DE69504191T2

DE69504191T2 - Immuntest für homocysteine

Info

Publication number: DE69504191T2
Application number: DE69504191T
Authority: DE
Inventors: Thomas C. Mountain View Ca 94025 Goodman; Edwin F. Atherton Ca 94025 Ullman; Reuel B. Mountain View Ca 94040 Van Atta
Original assignee: Behringwerke AG
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Priority date: 1994-04-28
Filing date: 1995-04-27
Publication date: 1999-02-11
Anticipated expiration: 2015-04-28
Also published as: US5478729A; ES2133772T3; EP0757794A1; AU2584495A; JP3422795B2; DE69504191D1; CA2188752A1; JPH09512634A; EP0757794B1; CA2188752C; WO1995030151A1

Description

Hintergrund der Erfindung

Gebiet der Erfindung

Homocystein (Hcy) ist eines einer Reihe von Zwischenprodukten, die über den Weg der Transsulfurierung hergestellt werden, in dem Methionin schließlich in Cystein (Cys) umgewandelt wird. Die ausschließliche Quelle von Hcy in Säugetieren ist das Produkt der enzymkatalysierten Hydrolyse von S-Adenosyl-Homocystein. Sobald Hcy gebildet wurde, kann es durch erneute Methylierung und Umwandlung in Methionin wieder in den Zyklus eintreten oder mit Serin kombinieren, um Cystathionin zu bilden, das schließlich in Cys umgewandelt wird. Der wesentliche metabolische Weg für die Methylierung von Hcy durch Methionin-Synthase erfordert Vitamin B&sub1;&sub2; (Cobalamin) als Methyl-Übertragungs-Cofaktor und 5-Methyltetrahydrofolat als letzte Methylquelle. Es ist nicht überraschend, daß hohe Werte an Serum-Hcy mit unzureichender Einnahme von Vitamin B&sub1;&sub2; oder Folat oder mit einer mangelnden Fähigkeit, diese zwei Vitamine richtig zu nutzen, assoziiert wurden. Mäßig hohe Werte an Hcy können üblicherweise durch Verabreichen von Folat ins Gleichgewicht gebracht werden; dies ist eine Behandlung, bei der wenige nachteilige Nebenwirkungen auftreten.
Zusätzlich zu Anämie sind Personen, die für ein fehlerhaftes Cystathionin-Synthase-Gen heterozygot sind, was zu einer 50%-igen Verringerung der normalen Enzymaktivität führt, nach Methonin-Zufuhr besonders für hohe Hcy-Werte anfällig. Die genetische Prädisposition ist die häufigste Ursache für moderate Homocysteinurie (Häufung von Hcy im Harn) bei ansonsten gesunden Patienten.
In letzter Zeit trat eine Korrelation zwischen mäßig hohen Hcy-Werten und kardiovaskulären Erkrankungen auf.
Aus diesen Gründen besteht ein großes Interesse an der Entwicklung eines präzisen Hcy-Assays.

Beschreibung verwandter Gebiete

Es gibt verschiedene Verfahren zur Quantifizierung des Gesamthomocysteins (Hcy) sowie zur Unterscheidung zwischen den freien (reduziert und Disulfid) und proteingebundenen (vor allem Albumin) Formen.
Einen hervorragenden Überblick über die Ursachen von Homocysteinurie sowie ein Update der aktuellen klinischen Analyseverfahren bieten Ueland et al., Clin. Chem. 39(9), 1764-1779 (1993).
Ein enzymatisches Verfahren für einen Hcy-Assay wird durch Sundrehagen et al., PCT/GB93/00138 (WO 93/15220) beschrieben, worin Hcy indirekt untersucht wird, indem die Produktkonzentration nach der enzymkatalysierten Umwandlung von Hcy in S-Adenosylhomocystein gemessen wird.
Hochleistungs-Flüssigchromatographie-Verfahren ("HPLC") für Hcy und Cys sind auf dem Gebiet bekannt. Dieses analytische Verfahren unterscheidet zwischen Hcy und Cys durch unterschiedliche Adsorption und Elution der Verbindungen auf einem chromatographischen Träger. Andersson et al., Clin. Chem. 39(8), 1590-1597 (1993), beschreiben die Bestimmung des gesamten, freien und reduzierten Hcy und Cys.
Hcy- und Cys-Analyse mittels eines Gaschromatographen-Massenspektrometers wird von Allen et al., US-A-4.940.658 beschrieben. Allen et al., PCT/US92/05727 (WO 93/01496) beschreiben einen chromatographischen Assay auf Cystathionin, das Aminosäure-Zwischenprodukt zwischen Hcy und Cys, das im Metabolismus von Methionin produziert wird.
Fiskerstrand et al., Clin. Chem. 39(2), 263-271 (1993) beschreiben eine vollautomatische Analyse von Gesamt-Hcy, umfassend die Fluoreszenzmarkierung von Serumthiolen, gefolgt von der chromatographischen Trennung des Hcy-Derivats von den anderen schwefelhaltigen Verbindungen.
Die Identifikation von Hcy durch HPLC-Verfahren umfaßt oft die Derivatisierung mit fluoreszierenden Reagentien, wie dies in Fiskerstrand, s. o., beschrieben ist, oder ein radioenzymatisches Verfahren wie jenes von Refsum et al., Clin. Chem. 31(4) 624-628 (1985). Darüber hinaus sieht die Identifikation von Cys durch Proteinsequenz-Analyse die Derivatisierung mit Alkylierungsreagentien vor. Siehe z. B. Jue et al., Analytical Biochemistry 210, 39-44 (1993).
Ungünstigerweise sind chromatographische Verfahren mit dem Nachteil verbunden, daß sie langsam und arbeitsintensiv sind. Außerdem erfordern aktuelle Verfahren zur Hcy-Analyse eine vorherige Derivatisierung mit fluoreszierenden Markern, wie z. B. Brombiman, wobei die Brommethylgruppe mit dem freien Thiol von Hcy reagiert, wodurch ein Thioether gebildet und freies Bromid-Ion freigesetzt wird. Das Brombiman- Reagens reagiert auch mit allen anderen freien Thiolen in Lösung, weshalb die chromatographische Trennung der verschiedenen derivatisierten schwefelhaltigen Spezies notwendig ist.
Da viele der aktuellen Verfahren zur Hcy-Analyse auf komplexen chromatographischen Verfahren beruhen, besteht die Notwendigkeit eines schnelleren und einfacheren Assays auf Hcy auf der Grundlage von Antikörpern. Es wurde bislang noch kein Immunassay auf Hcy eingesetzt, da man davon ausging, daß er problematisch sei, da das Hcy-Molekül wahrscheinlich zu klein ist und zu wenige Antikörper-Erkennungsmerkmale enthält, um als wirkungsvolles Hapten zur Antikörper-Bildung herangezogen zu werden. Außerdem erreichen Antikörper möglicherweise nicht den Grad an Antigen-Spezifität, der erforderlich ist, um zwischen Hcy und Cys zu unterscheiden, die sich hinsichtlich ihrer Struktur duch eine einzige Methylengruppe unterscheiden. Demzufolge besteht derzeit die Notwendigkeit, ein Immunassay-Verfahren zu entwickeln, das eine hochspezifische Quantifizierung und Unterscheidung dieser Verbindungen ermöglicht.
Es existieren zahlreiche Verfahren zur Handhabung unerwünschter kreuzreaktiver Mittel. Brynes et al., US-A-4.952.336 beschreiben ein Verfahren zur Vorbehandlung einer Probe mit einer wäßrigen Periodat-Lösung zur Eliminierung von kreuzreaktiven Mitteln in einem Amphetamin-Methamphetamin-Immunassay. Stevenson, PCT/GB90/01649 (WO 91/06856) beschreibt einen verbesserten Immunassay, worin das Interferenzniveau aufgrund von Rheumatoidfaktor durch Vorbehandeln der Probe mit einem Reduktionsmittel verringert wird. Mach et al., US-A-4.978.632 offenbaren einen verbesserten Immunassay, worin die Interferenz durch Blut und Blutprodukte eliminiert wird, indem die Probe mit einem Oxidationsmittel vorbehandelt wird. Diese Vorbehandlungsverfahren betreffen nur die kreuzreaktiven Mittel; keines dieser Verfahren betrifft den Analyten.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart oder Menge einer ersten Verbindung in Gegenwart einer zweiten Verbindung in einer Probe, die vermutlich die Verbindung enthält, wobei die Verbindungen immunologisch verwandt und homolog sind, umfassend die folgenden Schritte: (a) Zusammenbringen in einem wäßrigen Medium der Probe, eines Modifikator-Reagens, das die erste Verbindung und die zweite Verbindung chemisch modifizieren kann, wodurch eine modifizierte erste Verbindung und eine modifizierte zweite Verbindung gebildet werden, die immunologisch voneinander verschieden sind, und eines Antikörpers, der sich spezifisch an die modifizierte erste Verbindung, nicht jedoch an die modifizierte zweite Verbindung binden kann, um einen Immunkomplex zu bilden; und (b) Messen des Ausmaßes der Bindung des Antikörpers an der modifizierten ersten Verbindung, wobei dieses Ausmaß mit der Gegenwart oder Menge der ersten Verbindung in der Probe in Beziehung steht. Dieses Verfahren eignet sich besonders für einen Assay auf Hcy in Gegenwart des immunologisch verwandten Cys.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Menge an Hcy in Gegenwart von Cys in einer Probe, die vermutlich Hcy enthält, umfassend die folgenden Schritte: (a) Zusammenbringen in einem wäßrigen Medium: der Probe, eines Modifikator-Reagens, das Hcy und Cys chemisch modifizieren kann, um modifiziertes Hcy und modifiziertes Cys zu bilden, eines Analogs des modifizierten Hcy, das an einen nachweisbaren Marker gebunden ist, und eines Antikörpers, der sich spezifisch an das modifizierte Hcy und das Analog, nicht jedoch an das modifizierte Cys binden kann; und (b) Messen der Menge des Immunkomplexes, wobei diese Menge zur Menge des Hcy in der Probe in Beziehung steht.
Eine Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Menge an Hcy in Gegenwart von Cys in einer Probe, die vermutlich Hcy enthält, umfassend die folgenden Schritte: (a) Zusammenbringen in einem wäßrigen Medium: der Probe, eines Modifikator-Reagens, das Hcy und Cys chemisch modifizieren kann, um modifiziertes Hcy und modifiziertes Cys zu bilden, eines Analogs des modifizierten Hcy, das an einem nachweisbaren Marker gebunden ist, und eines Antikörpers, der sich spezifisch an das modifizierte Hcy und an das Analog, nicht jedoch an das modifizierte Cys binden kann; und (b) Messen des Ausmaßes der Bindung des Analogs am Antikörper, wobei dieses Ausmaß mit der Menge an Hcy in der Probe in Beziehung steht.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Menge an Hcy in einer Probe, die vermutlich Hcy und Cys enthält, umfassend die folgenden Schritte: (a) Zusammenbringen in einem wäßrigen Medium: der Probe, eines Modifikator-Reagens, das Hcy und Cys chemisch modifizieren kann, um modifiziertes Hcy und modifiziertes Cys zu bilden, eines Antikörpers, der sich spezifisch an das modifizierte Hcy, nicht jedoch an das modifizierte Cys binden kann, um einen Immunkomplex zu bilden, einer Oberfläche, die den Antikörper binden kann, und eines markierten Analogs des modifizierten Hcy; und (b) Messen des Ausmaßes der Bindung des markierten Analogs am Antikörper, wobei dieses Ausmaß mit der Menge an Hcy in der Probe in Beziehung steht.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Menge an Hcy in einer Probe, die vermutlich Hcy und Cys enthält, umfassend die folgenden Schritte: (a) Zusammenbringen in einem wäßrigen Medium: der Probe, eines Modifikator-Reagens, das Hcy und Cys chemisch modifizieren kann, um modifiziertes Hcy und modifiziertes Cys zu bilden, eines Antikörpers, der sich spezifisch an das modifizierte Hcy, nicht jedoch an das modifizierte Cys binden kann, um einen Immunkomplex zu bilden, und eines Rezeptors, der sich an einen Teil des Modifikator-Reagens binden kann, worin der Teil auf dem modifizierten Hcy vorhanden ist; und (b) Messen des Ausmaßes der Bindung des Antikörpers am Rezeptor, wobei dieses Ausmaß mit der Menge an Hcy in der Probe in Beziehung steht.
Eine weitere Ausführungsform betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Menge an Hcy in Gegenwart von Cys in einer Serumprobe, die vermutlich Hcy enthält, worin zumindest ein Teil von Hcy in der Disulfidform (proteingebunden und freies Disulfid) vorliegt, umfassend die folgenden Schritte: (a) Zusammenbringen in einem wäßrigen Medium: der Probe, eines Freisetzungsmittels, um das Hcy aus der Disulfidform freizusetzen, eines Modifikator-Reagens, das die Sulfhydrylgruppen von Hcy und Cys chemisch modifizieren kann, um modifiziertes Hcy und modifiziertes Cys zu bilden, und eines Antikörpers, der das modifizierte Hcy, jedoch nicht das modifizierte Cys spezifisch binden kann, um einen Immunkomplex zu bilden; und (b) Untersuchen des Mediums auf die Menge des Immunkomplexes, wobei diese Menge zur Menge an Hcy in der Probe in Beziehung steht.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Set zur Verwendung in einem Verfahren zur Bestimmung von Hcy, das - kombiniert verpackt - umfaßt: ein Modifikator-Reagens, das Hcy und Cys chemisch modifizieren kann, um modifiziertes Hcy und modifiziertes Cys zu bilden, und einen Antikörper, der sich spezifisch an modifiziertes Hcy, nicht jedoch an modifiziertes Cys binden kann. Das Set kann auch ein markiertes Analog des modifizierten Hcy und ein Freisetzungsmittel umfassen.

BESCHREIBUNG SPEZIFISCHER AUSFÜHRUNGSFORMEN

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Nachweis einer Verbindung in Gegenwart eines Homologs, das immunologisch mit dem Analyten verwandt ist. Die Verfahren der Erfindung umfassen das chemische Modifizieren des Analyten und des Homologs, um die Immunogenität zu erhöhen und die Antikörper-Erkennung zu erleichtern. Vor allem erfolgt diese Modifikation, um diese Verbindungen immunologisch unterscheidbar zu machen. Die chemische Modifikation umfaßt vorzugsweise mehr als das Ersetzen eines Wasserstoffs durch eine chemische Gruppe. Antikörper gegen die modifizierten und immunologisch unterschiedlichen Verbindungen werden dann erzeugt. Eine Assay-Vorschrift umfaßt das chemische Modifizieren des Analyten und Homologs und den anschließenden immunochemischen Nachweis des modifizierten Analyten mittels der obigen Antikörper. Insbesondere betrifft die Erfindung quantitative immunochemische Verfahren, die zwischen den Sulfhydryl-Aminosäuren Homocystein (Hcy) und Cystein (Cys) unterscheiden. Hcy und Cys sind Homologe:
HOOC-CH(NH&sub2;)-CH&sub2;-CH&sub2;-SH
Homocystein
HOOC-CH(NH&sub2;)-CH&sub2;-SH
Cystein
Außerdem sind Hcy und Cys immunologisch verwandt, da man davon ausgehen kann, daß ein gegen Hcy gebildeter Antikörper mit Cys kreuzreagiert, da der Unterschied zwischen den zwei Verbindungen nur in einem einzigen Kohlenstoff in der Länge ihrer Aminosäure-Seitenketten besteht.
Vor einer weiteren Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen der Erfindung werden einige Ausdrücke definiert.
Analyt: Die nachzuweisende Verbindung oder Zusammensetzung. Der Analyt kann ein Element eines spezifischen Bindepaars ("sbp") sein und kann ein Ligand sein, kann einwertig (monoepitop) oder mehrwertig (polyepitop) sein, ist üblicherweise ein Antigen oder Hapten und ist eine einzige Verbindung oder eine Vielzahl an Verbindungen, die zumindest eine gemeinsame Epitopen- oder Determinanten-Stelle aufweisen.
Die Erfindung bietet ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten in einer Probe, die auch ein Homolog des Analyten enthält, durch chemisches Modifizieren des Analyten und des Homologs und anschließendes Nachweisen des modifizierten Analyten. Daher wird der Analyt bestimmt, indem ein Reaktionsprodukt nachgewiesen wird, dessen Gegenwart nur nachgewiesen wird, wenn der Analyt von Interesse in der Probe vorhanden ist. Somit wird tatsächlich der "modifizierte" Analyt im Assay nachgewiesen. Der Analyt kann direkt in einer Probe, wie z. B. einer Körperflüssigkeit eines Wirts, festgestellt werden, z. B. Harn, Blut, Plasma, Serum, Speichel, Sperma, Kot, Sputum, Rückenmarksflüssigkeit, Tränenflüssigkeit, Schleim oder dergleichen, ist jedoch vorzugsweise Serum oder Plasma. Die Probe kann - wie nachstehend besprochen - vorbehandelt werden.
Element eines spezifischen Bindepaars ("sbp"-Element): Ein oder zwei unterschiedliche Moleküle mit einem Bereich auf der Oberfläche oder in einem Hohlraum, der sich spezifisch an eine bestimmte räumliche und polare Anordnung des anderen Moleküls bindet und somit als komplementär dazu definiert ist. Die Elemente des sbp können als Ligand und Rezeptor bezeichnet werden, z. B. Elemente eines immunologischen Paars, z. B. Antigen-Antikörper. Der Ausdruck "Ligand" bezieht sich hierin auf jede Verbindung, für die ein Rezeptor natürlich existiert oder hergestellt werden kann; der Ausdruck "Rezeptor" bezieht sich auf jede Verbindung oder Zusammensetzung, die eine bestimmte räumliche und polare Anordnung eines Moleküls erkennen kann, z. B. eine Epitopen- oder Determinanten-Stelle. Komplementäre sbp-Elemente binden sich aneinander, z. B. ein Ligand und sein komplementärer Rezeptor. Sbp-Elemente können immunologische Paare, wie z. B. Antigen und Antikörper, oder nicht-immunologisch, wie z. B. Avidin und Biotin oder die komplementären Stränge eines Oligonukleotids, sein. Sbp-Elemente können auch kleine Moleküle oder Reste kleiner Moleküle und ihrer Rezeptoren sein. Kleine Moleküle besitzen ein Molekulargewicht von 100 bis 2.000, vorzugsweise 150 bis 1.000, und entweder gibt es einen Rezeptor oder er kann hergestellt werden. Beispiele für kleine Moleküle sind Derivate von Biotin, Lysergsäure, Fluorescein oder ein Fluorescein-Derivat sowie Vitamin B&sub1;&sub2;, wobei die korrespondierenden Rezeptoren Avidin oder Streptavidin, Antilysergsäure, Antifluorescein bzw. Intrinsic Factor sind. Antikörper gegen kleine Moleküle können durch Binden des kleinen Moleküls an einen immunogenen Träger hergestellt werden.
Träger oder Oberfläche: Die feste Phase ist typischerweise ein Träger oder eine Oberfläche, der bzw. die aus einem porösen oder nichtporösen wasserunlöslichen Material besteht, das jede beliebige Form aufweisen kann, wie z. B. Streiten, Stab, Teilchen, Perlen und dergleichen. Geeignete Materialien sind auf dem Gebiet allgemein bekannt und z. B. von Ullman et al., US-A-5.185.243, Spalten 10-11, beschrieben. Die Bindung von sbp-Elementen an den Träger oder die Oberfläche kann durch allgemein bekannte und in der Literatur ausführlich beschriebene Verfahren erzielt werden. Siehe beispielsweise "Immobilized Enzymes", Ichiro Chibata, Halsted Press, New York (1978), und Cuatrecasas, J. Biol. Chem. 245, 3059 (1970).
Ungeachtet der Art des verwendeten festen Trägers muß er behandelt werden, um Antikörper aufzuweisen, die den modifizierten, an seine Oberfläche gebundenen Analyten oder einen an seine Oberfläche gebundenen Rezeptor spezifisch binden, wobei der Rezeptor sich spezifisch an solche Antikörper oder ein kleines, an solche Antikörper gebundenes Molekül bindet. Beispielsweise kann Avidin oder Streptavidin kovalent an kugelförmige Glasperlen von 0,5-1,5 mm gebunden und dazu verwendet werden, einen biotinylierten Antikörper einzufangen.
Signalerzeugendes System ("sps"): Eine oder mehrere Komponenten, von denen zumindest eine ein Marker ist, die ein nachweisbares Signal erzeugen, das mit der Men ge an gebundenem und/oder ungebundenem Marker in Beziehung steht. Vorzugsweise ist der Marker ein Fluoreszenzmittel, Radiomarker, Enzym, Chemolumineszenzmittel oder Photosensibilisator, die durch Beobachten von Enzymaktivität, Lumineszenz, Lichtabsorptionsvermögen oder Radioaktivität nachgewiesen werden.
Geeignete Marker, als Veranschaulichung und nicht als Einschränkung zu verstehen, umfassen Enzyme, wie z. B. alkalische Phosphatase und Meerrettich-Peroxidase; ein Substrat für eine Replicase, wie z. B. QB-Replicase; Promotoren; Farbstoffe; Fluoreszenzmittel, wie z. B. Fluorescein, Isothiocyanat, Rhodamin-Verbindungen, Phycoerythrin, Phycocyanin, Allophycocyanin, o-Phthalaldehyd und Fluorescamin; Chemolumineszenzmittel, wie z. B. Isoluminol; Sensibilisatoren; Coenzyme; Enzymsubstrate; Radiomarker, wie z. B. ¹²&sup5;I, ¹³¹I, ¹&sup4;C, ³H, ³²P und ³&sup5;S; Teilchen wie z. B. Latex- oder Kohlenstoffteilchen; Metallsol; Krystallite; Liposome; Zellen usw., die mit einem Farbstoff, Katalysator oder einer anderen nachweisbaren Gruppe und dergleichen weiter markiert sein können oder nicht. Geeignete Enzyme und Coenzyme werden von Litman et al., US-A-4.275.149, Spalten 19-28, und Bogusklaski et al. US-A-4.318.980, Spalten 10-14, geoffenbart; geeignete Fluoreszenzmittel und Chemolumineszenzmittel werden von Litman et al., US-A-4.275.149, Spalten 30 und 31, geoffenbart.
Es gibt zahlreiche Verfahren, durch die der Marker ein durch ein externes Mittel nachweisbares Signal erzeugen kann, z. B. visuelle Untersuchung, elektromagnetische Strahlung, elektrochemische Nachweise, phonakustische Spektroskopie und dergleichen. Der Marker oder andere sps-Elemente können auch an einem sbp-Element, einem anderen Molekül oder einem Träger gebunden sein.
Der Marker kann direkt ein Signal erzeugen, weshalb keine zusätzlichen Komponenten erforderlich sind, um ein Signal zu erzeugen. Zahlreiche organische Moleküle, beispielsweise Fluoreszenzmittel, können ultraviolettes und sichtbares Licht absorbieren, wo die Lichtabsorption Energie auf diese Moleküle überträgt und sie in einen angeregten Energiezustand hebt. Diese absorbierte Energie wird dann durch Emission von Licht bei einer zweiten Wellenlänge abgeleitet. Andere Marker, die ein Signal direkt erzeugen, sind radioaktive Isotope und Farbstoffe.
Alternativ dazu erfordert der Marker möglicherweise andere Komponenten, um ein Signal zu erzeugen, und das sps würde dann alle Komponenten enthalten, die zur Erzeugung eines meßbaren Signals erforderlich sind, umfassend z. B. Substrate, Coenzyme, Verstärker, zusätzliche Enzyme, Substanzen, die mit Enzymprodukten reagieren, Katalysatoren, Aktivatoren, Cofaktoren, Inhibitoren, Fänger, Metallionen, spezifische Bindungssubstanzen, die zur Bindung von signalerzeugenden Substanzen erforderlich sind, und dergleichen. Eine ausführliche Beschreibung geeigneter signalerzeugender Systeme findet sich in Ullman et al., US-A-5.185.243, Spalten 11-13.
Der Marker kann kovalent an mehrere sbp-Elemente gebunden sein: ein Antikörper, der den modifizierten Analyten bindet; ein Rezeptor für einen Antikörper, der den modifizierten Analyten bindet; ein Rezeptor, der zur Bindung an ein kleines Molekül fähig ist, das mit einem Antikörper verbunden ist, der den modifizierten Analyten bindet; oder ein Ligand, insbesondere ein Analog des modifizierten Analyten. Das Binden des Markers an das sbp-Element kann durch chemische Reaktionen erfolgen, die dazu führen, daß ein Wasserstoffatom des Markers durch eine Bindung an das sbp-Element ersetzt wird, oder kann eine Verbindungsgruppe zwischen dem Marker und dem sbp-Element enthalten. Andere sps-Elemente können auch kovalent an sbp-Elemente gebunden sein. Beispielsweise können zwei sps-Elemente, wie z. B. Fluoreszenzmittel und Quencher, jeweils an ein Analog des modifizierten Analyten und ein Antikörper an den Analyten gebunden sein, der einen Komplex mit dem Analog bildet. Die Bildung des Komplexes bringt das Fluoreszenzmittel und den Quencher in unmittelbare Nähe zueinander, wodurch es dem Quencher ermöglicht wird, mit dem Fluoreszenzsignal in Wechselwirkung zu treten, um ein Signal zu erzeugen. Bindungsverfahren sind auf dem Gebiet allgemein bekannt. Siehe z. B. Rubenstein et al., US-A-3.817.837. Die Erfindung betrifft auch einen Antikörper, der an ein erstes Element eines signalerzeugenden Systems gebunden ist, und einen nachweisbaren Marker als zweites Element eines signalerzeu genden Systems. Wenn beispielsweise der nachweisbare Marker an ein Analytenanalog gebunden ist, kann das Ausmaß der Bindung des Antikörpers an das Analog gemessen werden, indem das Signal, das durch die Wechselwirkung der signalerzeugenden Systemelemente erzeugt wird, nachgewiesen wird.
Zusatzmaterialien: In den Verfahren gemäß der Erfindung werden häufig verschiedene Zusatzmaterialien verwendet. Beispielsweise sind Puffer normalerweise im Assaymedium vorhanden, ebenso wie Stabilisatoren für das Assaymedium und die Assaykomponenten. Häufig können neben dieses Additiven Proteine enthalten sein, z. B. Albumine, organische Lösungsmittel, wie z. B. Formamid, quaternäre Ammoniumsalze, Polykationen, wie z. B. Dextransulfat, oder Tenside, insbesondere nichtionogene Tenside, Bindungsverstärker, z. B. Polyalkylenglykole, oder dergleichen.
Wie bereits erwähnt, betrifft die Erfindung Verfahren zum Nachweis einer Verbindung in Gegenwart eines Homologs, das immunologisch mit dem Analog verwandt ist.
Ein Verfahren der Erfindung betrifft die Bestimmung der Gegenwart oder Menge einer ersten Verbindung in Gegenwart einer zweiten Verbindung in einer Probe, die vermutlich die Verbindungen enthält, worin die Verbindungen immunologisch verwandt sind. Das Verfahren umfaßt folgende Schritte: (a) Zusammenbringen in einem wäßrigen Medium: der Probe, eines Modifikator-Reagens, das die erste Verbindung und die zweite Verbindung chemisch modifizieren kann, um eine modifizierte erste und eine modifizierte zweite Verbindung zu bilden, und eines Antikörpers, der sich spezifisch an die modifizierte erste Verbindung, jedoch nicht an die modifizierte zweite Verbindung binden kann, um einen Immunkomplex zu bilden; und (b) das Messen des Ausmaßes der Bindung des Antikörpers an die modifizierte erste Verbindung, wobei dieses Ausmaß mit der Gegenwart oder Menge der ersten Verbindung in der Probe in Beziehung steht. Dieses Verfahren eignet sich besonders dann, wenn die Verbindungen homolog sind.
Der Ausdruck "immunologisch verwandt" bezieht sich hierin auf zwei Verbindungen, von denen eine der Analyt von Interesse ist, für die ein Antikörper existiert, der Kreuzreaktivität aufweist. Die Berechnung der Kreuzreaktivität basiert auf dem Verhältnis der Konzentrationen der zwei Verbindungen, die zur gleichen Bindung an den Antikörper führen. Antikörper gegen unterschiedliche Homologe zeigen oft hohe Kreuzreaktivität. Häufig kann daher eine Verbindung in einem Immunassay nicht exakt gemessen werden, wenn ein Homolog im Medium vorhanden ist. In diesem Fall kann die Verwendung eines Antikörperreagens zum Nachweisen des Analyten oft dazu führen, daß sich einige der Antikörper an das Homolog binden und eine falsche positive oder ungenaue quantitative Ablesung ergeben. Das Ausmaß der Kreuzreaktivität, das in einem Immunassay anzunehmen ist, hängt von der höchsten Konzentration, die vom kreuzreaktiven Mittel erwartet wird, der für den Assay erforderlichen Sensitivität und der erforderlichen Genauigkeit ab. Wenn beispielsweise ein Antikörper 10% kreuzreaktiv mit Cys ist und Cys in einer Probe in einer Menge vorhanden ist, die fünfmal größer ist als die geringste nachzuweisende Menge an Hcy, ist die gemessene Menge von Hcy 50% zu hoch, wenn die Menge an Hcy am geringsten ist. Wenn nur ein 5%-iger Fehler anzunehmen ist, müßte die Kreuzreaktivität weniger als 1% betragen. In der vorliegenden Erfindung müssen Antikörper, die gegen den modifizierten Analyten gerichtet sind, ein geringes Maß an Kreuzreaktivität mit dem modifizierten Homolog aufweisen. Wie oben gezeigt, hängt die Quantifizierung eines "hohen" oder "niedrigen" Grads an Kreuzreaktivität von der maximalen erwarteten Konzentration des modifizierten Homologs sowie von der gewünschten Sensitivität und Genauigkeit ab.
Der Ausdruck "homolog" beschreibt hierin eine Verbindung in einer Reihe organischer Verbindungen, die die gleichen chemischen funktionellen Gruppen besitzen und sich von der nächsten durch eine eingefügte -CH&sub2;-Gruppe im Molekül unterscheiden. Beispielsweise sind CH&sub3;OH (Methanol), C&sub2;H&sub5;OH (Ethanol) und C&sub3;H&sub7;OH (Propanol) usw. alle Homologe und bilden eine homologe Reihe. Beispiele für homologe Verbindungen innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung sind Homocystein und Cystein, Amphetamin und Methamphetamin, Serin und Homoserin, Citrat und Homocitrat, Aspartat und Glutamat, Alanin und β-Aminoisobutyrat, Tetrahydrofolat und N&sup5;-Vtethyltetrahydrofolat, Oxaloacetat und α-Ketoglutarat, Gentisinsäure und Homogentisinsäure, Morphin und Normorphin und dergleichen.
Der Ausdruck "Modifikator-Reagens" bezieht sich hierin auf ein Reagens, das mit zwei Homologen reagiert, um zwei neue und immunologisch unterschiedliche Verbindungen zu bilden. Der Ausdruck "immunologisch unterschiedlich" bedeutet, daß es Antikörper gegen den modifizierten Analyten gibt, die geringe Kreuzreaktivität mit dem modifizierten Homolog aufweisen. Homologe besitzen die gleichen funktionellen Gruppen, und Antikörper gegen unterschiedliche Homologe zeigen oft einen hohen Grad an Kreuzreaktivität. Daher kann eine Verbindung in einem Immunassay nicht präzise gemessen werden, wenn ein Homolog im Medium vorhanden ist. Das Modifikator-Reagens ist in der Lage, die untersuchte Verbindung (den "Analyten") und ihr Homolog chemisch zu modifizieren, sodaß die zwei Verbindungen immunologisch unterschiedlich sind. In der Folge weisen Antikörper gegen den modifizierten Analyten geringere Kreuzreaktivität mit dem modifizierten Homolog auf. Das modifizierte Reagens ist üblicherweise in wäßrigen Lösungsmitteln löslich. Das modifizierte Reagens ist so gewählt, daß es beide Verbindungen innerhalb kurzer Zeit modifiziert, üblicherweise in weniger als 4 Stunden, vorzugsweise in weniger als 20 Minuten, am bevorzugtesten in weniger als 5 Minuten. Es muß in ausreichenden Mengen eingesetzt werden, um bei der Reaktion mit anderen Komponenten in der Probe zur Verfügung zu stehen, um mit dem Analyten zu reagieren. Beispiele für geeignete Modifikator-Reagentien sind Alkylierungsmittel, Acylierungsmittel, Metalle, Nukleophile und Elektrophile. Die Erfindung umfaßt auch ein Modifikator-Reagens mit einem daran gebundenen nachweisbaren Marker, wie z. B. einen Radiomarker. In diesem Fall kann die Menge an modifiziertem Analyt dann durch Nachweis des Markers gemessen werden.
Im oben beschriebenen Verfahren zum Nachweisen einer ersten Verbindung in Gegenwart einer zweiten immunologisch verwandten Verbindung kann der Antikörper nachweisbar markiert sein oder in der Lage sein, nachweisbar markiert zu werden. Alternativ dazu kann - wenn das Modifikator-Reagens markiert ist - der Antikörper an einen Träger gebunden sein oder in der Lage sein, an einen Träger gebunden zu werden.
Die Ausdrücke "in der Lage, nachweisbar markiert zu werden" und "in der Lage, an einen Träger gebunden zu werden" bedeuten, daß ein Reagens, z. B. in diesem Fall der Antikörper, an ein erstes sbp-Element oder ein kleines Molekül und ein komplementäres zweites sbp-Element oder einen Rezeptor für das kleine Molekül gebunden ist, das seinerseits an einen Marker oder einen Träger gebunden ist. Daher ist der Antikörper nicht wirklich markiert oder an einen Träger gebunden, sondern wird dann markiert oder gebunden, wenn das komplementäre sbp-Element oder der Rezeptor zugegeben wird.
Das oben beschriebene Verfahren kann außerdem das Zusammenbringen eines Analogs der modifizierten ersten Verbindung, die an einen nachweisbaren Marker gebunden ist oder gebunden werden kann, und eines Antikörpers, der sowohl das Analog als auch die modifizierte erste Verbindung spezifisch binden kann, umfassen. Das Ausmaß der Bindung des Antikörpers an der modifizierten ersten Verbindung wird durch Messen des Ausmaßes der Bindung des Analogs am Antikörper gemessen. Der Antikörper kann an einen Träger gebunden sein oder in der Lage sein, an einen Träger gebunden zu werden.
Insbesondere betrifft die Erfindung die chemische Modifikation von Hcy und Cys in einer Probe auf eine Weise, die bewirkt, daß sie beide immunologisch unterschiedlich sind, und das anschließende Nachweisen von Hcy. Ein Verfahren zum Bestimmen der Menge an Hcy in Gegenwart von Cys in einer Probe, die vermutlich Hcy enthält, umfaßt die folgenden Schritte: (a) Zusammenbringen in einem wäßrigen Medium: der Probe, eines Modifikator-Reagens, das Hcy und Cys chemisch modifizieren kann, um modifiziertes Hcy und modifiziertes Cys zu bilden, und eines Antikörpers, der sich spezifisch an das modifizierte Hcy, jedoch nicht an das modifizierte Cys binden kann, um einen Immunkomplex zu bilden; und (b) Messen der Menge des Immunkomplexes, wobei diese Menge mit der Menge an Hcy in der Probe in Beziehung steht.
Der Ausdruck "Immunkomplex" bezieht sich hierin auf den Komplex, der durch die immunologische Bindung eines Antigens an einen Antikörper entsteht.
Es eignen sich zur Verwendung im vorliegenden Verfahren die gleichen markierten Reagentien wie jene, die oben unter Bezugnahme auf ein Verfahren zum Nachweisen einer Verbindung in Gegenwart einer immunologisch verwandten Verbindung beschrieben wurden, d. h. markiertes Modifikator-Reagens, markierter Antikörper und markiertes Analog.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist das Modifikator-Reagens ausgebildet, eine Bindung mit zumindest einer der drei Funktionalitäten von Hcy und Cys, den Amino-, Sulfhydryl- und Carboxylgruppen, zu bilden. Üblicherweise bildet sich in zumindest einem der Produkte eine zweite Bindung an eine dieser Gruppen nach der Bildung der ersten Bindung. Dies erzeugt häufig einen Ring. Die erste Bindung kann z. B. mit der Sulfhydrylgruppe erfolgen, die zweite Bindung mit dem Amin.
Modifikator-Reagentien, die mit den Sulfhydrylgruppen von Hcy und Cys reagieren können, besitzen üblicherweise eine Gruppe, die geeigneterweise so liegt, daß sie mit den Hcy- oder Cys-Amino- oder Carboxylgruppen reagieren kann. Diese Gruppe kann - lediglich zur Veranschaulichung nicht aber als Einschränkung - eine Alkylierungs- oder Aclyierungsgruppe, ein Metall oder eine Arylgruppe sein, die für nucleophile Substitution aktiviert ist. Besonders geeignet sind Ketone, die an der α-Position mit einer Abgangsgruppe substituiert sind, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Cl, Br, I, Sulfonaten und Sulfoniumsalzen.
Wie bereits erwähnt, eignen sich Alkylierungsmittel, Acylierungsmittel und Metalle besonders als Modifikator-Reagentien zur Verwendung in einem Hcy-Assay. Der Ausdruck "Alkylierungsmittel" bezieht sich hierin auf ein Modifikator-Reagens, das mit einem organischen Molekül reagiert, um eine Alkyl- oder Arylgruppe in das Molekül einzuführen. Eine Alkylgruppe ist eine Gruppe, die von einem Alkan abgeleitet ist, indem ein Wasserstoff aus der Formel entfernt wird, beispielsweise Methyl, Ethyl, Propyl usw. Eine Arylgruppe ist eine Gruppe, deren Moleküle die Ringstruktur aufweisen, die für Benzol, Naphthalin, Phenanthren, Anthracen usw. charakteristisch ist, d. h. entweder der Kohlenstoff-6-Ring von Benzol oder die kondensierten Kohlenstoff-6-Ringe der anderen aromatischen Derivate. Vorzugsweise besitzt das Alkylierungsmittel eine Gruppe, wie z. B. ein Alkylhalogenid oder ein Arylhalogenid oder elektronegativ substituierte Olefine wie etwa ein Maleimid oder Acrylnitril. Bei Verwendung eines Alkylhalogenids ist üblicherweise ein Keton, Aldehyd, Ester, Olefin, Acetylen, Nitril, Aryl oder dergleichen zum Kohlenstoff, der das Halogen trägt, benachbart. Geeignete Alkylierungsmittel sind beispielsweise die in nachstehender Tabelle angeführten Modifikator-Reagentien I-VIII. Ein besonders geeignetes Alkylierungsmittel ist p-Bromacetylbenzoesäure (BABA), Modifikator-Reagens II.
Der Ausdruck "Acylierungsmittel" bezieht sich auf ein Modifikator-Reagens, üblicherweise ein Sulfonsäure- oder Carbonsäure-Derivat, wie z. B. deren Anhyrid oder Chlorid oder aktiver Ester, das mit einem organischen Molekül reagiert, um eine Sulfonyl- oder Acylgruppe in das Molekül einzuführen. Eine Acylgruppe ist eine organische Säuregruppe, in der -OH der Carboxylgruppe durch einen anderen Subsituenten ersetzt ist, z. B. Acetyl (CH&sub3;CO-) und Benzoyl (C&sub6;H&sub5;CO-). Geeignete Acetylierungsmittel sind z. B. die in nachstehender Tabelle angeführten Modifikator-Reagentien III-V und VIII.
Der Ausdruck "Metall" bezieht sich hierin auf Schwermetall-Chelate, umfassend Metallorganyl-Reagentien, die Chelate mit zweizähnigen Liganden bilden können. Geeignete Metalle sind beispielsweise die in nachstehender Tabelle angeführten Modifikator-Reagentien IX und X.
Besonders geeignete Reagentien besitzen Alkylierungsgruppen, wie z. B. ein Alkylhalogenid oder ein Arylhalogenid. Wenn ein Alkylhalogenid verwendet wird, ist üblicherweise ein Keton, Aldehyd, Ester, Olefin, Acetylen, Nitril, Aryl oder dergleichen zum Kohlenstoff benachbart, der das Halogen trägt. Typische Reagentien und ihre Reaktionsprodukte mit Hcy und Cys, d. h. das "modifizierte" Hcy und Cys, sind in nachstehender Tabelle angeführt:
Die unterstrichene Gruppe in jedem Reagens ist ein Beispiel für eine solubilisierende Gruppe, die für die Derivatisierungsreaktion nicht erforderlich ist:
Reagens Solubilisierungsgruppe
I -COOH
II -COOH
III -COOH
IV -SO&sub3;H
V -SO&sub3;H
VI -COOH
VII -COOH
VIII -COOH
IX -COOH
X -COOH
Wenn ein Marker im Modifikator-Reagens vorhanden ist, kann er aus praktischen Gründen durch die Solubilisierungsgruppe über eine Amid- oder Esterbindung gebunden sein. Vorzugsweise modifiziert das Modifikator-Reagens die Sulfhydryl-Gruppen des Hcy und Cys, um ein modifiziertes Hcy und Cys zu bilden, worin der Schwefel zumindest einer der modifizierten Verbindungen Teil eines Rings ist. Beispiele für Modifikator-Reagentien, worin eine der modifizierten Verbindungen einen Ring bildet, sind die oben dargestellten Modifikator-Reagentien I-X. Noch bevorzugter wird das Modifikator-Reagens so gewählt, daß sowohl das resultierende modifizierte Hcy als auch Cys einen Ring aufweisen, wie dies bei den Modifikator-Reagentien VI und X der Fall ist.
Von den oben erwähnten Modifikator-Reagentien ist ein bevorzugtes Reagens BABA (Modifikator-Reagens II), das sowohl mit Hcy als auch mit Cys bei Raumtemperatur und neutralem pH-Wert rasch reagiert. BABA besitzt die folgenden Vorteile: der Phenylring liefert eine hoch immunogene Gruppe, wenn er einem Immunsystem präsentiert wird; das Carboxylat bietet einen bestimmten Grad an Wasserlöslichkeit sowie eine günstige Stelle zur Bindung an das Trägerprotein; und das Carbonyl der Bromacetyl-Gruppe stellt ein geeignetes Mittel zur Differenzierung zwischen modifiziertem Hcy und Cys dar.
Wie bereits erwähnt, zeigen Antikörper gegen Hcy möglicherweise ein hohes Maß an Kreuzreaktivität mit Cys, da Hcy und Cys Homologe und immunologisch verwandt sind. Es bestehen verschiedene Möglichkeiten, Hcy und Cys zu modifizieren, um sie immunologisch unterschiedlich zu machen. Beispielsweise unterscheidet sich ein sechsgliedriger Ring stereochemisch recht deutlich von einer Kette, weshalb die Antikörpererkennung verbessert und die Kreuzreaktivität reduziert werden kann, wenn Cys so modifiziert wird, daß es einen sechsgliedrigen Ring bildet und das modifizierte Hcy acyclisch ist. Dies wird durch Modifikator-Reagens (VIII) veranschaulicht:
das Cys und Hcy modifiziert, um modifiziertes Cys (VIIIa), worin der Schwefel Teil eines sechsgliedrigen Rings ist:
und modifiziertes Hcy (VIIIb) zu bilden, worin der Schwefel kein Teil eines Rings ist:
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft einen Assay zur Bestimmung der Menge an Hcy in Gegenwart von Cys in einer Probe, die vermutlich Hcy enthält, unter Anwendung des folgenden Verfahrens: (a) Zusammenbringen in einem wäßrigen Medium: der Probe, eines Modifikator-Reagens, das Hcy und Cys chemisch modifizieren kann, um modifiziertes Hcy und modifiziertes Cys zu bilden, eines Analogs des modifizierten Hcy, das an einen nachweisbaren Marker gebunden ist, und eines Antikörpers, der sich spezifisch an das modifizierte Hcy und an das Analog, nicht jedoch an das modifizierte Cys binden kann; und (b) Messen des Ausmaßes an Bindung des Analogs am Antikörper, wobei dieses Ausmaß mit der Menge an Hcy in der Probe in Beziehung steht. In dieser Ausführungsform ist das gemessene Signal ein Anzeichen für das Ausmaß der Bindung des Analogs am Antikörper. Das Signal steht daher in umgekehrter Beziehung zur Menge an Hcy in der Probe.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft einen Assay auf die Menge an Hcy in einer Probe, die vermutlich Hcy und Cys enthält, unter Anwendung des folgenden Verfahrens: Zusammenbringen in einem wäßrigen Medium: der Probe, eines Modifikator-Reagens, das Hcy und Cys chemisch modifizieren kann, um modifiziertes Hcy und modifiziertes Cys zu bilden, eines Antikörpers, der sich spezifisch an modifiziertes Hcy, jedoch nicht an modifiziertes Cys binden kann, um einen Immunkomplex zu bilden, einer zur Bindung des Antikörpers fähigen Oberfläche, und eines markierten Analogs des modifizierten Hcy; und (b) Messen des Ausmaßes der Bindung des markierten Analogs am Antikörper, wobei dieses Ausmaß mit der Menge an Hcy in der Probe in Beziehung steht. Das Verfahren kann weiters das Zusammenbringen eines markierten ersten spezifischen Bindepaarelements umfassen, worin der Markier des markierten Analogs ein komplementäres zweites spezifisches Bindepaarelement ist, beispielsweise ein an Fluorescein gebundenes Analog und ein enzymmarkierter Anti-Fluorescein-Antikörper. In dieser Ausführungsform ist das gemessene Signal ein Anzeichen für das Ausmaß der Bindung des Analogs am Antikörper. Das Signal steht daher in umgekehrter Beziehung zur Menge an Hcy in der Probe.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft einen Assay zur Bestimmung der Menge an Hcy in einer Probe, die vermutlich Hcy und Cys enthält, umfassend die folgenden Schritte: (a) Zusammenbringen in einem wäßrigen Medium: der Probe, eines Modifikator-Reagens, das Hcy und Cys chemisch modifizieren kann, um modifiziertes Hcy und modifiziertes Cys zu bilden, eines Antikörpers, der sich spezifisch an modifiziertes Hcy, nicht jedoch an modifiziertes Cys zubinden, um einen Immunkomplex zu bilden, und eines Rezeptors, der sich an einen Teil des Modifikator-Reagens binden kann, worin der Teil auf dem modifizierten Cys vorhanden ist; und Messen des Ausmaßes der Bindung des Antikörpers am Rezeptor, wobei dieses Ausmaß mit der Menge an Hcy in der Probe in Beziehung steht. Das Modifikator-Reagens kann aus einem Hapten, einem Liganden oder einem Hcy- oder Cys-Rezeptor bestehen, worin der Rezeptor, der einen Teil des Modifikator-Reagens bindet, ein Anti-Hapten-Antikörper, ein Rezeptor für den Liganden oder ein Antikörper gegen den Hcy- oder Cys-Rezeptor sein kann. Entweder der Rezeptor oder der spezifische Antikörper oder sowohl der Rezeptor als auch der spezifische Antikörper können markiert sein, wobei einer an einen Träger gebunden sein kann. Es folgt eine Veranschaulichung der Ausführungsform dieses Verfahrens. Beispielsweise bildet ein an Biotin gebundenes Modifikator-Reagens ein an Biotin modifiziertes Hcy. Ein Komplex wird gebildet, der das modifizierte Hcy, einen markierten Antikörper, der sich spezifisch an das modifizierte Hcy binden kann, und an einen Träger gebundenes Avidin umfaßt. Alternativ dazu bildet ein an ein Hapten gebundenes Modifikator-Reagens ein an das Hapten gebundenes modifiziertes Hcy. Ein Komplex wird gebildet, der das modifizierte Hcy, einen Antikörper, der sich spezifisch an das modifizierts Hcy binden kann, das an einem ersten Marker gebunden ist, und einen Anti-Hapten-Antikörper, der an einem zweiten Marker gebunden ist, umfaßt.
Hcy liegt im menschlichen Plasma in Form von verschiedenen gemischten Disulfiden vor. Normalerweise ist ein Großteil von Hcy (etwa 70%) über eine Disulfidbindung an Proteine im Kreislaut, wie z. B. Albumin, proteingebunden. Das verbleibende "freie" Hcy (etwa 30%) liegt in Form von Hcy (reduziert) oder in Form von gemischte Disulfiden mit anderen Thiolen wie z. B. Cys vor. Die Summe dieser Hcy-Spezies, die im Plasma vorhanden sind (proteingebunden, freies Disulfid und frei-reduziert) wird als "Gesamt-Hcy" bezeichnet. Die Messung des Gesamt-Hcy in Serum umfaßt vorzugsweise einen Vorbehandlungsschritt, um proteingebundenes Hcy freizusetzen und die gemischte Disulfidform von Hcy zu reduzieren, d. h. die freie Disulfidform. Das bevorzugte Verfahren der Erfindung mißt das Gesamt-Hcy, da das Verhältnis der drei Formen von Hcy (proteingebunden, freies Disulfid oder frei-reduziert) von Faktoren wie z. B. Hcy-Konzentration, Probenbehandlung, Lagerart usw. abhängt. Die Messung von freiem Hcy kann jedoch, falls gewünscht, auch ohne Vorbehandlung erfolgen.
Zur Messung der Gesamtmenge an Hcy in einer Probe wird die Probe zuerst mit einem Freisetzungsmittel kombiniert, um das Hcy aus den Proteinen im Kreislauf sowie aus Hcy-Dimeren und anderen gemischten Disulfiden freizusetzen. Besonders geeignet ist ein Reduktionsmittel, das organische Disulfide reduziert. Ein solches Verfahren zur Bestimmung der Menge an Hcy in Gegenwart von Cys in einer Serumprobe, die vermutlich das Hcy enthält, worin zumindest ein Teil des Hcy in der Disulfidform vorliegt (proteingebunden und freies Disulfid), umfaßt die folgenden Schritte: (a) Zusammenbringen in einem wäßrigen Medium: der Probe, eines Freisetzungsmittels zur Freisetzung des Hcy aus der Disulfidform, eines Modifikator-Reagens, das die Sulfhydrylgruppen von Hcy und Cys chemisch modifizieren kann, um modifiziertes Hcy und modifiziertes Cys zu bilden, und eines Antikörpers, der sich spezifisch an modifiziertes Hcy, jedoch nicht an modifiziertes Cys binden kann, um einen Immunkomplex zu bilden; und (b) Untersuchen des Mediums hinsichtlich der Menge des Immunkomplexes, wobei diese Menge zur Menge an Hcy in der Probe in Beziehung steht. Das Freisetzungsmittel kann ein Reduktionsmittel (siehe oben) sein, oder es kann mit Disulfiden reagieren, um modifiziertes Hcy und modifiziertes Cys zu bilden und dadurch sowohl als Freisetzungsmittel als auch als Modifikator-Reagens zu wirken.
Geeignete Freisetzungsmittel, die die Hcy- und Cys-Schwefelverbindungen aus Serumproteinen freisetzen können, sind auf dem Gebiet allgemein bekannt und umfassen ohne Einschränkungen Reduktionsmittel, wie z. B. Natrium- und Kaliumborhydrid; Thiole, wie z. B. Dithiothreitol, Dithioerythritol, 2-Mercaptoethanol, Thioglykolsäure und Glutathion; und Phosphine und Trialkylphosphine, wie z. B. Tributylphosphin und Tris-(2-carboxyethyl)phosphin. Besonders geeignete Reduktionsmittel sind Dithiothreitol und Tris-(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP), wobei das letztere von Burns et al.,J. Org. Chem. 56 (8), 2648-2650 (1991), beschrieben wurde. Die Reduktionsreaktion ist nachstehend anhand von TCEP veranschaulicht, worin proteingebundenes Hcy und proteingebundenes Cys aus dem Serumprotein freigesetzt werden:
Wenn das Freisetzungsmittel auch als Modifikator-Reagens wirkt, können Sulfite, Phosphite, Phosphorimidate und dergleichen, einschließlich von Salzen ihrer Mono- und Diester, verwendet werden. Diese Reagentien reagieren mit Hcy- und Cys-Disulfiden, um modifiziertes Hcy und Cys zu ergeben, die Thiosulfat- oder Thiophosphatgruppen aufweisen.
Wenn das Freisetzungsmittel hingegen nicht als Modifikator-Reagens wirkt, werden die freigesetzten Thiole mit einem thiolspezifischen Modifikator-Reagens freigesetzt. Die Auswahl des Freisetzungsmittels kann oft durch Auswahl des Modifikator-Reagens bestimmt werden, da einige Kombinationen von Reagentien bevorzugter als andere sind. Zahlreiche Kombinationen von Freisetzungsmitteln und Modifikator-Reagentien reagieren miteinander, wodurch es erforderlich ist, daß die Probe und das Freisetzungsmittel zunächst zusammengebracht werden und dann ausreichend Modifikator-Reagens zugegeben wird, um mit dem Freisetzungsmittel und dem freigesetzten Hcy und Cys zu reagieren. Alternativ dazu kann ein Freisetzungsmittel wie z. B. Phosphin mit einem ungesättigten Modifikator-Reagens wie z. B. Maleimid, mit dem es nicht reagiert, verwendet werden. Obwohl dies für mehr Flexibilität in der Arbeitsvorschrift sorgt, kann die Verwendung eines weniger reaktiven Modifikator-Reagens eine längere Inkubationsdauer nach sich ziehen, um die vollständige Reaktion mit dem Hcy und Cys sicherzustellen. Die Auswahl des Freisetzungsmittels und Modifikator-Reagens beruht somit auf der gewünschten Arbeitsvorschrift und dem gewünschten Zeitablauf des Assays.
Geeignete Reaktionsbedingungen werden gewählt, um die Verfahren der Erfindung durchzuführen. Die folgende Beschreibung zeigt zweckmäßige Bedingungen auf, die von Fachleuten auf dem Gebiet je nach Reagentien und Assay-Arbeitsvorschrift, die für eine bestimmte Anwendung ausgewählt werden, modifizierbar sind. Beispielsweise können die Verfahren der Erfindung auf zahlreiche Arten von Assays wie z. B. heterogene oder homogene, kompetitive oder direkte angewendet werden, wobei die Bedingungen und Reagentien entsprechend gewählt werden.
Die Probe - vorzugsweise in einem geeigneten Medium - kann direkt untersucht oder vorbehandelt werden, bevor die Probe dem Assaymedium zugegeben wird. Die Vorbehandlung kann dafür sorgen, daß der Analyt einem oder mehreren der Assayreagentien leichter zugänglich oder leichter nachweisbar ist, indem Störungen im Assay durch Entfernen unerwünschter Materialien verringert wird. Die Probe kann vorbehandelt werden, um Zellen zu trennen oder zu lysieren; zu fällen; Proteine zu hydrolysieren oder denaturieren; Lipide zu hydrolysieren; den Analyten zu solubilisieren und dergleichen. Eine solche Vorbehandlung kann u. a. folgendes umfassen: Zentrifugation; Behandlung der Probe mit einem organischen Lösungsmittel, wie z. B. eines Alkohols, vorzugsweise eines Alkohols mit weniger als etwa 7 Kohlenstoffatomen wie etwa Methanol; Behandlung mit Detergentien; und Behandlung mit einem Freisetzungsmittel.
Die Konzentration der zu untersuchenden Verbindung reicht im allgemeinen von etwa 10&supmin;&sup4; bis 10&supmin;¹&sup5; M, noch häufiger von etwa 10&supmin;&sup5; bis 10&supmin;¹² M. Genauer gesagt reicht die Konzentration für einen Hcy-Analyten im allgemeinen von etwa 10&supmin;&sup4; bis 10&supmin;&sup8; M, noch häufiger von etwa 10&supmin;&sup5; bis 10&supmin;&sup7; M. Faktoren wie z. B. die Frage, ob der Assay qualitativ, semiquantitativ oder quantitativ ist, das jeweilige Nachweisverfahren und die Konzentration des Analyten bestimmen normalerweise die Konzentration der anderen Reagentien. Darüber hinaus wird die Endkonzentration jedes Reagens normalerweise empirisch festgestellt, um die Sensitivität des Assays im Bereich von Interesse zu optimieren.
Die relativen Mengen der verschiedenen im Assay verwendeten und in den unten beschriebenen Sets verpackten Reagentien können stark variieren, um für Konzentrationen der Reagentien zu sorgen, die jene Reakionen optimieren, die während des Verfahrens der Erfindung auftreten müssen, und die Sensitivität des durchgeführten Assays deutlich steigern. Die Konzentration der Antikörper im Assymedium hängt von der Art des Assays (heterogen oder homogen, kompetitiv oder direkt, usw.) ab. Normalerweise ist der antimodifizierte Analytenantikörper im Assaymedium in einer Konzentration von etwa der Hälfte bis zu 10&sup7; Mal der Konzentration des modifizierten Analyten vorhanden, noch häutiger in einer Konzentration von etwa dem gleichen Wert bis zu etwa 10³ Mal der Konzentration des modifizierten Analyten.
Bei der Durchführung des Verfahrens der Erfindung wird vorzugsweise ein wäßriges Medium verwendet. Andere polare Co-Lösungsmittel können auch im Medium eingesetzt werden; üblicherweise sind es sauerstoffangereicherte organische Lösungsmittel von 1-6, noch häufiger 1-4 Kohlenstoffatomen, z. B. Alkohole, Ether und dergleichen. Normalerweise sind diese Co-Lösungsmittel zu weniger als eta 70 Gew.-% vorhanden, noch häufiger weniger als etwa 30 Gew.-%.
In Assays der Erfindung liegt der pH-Wert für das Medium üblicherweise im Bereich von etwa 5-10, vorzugsweise im Bereich von etwa 7-9. Der pH-Wert wird so gewählt, daß ein beträchtliches Ausmaß an Bindung zwischen sbp-Elementen beibehalten wird, während die signalerzeugende Fähigkeit optimiert wird. In einigen Fällen wird ein Kompromiß zwischen diesen zwei Überlegungen geschlossen. Ferner kann der pH-Wert auch so gewählt werden, daß eine bestimmte strukturelle Konformation, wie z. B. Ringschluß, beibehalten wird. Verschiedene Puffer können dazu dienen, den gewünschten pH-Wert zu erreichen und während der Bestimmung zu halten. Beispiele für Puffer sind Borat, Phosphat, Carbonat, Tris, Barbital und dergleichen. Der jeweils verwendete Puffer ist für die Erfindung nicht entscheidend, doch in einzelnen Assays kann ein Puffer gegenüber dem anderen bevorzugt sein.
Es herrschen bei der Durchführung des Verfahrens moderate Temperaturen. Die Temperatur kann mit dem gerade durchgeführten Schritt variieren. Typischer ist es jedoch, daß während der Dauer des Verfahrens die Temperatur konstant ist. Die Temperaturen reichen im allgemeinen von 10ºC bis 50ºC, noch häufiger von etwa 15ºC bis 40ºC.
Obwohl die Reihenfolge der Zugabe der verschiedenen Reagentien stark variieren kann, gibt es doch je nach Art des jeweils verwendeten Assayformats bestimmte Präferenzen. Die Reagentien und die Probe können gleichzeitig oder zur Gänze oder teilweise nacheinander mit dem Träger kombiniert werden. Der Ausdruck "zur Gänze oder teilweise nacheinander" bedeutet hierin, daß beim Kombinieren der Probe und verschiedener Reagentien, die in der Erfindung eingesetzt werden, nicht miteinander (gleichzeitig) ein oder mehrere Reagentien, alleine oder zusammen mit anderen Reagentien, nacheinander zugegeben werden können. Beispielsweise kann die Probe, die vermutlich den Analyten enthält, und das Freisetzungsmittel zuerst kombiniert werden, damit das Freisetzungsmittel allfällige Disulfidbindungen reduzieren kann, gefolgt von der gleichzeitigen oder schrittweisen Zugabe der übrigen Reagentien. Außer wenn das Freisetzungsmittel und das Modifikator-Reagens nicht miteinander reagieren, wird die Zugabe des Freisetzungsmittels vor dem Modifikator-Reagens bevorzugt. Gegebenenfalls können ein oder mehrere Inkubationsschritte nach jeder Reagenszugabe durchgeführt werden, die im allgemeinen etwa 30 Sekunden bis 6 Stunden, noch häufiger etwa 2 Minuten bis 1 Stunde, dauern. Man beachte, daß es bestimmte Schrittabfolgen gibt, die günstiger sind, wobei die Wahl der jeweils angewendeten Abfolge von der Wahl der Reagentien und des Assayformats abhängt und für die Erfindung nicht entscheidend ist.
Der letzte Schritt eines Immunassays ist die Messung des Ausmaßes der Bindung zwischen dem modifizierten Analyten und dem Antikörper, welches Ausmaß zur Gegenwart oder Menge des Analyten in der Probe in Beziehung steht. Es gibt mehrere Möglichkeiten, das Ausmaß der Bindung zu messen, die auf dem Gebiet allgemein bekannt sind. Diese Verfahren hängen z. B. davon ab, ob der Assay kompetitiv, homogen, heterogen usw. ist.
Eine Messung des Bindungsausmaßes zwischen dem modifizierten Analyten und dem Antikörper kann erfolgen, indem nachweisbar markierter modifizierter Analyt, d. h. ein markiertes Analytenanalog, zugegeben und das Signal nachgewiesen wird, das durch Bindung des markierten modifizierten Analyten erzeugt wird, wobei der Antikörper um die Bindung des modifizierten Analyten konkurriert. In einem homogenen Assay kann z. B. der nachweisbare Marker ein Enzym sein, und der letzte Schritt kann die Aktivie rung des Enzymmarkers durch Zugabe von Substrat umfassen. Das erzeugte Signal steht üblicherweise in umgekehrter Beziehung zum Ausmaß der Bindung zwischen dem markierten modifizierten Analyten und dem Antikörper. Die Gegenwart oder das Ausmaß des Signals steht mit der Gegenwart oder Menge an Analyt in der Probe in Beziehung.
Bei einer weiteren Messung in einem kompetitiven homogenen Assay kann das Bindungsausmaß durch Verwendung eines mit Fluoreszenzmittel markierten modifizierten Analyten und eines mit Quencher markierten Antikörpers bestimmt werden. Das Signal steht wiederum in umgekehrter Beziehung zum Bindungsausmaß und in direkter Beziehung zur Menge des in der Probe vorhandenen Analyten. Alternativ dazu kann ein homogener nicht-kompetitiver Assay durchgeführt werden, worin der mit Fluoreszenzmittel modifizierte Analyt nicht als getrenntes Reagens zugegeben wird, sondern durch Reaktion des Analyten mit einem mit Fluoreszenzmittel markierten Modifikatorreagens gebildet wird. In diesem Fall steht das Signal wieder in umgekehrter Beziehung zum Bindungsausmaß, jedoch ebenfalls in umgekehrter Beziehung zur Menge des in der Probe vorhandenen Analyten.
In einem heterogenen Assay können unmarkierte antimodifizierte Analyten-Antikörper an einen Träger gebunden werden. Nach der Inkubation des Trägers mit dem modifizierten Analyten und markiertem modifiziertem Analyten wird der Träger von der flüssigen Phase getrennt und anschließend die Stärke des Signals der festen Phase oder der flüssigen Phase ermittelt; dies ist ein Anzeichen für das Ausmaß der Bindung zwischen dem modifizierten Analyten und dem Antikörper und somit der Menge an Analyt in der Probe. Eine ausführlichere Beschreibung der obigen Immunassay-Verfahren findet sich in "Enzyme-Immunoassay" von Edward T. Maggio, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1980.
Nachstehend sind Beispiele für Assay-Vorschriften angeführt, wobei diese Veranschaulichungen den Schutzumfang der Erfindung nicht einschränken, sondern lediglich Beispiele für die qualitativen, semiquantitativen und quantitativen Assay-Vorschriften darstellen, in denen das Verfahren der Erfindung zur Bestimmung von Hcy oder Cys in einer Probe angewendet werden kann. Das in diesen Verfahren nachgewiesene Signal wird mit einem Standard oder Vergleich mit einer bekannten Konzentration von Hcy verglichen.
(A) In einem Assay auf Hcy unter Verwendung von Modifikator-Reagens (I) wird ein monoklonaler Antikörper verwendet, der sich spezifisch an modifiziertes Hcy (Ib), nicht jedoch an modifiziertes Cys (Ia) bindet. Eine Probe, die vermutlich Hcy und Cys enthält, wird in einem geeigneten Medium mit Modifikator-Reagens (I) zusammengebracht. Die Reaktionen lauten wie folgt ab: Reagens (I) + Hcy → modifiziertes Hcy (Ib) und Reagens (I) + Cys → modifziertes Cys (Ia), wenn Hcy und Cys vorhanden sind. Ein Analog von modifiziertem Hcy (Ib), gebunden an Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase, wird dem Medium ebenfalls zugegeben. Nachdem ausreichend Zeit für die Reaktionen und die immunologische Bindung vergangen ist, wird der Anti-Hcy-Antikörper dem Medium zugegeben. Nach 30-minütiger Inkubation wird Glucose-6-phosphat zugegeben. Das erzeugte Signal steht in direkter Beziehung zur Menge an Hcy in der Probe.
(B) In einem Assay auf das Gesamt-Hcy in Serum verwendet man einen monoklonalen Antikörper, der sich spezifisch an modifiziertes Hcy (Vb), nicht jedoch an modifiziertes Cys (Va) bindet. Der Antikörper wird an Glasperlen gebunden. Die Serumprobe wird zunächst mit Dithiothreitol (DTT) behandelt, um jegliches als Disulfid gebundenes Hcy reduktiv freizusetzen. Überschüssiges DTT wird durch Behandlung mit Natriumarsenit maskiert. Die vorbehandelte Probe wird dann mit Modifikator-Reagens (V), das mit ³H markiert wurde, und dann mit dem an die Glasperlen gebundenen Antikörper kombiniert. Das Medium wird 10 Minuten lang inkubiert, und die Perlen werden abgetrennt und gewaschen. Anschließend wird die Radioaktivität der Perlen gemessen. Das erzeugte Signal steht in direkter Beziehung zur Menge an Hcy in der Probe.
(C) In einem Assay hinsichtlich Hcy unter Verwendung von Modifikator-Reagens (IX) wird ein monoklonaler Antikörper, der sich spezifisch an modifiziertes Hcy (IXb), jedoch nicht an modifiziertes Cys (IXa) bindet, an einen Träger gebunden. Ein Analog von modifiziertem Hcy (IXb), gebunden an Meerrettich-Peroxidase (HRP), wird auch verwendet. Eine Probe, die vermutlich Hcy und Cys enthält, wird in einem geeigneten Medium mit Modifikator-Reagens (IX) zusammengebracht. Nachdem ausreichend Zeit für die Reaktonen vergangen ist, werden das Anti-Hcy-Träger-Konjugat und das modifizierte Hcy-HRP-Konjugat dem Medium zugegeben. Nach 30-minütiger Inkubation der Suspension werden die feste und die flüssige Phase getrennt und die feste Phase gewaschen. Ein wäßriges Medium, dem Substrat zugegeben wurde, wird der festen Phase zugegeben, und das erzeugte Signal steht in umgekehrter Beziehung zur Menge an Hcy in der Probe.
Das Verfahren der Erfindung umfaßt ferner die Herstellung polyklonaler und monoklonaler Antikörper gegen Immunogene, die zum immunologisch unterschiedlichen Analyten, d. h. zum "modifizierten" Analyten, homolog sind. Das Immunogen, das verwendet wird, um die für die Verfahren der Erfindung geeigneten Antikörper zu erhalten, ist der modifizierte Analyt, der duch Umsetzen der untersuchten Verbindung mit dem ausgewählten Modifikator-Reagens erhalten wird. Typischerweise werden zur Herstellung des Immunogens zunächst die Solubilisierungsgruppen der Modifikator-Reagentien verwendet, um das Reagens an ein Immunogen-Trägerprotein zu binden. Üblicherweise werden diese Bindungsgruppen zuerst aktiviert und das Reagens an das Trägerprotein gebunden. Das resultierende Reagens-Protein-Konjugat wird dann mit dem Analyten umgesetzt, gereinigt und als Immunogen verwendet.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweisen einer ersten Verbindung in Gegenwart einer zweiten Verbindung, die ein Homolog der ersten ist. Daher werden die oben beschriebenen Antikörper auf ihre Fähigkeit gescreent, spezifisch mit dem Reaktionsprodukt des Modifikator-Reagens und entweder mit der ersten Verbindung (Analyt) oder der zweiten Verbindung zu reagieren, d. h. sich entweder an den modifi zierten Analyten oder an die modifizierte zweite Verbindung zu binden. Beispielsweise wäre in einem Assay auf Hcy ein Immunogen das derivatisierte Hcy, das mit einem Immunogen-Trägerprotein verbunden ist. Die resultierenden Antikörper könnten dann spezifisch den modifizierten Hcy-Analyten erkennen und würden das modifizierte Cys nicht erkennen.
Auch andere Gruppen zur Bindung des Modifikator-Reagens an den Proteinträger können eingesetzt werden, z. B. Aldehyde, Ketone, Diazoniumsalze, Alkylierungsmittel usw. Günstigerweise werden zur Verbindung Carbonsäuren oder Sulfonsäuren in aktive Ester oder Säurehalogenide umgewandelt. Das Trägerprotein kann jedes beliebige Protein sein, vorzugsweise eines, das für das immunisierte Tier fremd ist, z. B. Napfschnecken-Hämocyanin oder Rinder-Serumalbumin, wenn das Tier beispielsweise eine Maus, ein Hase, ein Schaf oder eine Ziege ist.
Die Erzeugung polyklonaler Antikörper, die für die Verfahren der Erfindung in Frage kommen, erfolgt nach auf dem Gebiet allgemein bekannten Vorgangsweisen. Monoklonale Antikörper werden im wesentlichen durch ein Verfahren erhalten, das ähnlich jenem von Milstein und Kohler, Nature 256, 495-497 (1975) ist. Die Details des Verfahrens von Milstein und Kohler sind allgemein bekannt. Üblicherweise umfaßt das Verfahren das Injizieren eines Immunogens in einen Wirt, normalerweise eine Maus oder ein anderes geeignetes Tier. Zellen werden aus der Milz des Tiers entnommen. Alternativ dazu kann der Wirt aus unsensibilisierten Milzzellen bestehen, die in vitro mit dem Immunogen sensibilisiert werden. Die resultierenden Zellen werden mit Myelomzellen fusioniert. Das Ergebnis ist eine Hybridzelle, die als "Hybridom" bezeichnet wird und in vitro kutiviert werden kann. Die Hybridom-Population wird gescreent und manipuliert, um einzelne Klone zu isolieren, von denen jeder einen einzigen Antikörper gegen das Antigen sekretiert.
Wenn das Immunogen in den Wirt eingebracht wird, reagiert das Immunsystem des Wirts, indem es eine Vielzahl an Antikörpern produziert, die verschiedene Stellen auf dem Immunogen erkennen können. Diese Vielzahl an Antikörpern besitzt unterschiedliche Affinitäten und Spezifitäten. Um jene Antikörper zu erhalten, die günstige Affinitäts- und Spezifitätseigenschaften für ein bestimmtes angewandtes Assayverfahren aufweisen, werden die unterschiedlichen Hybridom-Zellinien gescreent.
Aus praktischen Gründen können die Reagentien zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung als Set zur Verwendung in einem Assayverfahren bereitgestellt werden. Ein typisches Set zur Verwendung in einem Verfahren zum Detektieren von Hcy umfaßt kombiniert verpackt: ein Modifikator-Reagens, das Hcy und Cys chemisch modifizieren kann, um modifiziertes Hcy und modifiziertes Cys zu bilden, und einen Antikörper, der sich spezifisch an modifiziertes Hcy, jedoch nicht an modifiziertes Cys binden kann. Das Set kann außerdem ein markiertes Analog des modifizierten Hcy umfassen. Das Set kann auch ein Freisetzungsmittel umfassen, um jegliches in Disulfidform vorliegendes Hcy freizusetzen.
Unter geeigneten Bedingungen können ein oder mehrere der Reagentien im Set in Lösung oder als Trockenpulver bereitgestellt werden, üblicherweise lyophilisiert, einschließlich von Exzipienten, die beim Auflösen für eine Reagenslösung mit den geeigneten Konzentrationen sorgen, um ein Verfahren oder einen Assay gemäß der Erfindung durchzuführen. Um die Vielseitigkeit der Erfindung zu erhöhen, können die Reagentien kombiniert verpackt im gleichen oder in getrennten Behältern bereitgestellt werden, sodaß das Verhältnis der Reagentien für eine deutliche Optimierung des Verfahrens und Assays sorgt. Die Reagentien können jeweils in getrennten Behältern vorliegen, oder verschiedene Reagentien können in einem oder mehreren Behältern kombiniert sein; dies hängt von der Kreuzreaktivität und Stabilität der Reagentien ab. Aus praktischen Gründen können die in der Erfindung verwendeten Reagentien in vorbestimmten Mengen bereitgestellt werden. Die Reagentien können einen ersten Antikörper und einen zweiten Antikörper umfassen, die zur spezifischen Bindung des modifizierten Analyten und eines Reagens fähig sind, um den Analyten chemisch zu modifizieren. Das Set kann auch schriftliche Anweisungen enthalten, wie die Reagentien zu verwenden sind und/oder wie ein bestimmter Assay durchzuführen ist, z. B. in Form einer Packungsbeilage.
Die Erfindung wird durch die nachstehend angeführten veranschaulichenden Beispiele näher beschrieben.

ABKÜRZUNGEN

AP alkalische Phosphatase (Kalbsdarm)
BABA p-Bromacetylbenzoesäure
BSA Rinder-Serumalbumin
Cys-ABA Cystein-Acetylbenzoesäure
DCC Dicyclohexylcarbodiimid
DPBS Dulbecco's phosphatgepufferte Salzlösung
DTT Dithiothreitol
DMEM Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium
DMSO Dimethylsulfoxid
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
FBS Rinderfötenserum
Hcy-ABA Homocystein-Acetylbenzoesäure
Hcy-ABA-BSA Homocystein-Acetylbenzoesäure-Rinder-Serumalbumin
Hcy-ABA-AP Homocystein-Acetylbenzoesäure-Konjugat mit alkalischer Phosphatase
NHS N-Hydroxysuccinimid
PBS Phosphatgepufferte Salzlösung
PEG Polyethylenglykol
PNPP Phenylphosphat
S-DMEM Super Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium
RAM Hasen-Anti-Maus-
TCEP Tris-(2-carboxyethyl)phosphin
THF Tetrahydrofuran

HERSTELLUNG DER MATERIALIEN

Kristallisiertes BSA Cohn stammte von ICN.AP stammte von Pierce. Alle anderen Chemikalien waren von Reagens-Qualität und sind im Handel z. B. bei Gibco und Sigma erhältlich. Alle Lösungen wurden in H&sub2;O gebildet und alle Reaktionen - sofern nicht anders angegeben - unter Umgebungsbedingungen durchgeführt.

A) Herstellung von p-Bromacetylbenzoesäure (Molekulargewicht 243)

2,0 g (12,2 mMol) 4-Acetylbenzoesäure wurden zu 90 ml Essigsäure in einem 500 ml- Erlenmeyer-Kolben zugegeben und bis zum Auflösen auf 45ºC erwärmt. Bei gleichbleibender Temperatur von 45ºC wurden 1,95 g (12,2 mMol, 0,61 ml) Brom (gelöst in ca. 2 ml Essigsäure) innerhalb 1 Stunde unter kräftigem Rühren langsam zugegeben. Die Reaktion erforderte eine Induktionszeit von mehreren Minuten, bevor sie fortschritt, was durch den Verlust der roten Bromfärbung und die Entwicklung von HBr sichtbar wurde. Das Produkt, BABA (Modifikator-Reagens II), wurde auf Eis gefällt, durch Filtration gesammelt und dreimal aus heißem (75%) Ethanol umkristallisiert.

B) Herstellung von Bromacetylbenzoesäure-N-hydroxysuccinamidester (MW 340)

BABA wurde wie oben hergestellt und einmal umkristallisiert. 0,6 g BABA (2,5 mMol) und 0,28 g NHS (2,5 mMol), gelöst in 8 ml trockenem THF bei 0%, wurde 0,51 g (2,5 mMol) DCC in 1 ml THF zugegeben. Ein Niederschlag war nach mehreren Minuten zu beobachten, und die Lösung wurde über Nacht gerührt. Die Lösung wurde durch eine Glasfritte filtriert und das Volumen unter Vakuum auf ca. 2 ml verringert. Nach der Volumsreduktion war etwas Niederschlag zu beobachten. Überschüssiger Petrolether wurde zugegeben, um das übrige Produkt zu fällen, und der Feststoff umkristallisiert, indem es in einer geringen Menge an THF gelöst und wieder Petrolether bis zur Trübung zugegeben wurde; anschließend erfolgte Abkühlung auf -20ºC und Sammeln des Feststoffs durch Filtration. Die Ausbeute an BABA-NHS betrug 0,2 g.

C) Herstellung von Cystein-Acetylbenzoesäure (MW 283)

60 mg BABA und 60 mg 1-Cystein wurden zu 5,0 ml 200 mM Na-Phosphat, pH 7,5, zugegeben und 10 Minuten lang gerührt; anschließend wurden 0,5 ml 1,0 M HCl zugegeben, um das Produkt zu fällen. Der Feststoff wurde durch Filtration gesammelt, mit 0,1 M HCl und danach mit Wasser gewaschen und schließlich im Vakuum getrocknet, um Cys-ABA (modifiziertes Cys IIa) zu ergeben. DC-Analyse (Cellulose, 0,1 M Ammoniumacetat, pH 6,8) und NMR (Spektren aufgezeichnet in D&sub2;O, umfassend 100 mM Na&sub2;DPO&sub4;, pH 7,5; 100 mM NaDCO&sub3;, pH 8,4; und 100 mM Na&sub2;B&sub3;O&sub7;, pH 9,3) zeigten die Gegenwart von zumindest drei unterschiedlichen pH-abhängigen Produkten. Die Massenspektralanalyse (Cl) ergab einen Ausgangspeak bei MW 221, ein Anzeichen für Decarboxylierung.

D) Herstellung von Homocystein-Acetylbenzoesäure (MW 297)

100 mg 1-Homocysteinthiolacton wurden zu 5,0 ml entgaster 0,5 M NaOH zugegeben, 10 Minuten lang auf 45ºC erwärmt und mit einer Kombination von 1,0 M und konzentrierter HCl auf pH 8,0 neutralisiert. 80 mg BABA wurden der Hcy-Lösung zugegeben und 15 Minuten lang gerührt. Die Lösung wurde dann durch ein 0,22 um- Spritzenfilter filtriert und der Lösungs-pH durch Zugabe von 1,0 M HCl auf ca. 2 gesenkt, um das Produkt zu fällen. Das feste Hcy-ABA (modifiziertes Hcy IIb) wurde mehrmals mit 0,1 M HCl gewaschen, durch Zentrifugation gesammelt und im Vakuum getrocknet.

E) Herstellung von Homocystein-Acetylbenzosäure-Rinderserumalbumin-Konjugat

25 mg BSA wurden in 5,0 ml 100 mM Na-Phosphat, pH 7,0, gelöst und 2,2 ml dieser Lösung zu 200 ul 100 mM BABA-NHS in DMSO (+BABA-NHS rxn) oder zu 200 ul DMSO alleine (-BABA-NHS rxn) hinzugefügt und 3 Stunden lang vermischt. Die zwei Proben wurden dann zentrifugiert, um überschüssiges festes BABA-NHS zu fällen, durch ein 0,45 um-Spritzenfilter filtriert und fünfmal auf einem Centricon® 30 eingeengt. Die konzentrierten Lösungen wurden mit 100 mM Na-Phosphat, pH 7,0, auf 1,0 ml verdünnt. Eine 20 ul-Aliquote wurde aus jeder Lösung entfernt, auf 1,0 ml verdünnt und das Absorptionsvermögen gemessen, um den Reaktionsumsatz zu ermitteln. Die Proteinkonzentration wurde anhand der -BABA-NHS-Reaktion (BSA, &epsi;&sub2;&sub8;&sub0; = 43.600) und die Konzentration von proteingebundenem BABA anhand der +BABA-NHS-Reaktion (BABA, &epsi;&sub2;&sub6;&sub0; = 13.600) bestimmt.
Hcy wurde außerdem mit den oben hergestellten BABA-aktivierten BSA-Lösungen umgesetzt. 20 mM 1-Homocystein wurden hergestellt, indem 1,5 mg 1-Homocysteinthiolacton in 0,5 ml 1 M NaOH gelöst, 10 Minuten lang bei 37ºC inkubiert und schließlich mit 2,0 ml Na-Phosphat, pH 7,0, und 2,5 ml Na-Phosphat, pH 6,0, (End-pH 7) verdünnt wurden. Beide oben hergestellten BSA-Lösungen wurden mit H&sub2;O auf 4,0 ml verdünnt und 1,0 ml der Hcy-Lösung beiden zugegeben und über Nacht inkubiert. Die Reaktion wurde auf einem Centricon® 30 eingeengt und der Reaktionsumsatz anhand der Br&supmin; Konzentration der zurückgehaltenen Filtrate ermittelt. Bromidstandards wurden gebildet, indem 2 ul der geeigneten KBr-Stammlösungen zu 98 ul des -BABA- NHS-Reaktionsfiltrats zugegeben wurden, wodurch Standards mit Br&supmin; Konzentrationen von 0,0, 0,2, 0,4, 0,8 und 1,0 mM erhalten wurden. 20 ul der hergestellten Br&supmin; Standards oder 20 ul des Filtrats aus der +BABA-NHS-Reaktion wurden zu 0,9 ml 0,1 M Na-Citrat, pH 5,5, zugegeben, gefolgt von 20 ul 0,8 mM Fluorscein und 10 ul 0,1 M Chloramin T. Nach 10 Minuten wurden 20 ul 25 mM Thiosulfat in 0,2 M Na&sub2;CO&sub3; zugegeben, um die Reaktion abzubrechen, und das Absorptionsvermögen für jede Probe bei 515 nm in einer 1 cm-Zelle aufgezeichnet. Die Absorptionswerte der Standards wurden über den Br&supmin; Konzentationen aufgetragen, um eine Standardkurve zu ergeben, anhand der die Konzentration von in der +BABA-NHS-Reaktion enthaltenem Br&supmin; bestimmt wurde. Aus diesem Wert erhielt man eine Bestimmung des Bindungsumsatzs der BABA-Gruppen auf BSA mit Hcy. Die +BABA-NHS-Reaktionslösung wurde viermal auf einem Centricon® 30 eingeengt, mit 1 ml 2 · PBS verdünnt (Endkonzentration ca. 10 mg/ml) und zur nachfolgenden Antikörperentwicklung beiseite gestellt.

F) Herstellung von Homocystein-Acetylbenzoesäure-Konjugat mit alkalischer Phosphatase

Das Hcy-ABA-AP-Konjugat wurde in ähnlicher Weise wie das oben beschriebene BSa- Konjugat hergestellt. 10 mg AP wurden mit 15 ml 100 mM Na-Phosphat, pH 7,0, verdünnt und dreimal auf einem Centricon® 30 eingeengt; anschließend wurden 200 mM Na-Phosphat, pH 7,0, bis zu einem Endvolumen von 2,0 ml zugegeben. Zwei Reaktionen wurden vorbereitet: 0,48 ml der AP-Lösung wurden zu 45 ul 10 mM BABA- NHS in DMSO (+BABA-NHS rxn) oder 45 ul DMSO alleine (-BABA-NHS rxn) zugegeben und die Reaktionen 2,5 Stunden lang vermischt. Die Reaktionen wurden dann mit 2,0 ml H&sub2;O verdünnt, durch einen 0,45 um-Spritzenfilter filtriert, fünfmal auf einem Centricon® 30 eingeengt und schließlich mit 100 mM Na-Phosphat, pH 7,0, auf 1,0 ml verdünnt. 20 ul jeder Probe wurden auf 1,0 ml verdünnt, das Absorptionsvermögen aufgezeichnet und das Verhältnis zwischen proteingebunenem BABA und AP wie oben bestimmt (AP, &epsi;&sub2;&sub8;&sub0; = 110.000; BABA, &epsi;&sub2;&sub6;&sub0; = 13.600).
Das BABA-aktivierte AP wurde wie folgt mit Hcy umgesetzt: 9,3 mg 1-Homocysteinthiolacton wurden in 0,5 ml 1,0 M NaOH gelöst und 15 Minuten bei 37ºC inkubiert. Das Hcy wurde mit 0,5 M Na&sub2;HPO&sub4; und H&sub2;O bis zu einem Endvolumen von 5 ml und einem pH von 7,0 neutralisiert. 200 ul der Hcy-Lösung wurden beiden oben gebildeten AP-Lösungen zugegeben und 4 Stunden lang bei 37ºC inkubiert. Die Reaktionen wurden dann mittels Centricon® 30 eingeengt und die Filtrate behalten.
Das Ausmaß der Bindungsreaktion von BABA-aktiviertem AP mit Hcy wurde anhand der Konzentration an freigesetztem Br&supmin; bestimmt. Standardlösungen wurden hergestellt, indem 2 ul der KBr-Stammlösungen mit 98 ul eines Puffers vermischt wurden, dessen Zusammensetzung (1,0 ml 100 mM Na-Phosphat, pH 7,0, zugegeben zu 200 ul 0,5 M Hcy) dem Filtrat ähnelte, um Standards mit 0,0, 0,05, 0,1, 0,15 und 0,2 mM Bromid- Ionen zu ergeben. 80 ul der Br&supmin; Standards oder das Filtrat von +BABA-NHS rxn wurden zu 0,9 ml 0,1 M Na-Citrat, pH 5,5, zugegeben, gefolgt von 40 ul 0,4 mM Fluorscein und 30 ul 50 mM Chloramin T und 10-minütiger Inkubation. 50 ul 15 mM Thiosulfat in 0,1 M Na&sub2;CO&sub3; würden zugegeben, um die Reaktion abzubrechen, und das Absorptionsvermögen bei 515 nm aufgezeichnet. Die im +BABA-NHS rxn-Filtrat enthaltene Br&supmin; Konzentration wurde anhand der Standardkurve bestimmt und diente dazu, den Umsatz der Reaktion mit Hcy zu ermitteln. Sowohl die -BABA-NHS- als auch die +BABA-NHS- Reaktion wurden fünfmal auf einem Centricon® 30 eingeengt und 1 · PBS bis zu einem Endvolumen von 400 ul zugegeben.
Die Aktivität von derivatisiertem AP wurde bewertet, indem 2 ul jeder AP-Lösung in 10 ul H&sub2;O verdünnt und 2 ul der verdünnten Lösung 1,0 ml oder 1 mg/ml PNPP in 50 mM TRis Cl, pH 9,4, zugegeben wurden und die Änderung des Absorptionsvermögens im Verlauf von 30 Sekunden verglichen wurde.

G) Produktion und Isolation von monoklonalen Hcy-ABA-BSA-Antikörpern

1) Immunogene, Immunisierungen und Enzymkonjugate

Das Hcy-ABA-BSA-Immunogen wurde wie oben hergestellt. Mäuse wurden intraperitoneal einmal mit 100 ug und zweimal mit 50 ug Immunogen, das in RIBI-Adjuvanssystem emulgiert war, immunisiert. 3 Tage vor der Fusion erhielten die Mäuse eine intraperitoneale Auffrischung mit Salzlösung, die 250 ug Immunogen enthielt.
Hcy-ABA-AP wurde zum Screenen verwendet.

2) Gewebekultur

S-DMEM wurde für die gesamte Gewebekultur verwendet, die aus DMEM und den folgenden Ergänzungen bestand:
10% FBS
10% NCTC-135 (Gibco #440-1100EC)
4 mM Glutamin
1 mM Oxaloessigsäure
1 mM Natriumpyruvat
0,148 nM L-Cystein
200 Insulineinheiten
37,9 mM Natriumbicarbonat
Konditioniertes Medium wurde hergestellt, indem P388D1-Zellen (ATCC TIB 63) in S- DMEM gezüchtet und alle 4 bis 5 Tage 1 : 4 geteilt wurden. Verbrauchtes Medium wurde 15 Minuten lang bei 1500 U/min zentrifugiert. Das verbrauchte Medium wurde dann mittels einer sterilen 0,2 um Gewebekultur-Filtereinheit filtriert, um allfällige verbleibende Zellen und Zellbruchstücke zu entfernen. Glutamin (100 · Stamm = 58,5 g/l) wurde dem verbrauchten Medium zugegeben, bevor es eingesetzt oder bis zur nächsten Verwendung bei -20ºC eingefroren wurde. Konditioniertes S-DMEM wurde hergestellt, indem S-DMEM mit 10% verbrauchtem P38D1-Medium ergänzt und dann dazu verwendet wurde, das Hybridom-Wachstum nach der Fusion und während des Klonierens zu unterstützen.
Mäuse-Myelom-Zellinie P3X63 Ag8.653 (Ag8.653, ATCC CRL 1580) wurde in Kultur gehalten, indem sie täglich oder durch Reihenverdünnung in einer 6-Napf-Platte 2 Tage lang 1 : 2 bis 1 : 4 geteilt wurde.

3) Fusionen

Fusionen erfolgten im wesentlichen nach dem Verfahren von Milstein und Kohler, Nature 256, 495-497 (1975).
Die Milzen zweier immunisierter Mäuse wurden aseptisch entfernt und in eine 60 mm- Gewebekulturschale mit 10 ml DMEM eingelegt. Sie wurden einige Male erzkleinert und zwischen den Enden zweier Objektträger aus mattiertem Glas zerdrückt. Eine einzige Zellsuspension von Splenocyten wurde erhalten, indem die Zellsuspension durch ein Monofilament-Siebtuch geschickt wurde. Die Splenocyten, etwa 2 · 10&sup8; Zellen, wurden mit 40 · 10&sup6; Ag8.653-Zellen kombiniert, bei 800 U/min 5 Minuten lang zentrifugiert und ein- bis zweimal mit DMEM gewaschen. Die Fusion erfolgte durch Zugabe von 4,0 ml PEG (50% Lösung in 75 mM Hepes), das in einem Zeitraum von 3 Minuten unter leichtem Rühren zugegeben wurde, bevor 30 bis 40 ml S-DMEM zugegeben wurden, um das PEG zu inaktivieren. Die Zellsuspension wurde bei 800 U/min 5 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert, und die Zellen wurden mit 240 ml S-DMEM-HAT erneut suspendiert (Stamm-HAT = 50 · Sigma #H0262; in Medium: 100 uM Hypoxanthin, 0,4 uM Aminopterin und 16 uM Thymidin) und zu 200 ul/Napf in 12 der 96-Napf-Kulturplatten eingebracht.
Zellen wurden durch Entfernung von 100 ul verbrauchtem Medium pro Napf und anschließende Zugabe von 200 ul konditioniertem S-DMEM-HAT pro Napf 4 bis 5 Tage nach der Fusion zugeführt.
Die Fusionen wurden etwa 7 bis 10 Tage nach der Fusion gescreent. Hybridomkolonien waren üblicherweise mit dem Auge sichtbar, während das Medium noch rosa war oder gerade gelb wurde.

4) Klonieren durch Reihenverdünnung

Hybridome, die positive ELISA-Antikörper produzieren, wurden dann mehrmals durch Reihenverdünnung kloniert, um einzellige Kolonien sicherzustellen. Die Vorgangsweise war wie folgt:
Der Inhalt aus einem Napf einer 96-Napf-Platte wurde in einen Napf in einer 24-Napf- Platte übertragen, die 1,5 ml konditioniertes S-DMEM pro Napf enthielt. Zeilen wurden durch Pipettieren vermischt und 100 ul/Napf der ersten Reihe einer 96-Napf-Platte, die 200 ul konditioniertes S-DMEM pro Napf enthielt, zugegeben. 100 ul/Napf wurden unter Verwendung einer Flow Multichannel-Pipette in die zweite Reihe übertragen und durch Pipettieren vermischt, bevor wiederum 100 ul/Napf in die nächste Reihe übertragen wurden. Jeder "Klon" wurde siebenmal reihenverdünnt, 1 bis 4 Klone pro Platte. Zellen wurden durch Grenzverdünnung drei- bis viermal oder bis zur Stabilität erneut geklont.

5) Gefrieren und Auftauen von Zellinien

Klonierte und stabilisierte Zelinien, die ELISA+ waren, wurden bei -100ºC gelagert. Der ausgewählte Napf (Klon) aus einer 96-Napf-Platte wurde durch tägliches Passagieren von Zellen und hintereinander erfolgendes Expandieren von einer 24-Napf-Platte mit 1,5 ml S-DMEM pro Napf in eine 6-Napf-Platte mit 8 ml S-DMEM pro Napf und schließlich in einen T-75-Kolben mit 50 ml S-DMEM gezüchtet.
Zellen aus einem T-75-Kolben wurden bei 800 U/min 5 Minuten lang zentrifugiert und in 3 ml Gefriermedium, 10% DMSO (ATCC # 76-68-5) und zusätzlich 10% FBS in S- DMEM erneut suspendiert. 1 ml (3 bis 5 · 10&sup6; Zellen) Aliquote wurde in Cryofläschchen pipettiert, die dann in einen Gefrierbehälter gestellt wurden. Der Behälter wurde 1-2 Tage lang bei -100ºC gelagert, und dann wurden die Fläschchen zur späteren Verwendung in eine auf -100ºC gehaltene Gefrierkammer gestellt.
Die Zellen wurden durch Erwärmen der Fläschchen in einem 37ºC warmen Wasserbad aufgetaut. Die Zellsuspension wurde in ein 15 ml-Zentrifugenrohr mit 5 ml S-DMEM übertragen und 5 Minuten lang bei 800 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert und die Zellen in 8 ml S-DMEM erneut suspendiert und zur Zellexpansion in eine 6-Napf-Platte pipettiert.

6) Screenen

Die Hybridome wurden anfänglich durch kompetitiven Umkehr-ELISA-Screen und später durch Umkehr-ELISA gescreent. Alle ELISA-Screens erfolgten bei Raumtemperatur. Die kompetitive Umkehr-ELISA-Vorschrift diente für primäre Screens nur unter Verwendung einer Konzentration von Hcy-ABA, der modifizierten Form von Hcy, um Antikörper zu identifizieren. Um die besten Antikörper zu identifizieren, erfolgte der kompetitive Umkehr-ELISA unter Verwendung von Hcy-ABA in zwei unterschiedlichen Mengen, um die relative Sensitivität der Antikörper zu bestimmen. BABA und Cys-ABA dienten auch zur Bestimmung, ob vielleicht unerwünschte Kreuzreaktivität bestand. Die Umkehr-ELISA-Vorschrift diente für nachfolgende Screens von Klonierungsplatten. Die Reagentien für den kompetitiven Umkehr-ELISA und den Umkehr-ELISA waren:
DPBS (10X), pH 7,4, verdünnt 1 : 10
50 mM Carbonatpuffer, pH 9,0
ELISA-Waschpuffer: 0,5% Tween® 20 in DPBS
Plattenbeschichtung: Hasen-Anti-Maus-IgG, A, M; schwer und leicht (Zymed), rekonstituiert mit 2 ml Wasser gemäß Anweisungen des Herstellers, verdünnt 1 : 100 in DPBS (RAM)
Plattenblocker: 1% BSA in DPBS
Verdünner: 0,5% BSA in DPBS; verdünnter Plattenblocker 1 : 2 in DPBS
Elisa-Enzym-Liganden-Konjugate: AP-Hcy-ABA, verdünnt 1 : 1500 in Verdünner; kompetitiver Umkehr-ELISA: für primären Screen wurde Hcy-ABA auf 0,8 ug/ml in verdünntem Hcy-ABA-AP verdünnt; zur Charakterisierung von Antikörpern wurden Hcy-ABA, Cys- ABA und BABA auf 1 ug/ml und 1 ng/ml verdünntes AP-Hcy-ABA in Carbonatpuffer verdünnt.
Substratpuffer: 1 M Diethanolamin, 0,25 mM MgCl&sub2;, pH 9,8
Substrat: 0,25 mg p-Nitrophenylphosphat pro ml Substratpuffer
Die Arbeitsvorschrift für den kompetitiven Umkehr-ELISA und Umkehr-ELISA war:
1. Platten wurden mit RAM beschichtet (50 ul/Napf), 1 Stunde oder bis zu 1 Woche lang bei 4ºC inkubiert und der Inhalt der Näpfe danach entleert.
2. Platten wurden mit 300 ul/Napf blockiert, 15 Minuten lang inkubiert und der Inhalt der Näpfe danach entleert.
3. Antikörper (verbrauchtes Medium) wurde zugegeben (50 ul/Napf), 45 Minuten lang inkubiert und dreimal gewaschen.
4. Kompetitiver Umkehr-ELISA: 50 ul/Napf AP-Hcy-ABA oder AP-Hcy-ABA plus Hcy- ABA, AP-Hcy-ABA plus Cys-ABA oder Hcy-ABA-AP plus BABA wurden zugegeben, um die Platten zu replzieren; Umkehr-ELISA: 50 ul/Napf AP-Hcy-ABA wurde zugegeben. Platten wurden 45 Minuten lang inkubiert und dreimal gewaschen.
5. Substrat wurde zugegeben (100 ul/Napf), auf einem Schüttler 20 bis 30 Minuten lang inkubiert und bei 405 nm abgelesen.
6. Positiv im primären Screen waren Antikörper mit OD-Werten von mehr als 0,9 nur mit AP-HCy-ABA und mehr als 50% Kompetition mit Hcy-ABA-AP + Hcy-ABA. Der Kompetitions-Prozentsatz wurde wie folgt errechnet:
Positive Ergebnisse des Screenens von Klonierplatten unter Verwendung der Umkehr- ELISA-Vorschrift waren die Näpfe mit einer einzigen Kolonie oder den wenigsten Kolonien mit einem hohen OD-Wert.

7) Herstellung und Reinigung von in vitro-Antikörper

ELISA-positive Hybridome, die kloniert und stabilisiert waren, wurden dann in statischer Kultur expandiert. Hybridome wurden in zwei T225-Kolben (500 ml verbrauchtes Medium) oder in vier T225-Kolben (1 l verbrauchtes Medium) überzüchtet. Die Zellen und Zellbruchstücke wurden durch Zentrifugation und Filtration abgetrennt. Natriumazid wurde vor der Reinigung zu 0,02% zugegeben.
In statischer Kultur erzeugte Antikörper wurden durch Protein G-Säulenchromatographie gereinigt. Die Reinigung erfolgte bei Raumtemperatur.
Die für Protein G-Reinigung verwendeten Reagentien waren:
Wasch/Bindepuffer, PBS pH 7,0: 0,01 M Natriumphosphat, 0,15 M Natriumchlorid und 0,02% Natriumazid
Elutionspuffer: 0,5 M Essigsäure, mit Ammoniumhydroxid auf pH 3,0 eingestellt
Neutralisierlösung: 1 M Tris-Base
Reinigungspuffer: 1 M Essigsäure
Die für die Protein G-Reinigung verwendete Arbeitsvorschrift lautete:
1. Eine Säule wurde mit 10 ml Protein G gepackt und mit 25 ml Wasch/Bindepuffer gewaschen.
2. Antikörper (verbrauchtes Medium), 0,5 bis 11, wurde auf die Säule geladen.
3. Die Säule wurde mit Wasch/Bindepuffer gewaschen, bis die OD auf den Ausgangswert sank, oder mit etwa 50 ml gewaschen.
4. Antikörper wurde mit Elutionspuffer eluiert. 2 ml wurden pro Fraktion in einem Reagenzglas gesammelt, das bereits 1 ml Neutralisierlösung enthielt.
5. Der Antikörperpeak wurde gepoolt und über Nacht gegen 4 l DPBS, pH 7,4, dialyiert.
6. Die Säule wurde mit etwa 25 ml Reinigungspuffer gewaschen und dann mit dem Wasch/Bindepuffer erneut äquilibriert.
7. Die Antikörper-Reinheit wurde durch Paragon-Elektrophorese auf die Gegenwart einer einzelnen Bande überprüft. Die Antikörper-Konzentration wurde bestimmt, indem die OD der Antikörperlösung bei 280 nm erhalten und dann die Antikörper-Konzentration mittels des Extinktionskoeffizienten für Igd berechnet wurde: A&sub2;&sub8;&sub0; (1 mg/ml) = 1,35.
Ergebnisse: Kompetitive Umkehr-ELISA-Daten zeigten 13 Antikörper, die gut mit Hcy- ABA konkurrierten und - wenn überhaupt - schlecht mit Cys-ABA oder BABA konkurrierten. Die Sensitivität bei 1 ug/ml Hcy-ABA war sehr gut. Antikörper aus dem Klon Hcy I 5C12 wurden für die Verwendung im folgenden Versuch ausgewählt.

H) Herstellung von Biotin-Hcy I 5C12

400 ul der 0,7 mg/ml Antikörperlösung (Hcy I 5C12) wurden zweimal auf einem Centricon® 30 eingeengt (mit 100 mM Na-Carbonat, pH 8,5, verdünnt). Die Lösung wurde filtriert und Puffer bis zu einem Volumen von 300 ul zugegeben (Endkonzentration ca. 1 mg/ml). Der Antikörperlösung wurden 36 ul 1 mg/ml Biotinamidocapronat-NHS-Ester in DMSO zugegeben und die Lösung 2 Stunden lang inkubiert. Die Reaktion wurde fünfmal auf einem Centricon® 30 eingeengt und schließlich 50 mM Na- Phosphat, pH 7,5, bis zu einem Endvolumen von 1 ml zugegeben. Die Antikörper- Konzentration (100 ug/ml) wurde anhand des Absorptionsvermögens be 280 nm (1,2 mg/ml → Abs. von 1,0) bestimmt. Erfolgreiche Biotinylierung wurde durch Paragon- Gelelektrophorese verifiziert, indem die Mobilität des unmodifizierten und biotinylierten Antikörpers in Abwesenheit und Gegenwart von Streptavidin verglichen wurde. Die Biotin-Hcy I 5C12-Lösung wurde schließlich auf einem Centricon® 30 bis zu einem Volumen von 50 ul eingeengt.

BEISPIEL I

HPLC-HOMOCYSTEIN-ASSAY MIT DTT-ARSENIT-REDUKTION

Zu 200 ul-Proben Vollblut (Koagulierung mit EDTA gestoppt) wurden Aliquote von 1,0 mM Hcy hinzugefügt, um Endkonzentrationen von 0, 10, 20, 30 und 40 uM zu ergeben. Das Blut wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert und danach 3 Tage lang bei 4ºC gelagert, um die Äquilibrierung zwischen den freireduzierten, freien Disulfid- und proteingebundenen Formen von Hcy zu ermöglichen. 20 ul Plasma jeder Blutprobe wurde durch Zugabe von 10 ul 100 mM DTT und 30 ul 1,0 M Na-Carbonat, pH 8,2, reduziert und 30 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. Die Proteine in der Probe wurden anschließend mittels Filtration durch ein Millipore® Ultrafree MC (10 K MW Cutoff) entfernt. Überschüssiges DTT wurde durch Zugabe von 10 ul 1,0 M Na-Arsenit zu 20 ul des Filtrats und 10-minütiges Inkubieren maskiert. 10 ul 10 mM BABA wurden zugegeben und die Reaktion weitere 10 Minuten lang inkubiert. Die derivatisierten Plasmaproben wurden dann mittels HPLC analysiert und der Hcy-ABA-Peak quantifiziert, wodurch eine präzise Bestimmung des gesamten Plasma-Hcy ermöglicht wurde (20 ul Injektion, 1,0 ml/min. 10 cm Alltech® Econosphere C18-Säule, Gradient: 1-10% CH&sub3;CN in 100 mM Et&sub3;N-HOAc, pH 5,5, über 15 Minuten). Die Daten zeigten gute Übereinstimmung mit einer linearen Analyse der kleinsten Quadrate. Beim Extrapolieren auf Null-Fläche wies die Nur-Plasma-Probe ca. 28 mM Hcy auf, einen höheren Wert als erwartet (ca. 12 uM ist normal). Die Hcy-Konzentration im gelagerten Blut nahm jedoch im Verlauf der Zeit deutlich zu.

BEISPIEL II

HPLC-HOMOCYSTEIN-ANALYSE VON PLASMA MIT UND OHNE TCEP-REDUKTION

Es wurde gezeigt, daß TCEP bei niedrigen mM-Konzentrationen Hcy in Puffer quantitativ reduziert. Um aufzuzeigen, daß TCEP auch beim Reduzieren von Disulfiden in Plasma wirkungsvoll ist, wurde reines Plasma (ohne Hcy) mit BABA mit oder ohne vorherige Reduktion mit TCEP umgesetzt. 20 ul Plasma wurden 30 ul 1,0 M Na-Bicarbonat und 10 ul H&sub2;O oder 10 ul 20 mM TCEP zugegeben und 5 Minuten lang bei 37ºC inkubiert.
60 ul 10 mM BABA wurden danach zugegeben und die Reaktion 5 Minuten lang inkubiert:
Proteine wurden durch Filtration wie oben entfernt und die Reaktionen mittels HPLC (Bedingungen wie oben außer: Gradient 1-20% CH&sub3;CN in 1% Trifluoressigsäure in einem Zeitraum von 15 Minuten) auf Hcy-ABA analysiert. Kein Produkt wurde beobachtet, außer wenn TCEP vorhanden war. Die HPLC-Analyse zeigte auch, daß der Hcy- ABA-Peak anderer Verbindungen nicht vollständig aufgelöst war, wobei der Versuch in qualitativer Hinsicht als Beweis angesehen werden muß, daß die Reduktion mit TCEP die Disulfid-Reduktion in Plasma (oder Serum) beeinflußt. BEISPIEL III Hcy-ABA-HEMMUNG DER HCy-ABA-AP-BINDUNG AN BIOTIN-Hcy I 5C12
100 ul 1 · PBS, 0,05% Tween®, umfassend 5 ng Hcy-ABA-AP, wurden 100 ul H&sub2;O, umfassend HCy-ABA in einer Konzentration von 0,125, 0,25, 0,5, 1,0 oder 4,0 uM, zugegeben. 100 ul PBS-Tween®, umfassend 10 ng Biotin-HCy I 5C12, wurden zugegeben und die Reaktion 20 Minuten lang inkubiert. Vorgewaschene, mit Streptavidin beschichtete Teilchen (1 Pellet) wurden in 300 ul PBS-Tween® suspendiert und 20 ul der Reaktion zugegeben. Das Reagenzglas wurde 15 Minuten lang geschüttelt, sodaß die Teilchen suspendiert blieben. Die Teilchen wurden dann fünfmal mit PBS-Tween® gewaschen, wobei die Trennung der Teilchen von Lösung erleichtert wurde, indem die Teilchen mithilfe eines mit einem Magnetstreifen versehenen Röhrchenhalters an die Seite gezogen wurden. 300 ul 1 mg/ml PNPP-Substrat in 50 mM Tris Cl, pH 9,3, wurden zugegeben und 20 Minuten lang vermischt. 200 ul Lösung aus jedem Reagenzglas wurden in eine Mikrotiterplatte übertragen und das Absorptionsvermögen bei 414 nm auf einem Plattenablesegerät aufgezeichnet. Wie erwartet, bewirkte eine Zunahme der Konzentration von Hcy-ABA eine Verringerung der Größenordnung des aufgezeichneten Absorptionsvermögens. Die Signalmodulation betrug > 50% über einen wirksamen Lösungskonzentrations-Bereich von 0,04 bis 0,67 mM (es wurde kein Null-Konzentrations-Datenpunkt aufgezeichnet), was eine starke Verdünnung der Serumprobe (typi sche Hcy-Konzentration: ca. 12 mM) ermöglichte, während ein geeignetes Sensitivitätsniveau im Immunassay aufrechterhalten werden konnte.

BEISPIEL IV

ASSAY VON MIT HOMOCYSTEIN UNTERMISCHTEM SERUM

Serumproben wurden mit 10, 20, 30 und 40 uM Hcy (als Hcy zugegeben, d. h. in der dimeren Form von Hcy) untermischt. 6 Reaktionen wurden vorbereitet, worin 5 ul jeder mit Hcy untermischten Serumprobe oder Serum alleine (zwei Reaktionen) reduziert wurden, indem 10 ul 1,0 M Na-Phosphat, pH 7,5, und 10 ul 10 mM TCEP zugegeben und 10 Minuten lang inkubiert wurden. Das resultierende freie Hcy in 5 Proben wurde derivatisiert, d. h. durch Zugabe von 40 ul 8 mM BABA und 10-minütige Inkubation "modifiziert". Bei einer der "Nur-Serum"-Proben wurde BABA durch Zugabe von Bromacetamid ersetzt, wodurch ein Null-Hcy-ABA-Vergleich entstand. 40 ul BABA (1 Probe) oder Bromacetamid (5 Proben) wurden zugegeben, um das Reagensgemisch zu äquilibrieren, gefolgt von 100 ul PBS-Tween® mit 10 ng Hcy-ABA-AP und 100 ul PBS-Tween® mit 20 ng Biotin-Hcy I 5C12 und 15-minütiger Inkubation. 20 ul einer Suspension von mit Streptavidin beschichteten Teilchen wurden zugegeben und die Reaktion 15 Minuten lang gerührt. Nach fünfmaligem Waschen mit PBS-Tween® wurde die Reaktion mit PNPP entwickelt und wie oben analysiert. Die Datenpunkte wurden in einer stetigen Kurve aufgetragen (zugegebenes Hcy über dem aufgezeichneten Absorptionsvermögen). Die Ablesung des Absorptionsvermögens aus der mit Bromacetamid derivatisierten Nur- Serum-Probe wurde in der Kurve eingetragen und die endogene Hcy-Konzentration der Nur-Serum-Probe (0 mM zugegebenes Hcy) durch Vergleichen mit dem Null-Hcy-ABA- (+Bromacetamid) Vergleich ermittelt. Der Graph ergab eine Hcy-Konzentration der Serumprobe von 15 um, einen Wert, der innerhalb des erwarteten Bereichs eines normalen Individuums liegt.
Obwohl die Erfindung in veranschaulichender Weise und mittels erläuternden Beispielen ausführlich beschrieben wurde, ist es offenkundig, daß innerhalb des Schutz bereichs der beiliegenden Patentansprüche bestimmte Änderungen oder Modifikationen vorgenommen werden können.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart oder Menge einer ersten Verbindung in Gegenwart einer zweiten Verbindung in einer Probe, die vermutlich die Verbindungen enthält, wobei die Verbindungen immunologisch verwandt und homolog sind, umfassend die folgenden Schritte:

(a) Zusammenbringen in einem wäßrigen Medium:

(1) der Probe,

(2) eines Modifikator-Reagens, das die erste Verbindung und die zweite Verbindung chemisch modifizieren kann, wodurch eine modifizierte erste Verbindung und eine modifizierte zweite Verbindung gebildet werden, die immunologisch voneinander verschieden sind, und

(3) eines Antikörpers, der sich spezifisch an die modifizierte erste Verbindung, nicht jedoch an die modifizierte zweite Verbindung binden kann, um einen Immunkomplex zu bilden; und

(b) Nachweis des Immunkomplexes, dessen Gegenwart oder Menge zur Gegenwart oder Menge der ersten Verbindung in der Probe in Beziehung steht.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die erste und die zweite Verbindung Homocystein und Cystein sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das Modifikator-Reagens aus der Gruppe bestehend aus Alkylierungsmitteln, Acylierungsmitteln und Metallen ausgewählt ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das Modifikator-Reagens einen nachweisbaren Marker aufweist und der Immunkomplex durch Nachweisen des Markers nachgewiesen wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, worin der Antikörper an einen Träger gebunden ist oder an einen Träger gebunden werden kann.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin der Antikörper nachweisbar markiert ist oder nachweisbar markiert werden kann und der Immunkomplex durch Nachweisen des Markers nachgewiesen wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, weiters umfassend das Zusammenbringen eines Analogs der modifizierten ersten Verbindung, die an einen nachweisbaren Marker gebunden ist, worin der Antikörper sich auch spezifisch an das Analog binden kann, um einen zweiten Immunkomplex zu bilden, und worin die Gegenwart oder Menge des ersten Immunkomplexes durch Nachweisen des zweiten Immunkomplexes gemessen wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, worin der Antikörper an einen Träger gebunden ist oder an einen Träger gebunden werden kann.

9. Verfahren zur Bestimmung der Menge an Homocystein in Gegenwart von Cystein in einer Probe, die vermutlich Homocystein enthält, umfassend die folgenden Sch ritte:

(a) Zusammenbringen in einem wäßrigen Medium:

(1) der Probe,

(2) eines Modifikator-Reagens, das Homocystein und Cystein chemisch modifizieren kann, um modifiziertes Homocystein und modifiziertes Cystein zu bilden, und

(3) eines Antikörpers, der sich spezifisch an das modifizierte Homocystein, nicht jedoch an das modifizierte Cystein binden kann, um einen Immunkomplex zu bilden; und

(b) Messen der Menge des Immunkomplexes, wobei diese Menge zur Menge des Homocysteins in der Probe in Beziehung steht.

10. Verfahren nach Anspruch 9, worin das Modifikator-Reagens die Sulfhydrylgruppen des Homocysteins und des Cysteins modifiziert, um ein modifiziertes Homocystein, worin der Schwefel kein Teil eines Rings ist, und ein modifiziertes Cystein, worin der Schwefel Teil eines Rings ist, zu bilden.

11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, worin das Modifikator-Reagens aus der Gruppe bestehend aus Alkylierungsmitteln, Acylierungsmitteln und Metallen ausgewählt ist.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, worin das Modifikator-Reagens einen nachweisbaren Marker aufweist und der Marker nachgewiesen wird, um die Menge des Immunkomplexes zu messen.

13. Verfahren nach Anspruch 12, worin der Antikörper an einen Träger gebunden ist oder an einen Träger gebunden werden kann.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, worin der Antikörper nachweisbar markiert ist oder nachweisbar markiert werden kann und der Marker nachgewiesen wird, um die Menge des Immunkomplexes zu messen.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 14, weiters umfassend das Zusammenbringen eines Analogs des modifizierten Homocysteins, das an einen nachweisbaren Marker gebunden ist, worin der Antikörper sich auch spezifisch an das Analog binden kann, um einen zweiten Immunkomplex zu bilden, worin die Menge des ersten Immunkomplexes durch Messen der Menge des zweiten Immunkomplexes gemessen wird.

16. Verfahren nach Anspruch 15, worin der Antikörper an einen Träger gebunden ist oder an einen Träger gebunden werden kann.

17. Verfahren zur Bestimmung der Menge an Homocystein in Gegenwart von Cystein in einer Probe, die vermutlich Homocystein enthält, umfassend die folgenden Schritte:

(a) Zusammenbringen in einem wäßrigen Medium:

(1) der Probe,

(3) eines Analogs des modifizierten Homocysteins, das an einen nachweisbaren Marker gebunden ist, und

(4) eines Antikörpers, der sich spezifisch an das modifizierte Homocystein und das Analog, nicht jedoch an das modifizierte Cystein binden kann; und

(b) Messen der Menge des Immunkomplexes, der durch die Bindung des Analogs an den Antikörper gebildet wird, wobei diese Menge zur Menge des Homocysteins in der Probe in Beziehung steht.

18. Verfahren nach Anspruch 17, worin das Modifikator-Reagens aus der Gruppe bestehend aus Alkylierungsmitteln, Acylierungsmitteln und Metallen ausgewählt ist.

19. Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, worin der Antikörper an einen Träger gebunden ist oder an einen Träger gebunden werden kann.

20. Verfahren nach Anspruch 19, das außerdem das Zusammenbringen eines an ein erstes Element eines spezifischen Bindepaars gebundenen Trägers und des Antikörpers, der an ein komplementäres, zweites Element des spezifischen Bindepaars gebunden ist.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 20, worin der Marker aus der Gruppe bestehend aus Fluoreszenzmitteln, Radiomarkern, Enzymen, Chemilumineszenzmitteln und Photosensibilisatoren ausgewählt ist.

22. Verfahren nach Anspruch 17, worin der Antikörper an ein erstes Element eines signalerzeugenden Systems gebunden ist, der nachweisbare Marker ein zweites Element eines signalerzeugenden Systems ist und die Menge des Immunkomplexes durch Nachweisen des Signals gemessen wird, das durch die Wechselwirkung der Elemente des signalerzeugenden Systems erzeugt wird.

23. Verfahren zur Bestimmung der Menge an Homocystein in einer Probe, die vermutlich Homocystein und Cystein enthält, umfassend die folgenden Schritte:

(a) Zusammenbringen in einem wäßrigen Medium:

(1) der Probe,

(2) eines Modifikator-Reagens, das Homocystein und Cystein chemisch modifizieren kann, um modifiziertes Homocystein und modifiziertes Cystein zu bilden,

(3) eines Antikörpers, der sich spezifisch an das modifizierte Homocystein, nicht jedoch an das modifizierte Cystein binden kann, um einen ersten Immunkomplex zu bilden,

(4) einer Oberfläche, die den Antikörper binden kann, und

(5) eines markierten Analogs des modifizierten Homocysteins, das sich an den Antikörper binden kann, um einen zweiten Immunkomplex zu bilden; und

(b) Messen der Menge des zweiten Immunkomplexes, wobei diese Menge zur Menge an Homocystein in der Probe in Beziehung steht.

24. Verfahren nach Anspruch 23, worin das Modifikator-Reagens aus der Gruppe bestehend aus Alkylierungsmitteln, Acylierungsmitteln und Metallen ausgewählt ist.

25. Verfahren nach Anspruch 23 oder 24, worin der Marker des markierten Analogs aus der Gruppe bestehend aus Fluoreszenzmitteln, Radiomarkern, Enzymen, Chemolumineszenzmitteln und Photosensibilisatoren ausgewählt ist.

26. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 25, weiters umfassend das Zusammenbringen eines markierten ersten Elements eines spezifischen Bindepaars, worin der Marker des markierten Analogs ein komplementäres zweites Element eines spezifischen Bindepaars ist.

27. Verfahren zur Bestimmung der Menge an Homocystein in einer Probe, die vermutlich Homocystein und Cystein enthält, umfassend die folgenden Schritte:

(a) Zusammenbringen in einem wäßrigen Medium:

(1) der Probe,

(3) eines Antikörpers, der sich spezifisch an das modifizierte Homocystein, nicht jedoch an das modifizierte Cystein binden kann, um einen Immunkomplex zu bilden, und

(4) eines Rezeptors, der sich an einen Teil des Modifikator-Reagens binden kann, worin der Teil auf dem modifizierten Homocystein vorhanden ist;

(b) Messen der Menge des Immunkomplexes, wobei diese Menge zur Menge an Homocystein in der Probe in Beziehung steht.

28. Verfahren nach Anspruch 27, worin der Teil des modifizierenden Reagens aus der Gruppe bestehend aus Haptenen, Biotin und Fluorescein ausgewählt ist und der Rezeptor aus der Gruppe bestehend aus Antikörpern, Avidin und Streptavidin ausgewählt ist.

29. Verfahren zur Bestimmung der Menge an Homocystein in Gegenwart von Cystein in einer Serumprobe, die vermutlich Homocystein enthält, worin zumindest ein Teil des Homocysteins in Disulfidform (proteingebunden und freies Disulfid) vorliegt, umfassend die folgenden Schritte:

(a) Zusammenbringen in einem wäßrigen Medium:

(1) der Probe,

(2) eines Freisetzungsmittels, um das Homocystein aus der Disulfidform freizusetzen,

(3) eines Modifikator-Reagens, das die Sulfhydrylgruppen von Homocystein und Cystein chemisch modifizieren kann, um modifiziertes Homocystein und modifiziertes Cystein zu bilden, und

(4) eines Antikörpers, der sich spezifisch an das modifizierte Homocystein, nicht jedoch an das modifizierte Cystein binden kann, um einen Immunkomplex zu bilden;

(b) Untersuchen des Mediums hinsichtlich der Menge des Immunkomplexes, wobei diese Menge zur Menge an Homocystein in der Probe in Beziehung steht.

30. Verfahren nach Anspruch 29, worin das chemische Modifizieren der Sulfhydrylgruppe von Cystein die Bildung eines sechsgliedrigen Rings umfaßt.

31. Verfahren nach Anspruch 29, worin das chemische Modifizieren der Sulfhydrylgruppe von Homocystein etwas anderes als die Bildung eines sechsgliedrigen Rings umfaßt.

32. Verfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 31, worin das Freisetzungsmittel ein Reduktionsmittel ist.

33. Verfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 32, worin das Modifikator-Reagens ein Keton ist, das an der α-Position mit einer Abgangsgruppe, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Cl, Br, I, Sulfonaten und Sulfoniumsalzen, substituiert ist.

34. Verfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 33, worin die Menge des Immunkomplexes durch Nachweisen von Enzymaktivität, Lumineszenz, Lichtabsorptionsvermögen oder Radioaktivität bestimmt wird.

35. Set zur Verwendung in einem Verfahren zur Bestimmung einer ersten Verbindung in Gegenwart einer zweiten Verbindung, worin die Verbindungen immunologisch verwandt sind, kombiniert verpackt umfassend:

ein Modifikator-Reagens, das die erste Verbindung und die zweite Verbindung chemisch modifizieren kann, um eine modifizierte erste Verbindung und eine modifizierte zweite Verbindung zu bilden, und

einen Antikörper, der sich spezifisch an die modifizierte erste Verbindung, nicht jedoch an die modifizierte zweite Verbindung binden kann.

36. Set nach Anspruch 35, weiters umfassend ein markiertes Analog der modifizierten ersten Verbindung.

37. Set zur Verwendung in einem Verfahren zur Bestimmung von Homocystein, kombiniert verpackt umfassend:

ein Modifikator-Reagens, das Homocystein und Cystein chemisch modifizieren kann, um modifiziertes Homocystein und modifiziertes Cystein zu bilden, und

einen Antikörper, der sich spezifisch an das modifizierte Homocystein, nicht jedoch an das modifizierte Cystein binden kann.

38. Set nach Anspruch 37, weiters umfassend ein markiertes Analog des modifizierten Homocysteins.

39. Set nach Anspruch 37 oder 38, weiters umfassend ein Freisetzungsmittel zur Freisetzung von jeglichem in Disulfidform vorliegendem Homocystein.