JP2001272401A - フタル酸エステル類のハプテン化合物、抗体及び測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、フタル酸エステル類のハプテン化
合物、抗体及び測定方法を提供することを目的とする。 【解決手段】 本発明のハプテン化合物は、フタル酸エ
ステル類又はその部分にスペーサーアーム及び結合のた
めの官能基を共有結合させた構造を有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、フタル酸エステル
類のハプテン化合物、抗原、抗体及びそのフラグメント
に関する。

【０００２】本発明はさらに、前記抗原、抗体及びその
フラグメントを用いた免疫化学的測定方法に関する。

【０００３】

【従来の技術】フタル酸エステル類は、以下の式
（２）：

【０００４】

【化３】

【０００５】［式（２）中、Ｒ¹およびＲ²は枝分かれし
ていてもよい炭素数１−１３のアルキル基、又はシクロ
ヘキシル基若しくはベンジル基である］で表される構造
を有する、無水フタル酸とアルコールとの反応により合
成されるジエステル化合物（ジアルキルフタレート）の
総称である。フタル酸エステル類は、式（２）中のＲ¹
およびＲ²によって、ジブチルフタレート（ＤＢＰ）
（以下本明細書中、「フタル酸ジブチル」と言う）、ジ
（２−エチルヘキシル）フタレート（ＤＥＨＰ）、ジイ
ソノニルフタレート（ＤＩＮＰ）、ジヘプチルフタレー
ト（ＤＨＰ）、ジイソデシルフタレート（ＤＩＤＰ）、
ブチルベンジルフタレート（ＢＢＰ）、ジシクロヘキシ
ルフタレート（ＤＣＨＰ）、ジエチルフタレート（ＤＥ
Ｐ）等が含まれる。

【０００６】フタル酸エステル類は、主にポリ塩化ビニ
ル（Ｐｏｌｙ Ｖｉｎｙｌ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ，ＰＶ
Ｃ）樹脂を中心としたプラスチックに柔軟性を与える可
塑剤として用いられる他、一部塗料、顔料、接着剤など
にも用いられている。相溶性、可塑化効率、電気絶縁
性、耐水性に優れ、コストパフォーマンスもよいため、
日本では全可塑性剤生産量の８割以上を占めている。フ
タル酸エステル類は、ＰＶＣに多いときは４０％も加え
られるが、樹脂に化学的に結合していないので、時間の
経過とともに分離し、大気へ揮発したり水へ溶出したり
する。従って、フタル酸エステル類は環境中に広く存在
している。このように、フタル酸エステル類は広く環境
中に存在する汚染物質で、その上、脂溶性で、いくらか
動物脂肪中に残留する。にもかかわらず、従来は毒性
（有害性）がそれほど高くないと考えられており、あま
り問題とされていなかった。

【０００７】しかしながら、フタル酸エステル類はその
使用量が多いため環境（空気、水、土壌）や生物からは
常に検出され、分布が普遍的である。また、プラスチッ
クという難分解性の製品中に組み込まれているため、廃
棄方法の如何によっては、永続的な汚染をもたらす可能
性がある。

【０００８】また、最近、フタル酸エステル類のエスト
ロゲン様活性が発見され、従来からフタル酸エステル類
の催奇形性、生殖毒性の報告があったことから、「外因
性内分泌攪乱化学物質（環境ホルモン）」の疑いがある
物質として注目を集めることとなった。環境庁のリスト
でも８種類のフタル酸エステル類が挙げられている
（「環境ホルモン・環境汚染懸念化学物質 −現状と産
業界の対応−」 第７１頁−第７８頁、第２８０頁−第
２８５頁、１９９９．３．１発行、（株）シー・エム・
シー；「環境ホルモンのモニタリング技術−分析・測定
法の実際−」第１６３頁−第１７１頁、１９９９．１
１．１５発行、（株）シー・エム・シー）。

【０００９】「外因性内分泌攪乱化学物質」は、いわゆ
る「環境ホルモン」とも呼称され、「動物の生体内に取
り込まれた場合に、本来、その生体内で営まれている正
常なホルモン作用に影響を与える外因性の物質」を意味
する。近年、内分泌学を始めとする医学、野生動物に関
する科学、環境科学等の研究者・専門家によって、環境
中に存在するいくつかの化学物質が、動物の体内のホル
モン作用を攪乱することを通じて、生殖機能を阻害した
り、悪性腫瘍を引き起こすなどの悪影響を及ぼしている
可能性があるとの指摘がなされている。これが「外因性
内分泌攪乱化学物質（環境ホルモン）問題」と呼ばれて
いるものであり、環境保全上の新たで重要な課題の一つ
となっている。外因性内分泌攪乱化学物質問題に関して
は、人や野生動物への影響を示唆する科学的報告が数多
くなされているものの、報告された異常と原因物質との
因果関係、そうした異常が発生するメカニズム等に関し
てはいまだ十分には明らかにされていない状況にある
（「外因性内分泌攪乱化学物質問題への環境庁の対応方
針について −環境ホルモン戦略計画ＳＰＥＥＤ’９
８」、１９９８年５月、環境庁）。

【００１０】食品の安全性確保の上から、食品中の濃度
の実体を把握し、摂取量の推定及びリスク評価を行うこ
とが求められている。しかしながら、フタル酸エステル
類は実験室環境や分析に使用する器具、試薬等を広範囲
に汚染していることが知られており、食品中の微量でか
つ正確な測定は困難であった。

【００１１】従来、フタル酸エステル類は、例えば水質
試料、食品等から抽出した後、ガスクロマトグラフ質量
分析計（ＧＣ／ＭＳ）の選択イオン検出（ＳＩＭ）法に
より分析されてきた。即ち、例えば、試料をアセトンで
抽出し、酢酸エチル−ヘキサン、次いで、ヘキサン−飽
和アセトニトリルで分配した後に、フロリジルカラムク
ロマトグラフィーで精製後、ＧＣ／ＭＳで測定する方法
等が採用されている（「環境ホルモンのモニタリング技
術−分析・測定法の実際−」；上述）。これらの方法
は、試料の調製が煩雑で多大の手順と時間を必要とし、
分析に熟練を要すること、並びに、測定装置や設備等に
高額の費用を必要とする等の問題点がある。フタル酸エ
ステル類の測定は短時間で膨大な数の試料の分析結果を
出す必要があり、精度面だけでなく、簡便性、迅速性及
び経済性をも具備した新規測定方法が要求されてきてい
る。

【００１２】免疫化学的測定方法は、抗体が抗原を特異
的に認識する抗原抗体反応に基づいて抗原や抗体の検出
を行う方法であり、その優れた精度、簡便性、迅速性、
経済性から近年注目を集めてきている。免疫化学的測定
方法においては検出方法として非常に多種の標識、例え
ば、酵素、放射性トレーサー、化学発光あるいは蛍光物
質、金属原子、ゾル、ラテックス及びバクテリオファー
ジが適用されてきた。

【００１３】免疫化学的測定方法の中でも、酵素を使用
する酵素免疫測定法（ＥＩＡ）は経済性・利便性から特
に優れたものとして広く使用されるに至っている。酵素
免疫測定法についての優れた論評が、Ｔｉｊｓｓｅｎ
Ｐ，“Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ
ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ” ｉｎＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｍｓｔｅｒ
ｄａｍ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｏｘｆｏｒｄ ＩＳＢＮ
０−７２０４−４２００−１（１９９０）に記載され
ている。

【００１４】一般に、分子量が大きな分子については、
それ以上修飾することなく動物に接種することにより、
適当な免疫反応を惹起し、抗原を認識する抗体を産生さ
せることができる。しかし、フタル酸エステル類のよう
な低分子化合物は通常動物に接種したとき免疫応答を引
き出すことができない。これらの分子は免疫原性を有す
る高分子化合物（タンパク質や多糖類など）に結合させ
ることによって初めて一団のエピトープとして行動し、
Ｔ細胞受容体の存在下で免疫応答を起こし、その結果、
一群のＢリンパ球により抗体が産生される。このように
高分子化合物と結合させて初めて免疫原性を生じる分子
を総称して「ハプテン」と言う。

【００１５】しかし、低分子化合物を高分子化合物と結
合させたものを抗原としても、得られた抗体は望む分子
を認識しないか、あるいはごく低い親和性しかもたない
場合がしばしばある。そのため、一般に低分子化合物そ
のものではなく、結合に利用できる官能基と共にスペー
サーアーム（結合手）を導入したものをハプテンとして
使用する必要がある。しかしその場合に、結合手／官能
基の配置、結合手の大きさ等の全ての問題を考慮して導
入が適切に行われたものを使用しないと、好ましい抗体
は得られない。適切な導入は個々の分子に応じて工夫し
なければならない。

【００１６】フタル酸エステル類については、Ｆｒｅｓ
ｅｎｉｕｓ Ｊ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９３）３
４５，ｐ．５８９−５９１に抗体およびその作成方法が
記載されているが、酵素標識の免疫化学測定法ではな
く、蛍光物質を標識とした免疫化学測定法を採用してお
り、高価な分析装置を必要とする。また、酵素標識の免
疫化学測定法については、免疫化学測定法研究会年報２
０００年第４号第８６頁にフタル酸エステル定量キット
の記載があり、その定量範囲は２００μｇ／ｌないし４
０００μｇ／ｌである。

【００１７】しかしながら、フタル酸エステル類を高感
度かつ安価に測定できる適切な抗体及びそのような抗体
を作製するためのハプテンは、本発明前には得られてい
なかった。

【００１８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、フタル酸エ
ステル類に反応する新規な抗体若しくはそのフラグメン
ト、及びその作製方法を提供することを目的とする。
尚、本明細書において抗体の「フラグメント」とは、抗
原と結合可能な抗体の一部分、例えばＦ_ab断片等を意味
する。

【００１９】本発明はその一態様において、フタル酸エ
ステル類に反応性を有するモノクローナル抗体を提供す
る。

【００２０】本発明は、また、フタル酸エステル類に反
応性を有する新規な抗体を作製するための抗原を構成す
るハプテン化合物（フタル酸エステル類ハプテン）を提
供することを目的とする。

【００２１】本発明は、さらに、フタル酸エステル類ハ
プテンと高分子化合物との結合体を提供することを目的
とする。

【００２２】本発明は、さらにまた、前記抗体又はその
フラグメントを産生するハイブリドーマを提供すること
を目的とする。

【００２３】本発明は、さらに、前記抗体若しくはその
フラグメント及び／又は前記フタル酸エステル類ハプテ
ンと高分子化合物若しくは標識物質との結合体を使用す
ることを含む、フタル酸エステル類の免疫化学的測定方
法を提供することを目的とする。

【００２４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
を重ねた結果、フタル酸エステル類又はその部分にスペ
ーサーアーム及び高分子化合物との結合に利用できる官
能基を導入した、フタル酸エステル類の誘導体をハプテ
ンとして使用することにより、前記化合物に反応性を有
する抗体を得ることに成功し、本発明の完成に至った。

【００２５】本発明の対象となるフタル酸エステル類
は、以下の式（２）：

【００２６】

【化４】

【００２７】［式（２）中、Ｒ¹およびＲ²は枝分かれし
ていてもよい炭素数１−１３のアルキル基、又はシクロ
ヘキシル基若しくはベンジル基である］で表される構造
を有する化合物である。Ｒ¹とＲ²は、同一であっても異
なっていてもよい。特に好ましくは、本発明の対象とな
るフタル酸エステル類はＲ¹およびＲ²がブチル基である
フタル酸ジブチルである。

【００２８】本発明の抗体は、例えば、フタル酸エステ
ル類の一部分にスペーサーアーム及び結合に利用できる
官能基を導入した誘導体をハプテンとして適当な高分子
化合物と結合させたものを抗原として用いることによっ
て得ることができる。例えば、以下の式（１）：

【００２９】

【化５】

【００３０】［式（１）中、Ｒ¹およびＲ²は枝分かれし
ていてもよい炭素数１−１３のアルキル基、又はシクロ
ヘキシル基若しくはベンジル基であり；そしてｎは１−
１０の整数である］で表される構造を有する化合物を、
抗体作製のためのハプテンとして使用する。

【００３１】式（１）中、好ましくは、Ｒ¹およびＲ²は
ブチル基である。式（１）中、ｎは好ましくは３であ
る。

【００３２】本発明は、前記ハプテン化合物、ハプテン
化合物と高分子化合物との結合体、フタル酸エステル類
に反応する抗体及びその作製方法、並びに該ハプテン化
合物又は該抗体を用いるフタル酸エステル類の免疫化学
的測定方法に関する。

【００３３】フタル酸エステル類ハプテンの作製 式（１）で表されるフタル酸エステル類ハプテンは、公
知の方法に従って製造することができる。限定するわけ
ではないが、例えば以下のような方法を用いることがで
きる。

【００３４】まず、例えば、Ｒ¹およびＲ²が同一の場
合、無水ニトロフタル酸に以下の式（Ｘ１）：

【００３５】

【化６】

【００３６】［式（Ｘ１）中、Ｒ¹及びＲ²は、先に定義
した通りである］で表される構造を有するアルコールを
反応させて、以下の式（Ｘ２）：

【００３７】

【化７】

【００３８】［式（Ｘ２）中、Ｒ¹及びＲ²は、先に定義
した通りである］で表される構造を有する化合物を得
る。

【００３９】反応は、ベンゼン、トルエン、キシレンな
どの非極性溶媒中、溶媒を環流させ不要の水を取り除き
ながら行うのが好ましい。

【００４０】反応は、２０℃から溶媒の沸点の温度、好
ましくは５０℃から１５０℃で、５分から２０時間、好
ましくは３０分から５時間行う。

【００４１】次いで、有機溶媒中、パラジウム炭素、ロ
ジウム炭素またはラネーニッケル等の触媒の存在下、接
触水素還元で、式（Ｘ２）の化合物中のニトロ基を還元
し、以下の式（Ｘ３）：

【００４２】

【化８】

【００４３】［式（Ｘ３）中、Ｒ¹及びＲ²は、先に定義
した通りである］で表される構造を有する化合物を得
る。反応は、０℃から溶媒の沸点の温度、好ましくは２
０℃から８０℃で、５分から２０時間、好ましくは３０
分から５時間行う。有機溶媒としては、エタノール、メ
タノール、ジオキサン、酢酸等を使用できる。

【００４４】最後に、式（Ｘ３）の化合物を、有機塩
基、例えばピリジンの存在下、有機溶媒中または有機塩
基を溶媒として用い、以下の式（Ｘ４）：

【００４５】

【化９】

【００４６】［式（Ｘ４）中、ｎは先に定義した通りで
ある。］で表される構造を有する化合物と反応させるこ
とにより、式（１）の化合物を得ることができる。有機
溶媒としては、例えば、ジクロルメタン、クロロホル
ム、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ベンゼン、
トルエン、ジエチルエーテル等を挙げることができる。
反応は、０℃から溶媒の沸点の温度、好ましくは５０℃
から１５０℃で、５分から３０時間、好ましくは３時間
から５時間行う。上述したような製造方法によって得ら
れた化合物を、必要に応じシリカゲルクロマトグラフィ
ー又は再結晶操作等を行うことにより、さらに高純度の
精製品とすることができる。

【００４７】以下、本発明の抗原、抗体の作製、及び免
疫化学的測定法について説明する。尚、これらの調製は
公知の方法、例えば続生化学実験講座、免疫生化学研究
法（日本生化学会編）等に記載の方法に従って行うこと
ができる。

【００４８】フタル酸エステル類ハプテンと高分子化合
物との結合体の作製 上述のように合成されたフタル酸エステル類ハプテンを
適当な高分子化合物に結合させてから免疫用抗原若しく
は固相化用抗原として使用する。

【００４９】好ましい高分子化合物の例としては、スカ
シガイへモシアニン（以下、「ＫＬＨ」と言う）、卵白
アルブミン（以下、「ＯＶＡ」と言う）、ウシ血清アル
ブミン（以下、「ＢＳＡ」と言う）、ウサギ血清アルブ
ミン（以下、「ＲＳＡ」と言う）などがある。ＫＬＨ及
びＢＳＡが好ましい。

【００５０】フタル酸エステル類ハプテンと高分子化合
物との結合は、例えば、混合酸無水物法（Ｂ．Ｆ．Ｅｒ
ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２３４ １０９０‐１０９４（１９５４））又は活
性化エステル法（Ａ．Ｅ．ＫＡＲＵ ｅｔ ａｌ．：
Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．４２ ３０１−
３０９（１９９４））等の公知の方法によって行うこと
ができる。

【００５１】混合酸無水物法において用いられる酸無水
物は、通常のショッテン−バウマン反応により得られ、
これを高分子化合物と反応させることにより目的とする
ハプテン−高分子化合物結合体が製造される。ショッテ
ン−バウマン反応は塩基性化合物の存在下に行われる。
塩基性化合物としては、ショッテン−バウマン反応に慣
用の化合物を使用することができ、例えば、トリブチル
アミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、Ｎ−メ
チルモルホリン、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリ
ン、ＤＢＮ、ＤＢＵ、ＤＡＢＣＯ等の有機塩基、炭酸カ
リウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素
ナトリウム等の無機塩基等が挙げられる。該反応は、通
常マイナス２０℃から１５０℃、好ましくは０℃から１
００℃において行われ、反応時間は５分から１０時間、
好ましくは５分から２時間である。得られた混合酸無水
物と高分子化合物との反応は、通常マイナス２０℃から
１００℃、好ましくは０℃から５０℃において行われ、
反応時間は５分から１０時間、好ましくは５分から５時
間である。混合酸無水物法は一般に溶媒中で行われる。
溶媒としては、混合酸無水物法に慣用されているいずれ
の溶媒も使用可能であり、具体的にはジオキサン、ジエ
チルエーテル、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタン
等のエーテル類、ジクロロメタン、クロロホルム、ジク
ロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、ベンゼン、トル
エン、キシレン等の芳香族炭化水素類、酢酸メチル、酢
酸エチル等のエステル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミ
ド、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルリン酸トリア
ミド等の非プロトン性極性溶媒等が挙げられる。混合酸
無水物法において使用されるハロ蟻酸エステルとして
は、例えばクロロ蟻酸メチル、ブロモ蟻酸メチル、クロ
ロ蟻酸エチル、ブロモ蟻酸エチル、クロロ蟻酸イソブチ
ル等が挙げられる。当該方法におけるハプテンとハロ蟻
酸エステルと高分子化合物の使用割合は、広い範囲から
適宜選択され得る。

【００５２】一方、活性化エステル法は、一般に以下の
ように行うことができる。まず、ハプテン化合物を有機
溶媒に溶解し、カップリング剤の存在下にてＮ−ヒドロ
キシこはく酸イミドと反応させ、Ｎ−ヒドロキシこはく
酸イミド活性化エステルを生成させる。

【００５３】カップリング剤としては、縮合反応に慣用
されている通常のカップリング剤を使用でき、例えば、
ジシクロヘキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダ
ゾール、水溶性カルボジイミド等が含まれる。有機溶媒
としては、例えば、ジメチルスルホキシド（以下、「Ｄ
ＭＳＯ」と言う）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（以
下、「ＤＭＦ」と言う）、ジオキサン等が使用できる。
反応に使用するハプテン化合物とＮ−ヒドロキシこはく
酸イミドのモル比は好ましくは１：１０から１０：１、
より好ましくは１：１から１：１０、最も好ましくは
１：１である。反応温度は、０℃から１００℃、好まし
くは５℃から５０℃、より好ましくは２２℃から２７℃
で、反応時間は５分から２４時間、好ましくは３０分か
ら６時間、より好ましくは１時間から２時間である。

【００５４】カップリング反応後、反応液を高分子化合
物を溶解した溶液に加え反応させると、例えば高分子化
合物が遊離のアミノ基を有する場合、当該アミノ基とハ
プテン化合物のカルボキシル基の間に酸アミド結合が生
成される。反応温度は、０℃から６０℃、好ましくは５
℃から４０℃、より好ましくは２２℃から２７℃で、反
応時間は５分から２４時間、好ましくは１時間から１６
時間、より好ましくは１時間から２時間である。反応物
を、透析、脱塩カラム等によって精製して、フタル酸エ
ステル類ハプテンと高分子化合物との結合体を得ること
ができる。

【００５５】また、上記と同様の方法により、酵素等の
標識物質をフタル酸エステル類ハプテンに結合させたも
のを、免疫化学的測定方法において使用することができ
る。標識物質としては、西洋わさびペルオキシダーゼ
（以下「ＨＲＰ」と言う）、アルカリフォスファターゼ
等の酵素、フルオレセインイソシアネート、ローダミン
等の蛍光物質、³²Ｐ、¹²⁵Ｉ等の放射性物質、化学発光
物質などがある。

【００５６】ポリクローナル抗体の作製 フタル酸エステル類ハプテンと高分子化合物との結合体
を使用して、常法により本発明のポリクローナル抗体を
作製することができる。例えば、フタル酸エステル類ハ
プテンとＫＬＨとの結合体をリン酸ナトリウム緩衝液
（以下、「ＰＢＳ」と言う）に溶解し、フロイント完全
アジュバント又は不完全アジュバント、あるいはミョウ
バン等の補助剤と混合したものを、免疫用抗原として動
物に免疫することによって得ることができる。免疫され
る動物としては当該分野で常用されるものをいずれも使
用できるが、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、
ウマ等を挙げることができる。ただし、ヒトは含まれな
い。

【００５７】免疫の際の投与法は、皮下注射、腹腔内注
射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射のいずれでもよ
いが、皮下注射又は腹腔内注射が好ましい。免疫は１回
又は適当な間隔で、好ましくは１週間ないし５週間の問
隔で複数回行うことができる。

【００５８】免疫した動物から血液を採取し、そこから
分離した血清を用い、フタル酸エステル類と反応するポ
リクローナル抗体の存在を評価することができる。

【００５９】モノクローナル抗体の作製 フタル酸エステル類ハプテンと高分子化合物との結合体
を使用して、公知の方法により本発明のモノクローナル
抗体を作製することができる。

【００６０】モノクローナル抗体の製造にあたっては、
少なくとも下記のような作業工程が必要である。 （ａ）免疫用抗原として使用するフタル酸エステル類ハ
プテンと高分子化合物との結合体の作製 （ｂ）動物への免疫 （ｃ）血液の採取、アッセイ、及び抗体産生細胞の調製 （ｄ）ミエローマ細胞の調製 （ｅ）抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合とハ
イブリドーマの選択的培養 （ｆ）目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスク
リーニングと細胞クローニング （ｇ）ハイブリドーマの培養又は動物へのハイブリドー
マの移植によるモノクローナル抗体の調製 （ｈ）調製されたモノクローナル抗体の反応性の測定等 モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製す
るための常法は、例えば、ハイブリドーマ テクニック
ス（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ），コ
ールド スプリング ハーバー ラボラトリーズ（Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ，１９８０年版）、細胞組織化学（山下修二ら、日
本組織細胞化学会編；学際企画、１９８６年）に記載さ
れている。

【００６１】以下、本発明のフタル酸エステル類に対す
るモノクローナル抗体の作製方法を説明するが、これに
制限されないことは当業者によって明らかであろう。

【００６２】（ａ）−（ｂ）の工程は、ポリクローナル
抗体に関して記述した方法とほぼ同様の方法によって行
うことができる。

【００６３】（ｃ）の工程における抗体産生細胞はリン
パ球であり、これは一般には脾臓、胸腺、リンパ節、末
梢血液又はこれらの組み合わせから得ることができるが
脾細胞が最も一般的に用いられる。従って、最終免疫
後、抗体産生が確認されたマウスより抗体産生細胞が存
在する部位、例えば脾臓を摘出し、脾細胞を調製する。

【００６４】（ｄ）の工程に用いることのできるミエロ
ーマ細胞としては、例えば、Ｂａｌｂ／ｃマウス由来骨
髄腫細胞株のＰ３／Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）（Ｎａｔ
ｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５））、Ｐ３
／Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）（Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｔｏｐｉｃｓ．ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎ
ｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８１， １−７（１９８
７））、Ｐ３／ＮＳＩ−１−Ａｇ ４−１（ＮＳ−１）
（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１−５１９
（１９７６））、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（Ｓｐ２／０）
（Ｎａｔｕｒｅ， ２７６，２６９−２７０（１９７
８））、ＦＯ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．Ｍｅｔｈ．，３５，
１−２１（１９８０））、ＭＰＣ−１１、Ｘ６３．６
５３、Ｓ１９４等の骨髄腫株化細胞、あるいはラット由
来の２１０．ＲＣＹ３．Ａｇ １．２．３．（Ｙ３）
（Ｎａｔｕｒｅ， ２７７，１３１−１３３，（１９７
９））等を使用できる。

【００６５】上述したミエローマ細胞をウシ胎児血清を
含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）又はイス
コフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）で継代培養し、融
合当日に約１×１０⁶以上の細胞数を確保する。

【００６６】（ｅ）の工程の細胞融合は公知の方法、例
えばミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）らの方法（Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，７３，３
（１９８１））等に準じて行うことができる。現在最も
一般的に行われているのはポリエチレングリコール（Ｐ
ＥＧ）を用いる方法である。ＰＥＧ法については、例え
ば、細胞組織化学、山下修二ら（上述）に記載されてい
る。別の融合方法としては、電気処理（電気融合）によ
る方法を採用することもできる（大河内悦子ら、実験医
学 ５．１３１５−１９、１９８７）。その他の方法を
適宜採用することもできる。また、細胞の使用比率も公
知の方法と同様でよく、例えばミエローマ細胞に対して
脾細胞を３倍から１０倍程度用いればよい。

【００６７】脾細胞とミエローマ細胞とが融合し、抗体
分泌能及び増殖能を獲得したハイブリドーマ群の選択
は、例えば、ミエローマ細胞株としてヒポキサンチング
アニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損株を使用
した場合、例えば上述のＤＭＥＭやＩＭＤＭにヒポキサ
ンチン・アミノプテリン・チミジンを添加して調製した
ＨＡＴ培地の使用により行うことができる。

【００６８】（ｆ）の工程では、選択されたハイブリド
ーマ群を含む培養上清の一部をとり、例えば後述するＥ
ＬＩＳＡ法により、フタル酸エステル類に対する抗体活
性を測定する。

【００６９】さらに、測定によりフタル酸エステル類に
反応する抗体を産生することが判明したハイブリドーマ
の細胞クローニングを行う。この細胞クローニング法と
しては、限界希釈により１ウェルに１個のハイブリドー
マが含まれるように希釈する方法「限界希釈法」；軟寒
天培地上に撒きコロニーをとる方法；マイクロマニピュ
レーターによって１個の細胞を取り出す方法；セルソー
ターによって１個の細胞を分離する「ソータークローン
法」等が挙げられる。限界希釈法が簡単であり、よく用
いられる。

【００７０】抗体価の認められたウェルについて、例え
ば限界希釈法によりクローニングを１−４回繰り返して
安定して抗体価の得られたものを、抗フタル酸エステル
類モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択
する。ハイブリドーマを培養する培地としては、例え
ば、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭ又はＩＭＤ
Ｍ等が用いられる。ハイブリドーマの培養は、例えば二
酸化炭素濃度５−７％程度及び３７℃（１００％湿度の
恒温器中）で培養するのが好ましい。

【００７１】（ｇ）の工程で抗体を調製するための大量
培養は、フォローファイバー型の培養装置等によって行
われる。又は、同系統のマウス（例えば、上述のＢａｌ
ｂ／ｃ）あるいはＮｕ／Ｎｕマウスの腹腔内でハイブリ
ドーマを増殖させ、腹水液より抗体を調製することも可
能である。

【００７２】これらにより得られた培養上清液あるいは
腹水液を抗フタル酸エステル類モノクローナル抗体とし
て使用することできるが、さらに透析、硫酸アンモニウ
ムによる塩析、ゲル濾過、凍結乾燥等を行い、抗体画分
を集め精製することにより抗フタル酸エステル類モノク
ローナル抗体を得ることができる。さらに、精製が必要
な場合には、イオン交換カラムクロマトグラフィー、ア
フィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグ
ラフィー（ＨＰＬＣ）などの慣用されている方法を組合
わせることにより実施できる。

【００７３】以上のようにして得られた抗フタル酸エス
テル類モノクローナル抗体は、例えばＥＬＩＳＡ法など
の公知の方法を使用して、サブクラス、抗体価等を決定
することができる。

【００７４】抗体によるフタル酸エステル類の測定 本発明で使用する抗体によるフタル酸エステル類の測定
法としては、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、
ＥＬＩＳＡ法（Ｅｎｇｖａｌｌ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７０，４１９−４３９（１
９８０））、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、凝
集法、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）等の一
般に抗原の検出に使用されている種々の方法（「ハイブ
リドーマ法とモノクローナル抗体」、株式会社Ｒ＆Ｄプ
ラニング発行、第３０頁−第５３頁、昭和５７年３月５
日）が挙げられる。感度、簡便性等の観点からＥＬＩＳ
Ａ法が汎用されている。

【００７５】フタル酸エステル類の測定は、各種ＥＬＩ
ＳＡ法のうち例えば間接競合ＥＬＩＳＡ法により、以下
のような手順により行うことができる。

【００７６】（ａ）まず、固相化用抗原であるフタル酸
エステル類ハプテンと高分子化合物との結合体を担体に
固相化する。

【００７７】（ｂ）固相化用抗原が吸着していない固相
表面を抗原と無関係な物質、例えばタンパク質によりブ
ロッキングする。

【００７８】（ｃ）これに各種濃度のフタル酸エステル
類を含む試料及び抗体を加え、該抗体を前記固相化抗原
及びフタル酸エステル類に競合的に反応させて、固相化
抗原−抗体複合体及び、フタル酸エステル類−抗体複合
体を生成させる。

【００７９】（ｄ）固相化抗原−抗体複合体の量を測定
することにより、予め作成した検量線から試料中のフタ
ル酸エステル類の量を決定することができる。

【００８０】（ａ）工程において、固相化用抗原を固相
化する担体としては、特別な制限はなく、ＥＬＩＳＡ法
において常用されるものをいずれも使用することができ
る。例えば、ポリスチレン製の９６ウェルのマイクロタ
イタープレートが挙げられる。

【００８１】固相化用抗原を担体に固相化させるには、
例えば、固相化用抗原を含む緩衝液を担体上に載せ、イ
ンキュベーションすればよい。緩衝液としては公知のも
のが使用でき、例えば、リン酸緩衝液を挙げることがで
きる。緩衝液中の抗原の濃度は広い範囲から選択できる
が、通常０．０１μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌ程
度、好ましくは０．０５μｇ／ｍｌから５μｇ／ｍｌが
適している。また、担体として９６ウェルのマイクロタ
イタープレートを使用する場合には、３００μｌ／ウェ
ル以下で２０μｌ／ウェルから１５０μｌ／ウェル程度
が望ましい。更に、インキュベーションの条件にも特に
制限はないが、通常４℃程度で一晩インキュベーション
が適している。

【００８２】なお、担体に固相化させる抗原としては、
抗体を作製したフタル酸エステル類ハプテンと高分子化
合物との結合体自体のみならず、式（１）で表される他
のハプテンと高分子化合物との結合体を固相化抗原とし
て使用することも可能である。例えば、式（１）におい
てＲ¹、Ｒ²又はｎが抗体作製用と相違する化合物を、固
相化抗原として使用することもできる。さらに、式
（１）に含まれない他のフタル酸エステル類類似化合物
を固相化抗原として使用することも可能である。

【００８３】（ｂ）工程のブロッキングは、抗原（フタ
ル酸エステル類ハプテンと高分子化合物との結合体）を
固相化した担体において、フタル酸エステル類ハプテン
部分以外に後で添加する抗体が吸着され得る部分が存在
する場合があり、もっぱらそれを防ぐ目的で行われる。
ブロッキング剤として、例えば、ＢＳＡやスキムミルク
溶液を使用できる。あるいは、ブロックエース（「Ｂｌ
ｏｃｋ‐Ａｃｅ」、雪印乳業社製、コードＮｏ．ＵＫ−
２５Ｂ）等のブロッキング剤として市販されているもの
を使用することもできる。具体的には、限定されるわけ
ではないが、例えば抗原を固相化した部分にブロッキン
グ剤を含む緩衝液［例えば、１％ＢＳＡと６０ｍＭ Ｎ
ａＣｌを添加した８５ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．
０）］を適量加え、約４℃で、１時間ないし５時間イン
キュベーションした後、洗浄液で洗浄することにより行
われる。洗浄液としては特に制限はないが、例えば、Ｐ
ＢＳを用いることができる。

【００８４】次いで（ｃ）工程において、フタル酸エス
テル類を含む試料と抗体を固相化抗原と接触させ、抗体
を固相化抗原及びフタル酸エステル類と反応させること
により、固相化抗原−抗体複合体及びフタル酸エステル
類−抗体複合体が生成する。

【００８５】この際、抗体としては、第一抗体として本
願発明のフタル酸エステル類に対する抗体を加え、更に
第二抗体として標識酵素を結合した第一抗体に対する抗
体を順次加えて反応させる。

【００８６】第一抗体は緩衝液に溶解して添加する。限
定されるわけではないが、反応は、１０℃から４０℃、
好ましくは約２５℃で約１時間行えばよい。反応終了
後、緩衝液で担体を洗浄し、固相化抗原に結合しなかっ
た第一抗体を除去する。洗浄液としては、例えば、ＰＢ
Ｓを用いることができる。

【００８７】次いで第二抗体を添加する。例えば第一抗
体としてマウスモノクローナル抗体を用いる場合、酵素
（例えば、ペルオキシダーゼ又はアルカリホスファター
ゼ等）を結合したマウス抗体に対する抗体を用いるのが
適当である。担体に結合した第一抗体に好ましくは最終
吸光度が４以下、より好ましくは０．５−３．０となる
ように希釈した第二抗体を反応させるのが望ましい。希
釈には緩衝液を用いる。限定されるわけではないが、反
応は室温で約１時間行い、反応後、緩衝液で洗浄する。
以上の反応により、第二抗体が第一抗体に結合する。ま
た、標識した第一抗体を用いてもよく、その場合、第二
抗体は不要である。

【００８８】次いで（ｄ）工程において担体に結合した
第二抗体の標識物質と反応する発色基質溶液を加え、吸
光度を測定することによって検量線からフタル酸エステ
ル類の量を算出することができる。

【００８９】第二抗体に結合する酵素としてペルオキシ
ダーゼを使用する場合には、例えば、過酸化水素、並び
に３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン又はｏ
−フェニレンジアミン（以下、「ＯＰＤ」と言う）を含
む発色基質溶液を使用することができる。限定されるわ
けではないが、発色基質溶液を加え室温で約１０分間反
応させた後、１Ｎの硫酸を加えることにより酵素反応を
停止させる。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジ
ジンを使用する場合、４５０ｎｍの吸光度を測定する。
ＯＰＤを使用する場合、４９２ｎｍの吸光度を測定す
る。一方、第二抗体に結合する酵素としてアルカリホス
ファターゼを使用する場合には、例えばｐ−ニトロフェ
ニルリン酸を基質として発色させ、２ＮのＮａＯＨ溶液
を加えて酵素反応を止め、４１５ｎｍでの吸光度を測定
する方法が適している。

【００９０】フタル酸エステル類を添加しない反応溶液
の吸光度に対して、それらを添加して抗体と反応させた
溶液の吸光度の減少率を阻害率として計算する。既知の
濃度のフタル酸エステル類を添加した反応液の阻害率に
より予め作成しておいた検量線を用いて、試料中のフタ
ル酸エステル類の濃度を算出できる。

【００９１】あるいはフタル酸エステル類の測定は、例
えば以下に述べるような本発明のモノクローナル抗体を
用いた直接競合ＥＬＩＳＡ法によって行うこともでき
る。

【００９２】（ａ）まず、本発明のモノクローナル抗体
を、担体に固相化する。 （ｂ）抗体が固相化されていない担体表面を抗原と無関
係な物質、例えばタンパク質により、ブロッキングす
る。

【００９３】（ｃ）上記工程とは別に、各種濃度のフタ
ル酸エステル類を含む試料に、フタル酸エステル類ハプ
テンと酵素を結合させた酵素結合ハプテンを加えた混合
物を調製する。

【００９４】（ｄ）上記混合物を上記抗体固相化担体と
反応させる。 （ｅ）固相化抗体−酵素結合ハプテン複合体の量を測定
することにより、あらかじめ作成した検量線から試料中
のフタル酸エステル類の量を決定する。

【００９５】（ａ）工程においてモノクローナル抗体を
固相化する担体としては、特別な制限はなくＥＬＩＳＡ
法において常用されるものを用いることができ、例えば
９６ウェルのマイクロタイタープレートが挙げられる。
モノクローナル抗体の固相化は、例えばモノクローナル
抗体を含む緩衝液を担体上にのせ、インキュベートする
ことによって行える。緩衝液の組成・濃度は前述の間接
競合ＥＬＩＳＡ法と同様のものを採用できる。

【００９６】（ｂ）工程のブロッキングは、抗体を固相
化した担体において、後に添加する試料中のフタル酸エ
ステル類並びに酵素結合ハプテンが、抗原抗体反応とは
無関係に吸着される部分が存在する場合があるので、そ
れを防ぐ目的で行う。ブロッキング剤及びその方法は、
前述の間接競合ＥＬＩＳＡ法と同様のものを使用でき
る。

【００９７】（ｃ）工程において用いる酵素結合ハプテ
ンの調製は、フタル酸エステル類ハプテンを酵素に結合
する方法であれば特に制限なく、いかなる方法で行って
もよい。例えば、前述した活性化エステル法を採用する
ことができる。調製した酵素結合ハプテンは、フタル酸
エステル類を含む試料と混合する。

【００９８】なお、酵素等の標識物質に結合させるハプ
テンとしては、間接競合ＥＬＩＳＡ法における固相化抗
原の場合と同様に、抗体作製に使用したフタル酸エステ
ル類ハプテン自体のみならず、式（１）で表される他の
ハプテンと高分子化合物との結合体を標識用抗原として
使用することも可能である。例えば、式（１）において
Ｒ¹、Ｒ²又はｎが抗体作製用と相違する化合物を、標識
用抗原として使用することもできる。さらに、式（１）
に含まれない他のフタル酸エステル類類似化合物も、標
識用抗原として使用可能である。

【００９９】（ｄ）工程においてフタル酸エステル類を
含む試料及び酵素結合ハプテンを抗体固相化担体に接触
させ、フタル酸エステル類と酵素結合ハプテンとの競合
阻害反応により、これらと固相化抗体との複合体が生成
する。フタル酸エステル類を含む試料は適当な緩衝液で
希釈して使用する。限定されるわけではないが、反応は
例えば、室温でおよそ１時間行う。反応終了後、緩衝液
で担体を洗浄し、固相化抗体と結合しなかった酵素結合
ハプテンを除去する。洗浄液は例えばＰＢＳを使用する
ことができる。

【０１００】さらに、（ｅ）工程において酵素結合ハプ
テンの酵素に反応する発色基質溶液を前述の間接競合Ｅ
ＬＩＳＡ法と同様に加え、吸光度を測定することにより
検量線からフタル酸エステル類の量を算出することがで
きる。

【０１０１】本発明のモノクロ−ナル抗体ＤＢＰ３−４
２は、直接競合ＥＬＩＳＡ法で０．０１μｇ／ｍｌない
し５．０μｇ／ｍｌ、好ましくは約０．０１μｇ／ｍｌ
ないないし１．０μｇ／ｍｌの濃度範囲でフタル酸ジブ
チルと反応する（実施例８及び図１）。また、モノクロ
−ナル抗体ＤＢＰ３−４２は、０．１μｇ／ｍｌないし
１００μｇ／ｍｌ、好ましくは０．１μｇ／ｍｌないし
１０μｇ／ｍｌの濃度範囲でフタル酸ベンジルブチル、
フタル酸ジイソブチルと反応する（実施例９及び図
２）。

【０１０２】さらに前述したように直接競合ＥＬＩＳＡ
法において抗体作製用と異なるハプテンを標識用抗原と
して使用でき、その組み合わせによって直接競合ＥＬＩ
ＳＡ法において固有の反応性を示す。

【０１０３】本発明の抗体の交差反応性 上述した直接競合ＥＬＩＳＡ法又は間接競合ＥＬＩＳＡ
法により、本発明のモノクローナル抗体の交差反応性を
調べることができる。例えば、モノクローナル抗体ＤＢ
Ｐ３−４２は他の類似化合物のフタル酸ベンジルブチル
に約９％、フタル酸ジイソブチルに約６．５％の交差反
応性を有し、フタル酸ジエチルヘキシルに反応性を示さ
ない（実施例９、図２）。以下、実施例によって本発明
を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を
制限するためのものではない。当業者は本明細書の記載
に基づいて容易に本発明に修飾、変更を加えることがで
き、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。

【０１０４】

【実施例】実施例１ フタル酸ジブチルハプテンの合成

【０１０５】

【化１０】

【０１０６】４−アミノフタル酸ジｎ−ブチル （２）
の合成 無水４−ニトロフタル酸３．０ｇ（１５ｍｍｏｌ）と１
−ブタノール２．４ｇ（３３ｍｍｏｌ）の混合物を環流
下に３時間撹拌した。反応混合物にトルエン５０ｍｌと
２滴の硫酸を加えた後、ディーンスタークで水を取り除
きながら３時間環流した。有機層を水、５％ ＮａＯＨ
水溶液、水の順に洗い、無水硫酸マグネシウムで乾燥
後、濃縮した。残渣（１）を５０ｍｌのエタノールに溶
解し、この溶液に１０％パラジウム炭素５０ｍｇを加
え、反応が集結するまで水素ガスを吹き込んだ。反応混
合物を濾過、濾液を濃縮し４．０ｇ（粗収率９６％）の
（２）を得た。

【０１０７】３’，４’−ビス（ｎ−ブトキシカルボニ
ル）グルタルアニリド酸（３）の合成 ピリジン２５ｍｌ中の４−アミノフタル酸ジｎ−ブチル
（２）１．２ｇ（４ｍｍｏｌ）と無水グルタル酸０．５
０ｇ（４．４ｍｍｏｌ）の混合物を環流下で４時間撹拌
した。反応混合物を濃縮し、残渣に３０ｍｌの水を加
え、３０ｍｌの酢酸エチルで３回抽出した。酢酸エチル
層を水洗後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮し
た。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサ
ン：酢酸エチル＝１：１→０：１）で精製し１．５ｇ
（収率９４％）の（３）を得た。

【０１０８】上記フタル酸ジブチルハプテン（３）の¹
Ｈ−ＮＭＲによる物性データ（ケミカルシフトδ）を以
下に示す。

【０１０９】

【表１】¹Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−Ｄ₆，４００ＭＨｚ）
δ ０．９２（６Ｈ，ｔ，２ＣＨ₃）， １．３７（４Ｈ，
ｍ，２ＣＨ₂），１．６３（４Ｈ，ｍ，２ＣＨ₂），
１．８２（２Ｈ，ｍ，ＣＨ₂），２．２９（２Ｈ，ｔ，
ＣＨ₂）， ２．４１（２Ｈ，ｔ，ＣＨ₂），４．２１
（４Ｈ，ｍ，２ＣＨ₂）， ７．７７（２Ｈ，ｍ，２Ａ
ｒ：Ｈ），７．９４（１Ｈ，ｄ，Ａｒ：Ｈ），１０．３
６（１Ｈ，ｓ，ＮＨ），１２．０９（１Ｈ，ｓ，ＣＯＯ
Ｈ）実施例２ 免疫用抗原の作製 免疫用抗原としてフタル酸ジブチルハプテンとＫＬＨと
の結合体を以下のように混合酸無水物法により作製し
た。

【０１１０】実施例１で作製したフタル酸ジブチルハプ
テンの７ｍｇを無水ジオキサン０．７ｍｌに溶解し、１
０−１２℃に冷却した後、トリ−Ｎ−ブチルアミン４μ
ｌおよびクロロ蟻酸イソブチル２４μｌを添加し、１０
℃ないし１２℃にて３０分間撹拌した（以下これを「Ａ
液」という）。

【０１１１】一方、蒸留水１ｍｌにＫＬＨを２０ｍｇ溶
解し、０．５％ＮａＨＣＯ₃ ｐＨ９．４を外液として
一晩透析した。透析後３０００ｒｐｍ、３０分間遠心し
得られた上清１．５ｍｌにＡ液をゆっくり添加した。４
℃にて２時間反応させた後、スパーテル１杯のグリシン
を添加してさらに４℃にて３０分間撹拌することにより
反応を終了させた。この反応液を１４５ｍＭ ＮａＣｌ
−１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で１週間透析して
得たフタル酸ジブチルハプテンとＫＬＨとの結合体（以
下、「フタル酸ジブチルハプテン／ ＫＬＨ」と言う）
を免疫用抗原として用いた。

【０１１２】実施例３ スクリーニング用抗原の作製 実施例２と同様の方法を用いて、フタル酸ジブチルハプ
テンとＢＳＡとの結合体（以下、「フタル酸ジブチルハ
プテン／ＢＳＡ」と言う）を作製し、スクリーニング用
抗原として用いた。

【０１１３】実施例４ 免疫感作 実施例２で作製した免疫用抗原（フタル酸ジブチルハプ
テン／ＫＬＨ）１００μｇをＰＢＳ１００μｌに溶解
し、等量のフロイント完全アジュバントと混合した後、
Ｂａｌｂ／ｃマウスに接種した。初回免疫後１４日目、
３１日目、５８日目、７９日目にフロイント不完全アジ
ュバントを用いて前記と同様に調製した免疫用抗原を、
マウスに追加免疫した。また、１１５日後にはＰＢＳに
溶解した免疫抗原をマウスに追加免疫した。１２２日後
に、免疫したマウスの尾静脈より採血を行い、血清を分
離しこれを抗血清とした。

【０１１４】実施例５ 抗血清のフタル酸ジブチルに対
する反応性 実施例３で調製したスクリーニング用抗原（フタル酸ジ
ブチルハプテン／ＢＳＡ）を用いた間接競合ＥＬＩＳＡ
法により、実施例４で調製した抗血清のフタル酸ジブチ
ルに対する反応性を調べた。

【０１１５】まず、実施例３で調製したフタル酸ジブチ
ルハプテン／ＢＳＡの溶液（５μｇ／ｍｌ）を１００μ
ｌ／ウェルにて９６ウェルプレートにコーティングし
た。洗浄の後、４倍に希釈したブロックエース（「Ｂｌ
ｏｃｋ Ａｃｅ」：大日本製薬、コードＮｏ．ＵＫ−２
５Ｂ）でブロッキングした後、抗血清の１０００倍希釈
液と各種濃度のフタル酸ジブチルあるいはその類似化合
物を含む１０％メタノ−ル溶液とを等量混合し、その１
００μｌを各ウェルに入れ、３７℃にて１時間反応させ
た。

【０１１６】０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳにて１
回洗浄の後、ＰＢＳを用いて５０００倍希釈したペルオ
キシダ−ゼ結合抗マウスＩｇＧヤギ抗体（Ｃａｐｐｅｌ
社製）を１００μｌずつ各ウェルに添加し、３７℃にて
１時間反応させた。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢ
Ｓにて２回洗浄した後、０．４ｍｇ／ｍｌのＯＰＤ、及
び０．０４％過酸化水素を含む０．０５Ｍリン酸クエン
酸緩衝液（ｐＨ４．５）を１００μｌずつ各ウェルにい
れ室温にて２０分間放置し、発色させた。次いで、２Ｎ
硫酸１００μｌを各ウェルに加え、反応を停止させた
後、４９０ｎｍの吸光度を測定した。

【０１１７】実施例６ ハイブリド−マ細胞の作製 実施例４に続き、血清中の抗フタル酸ジブチル抗体の活
性が高くなったマウスの脾臓細胞と、マウスミエロ−マ
細胞（Ｐ３Ｕ１）とを電気融合法にて細胞融合をおこな
った。細胞増殖が認められた培養上清液について、以下
の方法でフタル酸ジブチルに対する抗体活性を調べた。

【０１１８】フタル酸ジブチルハプテン／ＢＳＡの溶液
（５μｇ／ｍｌ）を５０μｌ／ウェルにて９６ウェルプ
レートにコーティングした。洗浄の後、４倍に希釈した
ブロックエースでブロッキングした後、培養上清液と各
種濃度のフタル酸ジブチルあるいはその類似化合物を含
む１０％メタノ−ル溶液とを等量混合し、その１００μ
ｌをウェルに入れ、３７℃にて１時間反応させた。

【０１１９】０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳにて１
回洗浄の後、ＰＢＳを用いて、５０００倍希釈したペル
オキシダ−ゼ結合抗マウスＩｇＧヤギ抗体（Ｃａｐｐｅ
ｌ社製）を５０μｌずつ各ウェルにて３７℃１時間反応
させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳにて２回洗
浄の後、０．４ｍｇ／ｍｌのＯＰＤ及び０．０４％過酸
化水素を含む０．０５Ｍリン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ
４．５）を１００μｌずつ各ウェルにいれ室温にて２０
分間放置し、発色させた。

【０１２０】次いで、２Ｎ硫酸１００μｌを各ウェルに
加え、反応を停止させた後、４９０ｎｍの吸光度を測定
し、特異性のある抗体活性が認められたものを選抜し
た。次に、選抜されたウェルの細胞について限界希釈法
を用いた細胞クロ−ニングをおこなった。その結果、数
株のハイブリドーマが抗フタル酸ジブチル抗体を産生す
るハイブリド−マ細胞としてクロ−ン化された。そのう
ちのＤＢＰ３−４２を平成１２年２月２２日に寄託番号
ＦＥＲＭ Ｐ−１７７３９として工業技術院生命工学工
業研究所（〒３０５−００４６ 茨城県つくば市東１丁
目１番３号）に寄託した。

【０１２１】実施例７ フタル酸ジブチルハプテンとＨ
ＲＰとの結合体の作製 実施例２と同様の方法を用いて、フタル酸ジブチルハプ
テンとＨＲＰとの結合体（以下、「フタル酸ジブチルハ
プテン／ＨＲＰ」と言う）を作製した。

【０１２２】１ｍｇのフタル酸ジブチルハプテンを無水
ジオキサン０．２ｍｌに溶解した後、トリ−Ｎ−ブチル
アミン０．５μｌ、クロロ蟻酸イソブチル０．３μｌを
添加し、１０−１２℃にて３０分間撹拌した。（以下、
これを「Ｂ液」とする）。一方、０．５％ＮａＨＣＯ₃
をＮａＯＨでｐＨ９．４に調整した溶液１ｍｌにＨＲＰ
５ｍｇを溶解し、Ｂ液をこの中に滴下した。４℃にて２
時間撹拌し、さらにグリシンを添加して３０分間撹拌す
ることにより反応を終了させた。反応物をＰＢＳにて透
析することにより、フタル酸ジブチルハプテンとＨＲＰ
との結合体（以下、「フタル酸ジブチルハプテン／ＨＲ
Ｐ」と言う）を得た。

【０１２３】実施例８ 直接競合ＥＬＩＳＡ法によるフ
タル酸ジブチルの測定 実施例６で得られたハイブリド−マ細胞（ＤＢＰ３−４
２）をマウスの腹腔に移植し、１０−１５日後に得られ
た腹水を採取し、硫安分画法によりモノクロ−ナル抗体
を精製した。（以降、モノクローナル抗体は、これらを
産生するハイブリドーマと同一の名称を用いる。）この
モノクローナル抗体ＤＢＰ３−４２を用いて直接競合Ｅ
ＬＩＳＡ法にてフタル酸ジブチルを測定した。

【０１２４】上記のＤＢＰ３−４２抗体溶液（２μｇ／
ｍｌ）を１００μｌ／ウェルで９６ウェルプレ−トに加
え、４℃で一晩静置し、翌日４倍希釈したブロックエ−
スでブロッキングし、アッセイ用のプレートを作製し
た。各種濃度のフタル酸ジブチルを含む１０％メタノー
ル溶液と、実施例７で作製したフタル酸ジブチルハプテ
ン／ＨＲＰを適度に希釈したＰＢＳ溶液との等量混合液
を５０μｌずつ各ウェルに入れ、３７℃で１時間反応さ
せた。

【０１２５】反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢ
Ｓにて２回洗浄した後、０．４ｍｇ／ｍｌのＯＰＤ及び
０．０４％過酸化水素を含む０．０５Ｍリン酸クエン酸
緩衝液（ｐＨ４．５）を１００μｌずつ各ウェルにい
れ、室温にて２０分間放置し、発色させた。

【０１２６】次に、２Ｎ硫酸を１００μｌずつ各ウェル
に加え、発色反応を停止させた後、４９０ｎｍの吸光度
を測定した。この結果を図１に示す。直接競合ＥＬＩＳ
Ａ法において、本発明のモノクローナル抗体ＤＢＰ３−
４２は、フタル酸ジブチルを０．０１μｇ／ｍｌないし
５μｇ／ｍｌの濃度範囲で測定することができた。

【０１２７】実施例９ モノクロ−ナル抗体の交差反応
性 ハイブリド−マＤＢＰ３−４２の産生するモノクロ−ナ
ル抗体ＤＢＰ３−４２について実施例８と同様の方法を
用いてフタル酸ジブチルおよび他の類似化合物に対する
交差反応性を調べた。その結果を図２に示す。

【０１２８】モノクローナル抗体ＤＢＰ３−４２は類似
化合物のフタル酸ベンジルブチルに約９％、フタル酸ジ
イソブチルに約６．５％の交差反応率を示したが、フタ
ル酸ジエチルヘキシルに対しては反応性を示さなかっ
た。ここで、交差反応率は次式で定義される。

【０１２９】

【化１１】交差反応率（％）＝（フタル酸ジブチルのＩ
Ｃ₅₀／対象化合物のＩＣ₅₀）×１００ また、ＩＣ₅₀（μｇ／ｍｌ）は、フタル酸ジブチル等の
化合物を添加しない反応溶液の吸光度に対して吸光度を
５０％減少させる反応溶液中の対象化合物の濃度を示
す。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明のモノクロ−ナル抗体ＤＢＰ３
−４２の直接競合ＥＬＩＳＡ法によるフタル酸ジブチル
の測定を示す。

【図２】図２はモノクロ−ナル抗体ＤＢＰ３−４２を用
いた直接競合ＥＬＩＳＡ法によるフタル酸ジブチルおよ
び他の類似化合物の測定を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/577 (Ｃ１２Ｐ 21/08 //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者 渡辺 和明 東京都港区浜松町１丁目27番14号 株式会 社環境免疫技術研究所内 (72)発明者 香川 康浩 東京都港区浜松町１丁目27番14号 株式会 社環境免疫技術研究所内 Ｆターム(参考） 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA16 4B065 AA92X AB05 BA08 CA25 CA44 CA54 4H006 AA01 AB20 BJ50 BS10 BT32 BV25 4H045 AA11 AA20 AA30 BA10 CA42 DA76 DA86 EA50 FA72

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の式（１）： 【化１】 ［式（１）中、 Ｒ¹およびＲ²は枝分かれしていてもよい炭素数１−１３
   のアルキル基、又はシクロヘキシル基若しくはベンジル
   基であり；そしてｎは１−１０の整数である］で表され
   る構造を有する化合物。
2. 【請求項２】式（１）中、Ｒ¹及びＲ²がブチル基である
   請求項１に記載の化合物。
3. 【請求項３】式（１）中、ｎが３である請求項１又は２
   に記載の化合物。
4. 【請求項４】請求項１ないし３に記載された化合物と高
   分子化合物又は標識物質との結合体。
5. 【請求項５】請求項１ないし３に記載の化合物と高分子
   化合物を結合させることにより抗原を作製し、当該抗原
   を用いることにより、以下の式（２）： 【化２】 ［式（２）中、 Ｒ¹およびＲ²は枝分かれしていてもよい炭素数１−１３
   のアルキル基、又はシクロヘキシル基若しくはベンジル
   基である］で表される構造を有する化合物に反応性を示
   す抗体を製造することを特徴とする、式（２）で表され
   る化合物に反応性を示す抗体又はそのフラグメントの製
   造方法。
6. 【請求項６】請求項４に記載の結合体を抗原として用い
   ることにより製造された、式（２）で表される化合物に
   反応性を示す抗体又はそのフラグメント。
7. 【請求項７】モノクローナル抗体である、請求項６に記
   載の抗体又はフラグメント。
8. 【請求項８】寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７７３９で寄託
   されているハイブリドーマから産生されるモノクローナ
   ル抗体ＤＢＰ３−４２である、請求項６若しくは７に記
   載の抗体又はフラグメント。
9. 【請求項９】請求項６ないし９のいずれか１項に記載の
   抗体を産生するハイブリドーマ。
10. 【請求項１０】寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７７３９で寄
    託されている請求項９に記載のハイブリドーマ。
11. 【請求項１１】請求項６ないし９のいずれか１項に記載
    の抗体又はフラグメントを用いることを特徴とする、式
    （２）で表される化合物の免疫化学的測定方法。
12. 【請求項１２】さらに、請求項１ないし３のいずれか１
    項に記載の化合物又は請求項４に記載の結合体を用いる
    ことを含む、請求項１１に記載の免疫化学的測定方法。