【発明の詳細な説明】
ホモシステインのイムノアッセイ
発明の背景
発明の分野
ホモシステイン(Hcy)は、メチオニンをシステイン(Cys)に変換するトラ
ンススルフレーション(硫黄転移)経路にて生産される一連の中間体の1つであ
る。哺乳動物における専らのHcy源は、S−アデノシル−ホモシステインの酵素
触媒化加水分解産物に由来する。一度形成されたHcyは、再メチル化およびメチ
オニンへの変換を経て再び回路に入るか、またはセリンと化合してシスタチオニ
ンを形成することができ、これが、最終的にCysに変換される。メチオニンシン
ターゼによりHcyをメチル化する主要な代謝経路は、メチル転移補助因子として
ビタミンB12(コバラミン)を、最終的なメチル源として5−メチル−テトラヒ
ドロ葉酸を必要とする。意外なことではないが、血清Hcyのレベル上昇は、ビタ
ミンB12または葉酸の不十分な摂取、またはこれら2種のビタミンを適切に利用
する能力の欠乏に関連している。普通、葉酸を投与することにより、穏やかに上
昇したHcyのレベルを均衡にすることができ、その処置には不都合な副作用は殆
ど無い。
貧血に加えて、シスタチオンシンターゼ欠損遺伝子に対してヘテロ接合性であ
り、その結果正常酵素活性の50%を欠く個体は、特に、メチオニン負荷に続く
Hcyレベルの上昇の影響を受け易い。この遺伝的素因が、それ以外は健康な患者
における中度ホモシステイン尿症(尿中にHcyが排出される)の最も普通の原因
である。
最後に、穏やかに上昇したHcyのレベルと心臓血管疾患との間に相互関係があ
ることは明らかである。
このような理由から、正確なHcyアッセイの開発に大きな興味がもたれている
。
関連技術の説明
総ホモシステイン(Hcy)量を定量し、並びに遊離(還元およびジスルフィド)
形態とタンパク質結合形態(主にアルブミン)とを識別する幾つかの技術がある。
ホモシステイン尿症の原因に対する優れた洞察並びに現今の臨床分析法の更新
は、Ueland等、Clin.Chem.39(9):1764-1779(1993)において見ることができる。
Hcyアッセイの酵素的方法は、Sundrehagen等、PCT/GB93/00138に記載されて
おり、HcyをS−アデノシルホモシステインへと酵素触媒化変換した後の生成物
濃度を測定することによりHcyを間接的にアッセイするものである。
HcyおよびCysの高速液体クロマトグラフィー(“HPLC”)法は、当該技術
分野では知られている。この分析法は、クロマトグラフィー支持体への吸着と溶
出の差異により化合物HcyとCysとを識別するものである。Andersson等、Clin.
Chem.39(8):1590-1597(1993)は、遊離のおよび還元された総HcyおよびCysの測
定を記載している。
ガス−クロマトグラフ−質量分析法によるHcyおよびCys分析は、Allen等、
米国特許第4,940,658号に記載されている。Allen等のPCT/US92/05727には、メチ
オニンの代謝中に生産されるHcyとCysとの間の中間アミノ酸であるシスタチオ
ニンのクロマトグラフィーアッセイが記載されている。
Fiskerstrand等、Clin.Chem.39(2):263-271(1993)は、血清チオール類の蛍光
標識、続いてHcy誘導体の他の硫黄含有化合物からのクロマトグラフィー分離を
必要とする、総Hcyの完全自動化分析を記載している。
HPLC法によるHcyの同定は、しばしば、Fiskerstrand、上記文献に記載の
ような蛍光試薬での誘導体化、またはRefsum等、Clin.Chem.31(4)624-628(1985)
に記載のような放射性酵素技術を必要とする。更に、タンパク質配列分析による
Cysの同定は、アルキル化試薬での誘導体化を必要とする。例えば、Jue等、Ana
lyticla Biochemistry 210:39-44(1993)参照。
残念ながら、クロマトグラフィー法は、時間がかかり、大変な労力を要すると
いう不利点を有する。更には、現今のHcy分析法は、蛍光標識、例えば、ブロモ
ビマンによる事前の誘導体化を必要とし、これはブロモメチル基がHcyの遊離の
チオールと反応して、チオエステルを形成し、遊離の臭素イオンを放出するとい
うものである。このブロモビマン試薬は、溶液中の他の遊離の全てのチオールと
も反応し、それ故に、多様な誘導体化硫黄含有種のクロマトグラフィー分離が必
要である。
現今のHcy分析法の多くは、煩わしいクロマトグラフィー技術に頼るものであ
るので、より迅速かつ簡易な、抗体を基礎とするHcyアッセイに対する需要があ
る。Hcyのイムノアッセイは、問題があるとの予想から、今までのところ採用さ
れたことはなく、それはHcy分子が小さすぎて、抗体開発に有効なハプテンとし
て働く抗体認識部位がほとんど無いと思われていたためである。更には、抗体が
、単一メチレン基により構造が異なるHcyとCysとを識別するのに必要な抗原特
異性度を達成できない。従って、これらの化合物の高特異的定量および識別を可
能にするイムノアッセイ法の開発が現在要望されている。
望ましくない交差反応物を扱う技術は多数存在する。Brynes等、米国特許第4,
952,336号は、アンフェタミン−メタンフェタミンイムノアッセイにおいて試料
を水性過ヨウ素酸塩溶液で前処理して、交差反応物を除去する方法を記載してい
る。StevensonのPCT/GB90/01649は、試料を還元剤で前処理することによりリウ
マチ因子に起因する干渉レベルを低減する改良イムノアッセイに関するものであ
る。Mach等、米国特許第4,978,632号は、試料を酸化剤で前処理することにより
血液および血液産物に起因する干渉レベルを排除する改良イムノアッセイに関す
るものである。これらの前処理法は、交差反応物にのみ作用するものであり、分
析物に作用する方法は1つもない。
発明の概要
本発明は、免疫学的に関連する複数の化合物を含有する疑いのある試料中の第
1化合物の存在または量を、第2化合物の存在下で測定する方法に関するもので
あり、(a)水性媒質中で、試料、第1化合物と第2化合物を化学的に修飾して免
疫学的に異質である修飾第1化合物および修飾第2化合物を形成できる修飾試薬
、および修飾第1化合物には特異的に結合して免疫複合体を形成できるが修飾第
2化合物には結合できない抗体、を一緒にし;さらに(b)試料中の第1化合物の
存在または量に相関する、抗体の修飾第1化合物への結合度を測定する、各工程
を含んでなる。この方法は、特に、免疫学的に関連するCysの存在下でのHcyの
アッセイによく適している。
本発明の他の実施態様は、Hcyを含有する疑いのある試料中のHcyの量を、C
ysの存在下で測定する方法に関するものであり、(a)水性媒質中で、試料、Hcy
およびCysを化学的に修飾して修飾Hcyおよび修飾Cysを形成できる修飾試薬、
および修飾Hcyには特異的に結合して免疫複合体を形成できるが修飾Cysには結
合できない抗体、を一緒にし;さらに(b)試料中のHcyの量に相関する、免疫複
合体の量を測定する、各工程を含んでなる。
本発明の一実施態様は、Hcyを含有する疑いのある試料中のHcyの量を、Cys
の存在下で測定する方法に関し、(a)水性媒質中で、試料、HcyおよびCysを化
学的に修飾して修飾Hcyおよび修飾Cysを形成できる修飾試薬、検出可能な標識
に結合させた修飾Hcyの類似体、および修飾Hcyおよびその類似体には特異的に
結合できるが修飾Cysには結合できない抗体、を一緒にし;さらに(b)試料中の
Hcyの量に相関する、類似体の抗体への結合度を測定する、各工程を含んでなる
。
本発明のその他の実施態様は、HcyおよびCysを含有する疑いのある試料中の
Hcyの量を測定する方法に関するものであり、(a)水性媒質中で、試料、Hcyお
よびCysを化学的に修飾して修飾Hcyおよび修飾Cysを形成できる修飾試薬、修
飾Hcyには特異的に結合して免疫複合体を形成できるが修飾Cysには結合できな
い抗体、抗体を結合させることができる表面、および修飾Hcyの標識化類似体、
を一緒にし;さらに(b)試料中のHcyの量に相関する、標識化類似体の抗体への
結合度を測定する、各工程を含んでなる。
更に他の実施態様は、HcyおよびCysを含有する疑いのある試料中のHcyの量
を測定する方法に関し、(a)水性媒質中で、試料、HcyおよびCysを化学的に修
飾して修飾Hcyおよび修飾Cysを形成できる修飾試薬、修飾Hcyには特異的に結
合して免疫複合体を形成できるが修飾Cysには結合できない抗体、および修飾H
cy上に存在する修飾試薬の一部に結合できる受容体、を一緒にし;さらに(b)試
料中のHcyの量に相関する、抗体の受容体への結合度を測定する、各工程を含ん
でなる。
さらにその他の実施態様は、少なくともHcyの一部がジスルフィド形態(タン
パク質結合形態および遊離ジスルフィド形態)であるHcyを含有する疑いのある
血清試料中のHcyの量をCysの存在下で測定する方法に関するものであり、(a)
水性媒質中で、試料、Hcyをジスルフィド形態から解離する解離剤、Hcyおよび
Cysのスルフヒドリル基を化学的に修飾して修飾Hcyおよび修飾Cysを形成でき
る修飾試薬、および修飾Hcyには特異的に結合して免疫複合体を形成できるが修
飾Cysには結合できない抗体、を一緒にし;さらに(b)試料中のHcyの量に相関
する、免疫複合体の量を試験する、各工程を含んでなる。
本発明のその他の実施態様は、Hcy検出法に使用するめたのキットに関し、パ
ッケージした組物中に、HcyおよびCysを化学的に修飾して修飾Hcyおよび修飾
Cysを形成できる修飾試薬、および修飾Hcyには特異的に結合できるが修飾Cys
には結合できない抗体を含んでなる。このキットは、修飾Hcyの標識化類似体お
よび解離剤を含むこともできる。
特定の実施態様の説明
本発明は、分析物と免疫学的に関連する同族体の存在下に化合物を検出する方
法に関するものである。本発明の方法は、分析物とその同族体の両方を化学的に
修飾して、それらの免疫原性を高め、抗体認識を容易ならしめるものである。さ
らに重要なことは、このような修飾によりこれらの化合物を免疫学的に異質なも
のとすることである。化学修飾は、好ましくは化学基による水素の置換以上のも
のを含む。その場合、修飾した免疫学的に異質の化合物類に対する抗体を作成す
る。アッセイプロトコールは、分析物および類似体を化学的に修飾し、次いで、
修飾した分析物を上記抗体により免疫化学的に検出することからなる。特に、本
発明は、スルフヒドリルアミノ酸であるホモシステイン(Hcy)とシステイン(Cy
s)とを識別する定量免疫化学法に関するものである。HcyおよびCysは同族体で
ある:
HOOC−CH(NH2)−CH2−CH2−SH
ホモシステイン
HOOC−CH(NH2)−CH2−SH
システイン
更に、この2つの化合物はそれらのアミノ酸側鎖の長さにおいて炭素1つのみが
異なるだけであるので、Hcyに対して産生される抗体がCysと交差反応すると予
想されることから、HcyとCysは免疫学的に関連する。
更に本発明の特定の実施態様について説明を進める前に、多数の用語を定義す
る。
分析物:検出すべき化合物または組成物。分析物は、特異的結合対(“sbp”)
の構成員であることができ、リガンドであってもよく、一価(モノエピトープ性
)または多価(ポリエピトープ性)であり、普通は、抗原性またはハプテン性で
あり、単一の化合物または少なくとも1つの共通のエピトープ性部位または決定
因子部位を共有する複数の化合物である。
本発明は、分析物および同族体を化学的に修飾し、次いで、修飾した分析物を
検出することにより、分析物の同族体をも含む試料中の分析物を検出する方法を
提供するものである。そのため、試料中に対象となる分析物が存在するときのみ
その存在が検出されるような反応生成物を検出することにより、分析物を測定す
る。従って、“修飾した”分析物が実際にアッセイ中に検出される。分析物は、
宿主由来の体液、例えば、尿、血液、血漿、血清、唾液、精液、糞、たん、脳脊
髄液、涙、粘液、または同等物などの試料中に直接見い出すことができるが、好
ましくは血清または血漿である。この試料は、下記に述べるように、前処理する
こともできる。
特異的結合対の構成員(“sbp”構成員):他の分子の特定の空間的および極
性の構成と特異的に結合し、それによって、他の分子の特定の空間的および極性
の構成と相補的なものとして定義される領域を表面上または腔内に有する、2つ
の異なる分子のうちの1つ。sbp構成員は、例えば、免疫学的ペア、例えば抗
原−抗体の構成員のようなリガンドおよび受容体として表すことができる。“リ
ガンド”という用語は、受容体が天然に存在するかまたは調製できるあらゆる化
合物を表しており、“受容体”という用語は、分子の特定の空間的および極性の
構成、例えば、エピトープ性部位または決定因子部位を認識する能力のあるあら
ゆる化合物または組成物を表す。相補的sbp構成員は、例えばリガンドとその
相補的受容体のように、もう一方と結合するものである。sbp構成員は、抗原
および抗体のような免疫学的ペア、またはアビジンとビオチンまたはオリゴヌク
レオチドの相補鎖のような非免疫学的ペアであることができる。sbp構成員は
、また、低分子または低分子残基およびそれらの受容体であってもよい。低分子
は、分子量100から2000、好ましくは150ないし1000を有し、受容
体が存在するか、または調製できるかのいずれかである。低分子の例には、ビオ
チン、リセルグ酸、フルオレセイン、またはフルオレセイン誘導体、およびビタ
ミンB12があり、それぞれアビジンまたはストレプトアビジン、抗リセルグ酸、
抗フルオレセイン、および内因子である対応する受容体を持つ。低分子に対する
抗体は、低分子を免疫原性キャリアーに連結させることにより、調製できる。
支持体または表面:固相は典型的には支持体または表面であり、多くの形状、
例えば、ストリップ、ロッド、ビーズを含む粒子、および同等物のいずれか1つ
を持つことができる多孔性または非多孔性水不溶性物質である。適切な物質は当
該分野ではよく知られており、例えば、本明細書に参照して組み込んである、Ul
lman等、米国特許第5,185,243号、10-11欄に記載されている。sbp構成員の支
持体または表面への結合は、普通に文献から入手できるよく知られた技術により
達成することができる。例えば、“Immobilized Enzymes”、千畑一郎、Halsted
Press,New York(1978)およびCuatrecasas,J.Biol.Chem.245:3059(1970)参照。
どの型の固体支持体を用いるとしても、その表面に結合させた修飾分析物また
はその表面に結合させた受容体に特異的に結合する抗体を持つように処理しなけ
ればならず、該受容体は、そのような抗体またはその抗体とコンジュゲートした
低分子に特異的に結合するものである。例えば、アビジンまたはストレプトアビ
ジンは、0.5−1.5mmの球状ガラスビーズに共有結合でき、ビオチニル化抗体
を得ることができる。
シグナル生成系(“sps”):結合および/または非結合標識の量に相関する
検出可能なシグナルを産生する1またはそれ以上の成分で、少なくとも1つは標
識である成分。好ましくは、標識は、蛍光剤、放射性標識、酵素、化学発光剤、
または光増感剤であり、酵素活性、化学発光、光吸収または放射能を観察するこ
と
により検出する。
適切な標識には、例示であって限定ではないが、アルカリホスファターゼおよ
び西洋ワサビペルオキシダーゼのような酵素;QBレプリカーゼなどのレプリカ
ーゼの基質;プロモーター類;染料類;フルオレセイン、イソチオシアネート、
ロダミン化合物類、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、
o−フタルデヒド、およびフルオレカミンなどの蛍光剤;イソルミノールなどの
化学発光剤;増感剤;補酵素;酵素基質;121I、131I、14C、3H、32Pおよ
び35Sなどの放射性標識;ラテックスまたは炭素粒子などの粒子;金属ゾル;ク
リスタライト;リポソーム;細胞等があり、これらを更に染料、触媒または他の
検出可能な基、および同等物で標識してもよいし、また標識しなくてもよい。適
切な酵素および補酵素は、Litman等、米国特許第4,275,149号、19ないし28欄、
およびBoguslaski等、米国特許第4,318,980号、10ないし14欄に開示されており
;適切な蛍光剤および化学発光剤は、Litman等、米国特許第4,275,149号、30お
よび31欄に開示されており、全て出典明示により本明細書の一部としている。
目視試験、電磁放射、電気化学検出、光音響分光法などのような外的手段によ
り標識が検出可能なシグナルを産生できる方法は多数ある。標識または他のsp
s構成員もまたsbp構成員、他の分子、または支持体に結合できる。
標識は、直接、シグナルを産生できるので、シグナル産生のための更なる成分
を必要としない。多くの有機分子、例えば、蛍光剤は、紫外線および可視光を吸
収でき、その光吸収がエネルギーをこれらの分子に転移させ、それらを励起エネ
ルギー状態へと高める。その後、この吸収エネルギーは、第2波長での光放出に
より放散する。シグナルを直接産生する他の標識には、放射性アイソトープや色
素がある。
これとは別に、標識がシグナルを産生するのに他の成分を必要とする場合もあ
り、その場合、spsは、測定可能なシグナルを産生するのに必要な全ての成分
を含み、その成分には、基質、補酵素、増強剤、更なる酵素、酵素生成物と反応
する物質、触媒、アクチベーター、補助因子、阻害因子、スカベンジャー、金属
イオン、シグナル産生物質の結合に必要な特異的結合物質、および同等物を含む
ことができる。適切なシグナル産生系についての詳細な記載は、Ullman等、米国
特許第5,185,243号、11−13欄に見ることができ、これは参照して本明細書に組
み込んである。
標識は、多数のsbp構成員:修飾分析物に結合する抗体;修飾分析物に結合
する抗体の受容体;修飾分析物に結合する抗体とコンジュゲートした低分子に結
合することができる受容体;またはリガンド、特に修飾分析物の類似体、に共有
結合できる。標識のsbp構成員への結合は、化学反応の結果、標識の水素原子
をsbp構成員への結合で置換することにより達成することができ、また標識と
sbp構成員との間に連結基を含むこともできる。他のsps構成員もsbp構
成員と共有結合できる。例えば、蛍光剤や消光剤などの2つのsps構成員は、
修飾分析物の類似体および分析物に対する抗体にそれぞれ結合し、類似体との複
合体を形成する。複合体の形成により、蛍光剤と消光剤は極めて接近した状態に
なり、そうして消光剤が蛍光剤と相互作用してシグナルを産生可能にする。コン
ジュゲーション法は、当該分野ではよく知られている。例えば、参照して本明細
書に組み込んであるRubenstein等、米国特許第3,817,837号参照。本発明は、シ
グナル産生系の第1構成員に結合した抗体およびシグナル産生系の第2構成員と
して検出可能な標識を有することを意図する。例えば、検出可能な標識が分析物
類似体に結合するとき、抗体の類似体への結合度は、シグナル産生系構成員の相
互作用により産生したシグナルを検出することにより測定できる。
補助物質:様々な補助物質が、本発明に従う方法においてしばしば採用される
。例えば、緩衝液は、通常、アッセイ媒質やアッセイ成分の安定剤と同じく、ア
ッセイ媒質中に存在する。これらの添加物に加えて、アルブミンなどのタンパク
質類、ホルムアミドなどの有機溶媒類、第4級アンモニウム塩類、硫酸デキスト
ランなどのポリカチオン類、または界面活性剤類、特に非イオン性界面活性剤、
結合増強剤、例えば、ポリアルキレングリコール類、または同等物を含む場合が
しばしばある。
上記の通り、本発明は、分析物と免疫学的に関連する同族体の存在下に、化合
物を検出する方法に関するものである。
本発明の一方法は、免疫学的に関連する2種の化合物を含有する疑いのある試
料中の第1化合物の存在または量を、第2化合物の存在下で測定することに関す
るものである。この方法は、(a)水性媒質中で、試料、第1化合物および第2化
合物を化学的に修飾して修飾第1化合物および修飾第2化合物を形成できる修飾
試薬、および修飾第1化合物には特異的に結合して免疫複合体を形成できるが修
飾第2化合物には結合できない抗体、を一緒にし;さらに(b)試料中の第1化合
物の存在または量に相関する、抗体の修飾第1化合物への結合度を測定する、各
工程を含んでなる。本方法は、特に、それらの化合物が同族体である場合に有用
である。
本明細書で使用した“免疫学的に関連した”という用語は、2つの化合物で、
一方が対象となる分析物であり、それに対して交差反応性を示す抗体が存在する
ものを表すのに用いる。交差反応性の算定は、抗体へ等しく結合した2つの化合
物の濃度比率に基づく。異なる同族体に対する抗体は、しばしば高い交差反応性
を示す。それ故に、イムノアッセイでは、媒質中に同族体が存在する場合、化合
物を正確に測定できないことが多い。この場合に、分析物を検出するための抗体
試薬を用いると、たいてい一部の抗体が同族体に結合してしまい、偽陽性あるい
は、不正確な定量値を得ることとなる。イムノアッセイにおいて許容できる交差
反応性の度合いは、交差反応物の予想最大濃度、そのアッセイに要求される感度
、および必要な精度によって変わる。例えば、抗体がCysと10%交差反応性で
あり、Cysが検出しようとするHcyの最低レベルの5倍多い量で試料中に存在す
るならば、その場合、Hcyがその最低レベルであると、測定されたHcyのレベル
は50%高く出すぎることとなる。許容できる誤差が5%だけであるならば、交
差反応性は1%以下でなければならない。本発明において、修飾分析物に対する
抗体は、修飾同族体と低い交差反応性を示すものでなければならない。上に例示
説明したように、交差反応性の度合いを“高く”するか“低くする”かは、修飾
同族体の予想最大濃度および求められる感度および精度によって変わる。
本明細書で使用した“同族体”の用語は、同じ化学官能基を有し、さらに分子
中に−CH2−基1つが挿入されている点で次ぎのものとは異なる一系列の有機
化合物中の1化合物を表す。例えば、CH3OH(メタノール)、C2H5OH(
エタノール)およびC3H7OH(プロパノール)等は、全て同族体であり、同族
体系列を形成する。本発明の範囲内の同族体化合物の例は、ホモシステインとシ
ステイン、アンフェタミンとメタフェタミン、セリンとホモセリン、クエン酸と
ホモクエン酸、アスパラギン酸とグルタミン酸、アラニンとβ−アミノ−イソ酪
酸、テトラヒドロ葉酸とN5−メチルテトラヒドロ葉酸、オキサロ酢酸とα−ケ
トグルタル酸、ゲンチシン酸とホモゲンチシン酸、モルフィンとノルモルフィン
、および同等物である。
本明細書で使用した“修飾試薬”の用語は、2つの同族体と反応して、免疫学
的に異質の2つの新たな化合物を形成する試薬を意味するのに用いる。“免疫学
的に異質”という用語は、修飾分析物に対する抗体が修飾同族体に対して低い交
差反応性を示すので利用できるということを意味する。同族体は同じ官能基を有
し、異なる同族体に対する抗体は、しばしば高度の交差反応性を示す。故に、同
族体が媒質中に存在する場合、イムノアッセイにおいて化合物を正確に測定する
ことができない。修飾試薬は、アッセイされる化合物(“分析物”)およびその
同族体を化学的に修飾し、そうして2つの化合物を免疫学的に異質なものにする
能力を有する。結果として、修飾分析物に対する抗体は、修飾同族体に対してよ
り低い交差反応性を示すことになる。修飾試薬は、短時間内、通常は4時間以下
、好ましくは20分以下、最も好ましくは5分以下で両方の化合物を修飾するよ
うなものを選択する。それが試料中で他の化合物と反応する場合は、分析物との
反応に応じ得るような十分な量で使用しなければならない。適切な修飾試薬の例
には、アルキル化剤、アシル化剤、金属類、求核物質類、および親電子物質類が
ある。本発明は、放射性標識のような検出可能な標識が結合した修飾試薬を有す
ることも意図している。この場合、修飾分析物の量は標識を検出することにより
測定できる。
第1化合物を免疫学的に関連した第2化合物の存在下で検出する上記方法にお
いて、抗体は検出可能に標識され得るか、または検出可能に標識される能力があ
るものである。また、修飾試薬を標識する場合は、抗体は支持体に結合できるか
、
または支持体に結合できる能力があるものである。
本明細書で使用した“検出可能に標識される能力がある”および“支持体に結
合できる能力がある”との用語は、試薬、例えば、この場合では抗体が第1sb
p構成員または低分子と相補的第2sbp構成員または低分子の受容体に結合し
、次に標識または支持体に結合することを意味する。従って、実際には抗体は標
識されたり、支持体に結合したりしないが、相補的sbp構成員または受容体を
加えた時に、標識されたり、結合することになる。
上記方法は、更に、検出可能な標識に結合させた、または結合させることがで
きる修飾第1化合物の同族体と、その同族体と修飾第1化合物の両方に特異的に
結合できる抗体を一緒にすることを含むことができる。抗体の修飾第1化合物へ
の結合度は、同族体の抗体への結合度を測定することによって測定する。抗体は
、支持体に結合できるか、または支持体に結合する能力がある。
更に詳しくは、本発明は、試料中のHcyとCysを、それらを免疫学的に異質な
ものにする手段で化学的に修飾し、次いでHcyを検出することを含む。Hcyを含
有する疑いのある試料中のHcyの量を、Cysの存在下で測定する方法の1つは、
(a)水性媒質中で、試料、HcyおよびCysを化学的に修飾して修飾Hcyおよび修
飾Cysを形成できる修飾試薬、修飾Hcyには特異的に結合して免疫複合体を形成
できるが修飾Cysには結合できない抗体を、一緒にし;さらに(b)試料中のHcy
の量に相関する、免疫複合体の量を測定する、各工程を含んでなる。
本明細書で使用した“免疫複合体”の用語は、抗原の抗体への免疫学的結合に
より形成される複合体を意味する。
同様の標識化試薬は、ある化合物を免疫学的に関連のある化合物、即ち、標識
化修飾試薬、標識化抗体、および標識化類似体の存在下で検出する本方法におけ
る使用に適している。
本発明の一実施態様では、修飾試薬は、HcyとCysの3つの官能基、アミノ基
、スルフヒドリル基、およびカルボキシル基のうち少なくとも1つと結合を形成
するように設計されている。通常、少なくとも1つの生成物において、第2結合
は、第1結合の形成後、これらの基の1つに対して生じるであろう。多くの場合
、こ
れによって環が生じる。例えば、第1結合がスルフヒドリル基に対してできてお
り、第2結合がアミンを含んでいることができる。
HcyとCysのスルフヒドリル基と反応する能力がある修飾試薬は、普通、Hcy
またはCysのアミノ基またはカルボキシ基と反応するように適切に配置された基
を有する。この基は、アルキル化基またはアシル化基、金属、または求核置換の
ために活性化されたアリル基であることができるが、例示であって限定ではない
。特に、適するものは、Cl、Br、I、スルホネート類、およびスルホニウム塩
類からなる群から選択される脱離基によりアルファ位で置換されたケトン類であ
る。
上記指摘のように、アルキル化剤、アシル化剤、および金属類は、特にHcyア
ッセイにおいて使用する修飾試薬として適している。本明細書で使用した“アル
キル化剤”の用語は、有機分子と反応してアルキルまたはアリール基を分子内に
導入する修飾試薬を意味する。アルキル基は、アルカンに由来する基であり、そ
の構造から水素1つが取れたものである。例えば、メチル、エチル、プロピル等
。アリール基は、その分子がベンゼン、ナフタレン、フェナントレン、アントラ
セン等の環構造特性を有する基であり、即ち、ベンゼンの6炭素環または他の芳
香族誘導体の縮合6炭素環のいずれかである。好ましくは、アルキル化剤は、ア
ルキルハライドまたはアリールハライドまたはマレイミドまたはアクリロニトリ
ルなどの電気陰性的に置換されたオレフィン類などの基を有する。アルキルハラ
イドを用いる場合、ケトン、アルデヒド、エステル、オレフィン、アセチレン、
ニトリル、アリール、または同等物は、普通、ハロゲンのついた炭素に隣接する
ものである。適切なアルキル化剤には、下表に示した修飾試薬I−VIIIがある
が、例示であって限定ではない。特に有用なアルキル化剤は、p−ブロモアセチ
ル安息香酸(BABA)、即ち修飾試薬IIである。
本明細書で使用した“アシル化剤”の用語は、有機分子と反応してスルホニル
基またはアシル基を分子内に導入する修飾試薬を意味し、通常、スルホン酸また
はカルボン酸誘導体、例えば、その無水物または塩化物または活性エステルであ
る。アシル基は、カルボキシル基の−OHを他の置換基により置換した有機酸基
である。例えば、アセチル(CH3CO−)およびベンゾイル(C6H5CO−)。適
切なアシル化剤には、下表に示した修飾試薬III−VおよびVIIIがあるが、例示
であって限定ではない。
本明細書で使用した“金属”の用語は、二座配位子とキレートを形成する能力
のある有機金属試薬を含む重金属キレート類を意味する。適切な金属類には、下
表に示した修飾試薬IXとXがあるが、例示であって限定ではない。
特に有用な修飾試薬は、アルキルハライドまたはアリールハライドなどのアル
キル化基を有する。アルキルハライドを用いる場合、ケトン、アルデヒド、エス
テル、オレフィン、アセチレン、ニトリル、アリール、または同等物は、普通、
ハロゲンのついた炭素に隣接するものである。典型的な試薬およびそれらのHcy
とCysとの反応生成物、即ち“修飾”HcyとCysは、下表に示す。
各試薬において、下線を引いた基は、誘導体化反応には必要でない可溶化基の例
である:
試薬 可溶化基
I -COOH
II -COOH
III -COOH
IV -SO3H
V -SO3H
VI -COOH
VII -COOH
VIII -COOH
IX -COOH
X -COOH
標識が修飾試薬中に存在するとき、それは、便宜上、アミドまたはエステル結合
により可溶化基に付けることができる。好ましくは、修飾試薬は、HcyとCysの
スルフヒドリル基を修飾して、少なくとも1つの修飾化合物の硫黄が環の一部で
あるような修飾Hcyおよび修飾Cysを形成する。修飾化合物の1つが環を形成す
るような修飾試薬の例は、上記に示した修飾試薬I−Xである。より好ましくは
、修飾試薬は、修飾試薬VIとXの場合のように、生じた修飾HcyとCysの両方
が環を有するようなものを選択する。
上記修飾試薬の中で、好ましい試薬はBABA(修飾試薬II)であり、これは
HcyおよびCysと室温および中性pHで迅速に反応する。BABAは、下記の利
点を有する:フェニル環が、免疫系に与えられたとき高い免疫原性部位を提供し
;カルボキシレートが、ある程度の水溶性ならびにキャリアータンパク質への便
利な結合点を提供し;ブロモアセチル基のカルボニルが、修飾HcyとCysとの便
利な識別手段を提供する。
上記のように、Hcyに対する抗体は、HcyとCysが同族体であり、かつ免疫学
的に関連するため、Cysとの高度の交差反応性を示す可能性がある。HcyとCys
を修飾してそれらを免疫学的に異質なものにする方法は多数ある。例えば、6員
環は、鎖とは立体化学的にかなり異なり、そのため、Cysを修飾して6員環を形
成させるとき、かつ修飾Hcyが非環状であるとき、抗体認識を向上させ、交差反
応性を低減することができる。このことを、修飾試薬(VIII)で例示説明する:
CysとHcyを修飾して、硫黄が6員環の一部である修飾Cys(VIIIa):
および硫黄が環の一部ではない修飾Hcy(VIIIb):
を形成させる。
本発明のその他の実施態様は、Hcyを含有する疑いのある試料中のHcyの量を
、Cysの存在下で測定するアッセイを含み、次の方法:(a)水性媒質中で、試料
、HcyおよびCysを化学的に修飾して修飾Hcyおよび修飾Cysを形成できる修飾
試薬、検出可能な標識に結合させた修飾Hcyの類似体、および修飾Hcyおよびそ
の類似体には特異的に結合できるが修飾Cysには結合できない抗体、を一緒にし
;さらに(b)試料中のHcyの量に相関する、類似体の抗体への結合度を測定する
、を用いる。この実施態様では、測定したシグナルは、類似体の抗体への結合度
の指標である。従って、シグナルは、試料中のHcy量に反比例する。
更にその他の本発明の実施態様は、HcyおよびCysを含有する疑いのある試料
中のHcy量のアッセイを含み、次の方法:(a)水性媒質中で、試料、Hcyおよび
Cysを化学的に修飾して修飾Hcyおよび修飾Cysを形成できる修飾試薬、修飾H
cyには特異的に結合して免疫複合体を形成できるが修飾Cysには結合できない抗
体、抗体を結合させることができる表面、および修飾Hcyの標識化類似体、を一
緒にし;さらに(b)試料中のHcyの量に相関する、標識化類似体の抗体への結合
度を測定する、を用いる。この方法は、更に、標識化第1特異的結合対構成員を
一緒にすることを含んでいてもよく、その場合、標識化類似体の標識は相補的第
2特異的結合対構成員、例えば、フルオレセインに結合した類似体、および酵素
標識化抗フルオレセイン抗体である。この実施態様では、測定したシグナルは、
類似体の抗体への結合度の指標である。従って、シグナルは、試料中のHcy量に
反比例する。
本発明の更に他の実施態様は、HcyおよびCysを含有する疑いのある試料中の
Hcyの量を測定するアッセイを含み、(a)水性媒質中で、試料、HcyおよびCys
を化学的に修飾して修飾Hcyおよび修飾Cysを形成できる修飾試薬、修飾Hcyに
は特異的に結合して免疫複合体を形成できるが修飾Cysには結合できない抗体、
および修飾Hcy上に存在する修飾試薬の一部に結合できる受容体を一緒にし;さ
らに(b)試料中のHcyの量に相関する、抗体の受容体への結合度を測定する、各
工程を含んでなる。修飾試薬は、ハプテン、リガンド、またはHcyまたはCys受
容体である場合もあり、修飾試薬の一部に結合する受容体は、それぞれ、抗ハプ
テン抗体、リガンドに対する受容体、またはHcyまたはCys受容体であり得る。
受容体および特定の抗体のいずれかまたは両方を標識でき、1つは支持体に結合
させることができる。下記は本方法により包含される実施態様の単なる例示説明
である。例えば、ビオチンに結合させた修飾試薬は、ビオチンに結合させた修飾
Hcyを形成する。修飾Hcy、修飾Hcyに特異的に結合できる標識化抗体、および
支持体に結合させたアビジンを含む複合体が形成される。別法として、ハプテン
に結合させた修飾試薬は、ハプテンに結合させた修飾Hcyを形成する。修飾Hcy
、第1標識に結合させた修飾Hcyに特異的に結合できる抗体、および第2標識に
結合させた抗ハプテン抗体を含む複合体が形成される。
Hcyは、様々な混合ジスルフィドとしてヒト血漿中に存在する。通常、Hcyの
主たる画分(約70%)は、アルブミンなどの環状(circulating)タンパク質
にジスルフィド結合を介してタンパク質結合している。残りの“遊離”Hcy(約
30%)は、Hcy(還元型)の形態であるかまたはCysなどの他のチオール類と
の混合ジスルフィドとしてある。血漿中に存在するこれらのHcy種の和(タンパ
ク質結合形態、遊離ジスルフィド形態、および遊離還元形態)を“総Hcy”と表
す。血清中の総Hcyの測定は、好ましくは、タンパク質結合Hcyを解離し、Hcy
の混合ジスルフィド形態、即ち、遊離ジスルフィド形態を還元する前処理工程を
含む。Hcyの3つの形態(タンパク質結合形態、遊離ジスルフィド形態、または
遊離還元形態)の比率がHcy濃度、試料調製、貯蔵方法等のような要因に依存し
ているため、本発明の好ましい方法では、総Hcyを測定する。しかしながら、所
望ならば、遊離Hcyの測定を前処理なしで行うこともできる。
試料中のHcy総量を測定するには、試料をまず、Hcyを環状タンパク質並び
にHcy二量体および他の混合ジスルフィドから解離する解離剤と合わせる。特に
、有機ジスルフィドを還元する還元剤が適している。少なくともHcyの一部がジ
スルフィド形態(タンパク質結合形態および遊離ジスルフィド形態)である、H
cyを含有する疑いのある血清試料中のHcy量を、Cysの存在下で測定する方法の
1つは、(a)水性媒質中で、試料、Hcyをジスルフィド形態から解離する解離剤
、HcyおよびCysのスルフヒドリル基を化学的に修飾して修飾Hcyおよび修飾C
ysを形成できる修飾試薬、および修飾Hcyには特異的に結合して免疫複合体を形
成できるが修飾Cysには結合できない抗体、を一緒にし;さらに(b)試料中のH
cyの量に相関する、免疫複合体の量について媒質を試験する、各工程を含んでな
る。解離剤は、上記のような還元剤であることができるか、または、ジスルフィ
ドと反応して修飾Hcyおよび修飾Cysを形成し、それによって、解離剤および修
飾試薬の両方として働くことができるものであってよい。
HcyとCys硫黄化合物を血清タンパク質から遊離させることができる適切な解
離剤は、当分野ではよく知られており、ホウ化水素ナトリウムおよびホウ化水素
カリウムのような還元剤;ジチオトレイトール、ジチオエリトリトール、2−メ
ルカプトエタノール、チオグリコール酸、およびグルタチオンなどのチオール類
;およびホスフィン類およびトリブチルホスフィンおよびトリス(2−カルボキ
シエチル)ホスフィンなどのトリアルキルホスフィン類があるが、これらに限定
されない。特に適した還元剤は、ジチオトレイトールおよびトリス(2−カルボ
キシエチル)ホスフィン(TCEP)であり、後者は、Burns等、J.Org.Chem.56(8)
:2648-2650(1991)に記載されている。TCEPの場合の還元反応を下記に例示
説明するが、タンパク質結合Hcyとタンパク質結合Cysを血清タンパク質から遊
離させる:
解離剤が修飾試薬としても働くとき、スルファイト類、ホスファイト類、ホスホ
ルイミデート類、および同等物、およびそれらのモノ−およびジ−エステルが使
用できる。これらの試薬は、HcyおよびCysジスルフィドと反応して、チオスル
フェートまたはチオホスフェート基を有する修飾HcyおよびCysを与える。
一方、解離剤が修飾試薬として働かないとき、チオール特異的修飾試薬を用い
て遊離させたチオール類を修飾する。解離剤の選択は、試薬の組み合わせが他の
ものよりも好ましいように修飾試薬を選択することにより決定することが多い。
解離剤と修飾試薬との多くの組み合わせは、お互いに反応するものであり、その
ため、試料と解離剤をまず合わせ、次いで充分な修飾試薬を加えて解離剤および
遊離させたHcyおよびCysと反応させる必要がある。これとは別に、ホスフィン
などの解離剤を、これとは反応しないマレイミドのような不飽和修飾試薬と共に
用いることもできる。このことはそのプロトコールに一層の融通性を与えるが、
より反応性の低い修飾試薬を使用すれば、HcyおよびCysとの完全な反応を保証
するためにより長いインキュベーション時間が必要となり得る。従って、解離剤
と修飾試薬の選択は、所望のアッセイプロトコールおよび時間調節に基づくであ
ろう。
本発明の方法を実施するために適切な反応条件を選択する。下記には、適切な
条件を示したが、特定の施用のために選択された特定の試薬およびアッセイプロ
トコールによって、当業者により変更されることがある。例えば、本発明の方法
は、不均一系または均一系、競合型または直接型などの多くのアッセイ型に適用
でき、採用される条件および試薬類は、それに合わせて選択されるものである。
試料は、好ましくは適切な媒質中、直接試験することができるか、または試料
をアッセイ媒質に加える前に前処理してもよい。前処理は、不要な物質を除去す
ることによりアッセイ中の干渉を低減して、分析物を1またはそれ以上のアッセ
イ試薬に対してより容易に利用可能にするか、分析物をより容易に検出可能にす
ることができる。細胞の分離または溶解;タンパク質の沈殿、加水分解、または
変性;脂質の加水分解;分析物の可溶化;等のために試料を前処理することもで
きる。かかる前処理には、遠心分離;有機溶媒、例えば、アルコール、好ましく
はメタノールなどの炭素原子およそ7以下を有するアルコールでの試料の処理:
洗剤での処理;および解離剤での処理があるが、これらに限定されない。
アッセイされる化合物の濃度は、一般に、約10-4ら10-15M、より普通に
は約10-5から10-12Mで変わる。更に詳しくは、Hcy分析物の場合、その濃
度は、一般に、約10-4から10-8M、より普通には約10-5から10-7Mで変
わる。通常、アッセイが定性的であるか、半定量的であるか、または定量的であ
るかどうか、特定の検出技術、および分析物の濃度などを考慮して、他の試薬の
濃度を決定する。更に、それぞれの試薬の最終濃度は、普通、対象の範囲に合わ
せてアッセイ感度を最適化するよう経験的に決める。
アッセイに用いた、また下記キット中にパッケージした様々な試薬の相対量は
、本方法中に起こる必要がある反応を実質的に最適化する試薬の濃度を提供する
ため、また更に実施するアッセイの感度を実質的に最適化するために広範囲に変
わり得る。アッセイ媒質中の抗体の濃度は、アッセイ型、不均一系または均一系
、競合型または直接型、等によって変わる。通常は、抗修飾分析物抗体が、修飾
分析物濃度の半分ないし107倍の濃度でアッセイ媒質中に存在し、より普通に
は、
修飾分析物濃度のおよそ等倍から約103倍の濃度で存在する。
本発明の方法を実施する場合、好ましくは水性媒質を採用する。他の極性共溶
媒を媒質に採用することもでき、普通、炭素原子1−6、より普通には炭素数1
−4の酸素化有機溶媒であり、アルコール類、エーテル類および同等物を含む。
通常、これらの共溶媒は約70重量パーセント以下で、より普通には約30重量
パーセント以下で存在する。
本発明に従うアッセイでは、媒質のpHは、通常約5−10の範囲、好ましく
は約7−9の範囲である。このpHは、シグナル産生能を最適化しながらsbp
構成員間の充分なレベルの結合を維持するように選択する。ある場合では、これ
ら2つの条件の間に妥協される。更に、このpHは、環化などの特定の構造的コ
ンホーメーションを維持するように選択することもできる。様々な緩衝液を用い
て、所望のpHを達成し、かつ測定中pHを維持することもできる。緩衝液の例
には、ボレート、ホスフェート、カーボネート トリス、バルビタール、および
同等物がある。採用した特定の緩衝液が本発明にとって決定的なのではないが、
個々のアッセイにおいてある1つの緩衝液が他のものよりも好ましい場合がある
。
本方法の実施には、通常穏やかな温度を採用する。その温度は、実行している
工程によって変わり得る。しかしながら、より典型的には、本方法の期間中、一
定温度を維持する。その温度は、一般に、10から50℃、普通は約15℃から
40℃の範囲である。
様々な試薬の添加順序は広範囲に変わり得るが、採用する特定のアッセイ形式
の性質に依存するある優先順序がある。各試薬類および試料を同時に、または全
体にまたは部分的に連続して、お互いにおよび支持体と合わせることができる。
本明細書で使用した、“全体にまたは部分的に連続して”との用語は、本発明に
使用した試料および様々な試薬類を付随的に(同時に)合わせるのではないとき
に、1またはそれ以上の試薬類を単独で、または他の試薬類と一緒に連続して加
えることができることを意味する。例えば、まず、分析物を含有する疑いのある
試料と解離剤を合わせて、解離剤にジスルフィド結合を還元させ、次いで、残り
の試薬類を同時またはステップワイズ添加してもよい。解離剤と修飾試薬が一緒
に反応しないとき以外は、修飾試薬の前に解離剤を添加するのが好ましい。所望
により、1またはそれ以上のインキュベーション工程を各試薬添加後に含めても
よく、一般に、約30秒から6時間、より普通には、約2分から1時間の範囲で
ある。より便利な各工程順序があること、および採用する特定の順序の選択が試
薬類およびアッセイ形式の選択によって変わることが理解されるが、これは本発
明にとって重大ではない。
免疫アッセイの最終工程は、修飾分析物と抗体との結合度を測定することであ
り、これは、試料中の分析物の存在または量に相関する。結合度を測定する多く
の方法があり、当分野ではよく知られている。これらの方法は、例えば、アッセ
イが競合型であるか、均一系であるか、不均一系であるかどうか等によって異な
る。
修飾分析物と抗体との結合度の一測定は、検出可能に標識した修飾分析物、即
ち、標識化分析物類似体を加え、標識化修飾分析物と抗体とが修飾分析物との結
合と競合して結合することにより産生されたシグナルを検出することにより、達
成できる。例えば、均一系アッセイにおいて、検出可能な標識は酵素であること
ができ、最終工程が基質の添加による酵素標識の活性化を必要としてもよい。産
生されたシグナルは、通常、標識化修飾分析物と抗体との結合度に反比例する。
そのとき、シグナルの存在または量は、試料中の分析物の存在または量に相関す
る。
競合型の均一系アッセイにおけるその他の測定では、蛍光剤標識化修飾分析物
および消光剤標識化抗体の使用により、結合度を測定できる。この場合もまた、
シグナルは結合度に反比例し、試料中に存在する分析物の量に直接相関する。こ
れとは別に、均一系非競合型アッセイを用いることもでき、そこでは、蛍光剤標
識化修飾分析物は分離試薬として加えるのではなく、分析物と蛍光剤標識化修飾
試薬との反応により形成させる。この場合もまた、シグナルは結合度に反比例す
るが、試料中に存在する分析物の量にも反比例する。
不均一系アッセイでは、非標識化抗修飾分析物抗体を支持体に結合させること
ができる。支持体と修飾分析物および標識化修飾分析物とのインキュベーション
に続いて、支持体を液相から分離し、次いで固相または液相からのシグナル量を
測定するが、これは、修飾分析物と抗体との結合度を示すものであり、したがっ
て試料中の分析物量を示すものである。上記イムノアッセイ技術のより詳細な記
載については、Edward T.Mggioによる“Enzyme-Immunoassay”、CRC Press,Inc.
、フロリダ州ボカ・ラトン、1980参照。
例示目的で、下記アッセイプロトコールを採用できる。これらの例示説明は、
本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではないが、試料中のHcyまたは
Cysを測定するために本発明の方法を使用できる、定性、半定量、および定量ア
ッセイプロトコールの単なる例示説明である。これらの方法において検出される
シグナルを、既知のHcy濃度を持つ標準または対照と比較する。
(A)修飾試薬(I)を用いるHcyのアッセイでは、修飾Hcy(Ib)には特異
的に結合するが修飾Cys(Ia)には結合しないモノクローナル抗体を使用する。
HcyおよびCysを含有する疑いのある試料を適切な媒質中で修飾試薬(I)と合
わせる。反応は、次のように起こる:HcyとCysが存在するならば、試薬(I)+
Hcy → 修飾Hcyおよび試薬(I)+Cys → 修飾Cys(Ia)。グルコース−6−
ホスフェートデヒドロゲナーゼにコンジュゲートした修飾Hcy(Ib)の類似体も
また媒質に加える。反応および免疫学的結合が起こるのに充分な時間が経過した
ら、抗Hcy抗体を媒質に加える。30分間インキュベーション後、グルコース−
6−ホスフェートを加える。産生したシグナルは、試料中のHcy量に直接相関す
る。
(B)血清中の総Hcyのアッセイでは、修飾Hcy(Vb)には特異的に結合する
が、修飾Cys(Va)には結合しないモノクローナル抗体を使用する。抗体は、ガ
ラスビーズに結合させる。まず、血清試料をジチオトレイトール(DTT)で処
理して、ジスルフィドとして結び付いているHcyを還元的に遊離させる。過剰の
DTTを亜ヒ酸ナトリウムでの処理により封鎖(sequestered)する。次いで、
前処理した試料を、3Hで標識した修飾試薬(V)と合わせ、次いで、ガラスビー
ズ結合抗体と合わせる。媒質を10分間インキュベートし、ビーズを分離および
洗浄する。次いで、ビーズの放射能を測定する。産生したシグナルは、試料中の
Hcy量に直接相関する。
(C)修飾試薬(IX)を用いるHcyのアッセイでは、修飾Hcy(IXb)には特異
的に結合するが、修飾Cys(IXa)には結合しないモノクローナル抗体を支持体に
結合させる。西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)にコンジュゲートさせた修
飾Hcy(IXb)の類似体も使用する。HcyおよびCysを含有する疑いのある試料を
適切な媒質中で修飾試薬(IX)と合わせる。反応が起こるのに充分な時間が経過
したら、抗Hcy支持体コンジュゲートおよび修飾Hcy−HRPコンジュゲートを
次いで媒質に加える。懸濁液を30分間インキュベーション後、液相と固相を分
離し、固相を洗浄する。その後、基質を加えておいた水性媒質を固相に加えると
、産生したシグナルは、試料中のHcy量に反比例する。
本発明の方法は、更に、免疫学的に異質な分析物、即ち“修飾”分析物と同族
の免疫原に対するポリクローナルおよびモノクローナル抗体の調製を含む。本発
明の方法に有用な抗体を得るために使用される免疫原は修飾分析物であり、これ
はアッセイされる化合物を選択した修飾試薬と反応させることにより得られる。
典型的には、免疫原を調製するために、まず、修飾試薬の可溶性基を用いて、試
薬を免疫原性キャリアータンパク質に結合させる。普通、これらの結合性基をま
ず活性化し、次いで、試薬をキャリアータンパク質に結合させる。その後、得ら
れた試薬−タンパク質コンジュゲートを分析物と反応させ、精製し、免疫原とし
て使用する。
本発明は、第1化合物を第1化合物の同族体である第2化合物の存在下で検出
する方法に関するものである。したがって、上記の抗体を、修飾試薬と第1化合
物(分析物)または第2化合物のいずれかとの反応生成物と特異的に反応する、
即ち、修飾分析物または修飾第2化合物のいずれかと結合するその能力について
スクリーンする。例えば、Hcyのアッセイでは、免疫原は、免疫原性キャリアー
タンパク質に連結させた誘導体化Hcyであろう。その場合、得られた抗体は、修
飾Hcy分析物を特異的に認識する能力があり、修飾Cysを認識しないものである
。
その他の基を用いて修飾試薬をタンパク質キャリアーに結合させることができ
、例えば、アルデヒド類、ケトン類、ジアゾニウム塩類、アルキル化剤、等があ
る。カルボン酸またはスルホン酸を、適宜、コンジュゲーションのために活性エ
ステルまたは酸ハライドに変換する。キャリアータンパク質は、あらゆるタンパ
ク質であることができ、好ましくは、免疫化した動物とは無関係のものであり、
その動物が例えばマウス、ウサギ、ヒツジまたはヤギであるならば、鍵穴カサガ
イヘモシアニンまたはウシ血清アルブミンのようなものである。
本発明の方法に有用なポリクローナル抗体の調製は、当分野ではよく知られて
いる方法による。モノクローナル抗体は、実質的に、MilsteinおよびKohlerのNa
ture 256:495-497(1975)に記載と同様の方法により得られる。MilsteinおよびKo
hlerの方法の詳細は充分に確立されている。一般に、この方法は、宿主、普通は
マウスまたは他の適切な動物に、免疫原を注射することを含む。次いで、その動
物の脾臓から細胞を取る。または、宿主は非感作脾臓細胞であってもよく、これ
をインビトロで免疫原に感作させてもよい。得られた細胞を骨髄腫細胞と融合す
る。“ハイブリドーマ”と称されるハイブリッド細胞が得られ、これをインビト
ロで培養できる。ハイブリドーマの個体群をスクリーンし、それぞれが抗原に対
する単一抗体を分泌する、個々のクローンを単離する操作を行う。
免疫原を宿主に導入するとき、宿主の免疫系は、免疫原上の様々な部位を認識
できる多様な抗体を産出することによって応答する。これらの多数の抗体は、異
なる親和性および特異性を有する。採用した特定のアッセイ法について所望の親
和性および特異性特性を有するこれらの抗体を得るために、様々なハイブリドー
マ細胞ラインをスクリーンする。
便宜上、本発明に使用する試薬は、アッセイ法に使用するキット中に提供する
ことができる。Hcyを検出する方法に使用する代表的なキットは、パッケージし
た組物中に:HcyおよびCysを化学的に修飾して修飾Hcyおよび修飾Cysを形成
できる修飾試薬、および修飾Hcyには特異的に結合できるが修飾Cysには結合で
きない抗体を含んでなる。キットは、ジスルフィド形態中のあらゆるHcyを解離
するのに適した解離剤を含むこともできる。
適切な条件下では、キット中の1またはそれ以上の試薬は、溶液状態、または
溶解すると本発明の方法またはアッセイを実施するのに適切な濃度を有する試薬
溶液となる、賦形剤を含む乾燥粉末、通常は凍結乾燥したもの、として提供でき
る。主題発明の融通性を高めるために、同じかまたは別の容器に入れた試薬をパ
ッケージした組み物中に提供でき、そうして試薬の比率が当該方法およびアッセ
イの実質的な最適化をもたらすようにする。試薬をそれぞれ別々の容器に入れて
もよく、また様々な試薬を、その交差反応性および安定性に基づいて1またはそ
れ以上の容器に組み合わせて入れることもできる。便宜上、本発明で用いた試薬
を予め定めた量で提供できる。試薬は、修飾分析物に特異的に結合できる第1抗
体および第2抗体、および分析物を化学的に修飾するための試薬を含むことがで
きる。また、キットは、例えば一括挿入物(package insert)の形態における、
試薬の用い方および/または特定のアッセイの行い方についての指示書を含んで
いてもよい。
本発明を更に下記例示の実施例により説明する。略語
AP アルカリホスファターゼ(子ウシ腸)
BABA p−ブロモアセチル安息香酸
BSA ウシ血清アルブミン
Cys-ABA システインアセチル安息香酸
DCC ジシクロヘキシルカルボジイミド
DPBS ダルベッコホスフェート緩衝化塩水
DTT ジチオトレイトール
DMEM ダルベッコ修飾イーグル培地
DMSO ジメチルスルホキシド
EDTA エチレンジアミンテトラ酢酸
FBS ウシ胎児血清
Hcy-ABA ホモシステインアセチル安息香酸
Hcy-ABA-BSA ホモシステインアセチル安息香酸−ウシ血清アルブミン
Hcy-ABA-AP ホモシステインアセチル安息香酸−アルカリホスファタ
ーゼコンジュゲート
NHS N−ヒドロキシスクシンイミド
PBS ホスフェート緩衝化塩水
PEG ポリエチレングリコール
PNPP フェニルホスフェート
S-DMEM スーパーダルベッコ修飾イーグル培地
RAM ウサギ抗マウス
TCEP トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン
THF テトラヒドロフラン材料の調製
結晶化BSA CohnはICNから得た。APはPierceから得た。その他全ての化
学品は、試薬級であり、GibcoおよびSigmaなどの供給元から市販されている。
溶液は全てH2Oで調製し、反応は全て特記しない限り、周辺条件下で行った。
A)p−ブロモアセチル安息香酸(分子量243)の製造
4−アセチル安息香酸2.0g(12.2ミリモル)を500mlエーレンマイヤ
ーフラスコ中酢酸90mlに加え、45℃で溶解するまで加熱した。温度を45℃
に維持し、酢酸2mlに溶解させた臭素1.95g(12.2ミリモル、0.61ml)
を激しく撹拌しながらゆっくりと1時間にわたり加えた。この反応は、反応進行
の前に数分の誘導期間を必要とし、これは臭素の赤色の消失とHBrの放出によ
り明白になった。生成物BABA(修飾試薬II)を氷で沈澱させ、濾過して集め
、熱エタノール(75℃)から3回再結晶化した。
B)ブロモアセチル安息香酸N−ヒドロキシスクシンアミドエステル(分子量
340)の製造
BABAは上記のように製造し、1回再結晶化した。0℃で乾燥THF8mlに
溶解させたBABA0.6g(2.5ミリモル)およびNHS0.28g(2.5ミ
リモル)に、THF1ml中DCC0.51g(2.5ミリモル)を加えた。数分後
、沈澱が観察され、この溶液を一晩撹拌した。この溶液をガラスフリットにより
濾
過し、その容量を真空下で2mlまで減らした。容量低減後、若干沈澱が観察され
た。過剰の石油エーテルを加えて残りの生成物を沈澱させ、固体を限られた量の
THFに溶解し、濁るまで石油エーテルを再度加えることにより再結晶化し、次
いで−20℃まで冷却し、濾過により固体を集めた。BABA−NHSの収量0
.2g。
C)システインアセチル安息香酸(分子量283)の製造
BABA60mgおよび1−システイン60mgを200mMリン酸ナトリウム、
pH7.5の5.0mlに加え、10分間撹拌し、その後1.0MHCl 0.5mlを加
えて生成物を沈澱させた。固体を濾過により集め、0.1MHClおよび次いで水
で洗浄し、最終的に真空乾燥させて、Cys−ABA(修飾Cys IIa)を得た。T
LC分析(セルロース、0.1M酢酸アンモニウム、pH6.8)およびNMR(
100mMNa2DPO4、pH7.5;100mMNaDCO3、pH8.4;および
100mMNa2B307、pH9.3を含有するD2Oにて記録したスペクトル)は
、少なくとも3つの異なるpH依存性生成物の存在を示した。質量分析(CI)
では、脱カルボキシル化を示す分子量221の親ピークを生じた。
D)ホモシステインアセチル安息香酸(分子量297)の製造
1−ホモシステインチオラクトン100mgを脱気した0.5MNaOH5.0ml
に加え、45℃で10分間加熱し、1.0MHClと濃HClの組み合わせを用い
てpH8.0に中性化した。BABA80mgをHcy溶液に加え、15分間撹拌し
た。次いで、溶液を0.22ミクロンシリンジフィルターを通して濾過し、生成
物を沈澱させるために1.0MHClの添加により溶液pHを2まで下げた。固体
Hcy−ABA(修飾Hcy IIb)を0.1MHClで数回洗浄し、遠心分離により集
め、真空乾燥させた。
E)ホモシステインアセチル安息香酸−ウシ血清アルブミンコンジュゲートの
製造
BSA25mgを100mMリン酸ナトリウム、pH7.0、5.0mlに溶解し、
この溶液2.2mlをDMSO(+BABA−NHS rxn)中100mMBABA−
NHS200μl、またはDMSO単独200μl(−BABA−NHS rxn)に
加
え、3時間混合した。その後、2つの試料を遠心分離して過剰の固体BABA−
NHSを沈澱させ、0.45ミクロンシリンジフィルターを通して濾過し、セン
トリコン30で5倍に濃縮した。濃縮溶液を100mMリン酸ナトリウム、pH
7.0、で1.0mlまで希釈した。20μlずつを各溶液から取り出し、1.0mlま
で希釈し、吸光度を計測して反応効率を測定した。タンパク質濃度は、−BAB
A−NHS反応(BSA、ε280=43,600)から決定し、タンパク質結合BAB
A濃度は+BABA−NHS反応(BABA、ε260=13,600)から決定した。
更にHcyを上記製造したBABA−活性化BSA溶液と反応させた。1MNa
OH0.5mlに1−ホモシステインチオラクトン1.5mgを溶解し、37℃で10
分インキュベートし、最終的にpH7.0のリン酸ナトリウム2.0mlおよびpH
6.0のリン酸ナトリウム2.5mlで希釈する(最終pH7.0)ことにより、2
0mM1−ホモシステインを製造した。上記製造した両方のBSA溶液をH2Oで
4.0mlまで希釈し、Hcy溶液1.0mlをそれぞれに加え、一晩インキュベートし
た。反応物をセントリコン30で濃縮し、反応効率を、確保しておいた濾液のB
r-濃度から見積もった。臭化物標準は、適当なKBr貯蔵溶液2μlを−BABA
−NHS反応濾液98μlに加えて、Br-濃度0.0、0.2、0.4、0.8、お
よび1.0mMの標準を作ることにより製造した。製造したBr-標準20μlまた
は+BABA−NHS反応物由来の濾液20μlを0.1Mクエン酸ナトリウム、
pH5.5、0.9mlに加え、次いで0.8mMフルオレセイン20μlおよび0.1
MクロラミンT10μlを加えた。10分後、0.2MNa2CO3中25mMチオス
ルフェート20μlを加えて、反応を止め、各試料について吸光度を1cmセル中
515nmで記録した。標準の吸光度値をBr-濃度に対してプロットして標準曲線
を作り、そこから+BABA−NHS反応物に含有されるBr-濃度を測定した。
この値から、BSA上のBABA基とHcyとの結合効率の見積もりを得た。+B
ABA−NHS反応溶液をセントリコン30で4倍に濃縮し、1×PBSで希釈
し(最終濃度10mg/ml)、続く抗体開発のために取っておいた。
F)ホモシステインアセチル安息香酸−アルカリホスファターゼコンジュゲー
トの製造
Hcy−ABA−APコンジュゲートを上記BSAコンジュゲートの場合と同様
のやり方で製造した。AP10mlを100mMリン酸ナトリウム、pH7.0、1
5mlで希釈し、セントリコン30で3倍に濃縮し、その後、200mMリン酸ナ
トリウム、pH7.0を最終容量2.0mlまで加えた。2つの反応物を調製した:
AP溶液0.48mlをDMSO中100mMBABA−NHS(+BABA−NH
S rxn)45μlまたはDMSO単独(−BABA−NHS rxn)45μlに加え
、反応物を2.5時間混合した。次いで、反応物を2.0mlH2Oで希釈し、0.4
5μシリンジフィルターを通して濾過し、セントリコン30で5倍に濃縮し、最
終的に100mMリン酸ナトリウム、pH7.0で1.0mlまで希釈した。各試料
20μlを1.0mlまで希釈し、吸光度を記録し、APに対するタンパク質結合B
ABAの比率を前記のように測定した(AP、ε280=110,000;BABA、ε26 0
=13,600)。
BABA−活性化APを下記のようにHcyと反応させた。1−ホモシステイン
チオラクトン9.3mgを1.0M NaOH 0.5mlに溶解し、37℃で15分間イ
ンキュベートした。Hcyを0.5MNa2HPO4およびH2Oで中性化し、最終容
量5mlおよびpH7.0にした。Hcy溶液200μlを上記製造した両方のAP溶
液に加え、37℃で4時間インキュベートした。次いで、反応物をセントリコン
30で濃縮し、濾液を確保した。
BABA−活性化APとHcyとの結合反応度は、放出されたBr-の濃度から見
積もった。標準溶液は、貯蔵KBr溶液2μlを組成物中の濾液に似た緩衝液(0
.5MHcy200μlに加えた100mMリン酸ナトリウム、7.0、1.0ml)9
8μlと混合し、0.0、0.05、0.1、0.15、および0.2mM臭化物イオ
ンの標準を得ることにより製造した。Br-標準または+BABA−NHS rxn由
来の濾液80μlを、0.1Mクエン酸ナトリウム、pH5.5、0.9mlに加え、
次いで、0.4mMフルオレセイン40μlおよび50mMクロラミンT30μlを
加え、10分間インキュベートした。0.1MNa2CO3中15mMチオスルフェ
ート50μlを加えて反応を止め、515nmでの吸光度を記録した。+BABA
−NHS rxn濾液中に含まれるBr-濃度を標準曲線から測定し、Hcyとの反応の
効率を見積も
るのに使用した。−BABA−NHSと+BABA−NHS反応物の両方をセン
トリコン30で5倍に濃縮し、1×PBSを加えて最終容量400μlにした。
誘導体化APの活性は、H2O100μlの各AP溶液の2μlを希釈し、希釈
溶液2μlを50mMトリスCl、pH9.4中、1mg/mlのPNPP1.0mlに加
えることにより評価し、30秒にわたり記録した吸光度の変化を比較した。
G)Hcy-ABA−BSAモノクローナル抗体の生成および単離
1)免疫原、免疫感作、および酵素コンジュゲート
Hcy−ABA−BSA免疫原を上記のように製造した。マウスを、RIBI
アジュバント系に乳化させた免疫原100μgで1回、50μgで2回腹腔内免疫
感作させた。融合前の3日、マウスには免疫原250μgを含有する塩水ブース
トを腹腔内的に与えた。
Hcy−ABA−APをスクリーニングに用いた。
2)組織培養
S−DMEMを全ての組織培養に用いたが、これは下記のものを補足したDM
EMからなる:
10%FBS
10%NCTC−135(Gibco♯440-1100EC)
4mMグルタミン
1mMオキサロ酢酸
1mMピルビン酸ナトリウム
0.148nM L−システイン
200単位インシュリン
37.9mM重炭酸ナトリウム
ならし培地は、P388D1細胞(ATCC TIB 63)をS−DMEM中で生
育させ、4ないし5日毎に1:4に分ける(split)ことにより調製した。スペ
ント培地(spent media)を1500rpmで15分間遠心分離した。次いでこのス
ペント培地を0.2ミクロン滅菌組織培養フィルターユニットを用いて濾過し、
残っている細胞および異物を除去した。グルタミン(100×ストック=58.
5g/L)をこのスペント培地に加え、その後使用するか、または先の使用のた
めに−20℃で凍結した。ならしS−DMEMは、S−DMEMに10%P38
D1スペント培地を補足しすることにより製造し、次いで、それを融合後のおよ
びクローニング中のハイブリドーマ成長を支持するために使用した。
マウス骨髄腫細胞ラインP3X63 Ag8.653(Ag8.653、ATCC
CRL 1580)は、毎日1:2ないし1:4に分けることにより、または2日間の6
−ウェルプレートでの連続希釈により培養中維持された。
3)融合
融合は、実質的に、MilsteinおよびKohler、Nature 256:495-497(1975)の方法
に従って行った。
2匹の免疫感作マウスから脾臓を無菌的に除去し、10mlDMEMを含有する
60mm組織培養皿に置いた。これらを2・3回切り刻み、その後、つや消しスラ
イド2枚の端に挟んですり漬した。脾臓細胞の単一細胞懸濁液は細胞懸濁液を単
繊維スクリーンクロスに通すことにより得られた。脾臓細胞、約2×108細胞
を、40×106Ag8.653細胞と一緒にし、800rpmで5分間遠心分離し、
DMEMで1ないし2回洗浄した。PEG(75mMヘペス中50%溶液)4.
0mlを穏やかに撹拌しながら3分間かけて添加することにより融合を行い、次い
でS−DMEM30ないし40mlを加えてPEGを不活性化した。細胞懸濁液を
800rpmで5分間遠心分離した。上清を流し捨て、細胞をS−DMEM−HA
T(ストックHAT=50×Sigma♯H0262;培地中:100μMヒポキサンチ
ン、0.4μMアミノプテリン、および16μMチミジン)で再懸濁させ、12
個の96−ウェル培養プレートに200μL/ウェルで培養した。
細胞は、スペント培地100μl/ウェルを除去し、ならしS−DMEM−H
ATの200μl/ウェルを融合後4ないし5日連続添加することにより育てた
。
融合後約7ないし10日、融合物をスクリーンした。この場合、ハイブリドー
マコロニーは、通常、目で見ることができ、培地は依然ピンクであるか、または
ちょうど黄色に変わったところであった。
4)連続希釈によるクローニング
次いで、ELISA陽性抗体を生成するハイブリドーマを確実に単一細胞コロ
ニーを得るために連続希釈により数回クローンした。その操作は下記の通りであ
る。
96−ウェルプレートの1ウェルから内容物をならしS−DMEM1.5ml/
ウェルを含有する24−ウェルプレート中の1ウェルに移した。細胞をピペット
操作により混合し、100μl/ウェルを、ならしS−DMEM200μl/ウェ
ルを含有する96−ウェルプレートの第1列に加えた。100μl/ウェルをフ
ロウ・マルチチャンネルピペッターを用いて第2列に移し、ピペット操作により
混合し、再度、100μl/ウェルを次の列に移した。各“クローン’を連続的
に7倍に希釈し、プレート当たり1ないし4クローンにした。細胞を3ないし4
倍の制限希釈により、または安定するまで再クローンした。
5)細胞ラインの凍結および解凍
ELISA+であるクローン化かつ安定化した細胞ラインを−100℃で貯蔵
した。96−ウェルプレートから選択したウェル(クローン)は、細胞を毎日継
代し、1.5ml/ウェルS−DMEMの24−ウェルプレートから、次に8ml/
ウェルS−DMEMの6−ウェルプレートへ、最終的に50mlS−DMEMのT
−75フラスコへと広げることにより、増殖させた。
T−75フラスコからの細胞を800rpmで5分間遠心分離し、凍結用培地、
即ちS−DMEM中10%DMSO(ATCC♯76-68-5)および更に10%F
BS、3mlに再懸濁した。1ml(3ないし5×106細胞)ずつをピペットでク
リオバイアルに移し、次いで、凍結容器に入れた。それから、その容器を−10
0℃で1−2日間貯蔵し、次いでバイアルを後に使用するために−100℃の凍
結貯蔵ボックスに移した。
バイアルを37℃の水浴中で暖めて細胞を解凍した。細胞懸濁液をS−DME
M5mlを含有する15ml遠心分離管に移し、次いで、800rpmで5分間遠心分
離した。上清をデカントし、細胞をS−DMEM8mlに再懸濁し、細胞拡張(ce
ll expansion)のために6−ウェルプレートにピペットで移した。
6)スクリーニング
まず、ハイブリドーマを競合型逆ELISAスクリーンによりスクリーンし、
その後、逆ELISAによりスクリーンした。ELISAスクリーンは全て室温
で行った。競合型逆ELISAプロトコールは、唯一濃度の、Hcyの修飾形態で
あるHcy−ABAを用いる一次スクリーンに使用して、抗体を同定した。最善の
抗体を同定するために、Hcy−ABAを抗体の相対感度を測定するための2つの
異なるレベルで用いて競合型逆ELISAを行った。望ましくない交差反応性が
あるかどうかを測定するためにBABAおよびCys−ABAも使用した。逆EL
ISAプロトコールは、続くクローニングプレートのスクリーンのために使用し
た。競合型逆ELISAおよび逆ELISA用の試薬は下記の通りである:
DPBS(10×)、pH7.4、1:10希釈
50mM炭酸緩衝液、pH9.0
ELISA洗浄緩衝液:DPBS中0.5%ツイーン20
プレートコート:ウサギ抗マウスIgG、A、M;ヘビーおよびライト(Z
ymed)、製造元説明書により水2mlで再構成、DPBS(RAM)中1:100
希釈
プレートブロック:DPBS中1%BSA
希釈液:DPBS中0.5%BSA;DPBS中1:2希釈したプレート
ブロック
ELISA酵素−リガンドコンジュゲート:AP−Hcy−ABA、希釈液
中1:1500希釈;競合型逆ELISA:一次スクリーン用、Hcy−ABAを
希釈Hcy−ABA−AP中0.8μg/mlに希釈した;抗体の特性化用、Hcy−A
BA、Cys−ABA、およびBABAを炭酸緩衝液中希釈A−Hcy−ABAの1
μg/mlおよび1ng/mlに希釈した。
基質緩衝液:1Mジエタノールアミン、0.25mM MgCl2、pH9.8
基質:基質緩衝液ml当たりp−ニトロフェニルホスフェート0.25mg。
競合型逆ELISAおよび逆ELISAのプロトコールは、下記の通りである
:
1.プレートをRAM50μl/ウェルでコートし、1時間または1週間まで
4
℃でインキュベートし、次いで、ウェルの中身を空にした。
2.プレートを300μl/ウェルでブロックし、15分インキュベートし、
次いで、ウェルの中身を空にした。
3.抗体(スペント培地)を50μl/ウェル加え、45分インキュベートし
、3回洗浄した。
4.競合型逆ELISA:50μl/ウェルのAP−Hcy−ABAまたはAP
−Hcy−ABA加えるHcy−ABA、AP−Hcy−ABA加えるCys−ABA、
またはHcy−ABA−AP加えるBABAを加えてプレートを複製した。逆EL
ISA:50μl/ウェルのAP−Hcy−ABAを加えた。プレートを45分イ
ンキュベートし、3回洗浄した。
5.基質を100μl/ウェル加え、振盪器で20ないし30分インキュベー
トし、405nmで読んだ。
6.1次スクリーンで陽性のものは、AP−Hcy−ABA単独の場合0.9
以上のODsを有する抗体であり、Hcy−ABA−AP+Hcy−ABAの場合、
50%以上競合した。競合パーセントは下記のようにして求める:
逆ELISAプロトコールを用いるスクリーニングクローニングプレートに由来
する陽性のものは、高いODの単一コロニーまたは極少数のコロニーを有するウ
ェルであった。
7)イン・ビトロでの抗体の製造および精製
その後、クローン化し、安定化したELISA陽性ハイブリドーマを静置培養
に移した。ハイブリドーマを2つのT225フラスコ(スペント培地500ml)
または4つのT225フラスコ(スペント培地1L)に過剰増殖させた。細胞お
よび異物を遠心分離および濾過により分離した。精製する前にアジ化ナトリウム
を0.02%で加えた。
静置培養で生じた抗体をプロテインGカラムクロマトグラフィーにより精製し
た。精製は、室温で行った。プロテインG精製に使用した試薬は下記の通りであ
る:
洗浄/結合緩衝液、PBSpH7.0:0.01Mリン酸ナトリウム、0.15
M塩化ナトリウム、および0.02%アジ化ナトリウム
溶離緩衝液:水酸化アンモニウムでpH3.0に調整した0.5M酢酸
中性化溶液:1Mトリス塩基
クリーニング緩衝液:1M酢酸。
プロテインG精製に使用したプロトコールは下記の通りである:
1.カラムにプロテインG10mlを充填し、洗浄/結合緩衝液25mlで洗浄し
た。
2.抗体(スペント培地)、0.5ないし1Lをカラムにのせる。
3.カラムを洗浄/結合緩衝液で、ODが基線にもどるまで、または約50ml
を用いて洗浄した。
4.抗体を溶離緩衝液で溶出した。1画分当たり2mlを既に中性化溶液1mlを
含有する試験管に集めた。
5.抗体ピークをプールし、DPBS、pH7.4の4Lに対して一晩透析し
た。
6.カラムをクリーニング緩衝液約25mlで洗浄し、次いで、洗浄/結合緩衝
液で再平衡化した。
7.抗体純度は、単一バンドの存在についてパラゴン電気泳動によりチェック
した。抗体濃度は、まず280nmでの抗体溶液のODを得、次いで、IgGに対
する消光係数を用いて抗体濃度を計算することにより決定した:A280(1mg/m
l)=1.35。
結果:競合逆ELISAデータから、Hcy−ABAと十分に競合した、および
あったとしてもCys−ABAまたはBABAと不完全に競合した30の抗体が示
された。Hcy−ABAの1μg/mlでの感度は、非常に良好であった。Hcy I
5C12と称するクローンから抗体を下記実施例に用いるために選択した。
H)ビオチン−Hcy I 5C12の製造
0.7mg/ml抗体溶液(Hcy I 5C12)400μlをセントリコン30で2
倍に濃縮し、100mM炭酸ナトリウム、pH8.5で希釈した。溶液を濾過し、
緩衝液を加えて、容量を300μl(最終濃度1mg/ml)にした。抗体溶液に、D
MSO中1mg/mlビオチンアミド−カプロエート−NHSエステル36μlを加
え、2時間インキュベートした。反応物をセントリコン30で5倍に濃縮し、最
後に、50mMリン酸ナトリウム、pH7.5を加えて、最終容量1mlにした。抗
体の濃度(100μg/ml)は280nm吸光度から測定した(1.2mg/ml→吸光度
1.0)。ビオチニル化の成功は、ストレプトアビジンの不在下または存在下で非
修飾化抗体とビオチニル化抗体との移動度を比較することにより、パラゴンゲル
電気泳動により評価した。ビオチン−Hcy I 5C12溶液は、最後にセントリ
コン30で容量50μlまで濃縮した。
実施例I
DTT−亜砒酸塩還元を用いるHPLCモノシステインアッセイ
EDTAで凝固停止した全血液の試料200μlに、等分の1.0mMHcyを加
え、最終濃度0、10、20、30、40μMにした。血液を室温で2時間イン
キュベートし、次いで、4℃で3日間貯蔵して、Hcyの遊離還元型、遊離ジスル
フィド型およびタンパク質結合型の間で平衡にした。各血液試料から得られた血
漿20μlを、100mMDTT10μlおよび1.0M炭酸ナトリウム、pH8.
2、30μlを加え、37℃で30分間インキュベートすることにより還元した
。続いて、試料中のタンパク質をミリポア・ウルトラフリーMC(10K分子量
カットオフ)で濾過して除去した。過剰のDTTを、濾液20μlに1.0M亜砒
酸ナトリウム10μlを加えて、10分間インキュベートすることにより、封鎖
した。10mMBABAの10μlを加え、反応物を更に10分間インキュベート
した。その後、得られた血漿試料をHPLCで分析し、Hcy−ABAピークを定
量し、総血漿Hcyを正確に測定した。(20μl注入、1.0ml/分、10cmAllt
ech Econosphere C18カラム、勾配:100mMEt3N−HOAc中1−10%C
H3CN、pH5.5、15分以上)。データは、線形最小二乗分析に十分に一致
した。ゼロ領域に
外挿すると、血漿単独試料は、予想値(12μMが正常である)以上の値、28
mMHcyを記録した。しかしながら、貯蔵血液中のHcy濃度は、実質的に経時増
加することが示された。
実施例II
低mM濃度でのTCEPは、緩衝液中のHcyを定量的に還元することが示され
た。TCEPが血漿中のジスルフィドを還元する場合にもまた有効であることを
示すために、血漿単独(Hcyなし)を、TCEPで前還元するか、またはしない
でBABAと反応させた。血漿20μlを1.0M重炭酸ナトリウム30μlおよ
び10μlのH2Oまたは20mMTCEP10μlに加え、37℃で5分間インキ
ュベートした。
その後、10mMBABA60μlを加え、反応物を5分間インキュベートした:
タンパク質を上記のように濾過して除去し、反応物をHPLC(勾配:1%トリ
フルオロ酢酸中1−20%CH3CNで15分以上;これ以外は上記の条件)に
よりHcy−ABAについて分析した。TCEPが存在しなければ何等生成物は観
察されなかった。HPLC分析は、Hcy−ABAピークが完全に他の化合物から
分離されていないこと、およびTCEPでの還元が血漿(または血清)中のジス
ルフィド還元をもたらす証拠として、実験を定量的な点で考察しなければならな
いことも示していた。
実施例III
Hcy−ABA−APのビオチン−Hcy I 5C12への結合のHcy−ABA阻害
1×PBS、5ngのHcy−ABA−APを含有する0.05%トゥイーンの1
00μlを、Hcy−ABAを含有するH2O 100μlに、濃度0.125、0.2
5、0.5、1.0、または4.0μMで加えた。ビオチン−Hcy I 5C12 1
0ngを含有するPBS−トゥイーン100μlを加え、反応物を20分間インキ
ュベートした。前線上したストレプトアビジン−被覆粒子(1ペレット)を30
0μlPBS−トゥイーンに懸濁し、20μlを反応物に加えた。粒子が懸濁状態
であるように反応管を15分間撹拌した。次いで、粒子をPBS−トゥイーンで
5回洗浄し、粒子の溶液からの分離を、磁気ストリップを含有するチューブホル
ダーで粒子を側面に引っ張ることにより、容易にした。50mMトリスCl、pH
9.3中
1mg/mlPNPP基質300μlを加え、20分間混合した。各反応管から溶液
200μlをマイクロタイタープレートへ移し、プレートリーダーで414nmで
の吸光度を記録した。予想したとおり、Hcy−ABAの濃度が増加すると、記録
される吸光度の大きさの低減が生じた。シグナル調節は、0.04ないし0.67
mMの有効溶液濃度範囲の>50%であり(ゼロ濃度データポイントは記録せず)
、血清試料の実質的な希釈が可能であって、依然、イムノアッセイにおける適当
な感度レベルを維持した。
実施例IV
ホモシステイン−スパイク化血清のアッセイ
血清試料を10、20、30および40μMHcyでスパイク(spike)した(Hc
yとして、即ち、Hcyの二量体形態として加えた)。6つの反応物を準備したが
、その内、5μlの各Hcy−スパイク化血清試料または血清試料単独(2つの反
応物)は、1.0Mリン酸ナトリウム、pH7.5、10μlおよび10mMTCE
P10μlを加え、10分間インキュベートすることにより、還元した。5試料
中得られた遊離のHcyを誘導体化、即ち、8mMBABA40μlを加え、10分
間インキュベートすることにより“修飾”した。“血清単独”試料の1つには、
BABAの代わりにブロモアセトアミドを加え、ゼロHcy−ABA対照を作った
。次いで、BABA(1試料)またはブロモアセトアミド(5試料)を加えて、
試薬を均等に混合し、その後連続してHcy−ABA−AP10ngを含有するPB
S−トゥイーン100μlおよびビオチン−Hcy I 5C12 20ngを含有する
PBS−トゥイーン100μlを加え、15分間インキュベートした。ストレプ
トアビジン被覆粒子懸濁液20μlを加え、反応物を15分間撹拌した。PBS
−トゥイーンで5回洗浄後、反応物をPNPPで展開し、上記のように分析した
。データポイントは、加えたHcy対記録した吸光度のプロットでの滑らかな曲線
に一致した。血清単独、ブロモアセトアミド誘導体化試料から読んだその吸光度
は、曲線に一致しており、血清単独試料の内生Hcy濃度(加えたHcy0mM)を
ゼロHcy−ABA(+ブロモアセトアミド)対照との比較により見積もった。グ
ラフから、血清試料のHcy濃度は、15μMであり、その値は、正常個体の場合
に予想した範囲内
である。
上記発明は、明確さおよび理解を求める目的で例示説明および実施例によりあ
る程度詳細に記載したが、ある程度の変化または修飾が添付の請求の範囲内で実
施され得ることは明らかであろう。
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(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FR,GB,GR,IE,IT,LU,M
C,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF,CG
,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,SN,
TD,TG),AP(KE,MW,SD,SZ,UG),
AM,AT,AU,BB,BG,BR,BY,CA,C
H,CN,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,GB
,GE,HU,IS,JP,KE,KG,KP,KR,
KZ,LK,LR,LT,LU,LV,MD,MG,M
N,MW,MX,NO,NZ,PL,PT,RO,RU
,SD,SE,SG,SI,SK,TJ,TM,TT,
UA,UG,UZ,VN
(72)発明者 ウルマン,エドウィン・エフ
アメリカ合衆国94025カリフォルニア州
アサートン、セルビー・レイン135番