JP5026761B2

JP5026761B2 - ハプテン化合物および抗体

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Publication number: JP5026761B2
Application number: JP2006275362A
Authority: JP
Inventors: 光統切畑; 智之浅野
Original assignee: Stella Chemifa Corp; Osaka Prefecture University
Current assignee: Stella Chemifa Corp; Osaka Prefecture University
Priority date: 2006-10-06
Filing date: 2006-10-06
Publication date: 2012-09-19
Anticipated expiration: 2026-10-06
Also published as: JP2008094729A

Description

本発明は、ｐ−ボロノフェニルアラニン（ＢＰＡ）のハプテン化合物、ＢＰＡに対する抗体、およびそれを用いる免疫学的測定方法等に関し、特にホウ素中性子捕捉療法（ＢＮＣＴ）に用いられる中性子捕捉療法剤の検出、定量に有用である。

近年、放射性アイソトープを利用した新しい癌の治療方法として、ホウ素中性子捕捉療法（ＢＮＣＴ）が注目を集めている。ホウ素中性子捕捉療法は、ホウ素１０同位体（^１０Ｂ）を含むホウ素化合物をガン細胞に取り込ませ、低エネルギーの中性子線（たとえば熱中性子）を照射して、細胞内で起こる核反応により局所的にガン細胞を破壊する治療方法である。この治療方法では、^１０Ｂを含むホウ素化合物をガン組織の細胞に選択的に蓄積させることが、治療効果を高める上で重要であるため、ガン細胞に選択的に取り込まれるホウ素化合物を開発することが必要となる。

従来までに、ＢＮＣＴに用いる薬剤として基本骨格にホウ素原子またはホウ素原子団を導入したホウ素含有化合物が合成されている。実際の臨床で用いられている薬剤としては、ｐ−ボロノフェニルアラニン（ＢＰＡ）やメルカプトウンデカハイドロドデカボレート（ＢＳＨ）がある。このうち、ｐ−ボロノフェニルアラニンはフェニルアラニン（ＢＰＡ）のミミックとしてメラニン生合成経路に取り込まれやすく、メラニン生合成が活発な悪性黒色腫の治療に用いられてきた。さらに、近年、脳腫瘍細胞にもよく取り込まれることが明らかとなり、両方の治療に利用されており、特に脳腫瘍の治療については最近、ｐ−ボロノフェニルアラニンとメルカプトウンデカハイドロドデカボレート（ＢＳＨ）の併用による治療が多く見られる（たとえば、非特許文献１〜８参照）。

Ｉ．Ｍ．Ｗｙｚｌｉｃら、ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．，１９９２，３３，７４８９−７４９０，Ｗ．Ｔｊａｒｋ，Ｊ．Ｏｒｇａｎｏｍｅｔ．Ｃｈｅｍ．，２０００，６１４−６１５，３７−４７，Ｋ．Ｉｍａｍｕｒａら、Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，１９９７，７０．３１０３−３１１０．Ａ．Ｓ．Ａｌ−Ｍａｄｈｏｒｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２００２，４５，４０１８−４０２８，Ｆ．Ｃｏｍｐｏｓｔｅｌｌａら、Ｒｅｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．ＮｅｕｔｒｏｎＣａｐｔｕｒｅＴｈｅｒ．，２００２，８１−８４，Ｓ．ＢＫａｈｌら、ＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎＮｅｕｔｒｏｎＣａｐｔｕｒｅＴｈｅｒａｐｙｆｏｒＣａｎｃｅｒ，ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ１９９２，２２３，Ｊ．Ｃａｉら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９９７，４０，３８８７−３８９６，Ｈ．Ｌｉｍら、Ｒｅｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．ＮｅｕｔｒｏｎＣａｐｔｕｒｅＴｈｅｒ．，２００２，３７−４２

しかしながら、ＢＮＣＴに伴うＢＰＡの生体内挙動、特に細胞表層や細胞のミクロ分布についての詳細は未だ明らかとはなっておらず、ＢＰＡの生体内挙動を簡便かつ迅速に定性、定量できる方法の開発が強く望まれている。ＢＰＡの検出、定量方法として、免疫学的測定方法が期待されているが、ＢＰＡのような低分子無機化合物は、分子量・体積が小さいことや、イオン化し易いといった理由のため抗原性が低く、ＢＰＡを高感度で検出しうる抗体はこれまで得られていない。

そこで、本発明の目的は、ＢＰＡを高感度かつ高選択的に認識する抗体を作製するためのハプテン化合物、ＢＰＡに対する抗体、ならびに当該抗体を用いた高感度かつ定量性に優れたＢＰＡの測定用キットおよび免疫学的測定方法を提供することにある。

本発明者らは、上記目的を達成すべく、ＢＰＡをミミックした３−（ｐ−ボロノフェニル）プロピオン酸にリンカーを結合したハプテン化合物に着目して鋭意研究を重ねた結果、以下に示すハプテン化合物、抗体、ハイブリドーマ等が上記目的を達成できることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、下記式（１）：

で表わされる構造を有する化合物に関する。

本発明は、前記化合物をハプテンとし、当該ハプテンと高分子化合物との複合体を抗原として用いることにより得られるｐ−ボロノフェニルアラニン（ＢＰＡ）に対する抗体に関する。前記抗体は、モノクローナル抗体であることが好ましい。

本発明は、前記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに関する。前記ハイブリドーマは、ＢＰＨ−１（受領番号ＦＥＲＭＡＰ−２０９４３）であることが好ましい。

本発明は、前記モノクローナル抗体を含むｐ−ボロノフェニルアラニン（ＢＰＡ）の測定キットに関する。

また、本発明は、前記モノクローナル抗体または前記キットを用いることを特徴とするｐ−ボロノフェニルアラニン（ＢＰＡ）の測定方法に関する。

本発明の化合物は、ＢＰＡハプテンとして好適に用いられるものである。当該ハプテンと高分子化合物との複合体を抗原として用いることにより、動物においてＢＰＡに対する免疫応答を良好に惹起することができ、特異的かつ高感度なＢＰＡ抗体を得ることができる。

本発明の抗体は、特異的かつ高感度にＢＰＡを検出することができる。当該抗体がモノクローナル抗体の場合、ＢＰＡに対して特に高感度であり、交差反応性も低い。本発明のハイブリドーマは、前記モノクローナル抗体を安定して短期間で産生することができ、当該ハイブリドーマを培養することにより、大量のモノクローナル抗体を製造することができる。

また、本発明のキットは、本発明のモノクローナル抗体を含むことにより、ＢＰＡの免疫学的測定方法に好適に用いられ、ＢＰＡを特異的、高感度および簡便に測定することのできる手段を提供することができる。

本発明のＢＰＡの測定方法は、本発明のモノクローナル抗体またはキットを用いることにより感度、特異性および操作の簡便性にすぐれた効果を奏する。

本発明は、下記式（１）：
で表わされる構造を有する化合物を提供する。前記化合物は、６−[３−（ｐ−ボロノフェニル）プロパンアミド]ヘキサン酸であり、ＢＰＡハプテンとして好適に使用される。前記式（１）において、カルボキシル基が後述する高分子化合物と共有結合することにより、複合体（結合体）を形成する。

前記ＢＰＡハプテンの製造は、公知の合成方法により行なうことができ、特に限定されるものではないが、たとえば下記反応式：

で示す方法は、各工程において高収率で化合物を得ることから好適に用いられる。前記反応式において、式（２）等の原料化合物はいずれも入手が容易な化合物である。

また、前記各工程における詳細な合成方法は、実施例１に記載している。

前記ＢＰＡハプテンは、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウサギ血清アルブミン（ＲＳＡ）、オボアルブミン（ＯＶＡ）、スカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）、チログロブリン（ＴＧ）、免疫グロブリン等の高分子化合物（タンパク質）との複合体を形成させた後、免疫原として用いる。

複合体の形成方法は、公知の方法により行なうことができ、特に限定されるものではない。たとえば、混合酸無水物法または活性エステル法等により前記ＢＰＡハプテンのカルボキシル基と前記高分子化合物の官能基（たとえば、アミノ基等）とを反応させて、複合体を形成することができる。

本発明は、前記ハプテンと高分子化合物との複合体を抗原として用いることにより得られるＢＰＡに対する抗体を提供する。

本発明でいう「抗体」には、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体が包含され、ＦａｂフラグメントやＦ（ａｂ’）_２フラグメントなどのように抗原結合性を有する抗体の一部も包含される。これら抗体の中でも、モノクローナル抗体が好ましい。

前記抗体の製造方法は、公知であり、本発明の抗体も常法にしたがって製造することができる（ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ１１．１２〜１１．１３（２０００））。具体的には、本発明の抗体がポリクローナル抗体の場合には、常法にしたがって前記ＢＰＡハプテンと高分子化合物との複合体を形成させた後、当該複合体を家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法にしたがって得ることが可能である。

一方、モノクローナル抗体の場合には、前記複合体を常法にしたがってマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞をスクリーニングし、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを培養することにより得ることができる（ＣｕｒｒｅｎｔｐｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ．Ｓｅｃｔｉｏｎ１１．４〜１１．１１）。

抗体の調製は、限外ろ過、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニテイークロマトグラフィーなどの濃縮・精製法を適宜組み合わせて行うことができる。

また、本発明は、前記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを提供する。以下、マウスでのハイブリドーマの作製方法について詳細に説明する。

以下、Ｂａｌｂ／ｃマウスを例にして説明する。前記のように調製した抗原（免疫原）を２ｍｇ／ｍｌ程度になるように生理的リン酸緩衝液に溶解し、アジュバントと等量混合した後、Ｂａｌｂ／ｃマウスに腹腔内に投与する。その後、約２週間毎に追加免疫する。

尾血管から採取した血液の血清中の抗体力価が高くなった前記マウスの脾臓を摘出し、ＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地）を入れたシャーレ内で前記脾臓から細胞を取り出す。培地を遠沈管に移し、大きな組織片を沈降させ、脾臓細胞が浮遊している上清を静かに取り、単細胞の懸濁液を低速で遠心分離して細胞を集め、脾臓細胞を調製する。

マウスのミエローマ細胞（Ｐ３×６３Ａｇ８．６５３）を細胞数の比で５：１（ミエローマ細胞：脾臓細胞）になるように混合し、低速で遠心分離して細胞を集める。沈殿細胞をほぐした後、３７℃に温めておいた５０％ポリエチレングリコール（分子量１，５００）溶液１ｍｌをゆっくり加え細胞融合を行う。

細胞融合後、ＤＭＥＭ培地９ｍｌを加え、さらに含牛胎児血清ＤＭＥＭ培地４０ｍｌを添加する。遠心分離によって集めた細胞に、細胞数が５×１０^５個／ｍｌになるようにＨＡＴ培地を加えて懸濁し、細胞懸濁液を９６穴プラスチックプレートに２５０μｌ／ウェルの量で分注して、３７℃、５％炭酸ガス、加湿条件下のインキュベーター中で培養する。

１週間後、ウェル中の培地の半量をＨＡＴ培地で置換して、１０日から１４日間培養する。培養液中の抗体の活性をＥＬＩＳＡで調べ、目的とする抗体を産生しているウェルの細胞について、限界希釈法によりハイブリドーマのクローニングを行う。クローニングにより、抗ＢＰＡ抗体を産生している安定なハイブリドーマ株を得る。

本発明では、前記方法によりハイブリドーマを作製し、ＢＰＨ−１等の複数のハイブリドーマ株を樹立した。このうち、ＢＳＦ−２について、受領番号ＦＥＲＭＡＰ−２０９４３の下、２００６年６月２６日に独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター（郵便番号３０５−８５６６、茨城県つくば市東１丁目１番１号）に寄託されている。

本発明のハイブリドーマは、培地（たとえば、１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ）を用いて培養し、その培養液の遠心上清をモノクローナル抗体溶液とすることができる。また、本ハイブリドーマを由来する動物の腹腔に注入することにより、腹水を生成させ、得られた腹水をモノクローナル抗体溶液とすることができる。これらの抗体溶液は、さらに上述のように精製・濃縮することができる。

また、本発明は、前記抗体を含むＢＰＡの測定キットに関する。本発明の測定キットは、ＢＰＡに特異的に結合する抗体を含むことにより、ＢＰＡを簡便に測定することができ、後述のＢＰＡの測定方法に好適に使用することができる。前記キットは、さらに、測定法に応じて、標識された二次抗体もしくは標識されたＢＰＡハプテン（抗原）、緩衝液、検出試薬および／またはＢＰＡ標準溶液等を含む。

好ましいキットは、下記に示すような間接競合ＥＬＩＳＡ法または直接競合ＥＬＩＳＡ法に用いられうるものである。直接競合ＥＬＩＳＡ法に用いる場合、本キットは、本発明のモノクローナル抗体を固相化した担体をさらに含むことが好ましい。この場合、下記直接競合ＥＬＩＳＡ法の工程（１）を省略することができる。

間接競合ＥＬＩＳＡ法に用いる場合、本キットは、さらに固相化抗原を含むものが好ましく、当該固相化抗原を固相化した担体を含むことが好ましい。この場合、下記間接競合ＥＬＩＳＡ法の工程（１）を省略することができる。

前記固相化抗原は、本発明の抗体を製造するために用いるハプテンとは異なるハプテンを含むものである。前記固相化抗原のハプテン部分は、ＢＰＡ−ヘキサン酸であることが好ましい。

また、前記固相化抗原は、前記固相化抗原用ハプテンと、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウサギ血清アルブミン（ＲＳＡ）、オボアルブミン（ＯＶＡ）、スカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）、チログロブリン（ＴＧ）、免疫グロブリン等の高分子化合物（タンパク質）との複合体を形成することにより得られる。

前記固相化抗原用のハプテンは、公知の方法により合成することができ、市販品を利用することもできる。複合体の形成方法は、公知の方法により行なうことができ、特に限定されるものではない。たとえば、混合酸無水物法または活性エステル法等により前記固相化抗原用ハプテンのカルボキシル基と前記高分子化合物の官能基（たとえば、アミノ基）とを反応させて、複合体を形成することができる。

本発明のキットは、下記間接競合ＥＬＩＳＡ法に用いる場合、前記固相化抗原、固相化抗原を保持する担体、ＢＰＡ抗体、酵素標識された二次抗体および検出試薬などを含む。

さらに、本発明は、前記抗体またはキットを用いることを特徴とするＢＰＡの測定方法に関する。測定方法としては、通常の抗原−抗体反応を利用する方法であれば特に制限されず、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光もしくは発光測定法、凝集法、イムノブロット法、イムノクロマト法等（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，９２，１４７−５２３（１９８３），ＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓＶｏｌ．ＩＩＩＲＬＰｒｅｓｓＯｘｆｏｒｄ（１９８９））があげられるが、感度や簡便性等の点からＥＬＩＳＡが好ましい。ＥＬＩＳＡに用いる酵素としては、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ等があげられる。

ＥＬＩＳＡによる測定法は、間接競合ＥＬＩＳＡまたは直接競合ＥＬＩＳＡなどがあげられる。たとえば、間接競合ＥＬＩＳＡは、以下のような手順により行うことができる。

（１）固相化抗原を担体に固相化する。

用いる担体は、通常のＥＬＩＳＡに用いる担体であれば特に制限されないが、９６穴、４８穴、１９２穴等のマイクロタイタープレートが好ましい。固相化は、たとえば、固相化用抗原を含む緩衝液を担体上に載せ、インキュベーションすればよい。緩衝液中の抗原の濃度は、通常０．０１〜１００μｇ／ｍｌ程度である。緩衝液としては、検出手段に応じて公知のものを使用することができる。

（２）担体の固相表面へのタンパク質の非特異的吸着を防止するため、固相化用抗原が吸着していない固相表面部分を、抗原と無関係なタンパク質等によりブロッキングする。

ブロッキング剤としては、ＢＰＡもしくはスキムミルク溶液、または市販のブロックエース（大日本製薬社製）等を使用することができる。ブロッキングは、前記ブロッキング剤を担体に添加し、たとえば、約４℃で一晩インキュベーションした後、洗浄液で洗浄することにより行われる。洗浄液としては特に制限はないが、前記（１）と同じ緩衝液を使用することができる。

（３）前記（１）および（２）で処理された固相表面に各種濃度のＢＰＡを含む試料および本発明のモノクローナル抗体溶液を加え、該抗体を前記固相化抗原およびＢＰＡに競合的に反応させて、固相化抗原−抗体複合体およびＢＰＡ−抗体複合体を生成させる。

反応は、通常４〜３７℃で１〜２時間程度で行うことができる。

（４）固相化抗原−抗体複合体の量を測定することにより、予め作成した検量線から試料中のＢＰＡの量を決定することができる。

固相化抗原−抗体複合体の量は、酵素標識した二次抗体（ＢＰＡ抗体を認識する抗体）を添加して測定することができる。たとえばＢＰＡ抗体としてマウスモノクローナル抗体を用いる場合、酵素標識（たとえば、ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ等）した抗マウス−ヤギ抗体を用いて、担体に結合したＢＰＡ抗体と反応させるのが望ましい。反応は、前記（３）と同様の条件下で行えばよい。反応後、緩衝液で洗浄する。

（５）担体に結合した二次抗体の標識酵素と反応する発色基質溶液を加え、吸光度を測定することによって検量線からＢＰＡの量を算出することができる。

二次抗体に結合する酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、たとえば、過酸化水素と、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンまたはｏ−フェニレンジアミンを含む発色基質溶液を使用することができる。通常、発色基質溶液を加えて室温で約１０分程度反応させた後、硫酸を加えることにより酵素反応を停止させる。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンを使用する場合、４５０ｎｍの吸光度を測定する。ｏ−フェニレンジアミンを使用する場合、４９０ｎｍの吸光度を測定する。なお、バックグランド値を補正するため、６３０ｎｍの吸光度も同時に測定することが望ましい。

二次抗体に結合する酵素としてアルカリホスファターゼを使用する場合には、たとえばｐ−ニトロフェニルリン酸を基質として発色させ、ＮａＯＨ溶液を加えて酵素反応を停止し、４１５ｎｍでの吸光度を測定する方法があげられる。

ＢＰＡを添加しない反応溶液の吸光度に対して、ＢＰＡを添加して抗体と反応させた溶液の吸光度の減少率を阻害率として計算する。既知の濃度のＢＰＡを添加した反応液の阻害率により予め作成しておいた検量線を用いて、試料中のＢＰＡの濃度を算出することができる。

別の態様として、ＢＰＡの測定は、たとえば以下に述べるような本発明のモノクローナル抗体を用いた直接競合ＥＬＩＳＡによって行うこともできる。

（１）本発明のモノクローナル抗体を、担体に固相化する。

用いる担体は、９６穴、４８穴、１９２穴等のマイクロタイタープレートが好ましい。固相化は、たとえば、固相化用抗体を含む緩衝液を担体上に載せ、インキュベーションすればよい。緩衝液中の抗体の濃度は、通常０．０１〜１００μｇ／ｍｌ程度である。緩衝液としては、検出手段に応じて公知のものを使用することができる。

（２）担体の固相表面へのタンパク質の非特異的吸着を防止するため、固相化用抗体が吸着していない固相表面部分を、抗体と無関係なタンパク質等によりブロッキングする。

（３）各種濃度のＢＰＡを含む試料に、ＢＰＡハプテンと酵素を結合させた酵素結合ハプテンを加えた混合物を調製する。

酵素結合ハプテンの調製は、ＢＰＡハプテンを酵素に結合する方法であれば特に制限なく、いかなる方法で行ってもよい。

（４）工程（３）の混合物を工程（２）で得られた抗体固相化担体と反応させる。

ＢＰＡと酵素結合ハプテンとの競合阻害反応により、これらと固相化担体との複合体が生成する。反応はたとえば、約２５℃で約１時間行う。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、固相化抗体と結合しなかった酵素結合ハプテンを除去する。

固相化抗体−酵素結合ハプテン複合体の量を測定することにより、予め作成した検量線から試料中のＢＰＡの量を決定する。

本工程において酵素結合ハプテンの酵素に反応する発色基質溶液を前述の間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様に加え、吸光度を測定することにより検量線からＢＰＡの量を算出することができる。

前記本発明の測定方法においては、測定対象物に応じた前処理をして試料とした後、前記間接競合ＥＬＩＳＡまたは直接競合ＥＬＩＳＡの工程（３）に供せられる。

本発明のハイブリドーマＢＰＨ−１から産生されるモノクローナル抗体を用いて、ＢＰＡの測定方法を実施することができる。本抗体を用いることによって今までイムノアッセイによる測定法のなかったＢＰＡの特異的かつ高感度測定を実施することができる。

本発明の別の態様として、免疫染色法に本発明のモノクローナル抗体を使用して、ＢＮＣＴに伴うＢＰＡの生体内挙動、特に細胞表層や細胞のミクロ分布を調べることができる。

また、本発明のハイブリドーマは、前記モノクローナル抗体を安定して短期間で産生することができ、当該ハイブリドーマを培養することにより、ＢＰＡを高感度で分子認識するモノクローナル抗体を製造することができる。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明する。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。

下記実施例において、化合物の分析および分離精製には以下の機種や試薬を用いて行った。
・ＮＭＲスペクトル：日本電子ＪＭＴＣ−４００／５４／ＳＳ４００ＭＨｚ（日本電子社製）。特に明記しない限り、内部標準としてＴＭＳを用いた。また、下記ケミカルシフトはδ値で示した。
・カラムクロマトグラフィー用シリカゲル：ＢＷ−２００（富士シリシア社製）。

〔実施例１（ＢＰＡハプテンの合成）〕
（ａ）３−（ｐ−ボロノフェニル）プロピオン酸（３）の合成
中圧水添用反応容器にＢＣＡ（１５７ｍｇ、０．８２ｍｍｏｌ）のメタノール溶液（３ｍｌ）および、１０％パラジウム炭素（２０ｍｇ）を入れ、０．３ＭＰａ、常温下で接触還元反応を行った。
・ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．５（クロロホルム：メタノール＝５：１）
・^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ_３ＯＤ） δ（ｐｐｍ）：２．５５（２Ｈ，ｔ，７．５６）、２．８６（２Ｈ，ｔ，７．５６）、７．１６（２Ｈ，ｄ，７．０７）、７．５４（２Ｈ，ｓ）。

（ｂ）６−[３−（ｐ−ボロノフェニル）プロパンアミド]ヘキサン酸メチルエステル（４）の合成
Ｍｅｔｈｙｌ６−ａｍｉｎｏｈｅｘａｎｏａｔｅＨｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅをＤＭＦに溶解し、４−Ｍｅｔｈｙｌｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅを滴下し中和した。その後、３−（ｐ−ｂｏｒｏｎｏｐｈｅｎｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎｉｃａｃｉｄ、ＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）、ＥＤＣを加え２４時間撹拌した。反応溶液を水に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。これを１０％クエン酸、１０％炭酸水素ナトリウム溶液でそれぞれ１回洗浄した。酢酸エチルを濃縮後、酢酸エチルで再結晶し精製した。
・ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．５（クロロホルム：メタノール＝５：１）
・^１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６） δ（ｐｐｍ）：１．１９（２Ｈ，ｍ）、１．３４（２Ｈ，ｍ）、１．４９（２Ｈ，ｍ）、２．２７（２Ｈ，ｔ，７．５６）、２．３４（２Ｈ，ｔ，７．３１）、２．７９（２Ｈ，ｔ，７．５６）、２．９９（２Ｈ，ｍ）、３．５６（３Ｈ，ｓ）、７．１４（２Ｈ，ｄ，７．８０）、７．６８（２Ｈ，ｄ，７．５６）。

（ｃ）６−[３−（ｐ−ボロノフェニル）プロパンアミド]ヘキサン酸（５）の合成
６−[３−（ｐ−ボロノフェニル）プロパンアミド]ヘキサン酸メチルエステルをＭｅＯＨに溶解し、氷冷下２ＮのＮａＯＨ溶液を加えた後室温に戻し、２４時間撹拌した。ＭｅＯＨを濃縮して除き、残った水槽に水を加えた。塩基性であることを確かめたのち、エーテルで２回洗浄し、１ＮのＨＣｌ溶液を加えｐＨを約３にした。この酸性の水槽を酢酸エチルで３回抽出し、硫酸マグネシウムにより乾燥させた。酢酸エチルを濃縮後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝２：１）により精製した。
・ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．３（クロロホルム：メタノール＝５：１、テーリングした。）
・^１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６） δ（ｐｐｍ）：１．２１（２Ｈ，ｍ）、１．３５（２Ｈ，ｍ）、１．４６（２Ｈ，ｍ）、２．１８（２Ｈ，ｔ，７．３２）、２．３４（２Ｈ，ｔ，７．５６）、２．７９（２Ｈ，ｔ，７．３２）、３．００（２Ｈ，ｍ）、７．１５（２Ｈ，ｄ，７．８１）、７．６８（２Ｈ，ｄ，７．８１）、１１．９８（１Ｈ，ｂ）。

〔実施例２（免疫原の調整）〕
（ｄ）６−[３−（ｐ−ボロノフェニル）プロパンアミド]ヘキサン酸コハク酸イミドエステルの合成
セントチューブに上記（ｃ）で得た化合物（４．６ｍｇ、１４．９μｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（３．４ｍｇ、２９．８μｍｏｌ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（５．７ｍｇ、２９．８μｍｏｌ）、ＤＭＦ（２００μＬ）を加え、室温で一晩撹拌した（Ｉ液）。

（ｅ−１）６−[３−（ｐ−ボロノフェニル）プロパンアミド]ヘキサン酸−ＢＳＡ複合体（７）（ＢＳＡを用いた免疫原）の合成
セントチューブにウシ血清アルブミン（１０ｍｇ、１４９ｎｍｏｌ）およびｐＨ９．４のホウ酸塩緩衝液（ホウ酸５ｍｍｏｌ、塩化カリウム５ｍｍｏｌ、ｍｉｌｉＱ水４０ｍＬ、ｐＨ調整用ＮａＯＨ溶液にてｐＨを９．４に調整、調整後ｍｉｌｉＱ水で５０ｍＬにｆｉｌｌｕｐ）を７６０μＬ加え、４℃で２４間撹拌した後、ＤＭＦ（４０μＬ）を加えた（ＩＩ液）。

ＩＩ液にＩ液を室温で滴下（１０μＬ／５分）し、室温下で２．５時間撹拌後、４℃で２４間撹拌した。これを１０％イソプロパノール−リン酸緩衝液で約６０時間（緩衝液を６回換える）透析し、ＢＰＡ−ヘキサン酸−ＢＳＡ複合体（結合体）を得た。これをＩＣＰ分析によりホウ素濃度を測定した後、１．５ｍＬのエッペンチューブに移して、４℃で保存した。

（ｅ−２）ＢＰＡ−ヘキサン酸−ＫＬＨ複合体（８）（ＫＬＨを用いた免疫原）の合成
免疫原として、ＫＬＨと本発明ＢＰＡハプテンとの結合体を、上記（ｅ−１）と同様にして作製した。

〔実施例３（ポリクローナル抗体の作製）〕
実施例２で調整したＢＰＡハプテン−ＫＬＨ結合体をリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）で１ｍｇ／ｍＬになるように希釈した。この抗原溶液６００μＬを等量のＲＩＢＩアジュバント（ＭＰＬ＋ＴＤＭＡｄｊｕｖａｎｔＳｙｓｔｅｍ，ＳＩＧＭＡＭ６５３６）と混合し、２〜３分間ボルテックスすることで十分混合した。これを５匹のＢａｌｂ／ｃマウス（８週齢、オス）に腹腔内注射により免疫した（５０μｇ／ｄｏｓｅ）。これを２週間ごとに行い、３回目の免疫以降は各免疫から１週間後に採血（眼窩採血）を行った。

実施例２で調整した抗原（ＢＰＡハプテン−ＢＳＡ結合体）をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で５．０μｇ／ｍＬになるよう希釈し、ＥＬＩＳＡ用マイクロプレートに１００μＬずつ分注し、３７℃で１時間静置することで抗原をプレート表面に固定した。

その後ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ溶液（リン酸緩衝液ｐＨ７．４、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄し、非特異的吸着を防ぐためにブロッキング溶液（リン酸緩衝液ｐＨ７．４、１％ＢｌｏｃｋＡｃｅ）を２００μＬずつ加え、３７℃で一時間静置しブロッキングを行った。そして、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ溶液で洗浄後、調製したサンプルを１００μＬ加え、再び３７℃で１時間静置した。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ溶液で洗浄後、二次抗体を５０μＬ加え、３７℃で１時間静置し、二次抗体（ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（γ鎖特異的））と反応させた。

ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ溶液で洗浄後、事前に調整しておいた基質溶液（リン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、０．０４％ｏ−フェニレンジアミン）に過酸化水素水を０．０２％になるよう調整したものを２００μＬ加えた。３７℃で３０分静置し発色させた後、マイクロプレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ／Ｍｏｄｅｌ５５０）を用いて吸光度を測定した。

〔実施例４（ハイブリドーマおよびモノクローナル抗体の作製）〕
（ｆ）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
合成したＢＰＡハプテン−ＫＬＨ結合体（実施例２）をリン酸緩衝液ｐＨ７．４（ＰＢＳ）（ＮａＣｌ１３７ｍＭ、ＮａＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ８．１０ｍＭ、ＫＣｌ２．６８ｍＭ、ＫＨ_２ＰＯ_４１．４７ｍＭ）で５００μｇ／ｍＬになるように希釈した。この抗原溶液２ｍＬを４０℃にて１０分間加温したＲＩＢＩアジュバントシステム（ＲＩＢＩ／ＭＰＬ（登録商標）＋ＴＤＭＥｍｕｌｓｉｏｎ，Ｒ−７００）と混合し、２〜３分間ボルテックスし、十分に混合した。

これを５匹のＢａｌｂ／ｃマウス（８週齢、オス）に皮下注射により免疫した（５０μｇ／ｄｏｓｅ）。これを２週間ごとに行い、２回目の免疫以降は各免疫から、１週間後に採血（眼窩採血）を行った。採血した血液は１．５ｍＬチューブに集め、３７℃で１時間インキュベートした後、４℃にて一晩静置した。

（ｇ）細胞融合
（ｇ−１）ＤＭＥＭ培地の調製
ダルベッコ改変イーグル培地（ＩＷＡＫＩＤＭＥ／ＬＯＷ、Ｌｏｔ．９９５６２０１３）１パック、硫酸ゲンタマイシン（ゲンタマイシン６４２μｇ／ｍｇ、ＳＩＧＭＡＬｏｔ．１０５Ｈ０４５７）７８．４ｍｇ、炭酸水素ナトリウム（関東化学、Ｌｏｔ３０２Ｆ１３７８）２．２ｇにＭｉｌｌｉＱを加えて１Ｌにした後、０．２２μｍフィルター（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥＭＩＬＬＥＸ（登録商標）−ＧＶ、０．２２μｍフィルターＳＬＧＶ０１３５２）で滅菌して、ＤＭＥＭ培地を調製した。

（ｇ−２）ＨＡＴ培地およびＨＴ培地の調製
ＨＡＴｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＳＩＧＭＡ、Ｌｏｔ＃６１Ｋ８９３４）一瓶に１０ｍＬの滅菌したＭｉｌｌｉＱを加え、瓶内の試薬を完全に溶かした。この溶液をＤＭＥＭ培地（１５％ＦＣＳ）の１／５０量加えて混合し、ＨＡＴ培地とした。ＨＴｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＳＩＧＭＡ、Ｌｏｔ＃３２Ｋ８９２８）一瓶に１０ｍＬの滅菌したＭｉｌｌｉＱを加え、瓶内の試薬を完全に溶かし、この溶液をＤＭＥＭ培地（１５％ＦＣＳ）の１／５０量加えて混合し、ＨＴ培地とした。

（ｇ−３）５０％ＰＥＧ培地の調製
２０ｇのＰＥＧ６０００（ＰＥＧ♯６０００（Ｍ．Ｗ．７３００−９０００）、ナカライテスク、ＬｏｔＭ８Ｈ２９５０）を２０ｍＬのＤＭＥＭ培地に加え、ホットスターラーで２時間撹拌して完全に溶かした。その後、４０ｍＬにメスアップし、クリーンベンチで０．２０μｍフィルターを用いて滅菌した。その後、１．８ｍＬずつ分注して凍結し、使用直前に溶解し、２００μＬのＤＭＳＯ（ＳＩＧＭＡ、Ｌｏｔ＃４２Ｋ２４０１）を加えて、５０％ＰＥＧ（１０％ＤＭＳＯ）溶液を作製した。

（ｇ−４）ＡＣＫｌｙｓｉｓ緩衝液の調製
ＭｉｌｌｉＱ９０ｍＬに塩化アンモニウム８０２．３ｍｇ、炭酸水素カリウム１０．０１ｍｇ、ＥＤＴＡ３．７２ｍｇを加えｐＨ７．２〜７．４に調整し、１００ｍＬにメスアップした。これをメディウム瓶に入れ、１２１℃で２０分間オートクレーブし、滅菌して、ＡＣＫｌｙｓｉｓ緩衝液（０．１５Ｍ塩化アンモニウム、１．０ｍＭ炭酸水素カリウム、０．１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．２〜７．４）とした。

（ｈ）脾臓細胞の調整
抗体価が飽和に達したマウスに最終免疫（尾静脈注射）を行い、３日後に脾臓を摘出した。摘出した脾臓を氷上のＤＭＥＭの入ったシャーレに入れ、クリーンベンチ内に入れた。摘出した脾臓の不要な部分を除き、新しいＤＭＥＭ培地の入った５ｍＬシャーレに入れた。２本のピンセットを用いて、脾臓細胞をこそぎだし、セルストレーナー（ＦＡＬＣＯ−Ｎ２３５０、７０μｍナイロン）でろ過して不要なものを取り除き、通過した細胞をガラス製の遠心管に集め、１０００ｒｐｍで１０分間遠心した。

上清を捨て、５ｍＬのＡＣＫｌｙｓｉｓ緩衝液を加えピペッティングにより均一に混合し、室温で５分間静置し、脾臓細胞を洗浄除去した（赤血球の除去）。ここに２０ｍＬのＤＭＥＭ培地を加え、１０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を除去した。さらに２０ｍＬのＤＭＥＭ培地を加え、ピペッティングにより細胞を洗浄し、１０００ｒｐｍで１０分間遠心した。上清を除去し、ＤＭＥＭ培地を１０ｍＬ加え、ピペッティングにより混合した後、血球計算盤（ＥｒｍａＴｏｋｙｏ４０６２）を用いて、細胞数をカウントした。

（ｉ）ミエローマ細胞の調整
ミエローマ細胞（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１）を細胞融合を行う日程にあわせて培養し、使用直前に細胞をガラス製の遠心管に集め１０００ｒｐｍで１０分間遠心した。上清を除去し、ＤＭＥＭ培地を１０ｍＬ加え、ピペッティングにより混合した後、血球計算盤（ＥｒｍａＴｏｋｙｏ４０６２）を用いて、細胞数をカウントした。

（ｊ）細胞融合
脾臓細胞：ミエローマ細胞が１０：３になるようにミエローマ細胞懸濁液の量を調整し、脾臓細胞懸濁液の遠心管に入れ、ピペッティングによって混合した。これを１０００ｒｐｍで１０分間遠心し上清を除去した後、パスツールピペットを用いて完全に上清を除去した。

その後、遠心管をたたいて、細胞を遠心管の壁に広げた。遠心管を手で暖め、回しながら、１ｍＬの５０％ＰＥＧ（１０％ＤＭＳＯ）溶液を１分以上かけて、徐々に加えた。遠心管を１分間暖めながらまわし、同様の方法で、２ｍＬのＤＭＥＭ培地を２分以上かけて加え、さらに８ｍＬのＤＭＥＭ培地を５分以上かけて加えた。

その後、１０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を捨て、さらに１０ｍＬのＤＭＥＭ培地を加えて細胞を洗浄し、１０００ｒｐｍで１０分間遠心した。上清を除去し、ＤＭＥＭ（１５％ＦＣＳ）培地を細胞密度が２×１０^５個／ｍＬになるように調整し、９６穴プレートに１００μＬずつ分注し、３７℃で一晩静置した。

（ｋ）ＨＡＴ選択
９６穴プレートに分注した細胞に、２倍程度のＨＡＴ培地を１００μＬずつ分注し、３７℃で１週間放置した。その後、１００μＬのＨＡＴ培地を加えた。その後、陽性のウェルのハイブリドーマ細胞を２４穴プレートに移し変え、ＨＴ培地を用いて全量を１ｍＬにした。３日後、２次スクリーニングを行い、陽性であったウェルを限界希釈法によってクローニングした。

（ｌ）限界希釈法を用いたクローニング
２次スクリーニングで陽性であったウェルのハイブリドーマ細胞の細胞数を血球計算盤（ＥｒｍａＴｏｋｙｏ４０６２）を用いてカウントして、濃度を求め、クローニング用の培地（ＤＭＥＭ（１５％ＦＣＳ）培地２０ｍＬ、Ｂｒｉｃｌｏｎｅ１ｍＬ）を用いて、段階希釈することにより１０個／ｍＬ、５個／ｍＬに調整した。９６穴プレートに１００μＬずつ分注し、１ウェルあたり細胞が１個または０．５個とした。

これを３７℃で１週間静置し、その後各ウェルに１００μＬずつクローニング陽の培地を加え、さらに３７℃で１週間静置した。陽性であったウェルの細胞を４８穴プレートに移し、同様に２回目のクローニングを行い、最終的に単一のハイブリドーマ細胞を得た。

（ｍ）無血清培地からの抗体の精製
無血清培地で培養したハイブリドーマ細胞ＢＰＨ−１培養液を１０００ｒｐｍで１０分間遠心し、細胞上清に対し、６０％硫酸アンモニウム濃度になるように硫酸アンモニウムを加え、抗体タンパクを沈殿させた。これを４℃で２時間撹拌し、さらに一晩放置した。その後、４℃、１３５００ｒｐｍで２０分遠心し、結合バッファーに溶解させ、結合バッファーで透析した。

透析後、８０００ｒｐｍで１０分間遠心して、上清を０．４５μｍでフィルターろ過してサンプルとした。カラムに５ｍＬの超純水を流速１滴／秒（１〜２ｍＬ／分）で送液後、３〜５ｍＬの結合バッファーを流速１滴／秒（１〜２ｍＬ／分）で送液し、カラムの平衡化を行った。その後、調整したサンプルを１滴／２秒（１〜２ｍＬ／分）で送液し、抗体をカラムに吸着させた。

非吸着成分を３〜５ｍＬの結合バッファー（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．８Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ７．５）を流速１滴／秒で送液することにより除去した後、５ｍＬ溶出バッファー（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５）を１滴／秒（１〜２ｍＬ／分）で送液して抗体を溶出させた。溶出液を０．５ｍＬずつ回収した。

全てのフラクションの吸光度（ＯＤ＝２８０ｎｍ）を測定し、抗体タンパクを含んでいるフラクションをブラッドフォード法により、抗体タンパク濃度を測定した。その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでモノクローナル抗体の純度を確認した。

（ｎ）抗体の感度測定と検量線の作成（直接競合ＥＬＩＳＡ法）
ＰＢＳ溶液（リン酸緩衝液ｐＨ７．４）を用いて５μｇ／ｍＬに調製したモノクローナル抗体（ハイブリドーマ株（ＢＰＨ−１から調製）溶液を１００μＬずつ９６穴ＥＬＩＳＡ用プレートに分注し、３７℃で１時間静置することでプレートに抗体を固相化した。反応後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ溶液（リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄し、非特異的吸着を防ぐためにプレートにブロッキング溶液（リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１％ＢＳＡ）を加え、室温で１時間または４℃で一晩反応させ、プロッキングを行った。

ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ溶液で洗浄後、ＨＲＰ標識した競合剤（ＨＲＰ結合ＢＰＡ−ヘキサン酸）のＰＢＳ溶液（０．５μｇ／ｍＬ）中に、ＢＰＡがそれぞれ１００〜０．００１ｐｐｍの濃度になるようにサンプルを調整した。

調製したサンプルをそれぞれ１００μＬずつ９６穴ＥＬＩＳＡ用プレート（ＩＷＡＫＩ３８０１−０９６）に加え３７℃で１時間反応させた。その後、常法どおりＥＬＩＳＡ（基礎溶液（５０ｍｍｏｌリン酸クエン酸緩衝溶液（ｐＨ５．０）、０．０４％ｏ−フェニレンジアミン）を行い、マイクロプレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ／Ｍｏｄｅｌ５５０）を用いて４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。

測定結果を図１に示す。Ｘ軸はＢＰＡ濃度を、Ｙ軸は吸光度を表す。図１が示すように、ハイブリドーマ株ＢＰＨ−１から調製したモノクローナル抗体を用いてＢＰＡを特異的に検出することができ、ＢＰＡ濃度が０．００１〜１μＭの幅広い範囲で吸光度測定によるＢＰＡの濃度測定が可能であった。このように本発明のハイブリドーマおよび抗体を用いることにより、ＢＰＡの幅広い濃度範囲で非常に感度の高い定量評価および定性評価等が可能となる。

本発明のモノクローナル抗体を用いた直接競合ＥＬＩＳＡ法におけるＢＰＡ濃度と吸光度の関係を示すグラフ。

Claims

下記式（１）：

で表わされる構造を有する化合物。
請求項１に記載の化合物をハプテンとし、当該ハプテンと高分子化合物との複合体を抗原として用いることにより得られるｐ−ボロノフェニルアラニン（ＢＰＡ）に対する抗体。
前記抗体がモノクローナル抗体である請求項２に記載の抗体。
請求項３に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
前記ハイブリドーマがＢＰＨ−１（受領番号ＦＥＲＭＡＰ−２０９４３）である請求項４に記載のハイブリドーマ。
請求項３に記載のモノクローナル抗体を含むｐ−ボロノフェニルアラニン（ＢＰＡ）の測定キット。
請求項３に記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴とするｐ−ボロノフェニルアラニン（ＢＰＡ）の測定方法。
請求項６に記載のキットを用いることを特徴とするｐ−ボロノフェニルアラニン（ＢＰＡ）の測定方法。