JP3422795B2

JP3422795B2 - ホモシステインのイムノアッセイ

Info

Publication number: JP3422795B2
Application number: JP52837295A
Authority: JP
Inventors: バン・アッタ，リュエル・ビー; グッドマン，トーマス・シー; ウルマン，エドウィン・エフ
Original assignee: デイド・ベーリング・マルブルク・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング
Priority date: 1994-04-28
Filing date: 1995-04-27
Publication date: 2003-06-30
Anticipated expiration: 2018-06-30
Also published as: DE69504191T2; EP0757794B1; AU2584495A; ES2133772T3; WO1995030151A1; EP0757794A1; US5478729A; CA2188752A1; DE69504191D1; CA2188752C; JPH09512634A

Description

【発明の詳細な説明】発明の背景発明の分野ホモシステイン（Hcy）は、メチオニンをシステイン
（Cys）に変換するトランススルフレーション（硫黄転
移）経路にて生産される一連の中間体の１つである。哺
乳動物における専らのHcy源は、Ｓ−アデノシル−ホモ
システインの酵素触媒化加水分解産物に由来する。一度
形成されたHcyは、再メチル化およびメチオニンへの変
換を経て再び回路に入るか、またはセリンと化合してシ
スタチオニンを形成することができ、これが、最終的に
Cysに変換される。メチオニンシンターゼによりHcyをメ
チル化する主要な代謝経路は、メチル転移補助因子とし
てビタミンB₁₂（コバラミン）を、最終的なメチル源と
して５−メチル−テトラヒドロ葉酸を必要とする。意外
なことではないが、血清Hcyのレベル上昇は、ビタミンB
₁₂または葉酸の不十分な摂取、またはこれら２種のビタ
ミンを適切に利用する能力の欠乏に関連している。普
通、葉酸を投与することにより、穏やかに上昇したHcy
のレベルを均衡にすることができ、その処置には不都合
な副作用は殆ど無い。

貧血に加えて、シスタチオンシンターゼ欠損遺伝子に
対してヘテロ接合性であり、その結果正常酵素活性の50
％を欠く個体は、特に、メチオニン負荷に続くHcyレベ
ルの上昇の影響を受け易い。この遺伝的素因が、それ以
外は健康な患者における中度ホモシステイン尿症（尿中
にHcyが排出される）の最も普通の原因である。

最後に、穏やかに上昇したHcyのレベルと心臓血管疾
患との間に相互関係があることは明らかである。

このような理由から、正確なHcyアッセイの開発に大
きな興味がもたれている。

関連技術の説明総ホモシステイン（Hcy）量を定量し、並びに遊離
（還元およびジスルフィド）形態とタンパク質結合形態
（主にアルブミン）とを識別する幾つかの技術がある。

ホモシステイン尿症の原因に対する優れた洞察並びに
現今の臨床分析法で更新は、Ueland等、Clin.Chem.39
（９）:1764−1779（1993）において見ることができ
る。

Hcyアッセイの酵素的方法は、Sundrehagen等、PCT/GB
93/00138に記載されており、HcyをＳ−アデノシルホモ
システインへと酵素触媒化変換した後の生成物濃度を測
定することによりHcyを間接的にアッセイするものであ
る。

HcyおよびCysの高速液体クロマトグラフィー（“HPL
C"）法は、当該技術分野では知られている。この分析法
は、クロマトグラフィー支持体への吸着と溶出の差異に
より化合物HcyとCysとを識別するものである。Andersso
n等、Clin.Chem.39（８）:1590−1597（1993）は、遊離
のおよび還元された総HcyおよびCysの測定を記載してい
る。

ガス−クロマトグラフ−質量分析法によるHcyおよびC
ys分析は、Allen等、米国特許第4,940,658号に記載され
ている。Allen等のPCT/US92/05727には、メチオニンの
大謝中に生産されるHcyとCysとの間の中間アミノ酸であ
るシスタチオニンのクロマトグラフィーアッセイが記載
されている。

Fiskerstrand等、Clin.Chem.39（２）:263−271（199
3）は、血清チオール類の蛍光標識、続いてHcy誘導体の
他の硫黄含有化合物からのクロマトグラフィー分離を必
要とする。総Hcyの完全自動化分析を記載している。

HPLC法によるHcyの同定は、しばしば、Fiskerstran
d、上記文献に記載のような蛍光試薬での誘導体化、ま
たはRefsum等、Clin.Chem.31（４）624−628（1985）に
記載のような放射性酵素技術を必要とする。更に、タン
パク質配列分析によるCysの同定は、アルキル化試薬で
の誘導体化を必要とする。例えば、Jue等、Analyticla
Biochemistry 210:39−44（1993）参照。

残念ながら、クロマトグラフィー法は、時間がかか
り、大変な労力を要するという不利点を有する。更に
は、現今のHcy分析法は、蛍光標識、例えば、ブロモビ
マンによる事前の誘導体化を必要とし、これはブロモメ
チル基がHcyの遊離のチオールと反応して、チオエステ
ルを形成し、遊離の臭素イオンを放出するというもので
ある。このブロモビマン試薬は、溶液中の他の遊離の全
てのチオールとも反応し、それ故に、多様な誘導体化硫
黄含有種のクロマトグラフィー分離が必要である。

現今のHcy分析法の多くは、煩わしいクロマトグラフ
ィー技術に頼るものであるので、より迅速かつ簡易な、
抗体を基礎とするHcyアッセイに対する需要がある。Hcy
のイムノアッセイは、問題があるとの予想から、今まで
のところ採用されたことはなく、それはHcy分子が小さ
すぎて、抗体開発に有効なハプテンとして働く抗体認識
部位がほとんど無いと思われていたためである。更に
は、抗体が、単一メチレン基により構造が異なるHcyとC
ysとを識別するのに必要な抗原特異性度を達成できな
い。従って、これらの化合物の高特異的定量および識別
を可能にするイムノアッセイ法の開発が現在要望されて
いる。

望ましくない交差反応物を扱う技術は多数存在する。
Brynes等、米国特許第4,952,336号は、アンフェタミン
−メタンフェタミンイムノアッセイにおいて試料を水性
過ヨウ素酸塩溶液で前処理して、交差反応物を除去する
方法を記載している。StevensonのPCT/GB90/01649は、
試料を還元剤で前処理することによりリウマチ因子に起
因する干渉レベルを低減する改良イムノアッセイに関す
るものである。Mach等、米国特許第4,978,632号は、試
料を酸化剤で前処理することにより血液および血液産物
に起因する干渉レベルを排除する改良イムノアッセイに
関するものである。これらの前処理法は、交差反応物に
のみ作用するものであり、分析物に作用する方法は１つ
もない。

発明の概要本発明は、免疫学的に関連する複数の化合物を含有す
る疑いのある試料中の第１化合物の存在または量を、第
２化合物の存在下で測定する方法に関するものであり、
（ａ）水性媒質中で、試料、第１化合物と第２化合物を
化学的に修飾して免疫学的に異質である修飾第１化合物
および修飾第２化合物を形成できる修飾試薬、および修
飾第１化合物には特異的に結合して免疫複合体を形成で
きるが修飾第２化合物には結合できない抗体、を一緒に
し；さらに（ｂ）試料中の第１化合物の存在または量に
相関する、抗体の修飾第１化合物への結合度を測定す
る、各工程を含んでなる。この方法は、特に、免疫学的
に関連するCysの存在下でのHcyのアッセイによく適して
いる。

本発明の他の実施態様は、Hcyを含有する疑いのある
試料中のHcyの量を、Cysの存在下で測定する方法に関す
るものであり、（ａ）水性媒質中で、試料、HcyおよびC
ysを化学的に修飾して修飾Hcyおよび修飾Cysを形成でき
る修飾試薬、および修飾Hcyには特異的に結合して免疫
複合体を形成できるが修飾Cysには結合できない抗体、
を一緒にし；さらに（ｂ）試料中のHcyの量に相関す
る、免疫複合体の量を測定する、各工程を含んでなる。

本発明の一実施態様は、Hcyを含有する疑いのある試
料中のHcyの量を、Cysの存在下で測定する方法に関し、
（ａ）水性媒質中で、試料、HcyおよびCysを化学的に修
飾して修飾Hcyおよび修飾Cysを形成できる修飾試薬、検
出可能な標識に結合させた修飾Hcyの類似体、および修
飾Hcyおよびその類似体には特異的に結合できるが修飾C
ysには結合できない抗体、を一緒にし；さらに（ｂ）試
料中のHcyの量に相関する、類似体の抗体への結合度を
測定する、各工程を含んでなる。

本発明のその他の実施態様は、HcyおよびCysを含有す
る疑いのある試料中のHcyの量を測定する方法に関する
ものであり、（ａ）水性媒質中で、試料、HcyおよびCys
を化学的に修飾して修飾Hcyおよび修飾Cysを形成できる
修飾試薬、修飾Hcyには特異的に結合して免疫複合体を
形成できるが修飾Cysには結合できない抗体、抗体を結
合させることができる表面、および修飾Hcyの標識化類
似体、を一緒にし；さらに（ｂ）試料中のHcyの量に相
関する、標識化類似体の抗体への結合度を測定する、各
工程を含んでなる。

更に他の実施態様は、HcyおよびCysを含有する疑いの
ある試料中のHcyの量を測定する方法に関し、（ａ）水
性媒質中で、試料、HcyおよびCysを化学的に修飾して修
飾Hcyおよび修飾Cysを形成できる修飾試薬、修飾Hcyに
は特異的に結合して免疫複合体を形成できるが修飾Cys
には結合できない抗体、および修飾Hcy上に存在する修
飾試薬の一部に結合できる受容体、を一緒にし；さらに
（ｂ）試料中のHcyの量に相関する、抗体の受容体への
結合度を測定する、各工程を含んでなる。

さらにその他の実施態様は、少なくともHcyの一部が
ジスルフィド形態（タンパク質結合形態および遊離ジス
ルフィド形態）であるHcyを含有する疑いのある血清試
料中のHcyの量をCysの存在下で測定する方法に関するも
のであり、（ａ）水性媒質中で、試料、Hcyをジスルフ
ィド形態から解離する解離剤、HcyおよびCysのスルフヒ
ドリル基を化学的に修飾して修飾Hcyおよび修飾Cysを形
成できる修飾試薬、および修飾Hcyには特異的に結合し
て免疫複合体を形成できるが修飾Cysには結合できない
抗体、を一緒にし；さらに（ｂ）試料中のHcyの量に相
関する、免疫複合体の量を試験する、各工程を含んでな
る。

本発明のその他の実施態様は、Hcy検出法に使用する
ためのキットに関し、パッケージした組物中に、Hcyお
よびCysを化学的に修飾して修飾Hcyおよび修飾Cysを形
成できる修飾試薬、および修飾Hcyには特異的に結合で
きるが修飾Cysには結合できない抗体を含んでなる。こ
のキットは、修飾Hcyの標識化類似体および解離剤を含
むこともできる。

特定の実施態様の説明本発明は、分析物と免疫学的に関連する同族体の存在
下に化合物を検出する方法に関するものである。本発明
の方法は、分析物とその同族体の両方を化学的に修飾し
て、それらの免疫原性を高め、抗体認識を容易ならしめ
るものである。さらに重要なことは、このような修飾に
よりこれらの化合物を免疫学的に異質なものとすること
である。化学修飾は、好ましくは化学基による水素の置
換以上のものを含む。その場合、修飾した免疫学的に異
質の化合物類に対する抗体を作成する。アッセイプロト
コールは、分析物および類似体を化学的に修飾し、次い
で、修飾した分析物を上記抗体により免疫化学的に検出
することからなる。特に、本発明は、スルフヒドリルア
ミノ酸であるホモシステイン（Hcy）とシステイン（Cy
s）とを識別する定量免疫化学法に関するものである。H
cyおよびCysは同族体である： HOOC−CH（NH₂）−CH₂−CH₂−SH ホモシステイン HOOC−CH（NH₂）−CH₂−SH システイン更に、この２つの化合物はそれらのアミノ酸側鎖の長さ
において炭素１つのみが異なるだけであるので、Hcyに
対して産生される抗体がCysと交差反応すると予想され
ることから、HcyとCysは免疫学的に関連する。

更に本発明の特定の実施態様について説明を進める前
に、多数の用語を定義する。

分析物：検出すべき化合物または組成物。分析物は、
特異的結合体（“sbp"）の構成員であることができ、リ
ガンドであってもよく、一価（モノエピトープ性）また
は多価（ポリエピトープ性）であり、普通は、抗原性ま
たはハプテン性であり、単一の化合物または少なくとも
１つの共通のエピトープ性部位または決定因子部位を共
有する複数の化合物である。

本発明は、分析物および同族体を化学的に修飾し、次
いで、修飾した分析物を検出することにより、分析物の
同族体をも含む試料中の分析物を検出する方法を提供す
るものである。そのため、試料中に対象となる分析物が
存在するときのみその存在が検出されるような反応生成
物を検出することにより、分析物を測定する。従って、
“修飾した”分析物が実際にアッセイ中に検出される。
分析物は、宿主由来の体液、例えば、尿、血液、血漿、
血清、唾液、精液、糞、たん、脳脊髄液、涙、粘液、ま
たは同等物などの試料中に直接見い出すことができる
が、好ましくは血清または血漿である。この試料は、下
記に述べるように、前処理することもできる。

特異的結合対の構成員（“sbp"構成員）：他の分子の
特定の空間的および極性の構成と特異的に結合し、それ
によって、他の分子の特定の空間的および極性の構成と
相補的なものとして定義される領域を表面上または腔内
に有する、２つの異なる分子のうちの１つ。sbp構成員
は、例えば、免疫学的ペア、例えば抗原−抗体の構成員
のようなリガンドおよび受容体として表すことができ
る。“リガンド”という用語は、受容体が天然に存在す
るかまたは調製できるあらゆる化合物を表しており、
“受容体”という用語は、分子の特定の空間的および極
性の構成、例えば、エピトープ性部位または決定因子部
位を認識する能力のあるあらゆる化合物または組成物を
表す。相補的sbp構成員は、例えばリガンドとその相補
的受容体のように、もう一方と結合するものである。sb
p構成員は、抗原および抗体のような免疫学的ペア、ま
たはアビジンとビオチンまたはオリゴヌクレオチドの相
補鎖のような非免疫学的ベアであることができる。sbp
構成員は、また、低分子または低分子残基およびそれら
の受容体であってもよい。低分子は、分子量100から200
0、好ましくは150ないし1000を有し、受容体が存在する
か、または調製できるかのいずれかである。低分子の例
には、ビオチン、リセルグ酸、フルオレセイン、または
フルオレセイン誘導体、およびビタミンB₁₂があり、そ
れぞれアビジンまたはストレプトアビジン、抗リセルグ
酸、抗フルオレセイン、および内因子である対応する受
容体を持つ。低分子に対する抗体は、低分子を免疫原性
キャリアーに連結させることにより、調製できる。

支持体または表面：固相は典型的には支持体または表
面であり、多くの形状、例えば、ストリップ、ロッド、
ビーズを含む粒子、および同等物のいずれか１つを持つ
ことができる多孔性または非多孔性水不溶性物質であ
る。適切な物質は当該分野ではよく知られており、例え
ば、本明細書に参照して組み込んである、Ullman等、米
国特許第5,185,243号、10−11欄に記載されている。sbp
構成員の支持体または表面への結合は、普通に文献から
入手できるよく知られた技術により達成することができ
る。例えば、“Immobilized Enzymes"、千畑一郎、Hals
ted Press,New York（1978）およびCuatrecasas,J.Bio
l.Chem.245:3059（1970）参照。

どの型の固体支持体を用いるとしても、その表面に結
合させた修飾分析物またはその表面に結合させた受容体
に特異的に結合する抗体を持つように処理しなければな
らず、該受容体は、そのような抗体またはその抗体とコ
ンジュゲートした低分子に特異的に結合するものであ
る。例えば、アビジンまたはストレプトアビジンは、0.
5−1.5mmの球状ガラスビーズに共有結合でき、ビオチニ
ル化抗体を得ることができる。

シグナル生成系（“sps"）：結合および／または非結
合標識の量に相関する検出可能なシグナルを産生する１
またはそれ以上の成分で、少なくとも１つは標識である
成分。好ましくは、標識は、蛍光剤、放射性標識、酵
素、化学発光剤、または光増感剤であり、酵素活性、化
学発光、光吸収または放射能を観察することにより検出
する。

適切な標識には、例示であって限定ではないが、アル
カリホスファターゼおよび西洋ワサビペルオキシダーゼ
のような酵素:QBレプリカーゼなどのレプリカーゼの基
質；プロモーター類；染料類；フルオレセイン、イソチ
オシアネート、ロダミン化合物類、フィコエリトリン、
フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒ
ド、およびフルオレカミンなどの蛍光剤；イソルミノー
ルなどの化学発光剤；増感剤；補酵素；酵素基質;
¹²¹I、¹³¹I、¹⁴C、³H、³²Pおよび³⁵Sなどの放射性標
識；ラテックスまたは炭素粒子などの粒子；金属ゾル；
クリスタライト；リポソーム；細胞等があり、これらを
更に染料、触媒または他の検出可能な基、および同等物
で標識してもよいし、また標識しなくてもよい。適切な
酵素および補酵素は、Litman等、米国特許第4,275,149
号、19ないし28欄、およびBoguslaski等、米国特許第4,
318,980号、10ないし14欄に開示されており；適切な蛍
光剤および化学発光剤は、Litman等、米国特許第4,275,
149号、30および31欄に開示されており、全て出典明示
により本明細書の一部としている。

目視試験、電磁放射、電気化学検出、光音響分光法な
どのような外的手段により標識が検出可能なシグナルを
産生できる方法は多数ある。標識または他のsps構成員
もまたsbp構成員、他の分子、または支持体に結合でき
る。

標識は、直接、シグナルを産生できるので、シグナル
産生のための更なる成分を必要としない。多くの有機分
子、例えば、蛍光剤は、紫外線および可視光を吸収で
き、その光吸収がエネルギーをこれらの分子に転移さ
せ、それらを励起エネルギー状態へと高める。その後、
この吸収エネルギーは、第２波長での光放出により放散
する。シグナルを直接産生する他の標識には、放射性ア
イソトープや色素がある。

これとは別に、標識がシグナルを産生するのに他の成
分を必要とする場合もあり、その場合、spsは、測定可
能なシグナルを産生するのに必要な全ての成分を含み、
その成分には、基質、補酵素、増感剤、更なる酵素、酵
素生成物と反応する物質、触媒、アクチベーター、補助
因子、阻害因子、スカベンジャー、金属イオン、シグナ
ル産生物質の結合に必要な特異的結合物質、および同等
物を含むことができる。適切なシグナル産生系について
の詳細な記載は、Ullman等、米国特許第5,185,243号、1
1−13欄に見ることができ、これは参照して本明細書に
組み込んである。

標識は、多数のspb構成員：修飾分析物に結合する抗
体；修飾分析物に結合する抗体の受容体；修飾分析物に
結合する抗体とコンジュゲートした低分子に結合するこ
とができる受容体；またはリガンド、特に修飾分析物の
類似体、に共有結合できる。標識のsbp構成員への結合
は、化学反応の結果、標識の水素原子をsbp構成員への
結合で置換することにより達成することができ、また標
識とsbp構成員との間に連結基を含むこともできる。他
のsps構成員もsbp構成員と共有結合できる。例えば、蛍
光剤や消光剤などの２つのsps構成員は、修飾分析物の
類似体および分析物に対する抗体にそれぞれ結合し、類
似体との複合体を形成する。複合体の形成により、蛍光
剤と消光剤は極めて接近した状態になり、そうして消光
剤が蛍光剤と相互作用してシグナルを産生可能にする。
コンジュゲーション法は、当該分野ではよく知られてい
る。例えば、参照して本明細書に組み込んであるRubens
tein等、米国特許第3,817,837号参照。本発明は、シグ
ナル産生系の第１構成員に結合した抗体およびシグナル
産生系の第２構成員として検出可能な標識を有すること
を意図する。例えば、検出可能な標識が分析物類似体に
結合するとき、抗体の類似体への結合度は、シグナル産
生系構成員の相互作用により産生したシグナルを検出す
ることにより測定できる。

補助物質：様々な補助物質が、本発明に従う方法にお
いてしばしば採用される。例えば、緩衝液は、通常、ア
ッセイ媒質やアッセイ成分の安定剤と同じく、アッセイ
媒質中に存在する。これらの添加物に加えて、アルブミ
ンなどのタンパク質類、ホルムアミドなどの有機溶媒
類、第４級アンモニウム塩類、硫酸デキストランなどの
ポリカチオン類、または界面活性剤類、特に非イオン性
界面活性剤、結合増強剤、例えば、ポリアルキレングリ
コール類、または同等物を含む場合がしばしばある。

上記の通り、本発明は、分析物と免疫学的に関連する
同族体の存在下に、化合物を検出する方法に関するもの
である。

本発明の一方法は、免疫学的に関連する２種の化合物
を含有する疑いのある試料中の第１化合物の存在または
量を、第２化合物の存在下で測定することに関するもの
である。この方法は、（ａ）水性媒質中で、試料、第１
化合物および第２化合物を化学的に修飾して修飾第１化
合物および修飾第２化合物を形成できる修飾試薬、およ
び修飾第１化合物には特異的に結合して免疫複合体を形
成できるが修飾第２化合物には結合できない抗体、を一
緒にし；さらに（ｂ）試料中の第１化合物の存在または
量に相関する、抗体の修飾第１化合物への結合度を測定
する、各工程を含んでなる。本方法は、特に、それらの
化合物が同族体である場合に有用である。

本明細書で使用した“免疫学的に関連した”という用
語は、２つの化合物で、一方が対象となる分析物であ
り、それに対して交差反応性を示す抗体が存在するもの
を表すのに用いる。交差反応性の算定は、抗体へ等しく
結合した２つの化合物の濃度比率に基づく。異なる同族
体に対する抗体は、しばしば高い交差反応性を示す。そ
れ故に、イムノアッセイでは、媒質中に同族体が存在す
る場合、化合物を正確に測定できないことが多い。この
場合に、分析物を検出するための抗体試薬を用いると、
たいてい一部の抗体が同族体に結合してしまい、偽陽性
あるいは、不正確な定量値を得ることとなる。イムノア
ッセイにおいて許容できる交差反応性の度合いは、交差
反応物の予想最大濃度、そのアッセイに要求される感
度、および必要な精度によって変わる。例えば、抗体が
Cysと10％交差反応性であり、Cysが検出しようとするHc
yの最低レベルの５倍多い量で試料中に存在するなら
ば、その場合、Hcyがその最低レベルであると、測定さ
れたHcyのレベルは50％高く出すぎることとなる。許容
できる誤差が５％だけであるならば、交差反応性は１％
以下でなければならない。本発明において、修飾分析物
に対する抗体は、修飾同族体と低い交差反応性を示すも
のでなければならない。上に例示説明したように、交差
反応性の度合いを“高く”するか“低くする”かは、修
飾同族体の予想最大濃度および求められる感度および精
度によって変わる。

本明細書で使用した“同族体”の用語は、同じ化学官
能基を有し、さらに分子中に−CH₂−基１つが挿入され
ている点で次ぎのものとは異なる一系列の有機化合物中
の１化合物を表す。例えば、CH₃OH（メタノール）、C₂H
₅OH（エタノール）およびC₃H₇OH（プロパノール）等
は、全て同族体であり、同族体系列を形成する。本発明
の範囲内の同族体化合物の例は、ホモシステインとシス
テイン、アンフェタミンとメタフェタミン、セリンとホ
モセリン、クエン酸とホモクエン酸、アスパラギン酸と
グルタミン酸、アラニンとβ−アミノ−イト酪酸、テト
ラヒドロ葉酸とN⁵−メチルテトラヒドロ葉酸、オキサロ
酢酸とα−ケトグルタル酸、ゲンチシン酸とホモゲンチ
シン酸、モルフィンとノルモルフィン、および同等物で
ある。

本明細書で使用した“修飾試薬”の用語は、２つの同
族体と反応して、免疫学的に異質の２つの新たな化合物
を形成する試薬を意味するのに用いる。“免疫学的に異
質”という用語は、修飾分析物に対する抗体が修飾同族
体に対して低い交差反応性を示すので利用できるという
ことを意味する。同族体は同じ官能基を有し、異なる同
族体に対する抗体は、しばしば高度の交差反応性を示
す。故に、同族体が媒質中に存在する場合、イムノアッ
セイにおいて化合物を正確に測定することができない。
修飾試薬は、アッセイされる化合物（“分析物”）およ
びその同族体を化学的に修飾し、そうして２つの化合物
を免疫学的に異質なものにする能力を有する。結果とし
て、修飾分析物に対する抗体は、修飾同族体に対してよ
り低い交差反応性を示すことになる。修飾試薬は、短時
間内、通常は４時間以下、好ましくは20分以下、最も好
ましくは５分以下で両方の化合物を修飾するようなもの
を選択する。それが試料中で他の化合物と反応する場合
は、分析物との反応に応じ得るような十分な量で使用し
なければならない。適切な修飾試薬の例には、アルキル
化剤、アシル化剤、金属類、求核物質類、および親電子
物質類がある。本発明は、放射性標識のような検出可能
な標識が結合した修飾試薬を有することも意図してい
る。この場合、修飾分析物の量は標識を検出することに
より測定できる。

第１化合物を免疫学的に関連した第２化合物の存在下
で検出する上記方法において、抗体は検出可能に標識さ
れ得るか、または検出可能に標識される能力があるもの
である。また、修飾試薬を標識する場合は、抗体は支持
体に結合できるか、または支持体に結合できる能力があ
るものである。

本明細書で使用した“検出可能に標識される能力があ
る”および“支持体に結合できる能力がある”との用語
は、試薬、例えば、この場合では抗体が第1sbp構成員ま
たは低分子と相補的第2sbp構成員または低分子の受容体
に結合し、次に標識または支持体に結合することを意味
する。従って、実際には抗体は標識されたり、支持体に
結合したりしないが、相補的sbp構成員または受容体を
加えた時に、標識されたり、結合することになる。

上記方法は、更に、検出可能な標識に結合させた、ま
たは結合させることができる修飾第１化合物の同族体
と、その同族体と修飾第１化合物の両方に特異的に結合
できる抗体を一緒にすることを含むことができる。抗体
の修飾第１化合物への結合度は、同族体の抗体への結合
度を測定することによって測定する。抗体は、支持体に
結合できるか、または支持体に結合する能力がある。

更に詳しくは、本発明は、試料中のHcyとCysを、それ
らを免疫学的に異質なものにする手段で化学的に修飾
し、次いでHcyを検出することを含む。Hcyを含有する疑
いのある試料中のHcyの量を、Cysの存在下で測定する方
法の１つは、（ａ）水性媒質中で、試料、HcyおよびCys
を化学的に修飾して修飾Hcyおよび修飾Cysを形成できる
修飾試薬、修飾Hcyには特異的に結合して免疫複合体を
形成できるが修飾Cysには結合できない抗体を、一緒に
し；さらに（ｂ）試料中のHcyの量に相関する、免疫複
合体の量を測定する、各工程を含んでなる。

本明細書で使用した“免疫複合体”の用語は、抗原の
抗体への免疫学的結合により形成される複合体を意味す
る。

同様の標識化試薬は、ある化合物を免疫学的に関連の
ある化合物、即ち、標識化修飾試薬、標識化抗体、およ
び標識化類似体の存在下で検出する本方法における使用
に適している。

本発明の一実施態様では、修飾試薬は、HcyとCysの３
つの官能基、アミノ基、スルフヒドリル基、およびカル
ボキシル基のうち少なくとも１つと結合を形成するよう
に設計されている。通常、少なくとも１つの生成物にお
いて、第２結合は、第１結合の形成後、これらの基の１
つに対して生じるであろう。多くの場合、これによって
環が生じる。例えば、第１結合がスルフヒドリル基に対
してできており、第２結合がアミンを含んでいることが
できる。

HcyとCysのスルフヒドリル基と反応する能力がある修
飾試薬は、普通、HcyまたはCysのアミノ基またはカルボ
キシ基と反応するように適切に配置された基を有する。
この基は、アルキル化基またはアシル化基、金属、また
は求核置換のために活性化されたアリル基であることが
できるが、例示であって限定ではない。特に、適するも
のは、Cl、Br、Ｉ、スルホネート類、およびスルホニウ
ム塩類からなる群から選択される脱離基によりアルファ
位で置換されたケトン類である。

上記指摘のように、アルキル化剤、アシル化剤、およ
び金属類は、特にHcyアッセイにおいて使用する修飾試
薬として適している。本明細書で使用した“アルキル化
剤”の用語は、有機分子と反応してアルキルまたはアリ
ール基を分子内に導入する修飾試薬を意味する。アルキ
ル基は、アルカンに由来する基であり、その構造から水
素１つが取れたものである。例えば、メチル、エチル、
プロピル等。アリール基は、その分子がベンゼン、ナフ
タレン、フェナントレン、アントラセン等の環構造特性
を有する基であり、即ち、ベンゼンの６炭素環または他
の芳香族誘導体の縮合６炭素環のいずれかである。好ま
しくは、アルキル化剤は、アルキルハライドまたはアリ
ールハライドまたはマレイミドまたはアクリロニトリル
などの電気陰性的に置換されたオレフィン類などの基を
有する。アルキルハライドを用いる場合、ケトン、アル
デヒド、エステル、オレフィン、アセチレン、ニトリ
ル、アリール、または同等物は、普通、ハロゲンのつい
た炭素に隣接するものである。適切なアルキル化剤に
は、下表に示した修飾試薬Ｉ−VIIIがあるが、例示であ
って限定ではない。特に有用なアルキル化剤は、ｐ−ブ
ロモアセチル安息香酸（BABA）、即ち修飾試薬IIであ
る。

本明細書で使用した“アシル化剤”の用語は、有機分
子と反応してスルホニル基またはアシル基を分子内に導
入する修飾試薬を意味し、通常、スルホン酸またはカル
ボン酸誘導体、例えば、その無水物または塩化物または
活性エステルである。アシル基は、カルボキシル基の−
OHを他の置換基により置換した有機酸基である。例え
ば、アセチル（CH₃CO−）およびベンゾイル（C₆H₅CO
−）。適切なアシル化剤には、下表に示した修飾試薬II
I−ＶおよびVIIIがあるが、例示であって限定ではな
い。

本明細書で使用した“金属”の用語は、二座配位子と
キレートを形成する能力のある有機金属試薬を含む重金
属キレート類を意味する。適切な金属類には、下表に示
した修飾試薬IXとＸがあるが、例示であって限定ではな
い。

特に有用な修飾試薬は、アルキルハライドまたはアリ
ールハライドなどのアルキル化基を有する。アルキルハ
ライドを用いる場合、ケトン、アルデヒド、エステル、
オレフィン、アセチレン、ニトリル、アリール、または
同等物は、普通、ハロゲンのついた炭素に隣接するもの
である。典型的な試薬およびそれらのHcyとCysとの反応
生成物、即ち“修飾"HcyとCysは、下表に示す。

各試薬において、下線を引いた基は、誘導体化反応には
必要でない可溶化基の例である：試薬可溶化基Ｉ −COOH II −COOH III −COOH IV −SO₃H Ｖ −SO₃H VI −COOH VII −COOH VIII −COOH IX −COOH Ｘ −COOH 標識が修飾試験中に存在するとき、それは、便宜上、ア
ミドまたはエステル結合により可溶化基に付けることが
できる。好ましくは、修飾試薬は、HcyとCysのスルフヒ
ドリル基を修飾して、少なくとも１つの修飾化合物の硫
黄が環の一部であるような修飾Hcyおよび修飾Cysを形成
する。修飾化合物の１つが環を形成するような修飾試薬
の例は、上記に示した修飾試薬Ｉ−Ｘである。より好ま
しくは、修飾試薬は、修飾試薬VIとＸの場合のように、
生じた修飾HcyとCysの両方が環を有するようなものを選
択する。

上記修飾試薬の中で、好ましい試薬はBABA（修飾試薬
II）であり、これはHcyおよびCysと室温および中性pHで
迅速に反応する。BABAは、下記の利点を有する：フェニ
ル環が、免疫系に与えられたとき高い免疫原性部位を提
供し；カルボキシレートが、ある程度の水溶性ならびに
キャリアータンパク質への便利な結合点を提供し；ブロ
モアセチル基のカルボニルが、修飾HcyとCysとの便利な
識別手段を提供する。

上記のように、Hcyに対する抗体は、HcyとCysが同族
体であり、かつ免疫学的に関連するため、Cysとの高度
の交差反応性を示す可能性がある。HcyとCysを修飾して
それらを免疫学的に異質なものにする方法は多数ある。
例えば、６員環は、鎖とは立体化学的にかなり異なり、
そのため、Cysを修飾して６員環を形成させるとき、か
つ修飾Hcyが非環状であるとき、抗体認識を向上させ、
交差反応性を低減することができる。このことを、修飾
試薬（VIII）で例示説明する： CysとHcyを修飾して、硫黄が６員環の一部である修飾Cy
s（VIII a）：および硫黄が環の一部ではない修飾Hcy（VIII b）：を形成させる。

本発明のその他の実施態様は、Hcyを含有する疑いの
ある試料中のHcyの量を、Cysの存在下で測定するアッセ
イを含み、次の方法：（ａ）水性媒質中で、試料、Hcy
およびCysを化学的に修飾して修飾Hcyおよび修飾Cysを
形成できる修飾試薬、検出可能な標識に結合させた修飾
Hcyの類似体、および修飾Hcyおよびその類似体には特異
的に結合できるが修飾Cysには結合できない抗体、を一
緒にし；さらに（ｂ）試料中のHcyの量に相関する、類
似体の抗体への結合度を測定する、を用いる。この実施
態様では、測定したシグナルは、類似体の抗体への結合
度の指標である。従って、シグナルは、試料中のHcy量
に反比例する。

更にその他の本発明の実施態様は、HcyおよびCysを含
有する疑いのある試料中のHcy量のアッセイを含み、次
の方法：（ａ）水性媒質中で、試料、HcyおよびCysを化
学的に修飾して修飾Hcyおよび修飾Cysを形成できる修飾
試薬、修飾Hcyには特異的に結合して免疫複合体を形成
できるが修飾Cysには結合できない抗体、抗体を結合さ
せることができる表面、および修飾Hcyの標識化類似
体、を一緒にし；さらに（ｂ）試料中のHcyの量に相関
する、標識化類似体の抗体への結合度を測定する、を用
いる。この方法は、更に、標識化第１特異的結合対構成
員を一緒にすることを含んでいてもよく、その場合、標
識化類似体の標識は相補的第２特異的結合対構成員、例
えば、フルオレセインに結合した類似体、および酵素標
識化抗フルオレセイン抗体である。この実施態様では、
測定したシグナルは、類似体の抗体への結合度の指標で
ある。従って、シグナルは、試料中のHcy量に反比例す
る。

本発明の更に他の実施態様は、HcyおよびCysを含有す
る疑いのある試料中のHcyの量を測定するアッセイを含
み、（ａ）水性媒質中で、試料、HcyおよびCysを化学的
に修飾して修飾Hcyおよび修飾Cysを形成できる修飾試
薬、修飾Hcyには特異的に結合して免疫複合体を形成で
きるが修飾Cysには結合できない抗体、および修飾Hcy上
に存在する修飾試薬の一部に結合できる受容体を一緒に
し；さらに（ｂ）試料中のHcyの量に相関する、抗体の
受容体への結合度を測定する、各工程を含んでなる。修
飾試薬は、ハプテン、リガンド、またはHcyまたはCys受
容体である場合もあり、修飾試薬の一部に結合する受容
体は、それぞれ、抗ハプテン抗体、リガンドに対する受
容体、またはHcyまたはCys受容体であり得る。受容体お
よび特定の抗体のいずれかまたは両方を標識でき、１つ
は支持体に結合させることができる。下記は本方法によ
り包含される実施態様の単なる例示説明である。例え
ば、ビオチンに結合させた修飾試薬は、ビオチンに結合
させた修飾Hcyを形成する。修飾Hcy、修飾Hcyに特異的
に結合できる標識化抗体、および支持体に結合させたア
ビジンを含む複合体が形成される。別法として、ハプテ
ンに結合させた修飾試薬は、ハプテンに結合させた修飾
Hcyを形成する。修飾Hcy、第１標識に結合させた修飾Hc
yに特異的に結合できる抗体、および第２標識に結合さ
せた抗ハプテン抗体を含む複合体が形成される。

Hcyは、様々な混合ジスルフィドとしてヒト血漿中に
存在する。通常、Hcyの主たる画分（約70％）は、アル
ブミンなどの環状（circulating）タンパク質にジスル
フィド結合を介してタンパク質結合している。残りの
“遊離"Hcy（約30％）は、Hcy（還元型）の形態である
かまたはCysなどの他のチオール類との混合ジスルフィ
ドとしてある。血漿中に存在するこれらのHcy種の和
（タンパク質結合形態、遊離ジスルフィド形態、および
遊離還元形態）を“総Hcy"と表す。血清中の総Hcyの測
定は、好ましくは、タンパク質結合Hcyを解離し、Hcyの
混合ジスルフィド形態、即ち、遊離ジスルフィド形態を
還元する前処理工程を含む。Hcyの３つの形態（タンパ
ク質結合形態、遊離ジスルフィド形態、または遊離還元
形態）の比率がHcy濃度、試料調製、貯蔵方法等のよう
な要因に依存しているため、本発明の好ましい方法で
は、総Hcyを測定する。しかしながら、所望ならば、遊
離Hcyの測定を前処理なしで行うこともできる。

試料中のHcy総量を測定するには、試料をまず、Hcyを
環状タンパク質並びにHcy二量体および他の混合ジスル
フィドから解離する解離剤と合わせる。特に、有機ジス
ルフィドを還元する還元剤が適している。少なくともHc
yの一部がジスルフィド形態（タンパク質結合形態およ
び遊離ジスルフィド形態）である、Hcyを含有する疑い
のある血清試料中のHcy量を、Cysの存在下で測定する方
法の１つは、（ａ）水性媒質中で、試料、Hcyをジスル
フィド形態から解離する解離剤、HcyおよびCysのスルフ
ヒドリル基を化学的に修飾して修飾Hcyおよび修飾Cysを
形成できる修飾試薬、および修飾Hcyには特異的に結合
して免疫複合体を形成できるが修飾Cysには結合できな
い抗体、を一緒にし；さらに（ｂ）試料中のHcyの量に
相関する、免疫複合体の量について媒質を試験する、各
工程を含んでなる。解離剤は、上記のような還元剤であ
ることができるか、または、ジスルフィドと反応して修
飾Hcyおよび修飾Cysを形成し、それによって、解離剤お
よび修飾試薬の両方として働くことができるものであっ
てよい。

HcyとCys硫黄化合物を血清タンパク質から遊離させる
ことができる適切な解離剤は、当分野ではよく知られて
おり、ホウ化水素ナトリウムおよびホウ化水素カリウム
のような還元剤；ジチオトレイトール、ジチオエリトリ
トール、２−メルカプトエタノール、チオグリコール
酸、およびグルタチオンなどのチオール類；およびホス
フィン類およびトリブチルホスフィンおよびトリス（２
−カルボキシエチル）ホスフィンなどのトリアルキルホ
スフィン類があるが、これらに限定されない。特に適し
た還元剤は、ジチオトレイトールおよびトリス（２−カ
ルボキシエチル）ホスフィン（TCEP）であり、後者は、
Burns等、J.Org.Chem.56（８）:2648−2650（1991）に
記載されている。TCEPの場合の還元反応を下記に例示説
明するが、タンパク質結合Hcyとタンパク質結合Cysを血
清タンパク質から遊離させる：解離剤が修飾試薬としても働くとき、スルファイト類、
ホスファイト類、ホスホルイミデート類、および同等
物、およびそれらのモノ−およびジ−エステルが使用で
きる。これらの試薬は、HcyおよびCysジスルフィドと反
応して、チオスルフェートまたはチオホスフェート基を
有する修飾HcyおよびCysを与える。

一方、解離剤が修飾試薬として働かないとき、チオー
ル特異的修飾試薬を用いて遊離させたチオール類を修飾
する。解離剤の選択は、試薬の組み合わせが他のものよ
りも好ましいように修飾試薬を選択することにより決定
することが多い。解離剤と修飾試薬との多くの組み合わ
せは、お互いに反応するものであり、そのため、試料と
解離剤をまず合わせ、次いで充分な修飾試薬を加えて解
離剤および遊離させたHcyおよびCysと反応させる必要が
ある。これとは別に、ホスフィンなどの解離剤を、これ
とは反応しないマレイミドのような不飽和修飾試薬と共
に用いることもできる。このことはそのプロトコールに
一層の融通性を与えるが、より反応性の低い修飾試薬を
使用すれば、HcyおよびCysとの完全な反応を保証するた
めにより長いインキュベーション時間が必要となり得
る。従って、解離剤と修飾試薬の選択は、所望のアッセ
イプロトコールおよび時間調節に基づくであろう。

本発明の方法を実施するために適切な反応条件を選択
する。下記には、適切な条件を示したが、特定の施用の
ために選択された特定の試薬およびアッセイプロトコー
ルによって、当業者により変更されることがある。例え
ば、本発明の方法は、不均一系または均一系、競合型ま
たは直接型などの多くのアッセイ型に適用でき、採用さ
れる条件および試薬類は、それに合わせて選択されるも
のである。

試料は、好ましくは適切な媒質中、直接試験すること
ができるか、または試料をアッセイ媒質に加える前に前
処理してもよい。前処理は、不要な物質を除去すること
によりアッセイ中の干渉を低減して、分析物を１または
それ以上のアッセイ試薬に対してより容易に利用可能に
するか、分析物をより容易に検出可能にすることができ
る。細胞の分離または溶解；タンパク質の沈殿、加水分
解、または変性；脂質の加水分解；分析物の可溶化；等
のために試料を前処理することもできる。かかる前処理
には、遠心分離；有機溶媒、例えば、アルコール、好ま
しくはメタノールなどの炭素原子およそ７以下を有する
アルコールでの試料の処理：洗剤での処理；および解離
剤での処理があるが、これらに限定されない。

アッセイされる化合物の濃度は、一般に、約10^-4から
10^-15M、より普通には約10^-5から10^-12Mで変わる。更に
詳しくは、Hcy分析物の場合、その濃度は、一般に、約1
0^-4から10^-8M、より普通には約10^-5から10^-7Mで変わ
る。通常、アッセイが定性的であるか、半定量的である
か、または定量的であるかどうか、特定の検出技術、お
よび分析物の濃度などを考慮して、他の試薬の濃度を決
定する。更に、それぞれの試薬の最終濃度は、普通、対
象の範囲に合わせてアッセイ感度を最適化するよう経験
的に決める。

アッセイに用いた、また下記キット中にパッケージし
た様々な試薬の相対量は、本方法中に起こる必要がある
反応を実質的に最適化する試薬の濃度を保持するため、
また更に実施するアッセイの感度を実質的に最適化する
ために広範囲に変わり得る。アッセイ媒質中の抗体の濃
度は、アッセイ型、不均一系または均一系、競合型また
は直接型、等によって変わる。通常は、抗修飾分析物抗
体が、修飾分析物濃度の半分ないし10⁷倍の濃度でアッ
セイ媒質中に存在し、より普通には、修飾分析物濃度の
およそ等倍から約10³倍の濃度で存在する。

本発明の方法を実施する場合、好ましくは水性媒質を
採用する。他の極性共溶媒を媒質に採用することもで
き、普通、炭素原子１−６、より普通には炭素数１−４
の酸素化有機溶媒であり、アルコール類、エーテル類お
よび同等物を含む。通常、これらの共溶媒は約70重量パ
ーセント以下で、より普通には約30重量パーセント以下
で存在する。

本発明に従うアッセイでは、媒質のpHは、通常約５−
10の範囲、好ましくは約７−９の範囲である。このpH
は、シグナル産性能を最適化しながらsbp構成員間の充
分なレベルの結合を維持するように選択する。ある場合
では、これら２つの条件の間に妥協される。更に、この
pHは、環化などの特定の構造的コンホーメーションを維
持するように選択することもできる。様々な緩衝液を用
いて、所望のpHを達成し、かつ測定中pHを維持すること
もできる。緩衝液の例には、ボレート、ホスフェート、
カーボネート、トリス、バルビタール、および同等物が
ある。採用した特定の緩衝液が本発明にとって決定的な
のではないが、個々のアッセイにおいてある１つの緩衝
液が他のものよりも好ましい場合がある。

本方法の実施には、通常穏やかな温度を採用する。そ
の温度は、実行している工程によって変わり得る。しか
しながら、より典型的には、本方法の期間中、一定温度
を維持する。その温度は、一般に、10から50℃、普通は
約15℃から40℃の範囲である。

様々な試薬の添加順序は広範囲に変わり得るが、採用
する特定のアッセイ形式の性質に依存するある優先順序
がある。各試薬類および試料を同時に、または全体にま
たは部分的に連続して、お互いにおよび支持体と合わせ
ることができる。本明細書で使用した、“全体にまたは
部分的に連続して”との用語は、本発明に使用した試料
および様々な試薬類を付随的に（同時に）合わせるので
はないときに、１またはそれ以上の試薬類を単独で、ま
たは他の試薬類と一緒に連続して加えることができるこ
とを意味する。例えば、まず、分析物を含有する疑いの
ある試料と解離剤を合わせて、解離剤にジスルフィド結
合を還元させ、次いで、残りの試薬類を同時またはステ
ップワイズ添加してもよい。解離剤と修飾試薬が一緒に
反応しないとき以外は、修飾試薬の前に解離剤を添加す
るのが好ましい。所望により、１またはそれ以上のイン
キュベーション工程を各試薬添加後に含めてもよく、一
般に、約30秒から６時間、より普通には、約２分から１
時間の範囲である。より便利な各工程順序があること、
および採用する特定の順序の選択が試薬類およびアッセ
イ形式の選択によって変わることが理解されるが、これ
は本発明にとって重大ではない。

免疫アッセイの最終工程は、修飾分析物と抗体との結
合度を測定することであり、これは、試料中の分析物の
存在または量に相関する。結合度を測定する多くの方法
があり、当分野ではよく知られている。これらの方法
は、例えば、アッセイが競合型であるか、均一系である
か、不均一系であるかどうか等によって異なる。

修飾分析物と抗体との結合度の一測定は、検出可能に
標識した修飾分析物、即ち、標識化分析物類似体を加
え、標識化修飾分析物と抗体とが修飾分析物との結合と
競合して結合することにより産生されたシグナルを検出
することにより、達成できる。例えば、均一系アッセイ
において、検出可能な標識は酵素であることができ、最
終工程が基質の添加による酵素標識の活性化を必要とし
てもよい。産生されたシグナルは、通常、標識化修飾分
析物と抗体との結合度に反比例する。そのとき、シグナ
ルの存在または量は、試料中の分析物の存在または量に
相関する。

競合型の均一系アッセイにおけるその他の測定では、
蛍光剤標識化修飾分析物および消光剤標識化抗体の使用
により、結合度を測定できる。この場合もまた、シグナ
ルは結合度に反比例し、試料中に存在する分析物の量に
直接相関する。これとは別に、均一系非競合型アッセイ
を用いることもでき、そこでは、蛍光剤標識化修飾分析
物は分離試薬として加えるのではなく、分析物と蛍光剤
標識化修飾試薬との反応により形成させる。この場合も
また、シグナルは結合度に反比例するが、試料中に存在
する分析物の量にも反比例する。

不均一系アッセイでは、非標識化抗修飾分析物抗体を
支持体に結合させることができる。支持体と修飾分析物
および標識化修飾分析物とのインキュベーションに続い
て、支持体を液相から分離し、次いで固相または液相か
らのシグナル量を測定するが、これは、修飾分析物と抗
体との結合度を示すものであり、したがって試料中の分
析物量を示すものである。上記イムノアッセイ技術のよ
り詳細な記載については、Edward T.Mggioによる“Enzy
me−Immunoassay"、CRC Press,Inc.、フロリダ州ボカ・
ラトン、1980参照。

例示目的で、下記アッセイプロトコールを採用でき
る。これらの例示説明は、本発明の範囲を限定するもの
と解釈されるべきではないが、試料中のHcyまたはCysを
測定するために本発明の方法を使用できる、定性、半定
量、および定量アッセイプロトコールの単なる例示説明
である。これらの方法において検出されるシグナルを、
既知のHcy濃度を持つ標準または対照と比較する。

（Ａ）修飾試薬（Ｉ）を用いるHcyのアッセイでは、修
飾Hcy（I b）には特異的に結合するが修飾Cys（I a）に
は結合しないモノクローナル抗体を使用する。Hcyおよ
びCysを含有する疑いのある試料を適切な媒質中で修飾
試薬（Ｉ）と合わせる。反応は、次のように起こる:Hcy
とCysが存在するならば、試薬（Ｉ）＋Hcy→修飾Hcyお
よび試薬（Ｉ）＋Cys→修飾Cys（I a）。グルコース−
６−ホスフェートデヒドロゲナーゼにコンジュゲートし
た修飾Hcy（I b）の類似体もまた媒質に加える。反応お
よび免疫学的結合が起こるのに充分な時間が経過した
ら、抗Hcy抗体を媒質に加える。30分間インキュベーシ
ョン後、グルコース−６−ホスフェートを加える。産生
したシグナルは、試料中のHcy量に直接相関する。

（Ｂ）血清中の総Hcyのアッセイでは、修飾Hcy（V b）
には特異的に結合するが、修飾Cys（V a）には結合しな
いモノクローナル抗体を使用する。抗体は、ガラスビー
ズに結合させる。まず、血清試料をジチオトレイトール
（DTT）で処理して、ジスルフィドとして結び付いてい
るHcyを還元的に遊離させる。過剰のDTTを亜ヒ酸ナトリ
ウムでの処理により封鎖（sequestered）する。次い
で、前処理した試料を、³Hで標識した修飾試薬（Ｖ）と
合わせ、次いで、ガラスビーズ結合抗体と合わせる。媒
質を10分間インキュベートし、ビーズを分離および洗浄
する。次いで、ビーズの放射能の測定する。産生したシ
グナルは、試料中のHcy量に直接相関する。

（Ｃ）修飾試薬（IX）を用いるHcyのアッセイでは、修
飾Hcy（IX b）には特異的に結合するが、修飾Cys（IX
a）には結合しないモノクローナル抗体を支持体に結合
させる。西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）にコンジ
ュゲートさせた修飾Hcy（IX b）の類似体も使用する。H
cyおよびCysを含有する疑いのある試料を適切な媒質中
で修飾試薬（IX）と合わせる。反応が起こるのに充分な
時間が経過したら、抗Hcy支持体コンジュゲートおよび
修飾Hcy−HRPコンジュゲートを次いで媒質に加える。懸
濁液を30分間インキュベーション後、液相と固相を分離
し、固相を洗浄する。その後、基質を加えておいた水性
媒質を固相に加えると、産生したシグナルは、試料中の
Hcy量に反比例する。

本発明の方法は、更に、免疫学的に異質な分析物、即
ち“修飾”分析物と同族の免疫原に対するポリクローナ
ルおよびモノクローナル抗体の調製を含む。本発明の方
法に有用な抗体を得るために使用される免疫原は修飾分
析物であり、これはアッセイされる化合物を選択した修
飾試薬と反応させることにより得られる。典型的には、
免疫原を調製するために、まず、修飾試薬の可溶性基を
用いて、試薬を免疫原性キャリアータンパク質に結合さ
せる。普通、これらの結合性基をまず活性化し、次い
で、試薬をキャリアータンパク質に結合させる。その
後、得られた試薬−タンパク質コンジュゲートを分析物
と反応させ、精製し、免疫原として使用する。

本発明は、第１化合物を第１化合物の同族体である第
２化合物の存在下で検出する方法に関するものである。
したがって、上記の抗体を、修飾試薬と第１化合物（分
析物）または第２化合物のいずれかとの反応生成物と特
異的に反応する、即ち、修飾分析物または修飾第２化合
物のいずれかと結合するその能力についてスクリーンす
る。例えば、Hcyのアッセイでは、免疫原は、免疫原性
キャリアータンパク質に連結させた誘導体化Hcyであろ
う。その場合、得られた抗体は、修飾Hcy分析物を特異
的に認識する能力があり、修飾Cysを認識しないもので
ある。

その他の基を用いて修飾試薬をタンパク質キャリアー
に結合させることができ、例えば、アルデヒド類、ケト
ン類、ジアゾニウム塩類、アルキル化剤、等がある。カ
ルボン酸またはスルホン酸を、適宜、コンジュゲーショ
ンのために活性エステルまたは酸ハライドに変換する。
キャリアータンパク質は、あらゆるタンパク質であるこ
とができ、好ましくは、免疫化した動物とは無関係のも
のであり、その動物が例えばマウス、ウサギ、ヒツジま
たはヤギであるならば、鍵穴カサガイヘモシアニンまた
はウシ血清アルブミンのようなものである。

本発明の方法に有用のポリクローナル抗体の調製は、
当分野ではよく知られている方法による。モノクローナ
ル抗体は、実質的に、MilsteinおよびKohlerのNature 2
56:495−497（1975）に記載と同様の方法により得られ
る。MilsteinおよびKohlerの方法の詳細は充分に確立さ
れている。一般に、この方法は、宿主、普通はマウスま
たは他の適切な動物に、免疫原を注射することを含む。
次いで、その動物の脾臓から細胞を取る。または、宿主
は非感作脾臓細胞であってもよく、これをインビトロで
免疫原に感作させてもよい。得られた細胞を骨髄腫細胞
と融合する。“ハイブリドーマ”と称されるハイブリッ
ド細胞が得られ、これをインビトロで培養できる。ハイ
ブリドーマの個体群をスクリーンし、それぞれが抗原に
対する単一抗体を分泌する、個々のクローンを単離する
操作を行う。

免疫原を宿主に導入するとき、宿主の免疫系は、免疫
原上の様々な部位を認識できる多様な抗体を産出するこ
とによって応答する。これらの多数の抗体は、異なる親
和性および特異性を有する。採用した特定のアッセイ法
について所望の親和性および特異性特性を有するこれら
の抗体を得るために、様々なハイブリドーマ細胞ライン
をスクリーンする。

便宜上、本発明に使用する試薬は、アッセイ法に使用
するキット中に提供することができる。Hcyを検出する
方法に使用する代表的なキットは、パッケージした組物
中に:HcyおよびCysを化学的に修飾して修飾Hcyおよび修
飾Cysを形成できる修飾試薬、および修飾Hcyには特異的
に結合できるが修飾Cysには結合できない抗体を含んで
なる。キットは、ジスルフィド形態中のあらゆるHcyを
解離するのに適した解離剤を含むこともできる。

適切な条件下では、キット中の１またはそれ以上の試
薬は、溶液状態、または溶解すると本発明の方法または
アッセイを実施するのに適切な濃度を有する試薬溶液と
なる、賦形剤を含む乾燥粉末、通常は凍結乾燥したも
の、として提供できる。主題発明の融通性を高めるため
に、同じかまたは別の容器に入れた試薬をパッケージし
た組み物中に提供でき、そうして試薬の比率が当該方法
およびアッセイの実質的な最適化をもたらすようにす
る。試薬をそれぞれ別々の容器に入れてもよく、また様
々な試薬を、その交差反応性および安定性に基づいて１
またはそれ以上の容器に組み合わせて入れることもでき
る。便宜上、本発明で用いた試薬を予め定めた量で提供
できる。試薬は、修飾分析物に特異的に結合できる第１
抗体および第２抗体、および分析物を化学的に修飾する
ための試薬を含むことができる。また、キットは、例え
ば一括挿入物（package insert）の形態における、試薬
の用い方および／または特定のアッセイの行い方につい
ての指示量を含んでいてもよい。

本発明を更に下記例示の実施例により説明する。

略語 AP アルカリホスファターゼ（子ウシ腸） BABA ｐ−ブロモアセチル安息香酸 BSA ウシ血清アルブミン Cys−ABA システインアセチル安息香酸 DCC ジシクロヘキシルカルボジイミド DPBS ダルベッコホスフェート緩衝化塩水 DTT ジチオトレイトール DMEM ダルベッコ修飾イーグル培地 DMSO ジメチルスルホキシド EDTA エチレンジアミンテトラ酢酸 FBS ウシ胎児血清 Hcy−ABA ホモシステインアセチル安息香酸 Hcy−ABA−BSA ホモシステインアセチル安息香酸−
ウシ血清アルブミン Hcy−ABA−AP ホモシステインアセチル安息香酸−ア
ルカリホスファターゼコンジュゲート NHS Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド PBS ホスフェート緩衝化塩水 PEG ポリエチレングリコール PNPP フェニルホスフェートＳ−DMEM スーパーダルベッコ修飾イーグル培地 RAM ウサギ抗マウス TCEP トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン THF テトラヒドロフラン材料の調製結晶化BSA CohnはICNから得た。APはPierceから得
た。その他全ての化学品は、試薬級であり、Gibcoおよ
びSigmaなどの供給元から市販されている。溶液は全てH
₂Oで調製し、反応は全て特記しない限り、周辺条件下で
行った。

Ａ）ｐ−ブロモアセチル安息香酸（分子量243）の製造４−アセチル安息香酸2.0g（12.2ミリモル）を500ml
エーレンマイヤーフラスコ中酢酸90mlに加え、45℃で溶
解するまで加熱した。温度を45℃に維持し、酢酸2mlに
溶解させた臭素1.95g（12.2ミリモル、0.61ml）を激し
く撹拌しながらゆっくりと１時間にわたり加えた。この
反応は、反応進行の前に数分の誘導期間を必要とし、こ
れは臭素の赤色の消失とHBrの放出により明白になっ
た。生成物BABA（修飾試薬II）を氷で沈澱させ、濾過し
て集め、熱エタノール（75℃）から３回再結晶化した。

Ｂ）ブロモアセチル安息香酸Ｎ−ヒドロキシスクシンア
ミドエステル（分子量340）の製造 BABAは上記のように製造し、１回再結晶化した。０℃
で乾燥THF8mlに溶解させたBABA0.6g（2.5ミリモル）お
よびNHS0.28g（2.5ミリモル）に、THF1ml中DCC0.51g
（2.5ミリモル）を加えた。数分後、沈澱が観察され、
この溶液を一晩撹拌した。この溶液をガラスフリットに
より濾過し、その容量を真空下で2mlまで減らした。容
量低減後、若干沈澱が観察された。過剰の石油エーテル
を加えて残りの生成物を沈澱させ、固体を限られた量の
THFに溶解し、濁るまで石油エーテルを再度加えること
により再結晶化し、次いで−20℃まで冷却し、濾過によ
り固体を集めた。BABA−NHSの収量0.2g。

Ｃ）システインアセチル安息香酸（分子量283）の製造 BABA60mgおよび１−システイン60mgを200mMリン酸ナ
トリウム、pH7.5の5.0mlに加え、10分間撹拌し、その後
1.0MHCl 0.5mlを加えて生成物を沈澱させた。固体を濾
過により集め、0.1MHClおよび次いで水で洗浄し、最終
的に真空乾燥させて、Cys−ABA（修飾Cys II a）を得
た。TLC分析（セルロース、0.1M酢酸アンモニウム、pH
6.8）およびNMR（100mM Na₂DPO₄、pH7.5;100mM NaDC
O₃、pH8.4;および100mM Na₂B₃O₇、pH9.3を含有するD₂O
にて記録したスペクトル）は、少なくとも３つの異なる
pH依存性生成物の存在を示した。質量分析（CI）では、
脱カルボキシル化を示す分子量221の親ピークを生じ
た。

Ｄ）ホモシステインアセチル安息香酸（分子量297）の
製造１−ホモシステインチオラクトン100mgを脱気した0.5
M NaOH5.0mlに加え、45℃で10分間加熱し、1.0M HClと
濃HClの組み合わせを用いてpH8.0に中性化した。BABA80
mgをHcy溶液に加え、15分間撹拌した。次いで、溶液を
0.22ミクロンシリンジフィルターを通して濾過し、生成
物を沈澱させるために1.0M HClの添加により溶液pHを２
まで下げた。固体Hcy−ABA（修飾Hcy II b）を0.1M HCl
で数回洗浄し、遠心分離により集め、真空乾燥させた。

Ｅ）ホモシステインアセチル安息香酸−ウシ血清アルブ
ミンコンジュゲートの製造 BSA25mgを100mMリン酸ナトリウム、pH7.5、5.0mlに溶
解し、この溶液を2.2mlをDMSO（＋BABA−NHS rxn）中10
0mM BABA−NHS200μｌ、またはDMSO単独200μｌ（−BAB
A−NHS rxn）に加え、３時間混合した。その後、２つの
試料を遠心分離して過剰の固体BABA−NHSを沈澱させ、
0.45ミクロンシリンジフィルターを通して濾過し、セン
トリコン30で５倍に濃縮した。濃縮溶液を100mMリン酸
ナトリウム、pH7.0、で1.0mlまで希釈した。20μｌずつ
を各溶液から取り出し、1.0mlまで希釈し、吸光度を計
測して反応効率を測定した。タンパク質濃度は、−BABA
−NHS反応（BSA、ε₂₈₀＝43,600）から決定し、タンパ
ク質結合BABA濃度は＋BABA−NHS反応（BABA、ε₂₆₀＝1
3,600）から決定した。

更にHcyを上記製造したBABA−活性化BSA溶液と反応さ
せた。1M NaOH0.5mlに１−ホモシステインチオラクトン
1.5mgを溶解し、37℃で10分インキュベートし、最終的
にpH7.0のリン酸ナトリウム2.0mlおよびpH6.0のリン酸
ナトリウム2.5mlで希釈する（最終pH7.0）ことにより、
20mM1−ホモシステインを製造した。上記製造した両方
のBSA溶液をH₂Oで4.0mlまで希釈し、Hcy溶液1.0mlをそ
れぞれに加え、一晩インキュベートした。反応物をセン
トリコン30で濃縮し、反応効率を、確保しておいた濾液
のBr^-濃度から見積もった。臭化物標準は、適当なKBr貯
蔵溶液２μｌを−BABA−NHS反応濾液98μｌに加えて、B
r^-濃度0.0、0.2、0.4、0.8、および1.0mMの標準を作る
ことにより製造した。製造したBr^-標準20μｌまたは＋B
ABA−NHS反応物由来の濾液20μｌを0.1Mクエン酸ナトリ
ウム、pH5.5、0.9mlに加え、次いで0.8mMフルオレセイ
ン20μｌおよび0.1MクロラミンT10μｌを加えた。10分
後、0.2M Na₂CO₃中25mMチオスルフェート20μｌを加え
て、反応を止め、各試料について吸光度を1cmセル中515
nmで記録した。標準の吸光度値をBr^-濃度に対してプロ
ットして標準曲線を作り、そこから＋BABA−NHS反応物
に含有されるBr^-濃度を測定した。この値から、BSA上の
BABA基とHcyとの結合効率の見積もりを得た。＋BABA−N
HS反応溶液をセントコリン30で４倍に濃縮し、１×PBS
で希釈し（最終濃度10mg/ml）、続く抗体開発のために
取っておいた。

Ｆ）ホモシステインアセチル安息香酸−アルカルホスフ
ァターゼコンジュゲートの製造 Hcy−ABA−APコンジュゲートを上記BSAコンジュゲー
トの場合と同様のやり方で製造した。AP10mlを100mMリ
ン酸ナトリウム、pH7.0、15mlで希釈し、セントリコン3
0で３倍に濃縮し、その後、200mMリン酸ナトリウム、pH
7.0を最終容量2.0mlまで加えた。２つの反応物を調製し
た:AP溶液0.48mlをDMSO中100mM BABA−NHS（＋BABA−NH
S rxn）45μｌまたはDMSO単独（−BABA−NHS rxn）45μ
ｌに加え、反応物を2.5時間混合した。次いで、反応物
を2.0mlH₂Oで希釈し、0.45μシリンジフィルターを通し
て濾過し、セントリコン30で５倍に濃縮し、最終的に10
0mMリン酸ナトリウム、pH7.0で1.0mlまで希釈した。各
試料20μｌを1.0mlまで希釈し、吸光度を記録し、APに
対するタンパク質結合BABAの比率を前記のように測定し
た（AP、ε₂₈₀＝110,000;BABA、ε₂₆₀＝13,600）。

BABA−活性化APを下記のようにHcyと反応させた。１
−ホモシステインチオラクトン9.3mgを1.0M NaOH 0.5ml
に溶解し、37℃で15分間インキュベートした。Hcyを0.5
M Na₂HPO₄およびH₂Oで中性化し、最終容量5mlおよびpH
7.0にした。Hcy溶液200μｌを上記製造した両方のAP溶
液に加え、37℃で４時間インキュベートした。次いで、
反応物をセントリコン30で濃縮し、濾液を確保した。

BABA−活性化APとHcyとの結合反応度は、放出されたB
r^-濃度から見積もった。標準溶液は、貯蔵KBr溶液２μ
ｌの組成物中の濾液に似た緩衝液（0.5M Hcy200μｌに
加えた100mMリン酸ナトリウム、7.0、1.0ml）98μｌと
混合し、0.0、0.05、0.1、0.15、および0.2mM臭化物イ
オンの標準を得ることにより製造した。Br^-標準または
＋BABA−NHS rxn由来の濾液80μｌ、0.1Mクエン酸ナト
リウム、pH5.5、0.9mlに加え、次いで、0.4mMフルオレ
セイン40μｌおよび50mMクロラミンT30μｌを加え、10
分間インキュベートした。0.1M Na₂CO₃中15mMチオスル
フェート50μｌを加えて反応を止め、515nmでの吸光度
を記録した。＋BABA−NHS rxn濾液中に含まれるBr^-濃度
を標準曲線から測定し、Hcyとの反応の効率を見積もる
のに使用した。−BABA−NHSと＋BABA−NHS反応物の両方
をセントリコン30で５倍に濃縮し、１×PBSを加えて最
終容量400μｌにした。

誘導体化APの活性は、H₂O100μｌ中の各AP溶液の２μ
ｌを希釈し、希釈溶液２μｌを50mMトリスCl、pH9.4
中、1mg/mlのPNPP1.0mlに加えることにより評価し、30
秒にわたり記録した吸光度の変化を比較した。

Ｇ）Hcy−ABA−BSAモノクローナル抗体の生成および単
離１）免疫原、免疫感作、および酵素コンジュゲート Hcy−ABA−BSA免疫原を上記のように製造した。マウ
スを、RIBIアジュバント系に乳化させた免疫原100μｇ
で１回、50μｇで２回腹腔内免疫感作させた。融合前の
３日、マウスには免疫原250μｇを含有する塩水ブース
トを腹腔内的に与えた。

Hcy−ABA−APをスクリーニングに用いた。

２）組織培養Ｓ−DMEMを全ての組織培養に用いたが、これは下記の
ものを補足したDMEMからなる： 10％FBS 10％NCTC−135（Gibco＃440−1100EC） 4mMグルタミン 1mMオキサロ酢酸 1mMピルビン酸ナトリウム 0.148nM Ｌ−システイン 200単位インシュリン 37.9mM重炭酸ナトリウムならし培地は、P388D1細胞（ATCC TIB 63）をＳ−DME
M中で生育させ、４ないし５日毎に1:4に分ける（spli
t）ことにより調製した。スペント培地（spent media）
を1500rpmで15分間遠心分離した。次いでこのスペント
培地を0.2ミクロン滅菌組織培養フィルターユニットを
用いて濾過し、残っている細胞および異物を除去した。
グルタミン（100×ストック＝58.5g/L）をこのスペント
培地に加え、その後使用するか、または先の使用のため
に−20℃で凍結した。ならしＳ−DMEMは、Ｓ−DMEMに10
％P38D1スペント培地を補足しすることにより製造し、
次いで、それを融合後のおよびクローニング中のハイブ
リドーマ成長を支持するために使用した。

マウス骨髄腫細胞ラインP3X63 Ag8.653（Ag8.653、AT
CC CRL 1580）は、毎日1:2ないし1:4に分けることによ
り、または２日間の６−ウェルプレートでの連続希釈に
より培養中維持された。

３）融合融合は、実質的に、MilsteinおよびKohler、Nature 2
56:495−497（1975）の方法に従って行った。

２匹の免疫感作マウスから脾臓を無菌的に除去し、10
mlDMEMを含有する60mm組織培養皿に置いた。これらを２
・３回切り刻み、その後、つや消しスライド２枚の端に
挟んですり潰した。脾臓細胞の単一細胞懸濁液は細胞懸
濁液を単繊維スクリーンクロスに通すことにより得られ
た。脾臓細胞、約２×10⁸細胞を、40×10⁶Ag8.653細胞
と一緒にし、800rpmで５分間遠心分離し、DMEMで１ない
し２回洗浄した。PEG（75mMヘペス中50％溶液）4.0mlを
穏やかに撹拌しながら３分間かけて添加することにより
融合を行い、次いでＳ−DMEMないし40mlを加えてPEGを
不活性化した。細胞懸濁液を800rpmで５分間遠心分離し
た。上清を流し捨て、細胞をＳ−DMEM−HAT（ストックH
AT＝50×Sigma＃H0262;培地中:100μＭヒポキサンチ
ン、0.4μＭアミノプテリン、および16μＭチミジン）
で再懸濁させ、12個の96−ウェル培養プレートに200μL
/ウェルで培養した。

細胞は、スペント培地100μl/ウェルを除去し、なら
しＳ−DMEM−HATの200μl/ウェルを融合後４ないし５日
連続添加することにより育てた。

融合後約７ないし10日、融合物をスクリーンした。こ
の場合、ハイブリドーマコロニーは、通常、目で見るこ
とができ、培地は依然ピンクであるか、またはちょうど
黄色に変わったところであった。

４）連続希釈によるクローニング次いで、ELISA陽性抗体を生成するハイブリドーマを
確実に単一細胞コロニーを得るために連続希釈により数
回クローンした。その操作は下記の通りである。

96−ウェルプレートの１ウェルから内容物をならしＳ
−DMEM1.5ml/ウェルを含有する24−ウェルプレート中の
１ウェルに移した。細胞をピペット操作により混合し、
100μl/ウェルを、ならしＳ−DMEM200μl/ウェルを含有
する96−ウェルプレートの第１列に加えた。100μl/ウ
ェルをフロウ・マルチチャンネルピペッターを用いて第
２列に移し、ピペット操作により混合し、再度、100μl
/ウェルを次の列に移した。各“クローン”を連続的に
７倍に希釈し、プレート当たり１ないし４クローンにし
た。細胞を３ないし４倍の制限希釈により、または安定
するまで再クローンした。

５）細胞ラインの凍結および解凍 ELISA＋であるクローン化かつ安定化した細胞ライン
を−100℃で貯蔵した。96−ウェルプレートから選択し
たウェル（クローン）は、細胞を毎日継代し、1.5ml/ウ
ェルＳ−DMEMの24−ウェルプレートから、次に8ml/ウェ
ルＳ−DMEMの６−ウェルプレートへ、最終的に50mlS−D
MEMのＴ−75フラスコへと広げることにより、増殖させ
た。

Ｔ−75フラスコからの細胞を800rpmで５分間遠心分離
し、凍結用培地、即ちＳ−DMEM中10％DMSO（ATCC＃76−
68−５）および更に10％FBS、3mlに再懸濁した。1ml
（３ないし５×10⁶細胞）ずつをピペットでクリオバイ
アルに移し、次いで、凍結容器に入れた。それから、そ
の容器を−100℃で１−２日間貯蔵し、次いでバイアル
を後に使用するために−100℃の凍結貯蔵ボックスに移
した。

バイアルを37℃の水浴中で暖めて細胞を解凍した。細
胞懸濁液をＳ−DMEM5mlを含有する15ml遠心分離管に移
し、次いで、800rpmで５分間遠心分離した。上清をデカ
ントし、細胞をＳ−DMEM8mlに再懸濁し、細胞拡張（cel
l expansion）のために６−ウェルプレートにピペット
で移した。

６）スクリーニングまず、ハイブリドーマを競合型逆ELISAスクリーンに
よりスクリーンし、その後、逆ELISAによりスクリーン
した。ELISAスクリーンは全て室温で行った。競合型逆E
LISAプロトコールは、唯一濃度の、Hcyの修飾形態であ
るHcy−ABAを用いる一次スクリーンに使用して、抗体を
同定した。最善の抗体を同定するために、Hcy−ABAを抗
体の相対感度を測定するための２つの異なるレベルで用
いて競合型逆ELISAを行った。望ましくない交差反応性
があるかどうかを測定するためにBABAおよびCys−ABAも
使用した。逆ELISAプロトコールは、続くクローニング
プレートのスクリーンのために使用した。競合型逆ELIS
Aおよび逆ELISA用の試薬は下記の通りである： DPBS（10×）、pH7.4、1:10希釈 50mM炭酸緩衝液、pH9.0 ELISA洗浄緩衝液:DPBS中0.5％ツイーン20 プレートコート：ウサギ抗マウスIgG、Ａ、M;ヘビー
およびライト（Zymed）、製造元説明書により水2mlで再
構成、DPBS（RAM）中1:100希釈プレートブロック:DPBS中１％BSA 希釈液:DPBS中0.5％BSA;DPBS中1:2希釈したプレート
ブロック ELISA酵素−リガンドコンジュゲート:AP−Hcy−ABA、
希釈液中1:1500希釈；競合型逆ELISA:一次スクリーン
用、Hcy−ABAを希釈Hcy−ABA−AP中0.8μg/mlに希釈し
た；抗体の特性化用、Hcy−ABA、Cys−ABA、およびBABA
を炭酸緩衝液中希釈AP−Hcy−ABAの１μg/mlおよび1ng/
mlに希釈した。

基質緩衝液:1Mジエタノールアミン、0.25mM MgCl₂、p
H9.8 基質：基質緩衝液ml当たりｐ−ニトロフェニルホスフ
ェート0.25mg。

競合型逆ELISAおよび逆ELISAのプロトコールは、下記
の通りである： 1. プレートをRAM50μl/ウェルでコートし、１時間ま
たは１週間まで４℃でインキュベートし、次いで、ウェ
ルの中身を空にした。

2. プレートを300μl/ウェルでブロックし、15分イン
キュベートし、次いで、ウェルの中身を空にした。

3. 抗体（スペント培地）を50μl/ウェル加え、45分イ
ンキュベートし、３回洗浄した。

4. 競合型逆ELISA:50μl/ウェルのAP−Hcy−ABAまたは
AP−Hcy−ABA加えるHcy−ABA、AP−Hcy−ABA加えるCys
−ABA、またはHcy−ABA−AP加えるBABAを加えてプレー
トを複製した。逆ELISA:50μl/ウェルのAP−Hcy−ABAを
加えた。プレートを45分インキュベートし、３回洗浄し
た。

5. 基質を100μl/ウェル加え、振盪器で20ないし30分
間インキュベートし、405nmで読んだ。

6. １次スクリーンで陽性のものは、AP−Hcy−ABA単独
の場合0.9以上のODsを有する抗体であり、Hcy−ABA−AP
＋Hcy−ABAの場合、50％以上競合した。競合パーセント
は下記のようにして求める：逆ELISAプロトコールを用いるスクリーニングクローニ
ングプレートに由来する陽性のものは、高いODの単一コ
ロニーまたは極少数のコロニーを有するウェルであっ
た。

７）イン・ビトロでの抗体の製造および精製その後、クローン化し、安定化したELISA陽性ハイブ
リドーマを静置培養に移した。ハイブリドーマを２つの
T225フラスコ（スペント培地500ml）または４つのT225
フラスコ（スペント培地1L）に過剰増殖させた。細胞お
よび異物を遠心分離および濾過により分離した。精製す
る前にアジ化ナトリウムを0.02％で加えた。

静置培養で生じた抗体をプロテインＧカラムクロマト
グラフィーにより精製した。精製は、室温で行った。プ
ロテインＧ精製に使用した試薬は下記の通りである：洗浄／結合緩衝液、PBSpH7.0:0.01Mリン酸ナトリウ
ム、0.15M塩化ナトリウム、および0.20％アジ化ナトリ
ウム溶離緩衝液：水酸化アンモニウムでpH3.0に調整した
0.5M酢酸中性化溶液:1Mトリス塩基クリーニング緩衝液:1M酢酸。

プロテインＧ精製に使用したプロトコールは下記の通
りである： 1.カラムにプロテインG10mlを充填し、洗浄／結合緩衝
液25mlで洗浄した。

2.抗体（スペント培地）、0.5ないし1Lをカラムにのせ
る。

3.カラムを洗浄／結合緩衝液で、ODが基線にもどるま
で、または約50mlを用いて洗浄した。

4.抗体を溶離緩衝液で溶出した。１画分当たり2mlを既
に中性化溶液1mlを含有する試験管に集めた。

5.抗体ピークをプールし、DPBS、pH7.4の4Lに対して一
晩透析した。

6.カラムをクリーニング緩衝液約25mlで洗浄し、次い
で、洗浄／結合緩衝液で再平衡化した。

7.抗体純度は、単一バンドの存在についてパラゴン電気
泳動によりチェックした。抗体濃度は、まず280nmでの
抗体溶液のODを得、次いで、IgGに対する消光係数を用
いて抗体濃度を計算することにより決定した:A₂₈₀（1mg
/ml）＝1.35。

結果：競合逆ELISAデータから、Hcy−ABAと十分に競
合した、およびあったとしてもCys−ABAまたはBABAと不
完全に競合した30の抗体が示された。Hcy−ABA−の１μ
g/mlでの感度は、非常に良好であった。Hcy I 5C12と称
するクローンから抗体を下記実施例に用いるために選択
した。

Ｈ）ビオチン−Hcy I 5C12の製造 0.7mg/ml抗体溶液（Hcy I 5C12）400μｌをセントリ
コン30で２倍に濃縮し、100mM炭酸ナトリウム、pH8.5で
希釈した。溶液を濾過し、緩衝液を加えて、容量を300
μｌ（最終濃度1mg/ml）にした。抗体溶液に、DMSO中1m
g/mlビオチンアミド−カプロエート−NHSエステル36μ
ｌを加え、２時間インキュベートした。反応物をセント
リコン30で５倍に濃縮し、最後に、50mMリン酸ナトリウ
ム、pH7.5を加えて、最終容量1mlにした。抗体の濃度
（100μg/ml）は280nm吸光度から測定した（1.2mg/ml→
吸光度1.0）。ビオチニル化の成功は、ストレプトアビ
ジンの不在下または存在下で非修飾化抗体とビオチニル
化抗体との移動度を比較することにより、パラゴンゲル
電気泳動により評価した。ビオチン−Hcy I 5C12溶液
は、最後にセントリコン30で容量50μｌまで濃縮した。

実施例Ｉ DTT−亜砒酸塩還元を用いるHPLCモノシステインアッセ
イ EDTAで凝固停止した全血液の試料200μｌに、等分の
1.0mM Hcyを加え、最終濃度０、10、20、30、40μＭに
した。血液を室温で２時間インキュベートし、次いで、
４℃で３日間貯蔵して、Hcyの遊離還元型、遊離ジスル
フィド型およびタンパク質結合型の間で平衡にした。各
血液試料から得られた血漿20μｌを、100mM DTT10μｌ
および1.0M炭酸ナトリウム、pH8.2、30μｌを加え、37
℃で30分間インキュベートすることにより還元した。続
いて、試料中のタンパク質をミリポア・ウルトラフリー
MC（10K分子量カットオフ）で濾過して除去した。過剰
のDTTを、濾液20μｌに1.0M亜砒酸ナトリウム10μｌを
加えて、10分間インキュベートすることにより、封鎖し
た。10mM BABAの10μｌを加え、反応物を更に10分間イ
ンキュベートした。その後、得られた血漿試料をHPLCで
分析し、Hcy−ABAピークを定量し、総血漿Hcyを正確に
測定した。（20μｌ注入、1.0ml/分、10cm Alltech Eco
nosphere C18カラム、勾配:100mM Et₃N−HOAc中１−10
％CH₃CN、pH5.5、15分以上）。データは、線形最小二乗
分析に十分に一致した。ゼロ領域に外挿すると、血漿単
独試料は、予想値（12μＭが正常である）以上の値、28
mM Hcyを記録した。しかしながら、貯蔵血液中のHcy濃
度は、実質的に経時増加することが示された。

実施例II 低mM濃度でのTCEPは、緩衝液中のHcyを定量的に還元
することが示された。TCEPが血漿中のジスルフィドを還
元する場合にもまた有効であることを示すために、血漿
単独（Hcyなし）を、TCEPで前還元するか、またはしな
いでBABAと反応させた。血漿20μｌを1.0M重炭酸ナトリ
ウム30μｌおよび10μｌのH₂Oまたは20mM TCEP10μｌに
加え、37℃で５分間インキュベートした。

その後、10mM BABA60μｌを加え、反応混合物を５分間
インキュベートした：タンパク質を上記のように濾過して除去し、反応物をHP
LC（勾配:1％トリフルオロ酢酸中１−20％CH₃CNで15分
以上；これ以外は上記の条件）によりHcy−ABAについて
分析した。TCEPが存在しなければ何等生成物は観察され
なかった。HPLC分析は、Hcy−ABAピークが完全に他の化
合物から分離されていないこと、およびTCEPでの還元が
血漿（または血清）中のジスルフィド還元をもたらす証
拠として、実験を定量的な点で考察しなければならない
ことも示していた。

実施例III Hcy−ABA−APのビオチン−Hcy I 5C12への結合のHcy−A
BA阻害１×PBS、5ngのHcy−ABA−APを含有する0.05％トゥイ
ーンの100μｌを、Hcy−ABAを含有するH₂O 100μｌに、
濃度0.125、0.25、0.5、1.0、または4.0μＭで加えた。
ビオチン−Hcy I 5C12 10ngを含有するPBS−トゥイーン
100μｌを加え、反応物を20分間インキュベートした。
前線上したストレプトアビジン−被覆粒子（１ペレッ
ト）を300μlPBS−トゥイーンに懸濁し、20μｌを反応
物に加えた。粒子が懸濁状態であるように反応管を15分
間撹拌した。次いで、粒子をPBS−トゥイーンで５回洗
浄し、粒子の溶液からの分離を、磁気ストリップを含有
するチューブホルダーで粒子を側面に引っ張ることによ
り、容易にした。50mMトリスCl、pH9.3中1mg/mlPNPP基
質300μｌを加え、20分間混合した。各反応管から溶液2
00μｌのマイクロタイタープレートへ移し、プレートリ
ーダーで414nmでの吸光度を記録した。予想したとお
り、Hcy−ABAの濃度が増加すると、記録される吸光度の
大きさの低減が生じた。シグナル調節は、0.04ないし0.
67mMの有効溶液濃度範囲の＞50％であり（ゼロ濃度デー
タポイントは記録せず）、血清試料の実質的な希釈が可
能であって、依然、イムノアッセイにおける適当な感度
レベルを維持した。

実施例IV ホモシステイン−スパイク化血清のアッセイ血清試料を10、20、30および40μM Hcyでスパイク（s
pike）した（Hcyとして、即ち、Hcyの二量体形態として
加えた）。６つの反応物を準備したが、その内、５μｌ
の各Hcy−スパイク化血清試料または血清試料単独（２
つの反応物）は、1.0Mリン酸ナトリウム、pH7.5、10μ
ｌおよび10mM TCEP10μｌを加え、10分間インキュベー
トすることにより、還元した。５試料中得られた遊離の
Hcyを誘導体化、即ち、8mM BABA40μｌを加え、10分間
インキュベートすることにより“修飾”した。“血清単
独”試料の１つには、BABAの代わりにブロモアセトアミ
ドを加え、ゼロHcy−ABA対照を作った。次いで、BABA
（１試料）またはブロモアセトアミド（５試料）を加え
て、試薬を均等に混合し、その後連続してHcy−ABA−AP
10ngを含有するPBS−トゥイーン100μｌおよびビオチン
−Hcy I 5C12 20ngを含有するPBS−トゥイーン100μｌ
を加え、15分間インキュベートした。ストレプトアビジ
ン被覆粒子懸濁液20μｌを加え、反応物を15分間撹拌し
た。PBS−トゥイーンで５回洗浄後、反応物をPNPPで展
開し、上記のように分析した。データポイントは、加え
たHcy対記録した吸光度のプロットでの滑らかな曲線に
一致した。血清単独、ブロモアセトアミド誘導体化試料
から読んだその吸光度は、曲線に一致しており、血清単
独試料の内生Hcy濃度（加えたHcy0mM）をゼロHcy−ABA
（＋ブロモアセトアミド）対照との比較により見積もっ
た。グラフから、血清試料のHcy濃度は、15μＭであ
り、その値は、正常個体の場合に予想した範囲内であ
る。

上記発明は、明確さおよび理解を求める目的で例示説
明および実施例によりある程度詳細に記載したが、ある
程度の変化または修飾が添付の請求の範囲内で実施され
得ることは明らかであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者グッドマン，トーマス・シーアメリカ合衆国94025カリフォルニア州マウンテン・ビュー、ホイットニー・ドライブ 2435番 (72)発明者ウルマン，エドウィン・エフアメリカ合衆国94025カリフォルニア州アサートン、セルビー・レイン135番 (56)参考文献特開昭63−221249（ＪＰ，Ａ) 特開昭63−195569（ＪＰ，Ａ) 特開平６−347460（ＪＰ，Ａ) 特表平７−501878（ＪＰ，Ａ) 国際公開93／15220（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/48 - 33/98

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】免疫学的に関連する複数化合物を含有する
疑いのある試料中の第１化合物の存在または量を、第２
化合物の存在下で測定する方法であって：（ａ）水性媒質中で：（１）該試料、（２）第１化合物と第２化合物を化学的に修飾して修飾
第１化合物および修飾第２化合物を形成できる修飾試
薬、および（３）修飾第１化合物には特異的に結合して免疫複合体
を形成できるが修飾第２化合物には結合できない抗体；を一緒にし、そして（ｂ）該試料中の該第１化合物の存在または量に相関す
る、該抗体の修飾第１化合物への結合度を測定する、各工程を含んでなる方法。
【請求項２】該複数化合物が同族体である、請求の範囲
第１項記載の方法。
【請求項３】該第１および第２化合物がホモシステイン
およびシステインである、請求の範囲第１項記載の方
法。
【請求項４】該修飾試薬がアルキル化剤、アシル化剤、
および金属類からなる群から選択される、請求の範囲第
１項記載の方法。
【請求項５】該修飾試薬が検出可能な標識を有し、その
標識を検出することにより、抗体の修飾第１化合物への
結合度を測定する、請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項６】該抗体が支持体に結合しているか、または
支持体に結合させることができるものである、請求の範
囲第５項記載の方法。
【請求項７】該抗体が検出できるように標識されている
か、または検出できるように標識されることができるも
のであり、該標識を検出することにより、抗体の修飾第
１化合物への結合度を測定する、請求の範囲第１項記載
の方法。
【請求項８】更に、検出可能な標識に結合させた該修飾
第１化合物の類似体を一緒にすることを含んでなり、該
抗体もまたその類似体に特異的に結合でき、そして該類
似体の該抗体への結合度を測定することにより、該抗体
の該修飾第１化合物への結合度を測定する、請求の範囲
第１項記載の方法。
【請求項９】該抗体が支持体に結合しているか、または
支持体に結合させることができるものである、請求の範
囲第８項記載の方法。
【請求項１０】ホモシステインを含有する疑いのある試
料中のホモシステインの量を、システインの存在下で測
定する方法であって：（ａ）水性媒質中で：（１）該試料、（２）ホモシステインとシステインを化学的に修飾して
修飾ホモシステインおよび修飾システインを形成できる
修飾試薬、および（３）修飾ホモシステインには特異的に結合して免疫複
合体を形成できるが修飾システインには結合できない抗
体；を一緒にし、そして（ｂ）該試料中のホモシステインの量に相関する、該免
疫複合体の量を測定する、各工程を含んでなる方法。
【請求項１１】該修飾試薬が該ホモシステインと該シス
テインのスルフヒドリル基を修飾して、硫黄が環の一部
でない修飾ホモシステインと、硫黄が環の一部である修
飾システインとを形成する、請求の範囲第10項記載の方
法。
【請求項１２】該修飾試薬がアルキル化剤、アシル化
剤、および金属類からなる群から選択される、請求の範
囲第10項記載の方法。
【請求項１３】該修飾試薬が検出可能な標識を有し、該
標識を検出して該免疫複合体の量を測定する、請求の範
囲第10項記載の方法。
【請求項１４】該抗体が支持体に結合しているか、また
は支持体に結合させることができるものである、請求の
範囲第13項記載の方法。
【請求項１５】該抗体が検出できるように標識されてい
るか、または検出できるように標識されることができる
ものであり、該標識を検出して該免疫複合体の存在また
は量を測定する、請求の範囲第10項記載の方法。
【請求項１６】更に、検出可能な標識に結合させた該修
飾ホモシステインの類似体を一緒にすることを含んでな
り、該抗体もまたその類似体に特異的に結合して第２の
免疫複合体を形成でき、該類似体が該抗体へ結合して該
第２の免疫複合体を形成する度合いを測定することによ
り、該該第１の免疫複合体の存在または量を測定する、
請求の範囲第10項記載の方法。
【請求項１７】該抗体が支持体に結合しているか、また
は支持体に結合させることができるものである、請求の
範囲第16項記載の方法。
【請求項１８】ホモシステインを含有する疑いのある試
料中のホモシステインの量を、システインの存在下で測
定する方法であって：（ａ）水性媒質中で：（１）該試料、（２）ホモシステインとシステインを化学的に修飾して
修飾ホモシステインおよび修飾システインを形成できる
修飾試薬、（３）検出可能な標識に結合させた該修飾ホモシステイ
ンの類似体、および（４）該修飾ホモシステインおよび該類似体には特異的
に結合するが該修飾システインには結合できない抗体；を一緒にし、そして（ｂ）該試料中のホモシステインの量に相関する、該類
似体の該抗体への結合度を測定する、各工程を含んでな
る方法。
【請求項１９】該修飾試薬がアルキル化剤、アシル化
剤、および金属類からなる群から選択される、請求の範
囲第18項記載の方法。
【請求項２０】該抗体が支持体に結合しているか、また
は支持体に結合させることができるものである、請求の
範囲第18項記載の方法。
【請求項２１】更に、第１特異的結合対構成員に結合さ
せた支持体を一緒にすることを含んでなり、該抗体を相
補的第２特異的結合対構成員に結合させる、請求の範囲
第20項記載の方法。
【請求項２２】該標識が、蛍光剤類、放射性標識類、酵
素類、化学発光剤類、および光増感剤からなる群から選
択される、請求の範囲第18項記載の方法。
【請求項２３】該抗体をシグナル生成系の第１構成員に
結合させ、該検出可能な標識がシグナル生成系の第２構
成員であり、該シグナル生成系構成員の相互作用により
生じたシグナルを検出することにより、該抗体の該類似
体への結合度を測定する、請求の範囲第18項記載の方
法。
【請求項２４】ホモシステインおよびシステインを含有
する疑いのある試料中のホモシステインの量を測定する
方法であって：（ａ）水性媒質中で：（１）該試料、（２）ホモシステインとシステインを化学的に修飾して
修飾ホモシステインおよび修飾システインを形成できる
修飾試薬、（３）該修飾ホモシステインには特異的に結合して免疫
複合体を形成するが該修飾システインには結合できない
抗体；（４）該抗体に結合できる表面、および（５）該修飾ホモシステインの標識化類似体を一緒にし、そして（ｂ）該試料中のホモシステインの量に相関する、該標
識化類似体の該抗体への結合度を測定する、各工程を含
んでなる方法。
【請求項２５】該修飾試薬がアルキル化剤、アシル化
剤、および金属類からなる群から選択される、請求の範
囲第24項記載の方法。
【請求項２６】該標識化類似体の標識が、蛍光剤類、放
射性標識類、酵素類、化学発光剤類、および光増感剤か
らなる群から選択される、請求の範囲第24項記載の方
法。
【請求項２７】更に、標識化第１特異的結合対構成員を
一緒にすることを含んでなり、該標識化類似体の標識が
相補的第２特異的結合対構成員である、請求の範囲第24
項記載の方法。
【請求項２８】ホモシステインおよびシステインを含有
する疑いのある試料中のホモシステインの量を測定する
方法であって：（ａ）水性媒質中で：（１）該試料、（２）ホモシステインとシステインを化学的に修飾して
修飾ホモシステインおよび修飾システインを形成できる
修飾試薬、（３）該修飾ホモシステインには特異的に結合して免疫
複合体を形成するが該修飾システインには結合できない
抗体、および（４）該修飾ホモシステイン上に存在する該修飾試薬の
一部、に結合できる受容体；を一緒にし、そして（ｂ）該試料中のホモシステインの量に相関する、該抗
体の該受容体への結合度を測定する、各工程を含んでな
る方法。
【請求項２９】該修飾試薬の一部はハプテン類、ビオチ
ン、およびフルオレセインからなる群から選択され；該
受容体が、抗体類、アビジン、およびストレプトアビジ
ンからなる群から選択される、請求の範囲第28項記載の
方法。
【請求項３０】ホモシステインを含有する疑いのある血
清試料中のホモシステインの量を、システインの存在下
で測定する方法であって、該ホモシステインの少なくと
も一部はジスルフィド形態（タンパク質結合および遊離
ジスルフィド）であり：（ａ）水性媒質中で：（１）該試料、（２）ジスルフィド形態から該ホモシステインを解離さ
せる解離剤、（３）ホモシステインとシステインのスルフヒドリン基
を化学的に修飾して修飾ホモシステインおよび修飾シス
テインを形成できる修飾試薬、および（４）該修飾ホモシステインには特異的に結合して免疫
複合体を形成するが該修飾システインには結合できない
抗体；を一緒にし、そして（ｂ）該試料中のホモシステインの量に相関する、該免
疫複合体の量について該媒質を検査する、各工程を含ん
でなる方法。
【請求項３１】システインのスルフヒドリル基を化学的
に修飾することが、６員環の形成を含んでなる、請求の
範囲第30項記載の方法。
【請求項３２】ホモシステインのスルフヒドリル基を化
学的に修飾することが、６員環の形成を含まない、請求
の範囲第31項記載の方法。
【請求項３３】解離剤が還元剤である、請求の範囲第30
項記載の方法。
【請求項３４】該修飾試薬が、Cl、Br、Ｉ、スルホネー
ト類、およびスルホニウム塩からなる群から選択される
脱離基によりアルファ位で置換されたケトンである、請
求の範囲第30項記載の方法。
【請求項３５】酵素活性、化学発光、光吸収、または放
射能の検出により、該免疫複合体の量を測定する、請求
の範囲第30項記載の方法。
【請求項３６】第１化合物を第２化合物の存在下で検出
する方法において使用するためのキットであって、該化
合物群は免疫学的に関連しており、パッケージした組物
中に：第１化合物および第２化合物を化学的に修飾して修飾第
１化合物および修飾第２化合物を形成できる修飾試薬、
および該修飾第１化合物には特異的に結合できるが該修飾第２
化合物には結合できない抗体を含んでなる、キット。
【請求項３７】更に該修飾第１化合物の標識化類似体を
含んで成る、請求の範囲第36項記載のキット。
【請求項３８】ホモシステインを検出する方法において
使用するためのキットであって、パッケージした組物中
に：ホモシステインおよびシステインを化学的に修飾して修
飾ホモシステインおよび修飾システインを形成できる修
飾試薬、および該修飾ホモシステインには特異的に結合できるが該修飾
システインには結合できない抗体、を含んでなる、キット。
【請求項３９】更に該修飾ホモシステインの標識化類似
体を含んで成る、請求の範囲第38項記載のキット。
【請求項４０】更にジスルフィド形態中に存在するあら
ゆるホモシステインを解離する解離剤を含んで成る、請
求の範囲第38項記載のキット。