酵母膏5g，蛋白胨4g，葡萄糖1g和天然海水1000mL；种子培养基的pH为6.8；培养条件为：通气量50L/min，搅拌转速170转/min，28℃培养16小时，光镜观察菌体生长良好，无杂菌污染，即可接种于发酵罐中；
(3)发酵培养：按发酵罐的配方，配制培养液20L，加入50L的发酵罐中，通蒸汽加热，121℃灭菌30分钟，冷却至28℃，将种子液通过管道接种于发酵罐中的发酵培养基上，发酵培养基的成分为：酵母膏8g，蛋白胨7g，葡萄糖5g，氯化铵0.045g，氯化钾0.02g，氯化锶0.05g，维生素复合物0.005g和天然海水1000mL；发酵培养基的pH为6.8；发酵培养条件为：维持通气量60L/min，搅拌转速180转/min，28℃培养60小时，得到含有西加毒素的发酵液；
(4)发酵液的提取：将发酵液经板框过滤后得细胞沉淀，加入6L的95％(v/v)甲醇溶液进行产物提取，将提取液通过0.45微米滤膜过滤，对沉淀进行二次提取，得到二次提取液；将二次提取液经0.45微米滤膜过滤后，加入6L的95％(v/v)甲醇溶液进行三次提取，合并三次提取液，旋蒸浓缩，得到粗提物；
(5)产物纯化：将粗提物通过制备色谱进行梯度洗脱，通过与西加毒素标准品进行比对，收集西加毒素组分，旋转蒸发干溶剂，获得白色粉末，即获得西加毒素。
实施例2
(1)摇瓶种子液：取保存于固体斜面的海洋甲藻共栖细菌株(Haliea sp.)LZ16-2菌种接种于装液量为200mL的1L容积三角瓶中，28℃培养12小时，光镜观察菌体生长良好，无杂菌污染，即可接种于种子罐中；
(2)种子液的准备：按摇瓶种子液的培养基配方配制培养液1L，加入5L容积种子罐中，蒸汽加热，121℃灭菌30分钟，冷却至28℃，用火焰法接种，将摇瓶种子液接种于种子罐中的种子培养基上，种子培养基的成分为：酵母膏5g，蛋白胨4g，葡萄糖1g和天然海水1000mL；种子培养基的pH为6.8；培养条件为：通气量60L/min，搅拌转速180转/min，28℃培养16小时，光镜观察菌体生长良好，无杂菌污染，即可接种于发酵罐中；
(3)发酵培养：按发酵罐的配方，配制培养液20L，加入50L的发酵罐中，通蒸汽加热，121℃灭菌30分钟，冷却至28℃，将种子液通过管道接种于发酵罐中的发酵培养基上，发酵培养基的成分为：酵母膏8g，蛋白胨7g，葡萄糖5g，氯化铵0.045g，氯化钾0.02g，氯化锶0.05g，维生素复合物0.005g和天然海水1000mL；发酵培养基的pH为6.8；发酵培养条件为：维持通气量70L/min，搅拌转速160转/min，28℃培养60-64小时，得到含有西加毒素的发酵液；
(4)发酵液的提取：将发酵液经板框过滤后得细胞沉淀，加入6L的95％(v/v)甲醇溶液进行产物提取，将提取液通过0.45微米滤膜过滤，对沉淀进行二次提取，得到二次提取液；将二次提取液经0.45微米滤膜过滤后，加入6L的95％(v/v)甲醇溶液进行三次提取，合并三次提取液，旋蒸浓缩，得到粗提物；
(5)产物纯化：将粗提物通过制备色谱进行梯度洗脱，通过与西加毒素标准品进行比对，收集西加毒素组分，旋转蒸发干溶剂，获得白色粉末，即获得西加毒素。
实施例3
(1)摇瓶种子液：取保存于固体斜面的海洋甲藻共栖细菌株(Haliea sp.)LZ16-2菌种接种于装液量为200mL的1L容积三角瓶中，28℃培养12小时，光镜观察菌体生长良好，无杂菌污染，即可接种于种子罐中；
(2)种子液的准备：按摇瓶种子液的培养基配方配制培养液1L，加入5L容积种子罐中，蒸汽加热，121℃灭菌30分钟，冷却至28℃，用火焰法接种，将摇瓶种子液接种于种子罐中的种子培养基上，种子培养基的成分为：酵母膏5g，蛋白胨4g，葡萄糖1g和天然海水1000mL；种子培养基的pH为6.8；培养条件为：通气量55L/min，搅拌转速175180转/min，28℃培养16小时，光镜观察菌体生长良好，无杂菌污染，即可接种于发酵罐中；
(3)发酵培养：按发酵罐的配方，配制培养液20L，加入50L的发酵罐中，通蒸汽加热，121℃灭菌30分钟，冷却至28℃，将种子液通过管道接种于发酵罐中的发酵培养基上，发酵培养基的成分为：酵母膏8g，蛋白胨7g，葡萄糖5g，氯化铵0.045g，氯化钾0.02g，氯化锶0.05g，维生素复合物0.005g和天然海水1000mL；发酵培养基的pH为6.8；发酵培养条件为：维持通气量65L/min，搅拌转速170转/min，28℃培养62小时，得到含有西加毒素的发酵液；
(4)发酵液的提取：将发酵液经板框过滤后得细胞沉淀，加入6L的95％(v/v)甲醇溶液进行产物提取，将提取液通过0.45微米滤膜过滤，对沉淀进行二次提取，得到二次提取液；将二次提取液经0.45微米滤膜过滤后，加入6L的95％(v/v)甲醇溶液进行三次提取，合并三次提取液，旋蒸浓缩，得到粗提物；
(5)产物纯化：将粗提物通过制备色谱进行梯度洗脱，通过与西加毒素标准品进行比对，收集西加毒素组分，旋转蒸发干溶剂，获得白色粉末，即获得西加毒素。
对实施例1-3制得的西加毒素的产率进行测试，结果如表1所示：
表1.测试结果
| 性能指标 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 |
| 西加毒素产率μg/L | 21.1 | 25.3 | 23.6 |
由表1可以看出，采用本发明利用海洋产毒甲藻共栖细菌发酵制备西加毒素的方法制得的西加毒素的高，可达到21.1～25.3μg/L。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
Claims (6)
1.一种利用海洋产毒甲藻共栖细菌发酵制备西加毒素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）摇瓶种子液：取保存于固体斜面的海洋甲藻共栖细菌株Haliea sp.LZ16-2菌种接种于装液量为200 mL的1 L容积三角瓶中，28℃培养12小时，光镜观察菌体生长良好，无杂菌污染，即可接种于种子罐中；所述海洋甲藻共栖细菌株Haliea sp.LZ16-2菌种已于2017年10月18日保藏于中国典型培养物中心CCTCC，其保藏编号为：CCTCC AB 2017229；
（2）种子液的准备：按摇瓶种子液的培养基配方配制培养液1L，加入5L容积种子罐中，蒸汽加热，121℃灭菌30分钟，冷却至28℃，用火焰法接种，将摇瓶种子液接种于种子罐中的种子培养基上，进行培养，光镜观察菌体生长良好，无杂菌污染，即可接种于发酵罐中；所述种子培养基的成分为：酵母膏5 g，蛋白胨4 g，葡萄糖1 g和天然海水1000 mL；
（3）发酵培养：按发酵罐的配方，配制培养液20L，加入50L的发酵罐中，通蒸汽加热，121℃灭菌30分钟，冷却至28℃，将种子液通过管道接种于发酵罐中的发酵培养基上，进行发酵培养，得到含有西加毒素的发酵液；所述发酵培养基的成分为：酵母膏8 g，蛋白胨7 g，葡萄糖5 g，氯化铵0.045 g，氯化钾0.02 g，氯化锶0.05 g，维生素复合物0.005 g和天然海水1000 mL；
（4）发酵液的提取：将步骤（3）所得的发酵液经板框过滤后得细胞沉淀，加入提取溶剂进行提取，将提取液旋蒸浓缩，得到粗提物；所述提取溶剂为体积分数为95%的甲醇溶液；
（5）粗提物的纯化：将步骤（4）所得的粗提物通过制备色谱进行梯度洗脱，通过与西加毒素标准品进行比对，收集西加毒素组分，旋转蒸发干溶剂，获得白色粉末，即得西加毒素。
2.根据权利要求1所述的一种利用海洋产毒甲藻共栖细菌发酵制备西加毒素的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述种子培养基的pH为6.8。
3.根据权利要求2所述的一种利用海洋产毒甲藻共栖细菌发酵制备西加毒素的方法，其特征在于，步骤（2）中，培养条件为：通气量50~60 L/min，搅拌转速170~180转/min；培养温度为28℃；培养时间为16小时。
4.根据权利要求1所述的一种利用海洋产毒甲藻共栖细菌发酵制备西加毒素的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述发酵培养基的pH为6.8。
5.根据权利要求4所述的一种利用海洋产毒甲藻共栖细菌发酵制备西加毒素的方法，其特征在于，步骤（3）中，发酵培养的条件为：维持通气量60~70 L/min，搅拌转速160~180转/min；培养温度为28℃，培养时间为60~64 h。
6.根据权利要求3或5所述的一种利用海洋产毒甲藻共栖细菌发酵制备西加毒素的方法，其特征在于，步骤（4）中，所述提取溶剂为体积分数为95%的甲醇溶液；所述提取溶剂加入量为6 L。
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2018
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