CN108033890A - 一种酞酸酯类环境激素通用结构半抗原的设计方法及应用 - Google Patents

一种酞酸酯类环境激素通用结构半抗原的设计方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于环境污染检测技术领域，涉及一种酞酸酯类环境激素通用结构半抗原的设计方法和应用，包括下述步骤：(1)综合利用Avogadro和Gaussian 09等分子模拟软件，对6种酞酸酯类环境激素和5种半抗原分子的几何结构，电荷分布和分子疏水表面情况进行模拟，对结果进行综合评价，筛选出最佳免疫半抗原(hapten 1)和包被半抗原(hapten 5)；(2)利用重氮化法将hapten 1与牛血清白蛋白偶联合成免疫原；(3)利用活性酯法将hapten 5与卵清蛋白偶联合成包被原；(4)多克隆抗体的制备及抗体特性测定。本发明成功运用分子模拟技术设计了酞酸酯类通用半抗原，并通过动物免疫实验进行验证，证明本发明方法可以大大提高半抗原的研发效率，节约时间和资金消耗，具有很好的预测能力，可为其他小分子半抗原的设计提供借鉴。

Description

一种酞酸酯类环境激素通用结构半抗原的设计方法及应用
技术领域
本发明属于环境污染物检测技术领域，具体涉及一种酞酸酯类环境激素通用半抗原的设计方法和应用。
背景技术
酞酸酯(Phthalic Acid Esters,PAEs)类化合物是塑料生产中最常用的一类塑化剂，占增塑剂市场份额的88％，大约包含30种化合物，主要用于生产医疗制品、塑料玩具、化妆品、食品包装、农用地膜等，由于酞酸酯与产品基质间为非共价结合，致使其在生产、加工和使用过程中不断向环境中释放，已成为全球性的最普遍的一类环境污染物。毒理学研究表明：酞酸酯是一类内分泌干扰物，具有雌激素效应，并表现出一定的生物累积性，是一种具有生殖毒性和发育毒性的环境雌激素，并与肥胖症和糖尿病的发生有关。美国国家环保局将酞酸二甲酯(DMP)、酞酸二乙酯(DEP)、酞酸二正丁酯(DBP)、酞酸二正辛酯(DOP)、酞酸二异辛酯(DEHP)和酞酸丁基苄酯(BBP)6种PAEs类化合物列为“优先控制污染物”，我国也将DMP、DBP、DOP列入环境优先控制污染物黑名单。卫生部也将16种酞酸酯列入《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂名单(第六批)》。因此，建立酞酸酯类环境激素快速，简便和灵敏的检测技术具有重要的社会意义。
目前，酞酸酯类环境激素的检测多采用仪器分析法，需要昂贵的仪器设备和专业技术人员，对检材要求较高，样品前处理和提纯过程费时费力，不能满足现代检测对方便、快速、准确的要求。酶联免疫检测技术操作简便，对样本要求不高，近年来在酞酸酯检测领域得到广泛应用。但是，现有的免疫分析主要针对单个酞酸酯化合物，而实际检测中常为多个化合物同时被检出，因此实现酞酸酯类塑化剂的多残留检测更具有现实意义。
酶联免疫检测技术基于抗原、抗体之间特异性识别，实现对检测样品中目标物的定性、定量分析，其关键在于制备出高特异性和高灵敏度的抗体，而抗体制备的关键在于半抗原的结构设计。酞酸酯类环境激素多残留检测需要制备出群选性的抗体，其前提就在于设计结构合理的通用型半抗原。半抗原与目标物尽可能相似是半抗原设计的一个主要原则，包括拓扑结构、电荷分布，疏水特性等。传统的半抗原设计大多为“试错法”，需要设计多个半抗原分子，然后根据大量的动物免疫实验效果来进行优化选择，不仅工作量大，周期长，成本高，而且带有很大的经验性和盲目性。
针对这一问题，近年来研究者不断将一些新的设计手段引入到小分子目标物的半抗原设计中，其中尤以运用计算机分子模拟方法取得的成果最为突出。分子模拟技术可以提供丰富的小分子化合物的结构信息，如疏水性、电性、空间特性等，为深入了解半抗原的机构信息提供了强有力的工具，为建立基于“信息含量丰富”的半抗原设计提供了可能。目前经检索未发现有关于基于计算机模拟技术的酞酸酯类环境激素的通用半抗原设计的报道。
发明内容
本发明针对现有酞酸酯类环境激素半抗原设计中针对性和预见性差、工作量大、制备周期长的缺点，提供一种基于计算机模拟技术的酞酸酯类环境激素通用半抗原的设计方法，从而理论指导半抗原结构设计和筛选，提高半抗原制备工作效率。
技术方案：针对上述问题，本发明公开了一种基于计算机模拟的酞酸酯类环境激素通用半抗原的设计方法，根据6种酞酸酯类环境激素目标检测物的共同分子结构(苯环和双侧链)，设计了5种半抗原。
6种酞酸酯类环境激素的分子结构式为：
5种半抗原的分子结构式为：
所述的基于计算机分子模拟技术的酞酸酯类环境激素通用半抗原设计和应用的具体操作步骤为：
(1)计算机模拟筛选最佳的免疫半抗原和包被半抗原：6种酞酸酯类环境激素和5种半抗原的分子结构、电荷分布、分子表面疏水情况的计算模拟，通过对比11个分子的几何结构、电荷分布和分子表面疏水情况，综合评价后选择合适的免疫半抗原和包被半抗原。
(2)免疫原制备：Hapten 1含有氨基功能基团，以牛血清白蛋白(BSA)为载体蛋白，采用重氮化法合成免疫原：称取0.07mmol的Hapten 1，用0.1mol/L的稀盐酸充分溶解，在0-4℃预冷30min；然后逐滴加入现配好的0.2mol/L NaNO2溶液，用淀粉碘化钾试纸检测NaNO2用量，直到试纸在15秒内变蓝为止，冰浴下搅拌反应1h，得到A液；
称取0.0007mmol的牛血清白蛋白，溶于6mL碳酸盐缓冲液(0.05M，pH9.6)中，在4℃预冷30min，此为B液；冰浴下，将A液缓慢滴加到B液中，并用1M NaOH溶液调节pH维持在8.5左右，继续反应4h；于PBS缓冲液(0.01mol/L，pH 7.4)中4℃搅拌透析，每天换水3次，共透析3天，鉴定后分装于0.5mL离心管中，-20℃保藏待用。
(3)包被原制备：Hapten 5含有羧基功能基团，以卵清蛋白(OVA)为载体蛋白，采用活性酯法合成包被原：称取0.025mmol的Hapten 5加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，待其完全溶解后加入0.05mmol的碳二亚胺(EDC)和0.05mmol的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温下搅拌反应过夜，得到A液；
称取0.0008mmol的OVA溶解在5mL 0.01mol/L PBS溶液中，为B液；在冰水浴中，将A液缓慢滴加到B液中，磁力搅拌下冰浴中继续反应6h，于PBS缓冲液(0.01mol/L，pH 7.4)中4℃搅拌透析，每天换水3次，共透析3天，鉴定后分装于0.5mL离心管中，-20℃保藏待用。
(4)多克隆抗体的制备：选取4只6-8周龄的雌性Balb/c小鼠，采用快速佐剂进行免疫，首免取适量免疫原与等体积的快速佐剂混合后，注射于小鼠后腿肌肉内进行免疫，间隔21天后同法加强免疫一次；三免后第10天小鼠断尾取血，离心取血清，4℃保藏。
(5)抗体特性测定：采用间接ELISA法测定抗血清效价和抑制率，包被原的包被浓度为0.5μg/mL。
本发明的有益效果：本发明基于计算机分子模拟技术构建目标酞酸酯类环境激素和半抗原的空间构象、电荷分布和分子表面疏水图，通过比较来预测具有最佳免疫效果的免疫半抗原和最佳竞争效果的包被半抗原，以此取代传统半抗原设计所用的试错法，大大减少了盲目性和随机性，提高半抗原设计的研发效率和免疫性能，实现识别酞酸酯类环境激素群选性抗体的制备，具有很好的预测能力，并有助于揭示抗原抗体之间的识别原理。
附图说明
图1不同酞酸酯类环境激素和半抗原分子的优化构型图。
图2不同酞酸酯类环境激素和半抗原分子mulliken原子电荷分布图。
图3合成免疫原hapten1-BSA的紫外鉴定图。
图4合成包被原hapten5-OVA的紫外鉴定图。
图5免疫小鼠三免抗血清效价测定。
具体实施方式
为更好的理解本发明，下面结合具体的实施例来进一步阐明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。
(1)计算机模拟筛选最佳的免疫半抗原和包被半抗原
①使用Avogadro程序构建11个分子的三维结构，对每个小分子进行了构象搜索，选择其能量最低的构型作为结构优化的初始结构；
②使用Avogadro程序对各分子结构进行分子力学几何优化，优化参数为：MMFF94力场，500步的最陡下降法，收敛标准为10-7；11个分子的优化结构如图1所示；
从图1上可以看出，酞酸酯类小分子的共同特征为邻苯二甲酸酯上的邻苯二甲酸基团一侧。由于苯环上的离域共轭效应，特征基团的苯环上6个碳原子位于同一个平面，C-C键之间的距离在单键和双键之间。当酯基链接的不同基团时候，分子的结构也有不同的变化。当链接的是长碳链或者带有支链的基团，则对分子几何构型影响比较大。从结构上看，半抗原Hapten 1的链接臂是6个碳的柔性直链，Hapten 2的链接臂上只有3个碳的长度，Hapten 3缺少了一个酯基，而且一个链接臂上还有支链，相比其他的半抗原小分子，位阻作用会增大，Hapten 4是三个碳长度的链接臂再加上一个羧基，Hapten 5则是在邻苯二甲酸的间位偶连引入链接臂，这种方式会导致活性基团邻苯二甲酸基团被遮蔽，重要的特征官能团不能“暴露”出来从而减少抗体和目标半抗原之间的识别。综合几何结构的相似性，Hapten 1、Hapten 2与Hapten 4与其他6个酞酸酯小分子的结构最相似。
③使用Gaussian 09程序对各分子结构进行量子力学优化，采用半经验的PM3方法对11个分子的结构进行全优化，计算其mulliken电荷；11个分子的原子电荷分布图如图2所示；
从图2上可以看出，酞酸酯分子的特征官能团为邻苯二甲酸基团，因为苯环的共扼作用，极化作用小，环上碳原子的静电荷较小。分子Hapten 5在苯环间位引入链接臂，苯环上的电荷分布发生改变；分子Hapten3只有一个酯基，电荷分布也受链接臂的影响发生了部分的变化；而Hapten 1、Hapten 2与Hapten 4上特征官能团的电荷分布与酞酸酯分子相比基本无变化。
④使用YASARA View软件显示各分子的疏水表面图。分析结果表明，所有的酞酸酯和半抗原分子中只有两个羧酸基团处于亲水区域，其他部分皆为疏水区域。5种半抗原在与载体蛋白偶联后，Hapten 1、Hapten 2和Hapten 4会多出一个亲水区域，且多出的亲水基团分布在靠近羧酸特征基团的地方，可以看做相当于一个亲水区域，因此，Hapten 1、Hapten2和Hapten 4在与载体蛋白偶联后仍具有和酞酸酯分子一样的亲水区域，同时，考虑到Hapten 1的烷基侧链较长，可以更好的暴露酞酸酯的结构特征，故选择Hapten 1为最佳的免疫半抗原。Hapten 3在与载体蛋白偶联后其亲水区域会减少为一个，Hapten 5与载体蛋白偶联后保持两个亲水区域，该部分与酞酸酯各分子一致，故选择Hapten 5作为最佳的包被半抗原。
⑤综合考虑、对比11个分子的几何结构，电荷分布和分子疏水表面情况，选择几何结构、电荷分布和分子疏水表面情况与酞酸酯类分子最接近的半抗原Hapten 1作为免疫半抗原，选择几何结构和电荷分布差异最大而分子疏水表面情况相似的半抗原Hapten 5作为包被半抗原。
(2)免疫原制备
称取Hapten 1(25.5mg，0.07mmol)的，用0.1mol/L的稀盐酸充分溶解，在0-4℃预冷30min；然后逐滴加入现配好的0.2mol/L NaNO2溶液，用淀粉碘化钾试纸检测NaNO2用量，直到试纸在15秒内变蓝为止，冰浴下搅拌反应1h，得到A液；
称取牛血清白蛋白(47.6mg，0.0007mmol)，溶于6mL碳酸盐缓冲液(0.05M，pH9.6)中，在4℃预冷30min，此为B液；冰浴下，将A液缓慢滴加到B液中，并用1M NaOH溶液调节pH维持在8.5左右，继续反应4h；于PBS缓冲液(0.01mol/L，pH 7.4)中4℃搅拌透析，每天换水3次，共透析3天，鉴定后分装于0.5mL离心管中，-20℃保藏待用。
(3)包被原制备
称取Hapten 5(8.8mg，0.025mmol)加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，待其完全溶解后加入EDC(9.9mg，0.05mmol)和NHS(5.8mg，0.05mmol)，室温下搅拌反应过夜，得到A液；
称取OVA(36.7mg，0.0008mmol)溶解在5mL 0.01mol/L PBS溶液中，为B液；在冰水浴中，将A液缓慢滴加到B液中，磁力搅拌下冰浴中继续反应6h，于PBS缓冲液(0.01mol/L，pH7.4)中4℃搅拌透析，每天换水3次，共透析3天，鉴定后分装于0.5mL离心管中，-20℃保藏待用。
(4)多克隆抗体的制备：选取4只6-8周龄的雌性Balb/c小鼠，采用快速佐剂进行免疫，首免取适量免疫原与等体积的快速佐剂混合后，注射于小鼠后腿肌肉内进行免疫，间隔21天后同法加强免疫一次；三免后第10天小鼠断尾取血，离心取血清，4℃保藏。
(5)抗体特性测定：首先采用间接ELISA法测定4只小鼠所获得抗血清效价，包被原的包被浓度为0.5μg/mL，结果如图5所示，抗血清效价均达到16000以上，满足后续制备单克隆抗体要求；采用间接竞争ELISA法测定抗血清的抑制率，将酞酸酯类环境激素标准品用甲醇溶液分别配制成1mg/mL的母液，在测定时再用PBS溶液(0.01M，pH7.4)倍比稀释，加入标准品浓度为0.5μg/mL，检测结果如表1所示，所得抗血清对目标酞酸酯类环境激素抑制效果明显，说明本发明制备的半抗原可以用于后续酞酸酯类环境激素单克隆抗体的制备及免疫检测方法的建立。
表1免疫小鼠所获得抗血清的抑制测定结果

Claims (2)

1.一种酞酸酯类环境激素通用半抗原的设计方法和应用，其特征在于根据6种酞酸酯类环境激素目标检物的共同分子结构(苯环和双侧链)设计5种半抗原，其分子结构式分别为：
(1)计算机模拟筛选最佳的免疫半抗原和包被半抗原：6种酞酸酯类环境激素和5种半抗原的分子结构、电荷分布、分子表面疏水情况的计算模拟，通过对比11个分子的几何结构、电荷分布和分子表面疏水情况选择合适的免疫半抗原和包被半抗原。
(2)免疫原制备：Hapten 1含有氨基功能基团，以牛血清白蛋白为载体蛋白，采用重氮化法合成免疫原：称取0.07mmol的Hapten 1，用0.1mol/L的稀盐酸充分溶解，在0-4℃预冷30min；然后逐滴加入现配好的0.2mol/L NaNO2溶液，用淀粉碘化钾试纸检测NaNO2用量，直到试纸在15秒内变蓝为止，冰浴下搅拌反应1h，得到A液；称取0.0007mmol的牛血清白蛋白，溶于6mL 0.05M，pH9.6的碳酸盐缓冲液中，在4℃预冷30min，此为B液；冰浴下，将A液缓慢滴加到B液中，并用1M NaOH溶液调节pH维持在8.5左右，继续反应4h；于0.01M，pH 7.4的PBS缓冲液中4℃搅拌透析，每天换水3次，共透析3天，鉴定后分装于0.5mL离心管中，-20℃保藏待用。
(3)包被原制备：Hapten 5含有羧基功能基团，以卵清蛋白为载体蛋白，采用活性酯法合成包被原：称取0.025mmol的Hapten 5加入N,N-二甲基甲酰胺中溶解，待其完全溶解后加入0.05mmol的碳二亚胺和0.05mmol的N-羟基琥珀酰亚胺，室温下搅拌反应过夜，得到A液；称取0.0008mmol的卵清蛋白溶解在5mL 0.01M，pH 7.4的PBS溶液中，为B液；在冰水浴中，将A液缓慢滴加到B液中，磁力搅拌下冰浴中继续反应6h，于PBS缓冲液中4℃搅拌透析，每天换水3次，共透析3天，鉴定后分装于0.5mL离心管中，-20℃保藏待用。
(4)多克隆抗体的制备：选取4只6-8周龄的雌性Balb/c小鼠，采用快速佐剂进行免疫，首免取适量免疫原与等体积的快速佐剂混合后，注射于小鼠后腿肌肉内进行免疫，间隔21天后同法加强免疫一次；三免后第10天小鼠断尾取血，离心取血清，4℃保藏。
(5)抗体特性测定：采用间接ELISA法测定抗血清效价和抑制率，包被原的包被浓度为0.5μg/mL。
2.根据权利要求1所述一种酞酸酯类环境激素通用半抗原的设计方法和应用，其特征在于：步骤(1)所述计算机模拟筛选最佳的免疫半抗原和包被半抗原通过以下步骤确定：
①使用Avogadro程序构建6种酞酸酯类环境激素和5种半抗原分子的三维结构，对每个小分子进行了构象搜索，选择其能量最低的构型作为结构优化的初始结构；
②使用Avogadro程序对各分子结构进行分子力学几何优化，优化参数为：MMFF94力场，500步的最陡下降法，收敛标准为10-7；
③使用Gaussian 09程序对各分子结构进行量子力学优化，采用半经验的PM3方法对11个分子的结构进行全优化，计算其mulliken电荷；
④使用YASARA View软件显示各分子的疏水表面图。
⑤根据对各分子几何结构，电荷分布和分子疏水表面情况的模拟结果，进行综合评价，选择几何结构、电荷分布和分子疏水表面情况与酞酸酯类分子最接近的半抗原Hapten 1作为免疫半抗原，选择半抗原Hapten 5作为包被半抗原。
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