JP2006193485A - シガトキシン類を認識するモノクローナル抗体、およびそれを用いるシガトキシン類検出キット - Google Patents
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Abstract
【解決手段】M環部に水酸基を有するシガトキシン類を特異的に認識するモノクローナル抗体、および該抗体を含むシガトキシン類検出キットにより上記の課題を解決する。
【選択図】なし
Description
しかしながら、この抗体はシガトキシンに結合するが、シガトキシン類と類似の構造を有する海産ポリエーテル系毒素であるオカダ酸とも強い交差活性を示し、その親和性の差は5倍程度しかない(非特許文献2参照)。
また、その他の海産ポリエーテル系毒素であるブレベトキシン、マイトトキシン、パリトキシンなどとも交差活性を示すことが分かっているが、詳しいデータは発表されていない(非特許文献3参照)。
このホカマらの抗体を用いて、シガトキシン類に汚染された魚類を免疫的手法により検出するための試薬や、キット(Cigua Check(商標))などが開発されている。
また、他のグループも合成ハプテン(JKLM環部)のコンジュゲートを用いて免疫を試みているが、モノクローナル抗体は得られていない(非特許文献5参照)。
また、本発明は、上記のモノクローナル抗体を産生する受領番号FERM AP-20347として受領されたハイブリドーマ8H4 (受領番号FERM AP-20347として独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに受領された。受領日:平成16年12月22日、本明細書ではこのハイブリドーマを抗体と同じ名称8H4と表示する。)である。
また、本発明は、上記のモノクローナル抗体、および受託番号FERM PB-8292として受託されたハイブリドーマ10C9 (平成14年3月5日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託)により産生されるモノクローナル抗体を含む、サンドイッチ法によるシガトキシン類検出キットである。
モノクローナル抗体を標識する方法としては公知の方法を用いることができ、また、市販の抗体標識用キットを用いることもできる。
式(II)の化合物は、下記の方法1により得ることができる。
式(II)の化合物は、次の式(III):
このジアステレオマー混合物は、順相、逆相カラムを用いる高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により分割することができる。例えば、シリカゲルカラムやオクタデシルシリカゲルカラムが利用可能である。
A. 式(II)の化合物の製造
上記の式(II)の化合物を、下記の方法1により式(III)および式(IV)のジアステレオマー混合物として合成した。
化合物5 (14.3 mg, 11.6μmol)のTHF溶液(0.5 mL)に、室温でTBAF (116μL, 1.0 M THF溶液、116μmol)を加えた。反応溶液を室温で5時間攪拌後、溶媒を留去した。残渣をODS (オクタデシルシリル)カラム(ODS Merck RP18、溶離液:メタノール:H2O = 20:1〜メタノール100%)で精製し、化合物6を得た(4.5 mg、収率:93%)。
ESI-TOFMS :C33H52O12Naについて算出 (M+Na+):663.401, 実測値:663.336.
キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)コンジュゲートの製造:KLH (6.6 mg)のPBS (phosphate buffered saline;1.0 mL)溶液に、上記の方法により得られた化合物11と化合物12の混合物のDMF溶液(100μL)を加えて室温で5分間攪拌した。室温で1日間静置後、4℃でPBS (1 L)に対して透析した。6時間後にPBS (1 L)を交換し、12時間後に透析チューブからエッペンドルフチューブに移し変えて-78℃で保存した。
上記のようにして得られたBSAコンジュゲートを、MALDI-TOF-MSで分析した。BSAコンジュゲートの平均分子量は約71300であった(BSAの分子量は約66400)。上記の式(II)の化合物に由来する部分であるハプテン部分の分子量が608であるので、BSAコンジュゲートには平均8個のハプテンが連結されていることがわかる。
上記のようにして得られたKLHコンジュゲート(100μg)にRIBIアジュバント(RIBI Immunol. Res. Inst.製)を加え、よく撹拌してエマルジョンとしたのち、これをBalb/cマウス(5匹)に2週間毎に3回、腹腔内投与した。3回目の免疫から1週間後にマウスの血清を採取し、上記のBSAコンジュゲートを用いて下記のELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)法で血清の抗体価を決定した。
96ウェルELISA用プレート(COSTAR社製3596)の各ウェルに上記のBSAコンジュゲート(2μg / mL) 50μLを入れ、室温で2時間放置後、4℃で一晩放置して、プレートにコンジュゲートを吸着させた。プレートをPBS-Tween (5% Tween 20 [ICI社製Tween-20(ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレート)相当品No. 167-11515]を含むPBS) で3回洗浄後、MILLI-Q水(Millipore社製のDirect-Qにより複数段階の樹脂やフィルターを用いて脱イオン化した精製水)で1回洗浄し、吸着しなかったコンジュゲートを除去した。ウェルに抗血清(またはハイブリドーマ培養上清、精製抗体溶液)を加え、室温で1時間放置後、PBS-TweenとMILLI-Q水でそれぞれ3回順次洗浄した。50μLの酵素標識二次抗体(ヤギ抗マウスIgG-西洋わさびペルオキシターゼ(HRP))(BIO-RAD社製、170-6516、1000倍希釈)を各ウェルに入れ、室温で1時間放置後、PBS-TweenとMILLI-Q水でそれぞれ3回順次洗浄した。100μLの基質溶液(1,2-フェニレンジアミン 4.0 mg、過酸化水素水10μL、0.1 M クエン酸バッファー (pH 5.0) 10 mL)を加え、数分間呈色反応を進行させた後、2規定硫酸(50μL)で反応を停止した。マイクロプレート吸光度測定装置(BIO-RAD社製、モデル680)を用いて、490 nmの吸光度を測定した。
マウスから採取した血清を、10% ウシ胎児血清(FBS)含有PBSを用いて400倍から51200倍まで順次2倍希釈した希釈系列サンプルを作製した。上記のようにしてBSAコンジュゲートを吸着させたELISAプレート(COSTAR社製3596)に、希釈系列サンプルを50μLずつ入れ、室温で1時間放置後、上記と同様にして490 nmの吸光度を測定した。5匹のマウスについて、血清希釈度の対数と吸光度とをプロットした結果を図1に示す。
図1より、血清中の抗体が血清濃度依存的にBSAコンジュゲートと結合することがわかる。
3回目の免疫から3週間後に、5匹の中で最も高い抗体価を示したマウスを選択した。このマウスの腹腔内に、KLHコンジュゲート(100μg)にRIBIアジュバント(RIBI Immunol. Res. Inst. 社製)を加え、よく撹拌してエマルジョンとしたものを追加免疫し、3日後に脾臓を摘出した。脾臓に付着している組織や臓器の断片をピンセットで取り除いた後、無血清培地 [RPMI 1640 Medium (GIBCO社製、11875-185) 1000 mLにペニシリン・ストレプトマイシン(GIBCO社製、15140-122) 10 mLを加えたもの] 15 mL入りのシャーレに移し、ピンセットで脾臓内の細胞を浮遊させた。脾臓細胞浮遊液を濾過後、50 mL遠心管に移した。さらに、無血清培地15 mLを加え、よくピペッティングして濾過し全量を30 mLとした。800 rpmで5分間、室温で遠心分離し、上清を除去し、タッピングした。
抗体の精製およびサブクラスの決定
上記の3種のハイブリドーマの培養上清を、抗マウスIgG + IgMアフィニティーカラム(NGK Industries, Ltd.製)で精製した(結合用バッファー:リン酸バッファーpH 7.0、溶出用バッファー:0.2 M Gly-HCl pH 2.5)。精製した抗体をSDS-PAGEで分析し、それぞれ95%の純度であることを確認した。タイピングキット(PIERCE社製37501)を用いて、それぞれの抗体のサブクラスを決定した。その結果、8H4はIgG1κ、8B9はIgG1κ、7C9はIgG2bκであった。
上記のようにして精製した3種の抗体について、次のようにして抗体とハプテンとの解離定数(Kd)を求めた。ELISA用プレートに競合阻害剤(PBS溶液、各30μL)の溶液を順次2倍希釈で調製した。これに上記の抗体溶液(30μL)を加え、室温で2時間放置した。抗体と阻害剤の混合液50μLを、BSAコンジュゲート(0.625μg/mL)を吸着させた96ウェルELISA用プレート(COSTAR社製3596)に加え、室温で15分間放置した。プレートをPBS-TweenとMILLI-Q水でそれぞれ3回順次洗浄した後、50μLの酵素標識二次抗体(ヤギ抗マウスIgG-HRP)(BIO-RAD社製、170-6516、1000倍希釈)を各ウェルに入れ、室温で1時間放置後、PBS-TweenとMILLI-Q水でそれぞれ3回順次洗浄した。100μLの基質溶液(1,2-フェニレンジアミン 4.0 mg、 過酸化水素水10μL、0.1 M クエン酸バッファー (pH 5.0) 10 mL)を加え、数分間呈色反応を進行させた後、2規定硫酸(50μL)で反応を停止した。マイクロプレート吸光度測定装置(BIO-RAD社製、モデル680)を用いて、490 nmの吸光度を測定し、滴定曲線を得た。Friguetらの方法(Journal of Immunological Method, 第77巻(1985年)、第305頁)を参考に、Klotzプロットを作製して得た直線の傾きから阻害剤のKdを求めた。
化合物6を競合阻害剤として用いた場合の結果を表1に示す。表1から、3種類のモノクローナル抗体はいずれもハプテン化合物6に強く結合することがわかる。
8H4抗体の酵素標識(サンドイッチ法に用いる8H4-HRPの合成)
8H4のHRP標識は、Peroxidase Labeling Kit -NH2 (商品名、Dojindo Molecular Technologies, Inc.製)を用い、製造業者の説明書に従って行った。すなわち、キットに添付の洗浄バッファー100μLとモノクローナル抗体8H4 (0.2 mg)とをFiltration Tubeに入れた。ピペッティングにより軽く混合した後、遠心分離した(8000×g、10分間)。洗浄バッファー100μLを加え、もう一度遠心分離した(8000×g、10分間)。この抗体8H4が濃縮されているFiltration Tubeのメンブレン上に、反応バッファー10μLとNH2-Reactive Peroxidaseとをピペッティングにより混合・溶解して得られた溶液を加えた。ピペッティングによりメンブレン上の抗体と溶液とを混合した後、37℃で2時間放置した。洗浄バッファー100μLを加え、遠心分離した(8000×g、10分間)。保存バッファー200μLを加え、ピペッティングにより標識された抗体を溶解した。溶液を500μLチューブに入れて4℃で保存した。
ELISA用プレート(COASTER 社製3590)に、受託番号FERM PB-8292として受託されたハイブリドーマ10C9により産生されたモノクローナル抗体10C9のPBS溶液(4.3μg/mL)をウェル当たり50μL入れ、4℃で一晩放置した。溶液を捨て、1%スキムミルク含有PBSを加えて(400μL/ウェル)、室温で1時間静置した。溶液を捨て、PBS-Tweenで3回洗浄後、シガトキシン51-OH-CTX3C (化合物2)の希釈溶液を入れ(50μL/ウェル)、室温で1時間静置した。溶液を捨て、PBS-Tweenで3回洗浄した後、上記のHRP標識モノクローナル抗体8H4の溶液(1 mg/mL, 50μL)を添加し、室温で1時間静置した。溶液を捨て、PBS-Tweenで3回洗浄した後、100μLの基質溶液(1,2-フェニレンジアミン4.0 mg、過酸化水素水10μL、0.1 M クエン酸バッファー(pH 5.0) 10 mL)を加え、数分間呈色反応を進行させた後、2規定硫酸(50μL)で反応を停止した。マイクロプレート吸光度測定装置(BIO-RAD社製、モデル680)を用いて、490 nmの吸光度を測定した。結果を図2に示す。
Claims (12)
- M環部に水酸基を有するシガトキシン類を特異的に認識するモノクローナル抗体。
- 動物がマウスである請求項2に記載のモノクローナル抗体。
- M環部に水酸基を有するシガトキシン類が、シガトキシン51-OH-CTX3Cである請求項1〜3のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体を産生する受領番号FERM AP-20347として受領されたハイブリドーマ8H4。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体、および受託番号FERM PB-8292として受託されたハイブリドーマ10C9により産生されるモノクローナル抗体を含む、サンドイッチ法によるシガトキシン類検出キット。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体、または受託番号FERM PB-8292として受託されたハイブリドーマ10C9により産生されるモノクローナル抗体が標識されてなるものである、請求項6に記載のシガトキシン類検出キット。
- 標識が酵素標識である、請求項7に記載のシガトキシン類検出キット。
- キャリアータンパク質が、ウシ血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニンまたは卵アルブミンである請求項11に記載のタンパク質コンジュゲート。
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