DE69332891T3 - Testverfahren für Homocysteine - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Bestimmung von Homocystein in klinischen Proben.
  • Homocystein ist ein Aminosäure-Zwischenprodukt, welches beim Metabolismus von Methionin zu Cystein gebildet wird. Im Allgemeinen wird im Körper gebildetes Homocystein auf einem der folgenden zwei Wege rasch metabolisiert: (1) Kondensation mit Serin unter Bildung von Cystathion oder (2) Umwandlung zu Methionin, wobei seine Konzentration (und diejenige der oxidierten Form Homocystin) im lebenden Körper unter normalen Bedingungen im Wesentlichen vernachlässigbar ist.
  • Die Homocysteinmenge in biologischen Proben kann jedoch unter gewissen Umständen klinisch signifikant sein, da Homocystein bei den komplexen Wegen, auf welchen der Metabolismus von Sulfhydryl-Aminosäuren stattfinden kann, eine wichtige Rolle spielt, wobei seine Akkumulation ein Hinweis auf das Auftreten unterschiedlicher Störungen innerhalb dieser Wege sein kann, z. B. auf bestimmte angeborene Metabolismusfehler. So ist beispielsweise bekannt, dass es sich bei Homocystinurie (eine abnormale Menge an Homocystein im Urin) um eine Störung des Aminosäuremetabolismus handelt, der Folge des Mangels an den Enzymen Cystathionin-β-synthetase oder Methyltetrahydrofolsäuremethyltransferase (welche die Methylierung von Homocystein zum Methionin katalysiert) ist.
  • Der Metabolismus von Sulfhydryl-Aminosäuren ist mit demjenigen von Folsäure und Vitamin B12 (Cobalamin), die als Substrate oder Co-Faktoren in den zahlreichen beteiligten Transformationen wirken, eng verbunden. Daher wurde die Homocystein-Akkumulierung als Indikator für die Dysfunktion von Cobalamin- oder Folat-abhängigen Enzymen oder andere Störungen oder Erkrankungen, die mit dem Cobalamin- oder Folat-Metabolismus zusammenhängen, vorgeschlagen.
  • Da außerdem die Homocystein-Umwandlung zu Methionin auf einer Reaktion, bei der 5-Methyltetrahydrofolat als Methyl-Donor beteiligt ist, beruht, kann der Homocysteinmetabolismus auch durch Anti-Folat-Medikamente, wie Methotrexat, welche zur Bekämpfung anderer Erkrankungen, insbesondere von Krebs, eingesetzt werden, beeinflusst werden. Daher ist auch vorgeschlagen worden, Homocystein bei der Behandlung von bösartigen Erkrankungen mit Anti-Folat-Medikamenten zu überwachen.
  • Kürzlich sind erhöhte Homocysteinwerte im Blut mit der Entstehung von Artherosklerose in Zusammenhang gebracht worden (siehe Clarke et al., New Eng. J. Med. 324, 1149–1155 (1991)) und nunmehr wird sogar eine nur mäßige Homocysteinämie als Risikofaktor für Herz- und Gefäßerkrankungen eingeschätzt. Die Bestimmung der Homocysteinmenge in Plasma oder Blut ist daher auch für die Diagnose und Behandlung von Gefäßerkrankungen von Bedeutung.
  • Obgleich keine immunologischen Verfahren zur direkten Homocysteinbestimmung existieren, da keine Antikörper gegen Homocystein zur Verfügung stehen, wurden einige andere Verfahren zur Homocysteinbestimmung in klinischen Proben vorgeschlagen. Alle umfassen jedoch chromatographische Trennungen und beruhen im Allgemeinen auf den folgenden drei Prinzipien:
    • 1. Klassische chromatographische Aminosäurenanalyse,
    • 2. Umsetzung von Homocystein der Probe mit dem Enzym S-Adenosyl-L-homocysteinhydrolase in Gegenwart eines radioaktiv oder anders markierten S-Adenosin-Co-Substrats und anschließende Trennung und Quantifizierung des gebildeten Produkts (S-Adenosyl-L-homocystein, SAH). Im Allgemeinen werden chromatographische Trennungen (HPLC oder DC) und Radioaktivitätsmessungen durchgeführt (siehe Refsum et al., Clin. Chem. 31, 624–628 (1985), Kredich et al., Anal. Biochem. 116, 503–510 (1981); Chui, Am. J. Clin. Path. 90(4), 446–449 (1988), Totani et al., Biochem. Soc. 14(6), 1172–9 (1988) und Schimizu et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 8, 153–159 (1986))
    • 3. Umsetzung von Homocystein der Probe mit einem Fluorophor und anschließende HPLC-Trennung und Fluorometrie (siehe Refsum et al., Clin. Chem. 35(9), 1921–1927 (1989)).
  • Diese Verfahren sind zeitaufwändig und mühsam und beruhen alle auf der direkten Quantifizierung. Insbesondere ist die chromatographische Trennung ein gemeinsames Merkmal der Verfahren des Standes der Technik und erfordert eine hochspezialisierte und aufwändige Ausrüstung.
  • Die Verwendung einer solchen Ausrüstung wird in der Regel in der klinischen Routine-Laborpraxis nicht gut angenommen, so dass solche Verfahren folglich im Rahmen üblicher klinischer Laborverfahren im Allgemeinen nicht automatisiert werden.
  • Tanaka et al., Enzyme Microb. Technol. 7: 530–537 (1985), schlagen vor, dass unter Verwendung von Methionin-γ-Lyase auf Homocystein untersucht werden kann.
  • Es besteht daher ein Bedarf nach einem verbesserten Bestimmungsverfahren für Homocystein, welches einfach, spezifisch und schnell durchzuführen ist und für die Anwendung in klinischen Laboratorien leicht angepasst werden kann und welches insbesondere keine kosten- und zeitaufwändige chromatographische Trennung erfordert. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher die Bereitstellung eines solchen Bestimmungsverfahrens.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Bestimmung von Homocystein in einer klinischen Probe, bei welchem man die Probe mit einem unter Cystathionin-β-Synthetase, Methioninsynthase oder Betain-Homocystein-Methyltransferase ausgewählten Homocystein-umwandelnden Enzym und wenigstens einem von Homocystein verschiedenen Substrat für das Enzym in Kontakt bringt und ohne chromatographische Trennung (d. h. der Edukte oder Reaktionsprodukte) (vorzugsweise photometrisch) einen nicht-markierten Nachweisstoff bestimmt, der ausgewählt ist unter dem Homocystein-Co-Substrat und den Homocystein-Umwandlungsprodukten der enzymatischen Umwandlung des Homocysteins durch das Enzym, wobei das Co-Substrat eine Verbindung ist, die in der vom Homocystein-umwandelnden Enzym katalysierten Homocystein-Umwandlungsreaktion mit Homocystein reagiert.
  • Nach dem Inkontaktbringen der Probe mit dem Homocystein-umwandelnden Enzym und dem Substrat wird vorzugsweise wenigstens 30 Sekunden, insbesondere wenigstens 5 Minuten inkubiert, bevor sich die nachfolgenden Schritte des Bestimmungsverfahrens anschließen.
  • Bei dem im erfindungsgemäßen Bestimmungsverfahren verwendeten Homocystein-umwandelnden Enzym handelt es sich nicht um eine SAH-Hydrolase, sondern um Enzyme nach Anspruch 1. Als Beispiel seien genannt Betain-Homocystein-Methyltransferase und andere Enzyme, die bei Homocystein-Umwandlungen beteiligt sind (wie sie beispielsweise von Graham in Trends Cardiovasc. Med. 1, 244–249 (1991) beschrieben werden).
  • Bei dem im erfindungsgemäßen Verfahren bestimmten Homocystein-Co-Substrat handelt es sich um eine Verbindung, die in der Enzym-katalysierten Homocystein-Umwandlungsreaktion mit Homocystein reagiert.
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung umfasst der Begriff ”bestimmen” sowohl die quantitative als auch die qualitative Bestimmung in dem Sinne, dass man einen Absolutwert für die Konzentration des Nachweisstoffs, z. B. des in der Probe vorhandenen Homocystein-Co-Substrats erhält, aber auch den Erhalt eines Indexes, eines Verhältnisses, eines Prozentverhältnisses, eines visuellen oder davon verschiedenen Wertes, der Rückschlüsse auf die Nachweisstoffmenge in der Probe zulässt. Die Bestimmung kann sowohl direkt als auch indirekt erfolgen, wobei es sich bei der tatsächlich bestimmten chemischen Spezies selbstverständlich nicht nur um den Nachweisstoff selbst, sondern beispielsweise auch um ein Derivat davon oder um andere Substanzen handeln kann, wie nachstehend ausgeführt wird.
  • Das erfindungsgemäße Bestimmungsverfahren verwendet zur Bestimmung des Nachweisstoffes geeigneterweise entweder enzymatische oder immunologische Techniken. Bei einer bevorzugten enzymatischen Technik wird der Nachweisstoff mit einem weiteren Enzym, für welchen es ein Substrat darstellt, in Kontakt gebracht und man bestimmt entweder ein Co-Substrat oder ein direktes oder indirektes Reaktionsprodukt der enzymatischen Umwandlung des Nachweisstoffes durch dieses weitere Enzym. Bei einer bevorzugten immunologischen Technik wird der Nachweisstoff unter Anwendung eines Verfahrens bestimmt, welches das kompetetive Binden des Nachweisstoffes an einen Antikörper und eines weiteren Haptens (z. B. ein Polyhapten oder ein markiertes Analog des Nachweisstoffes) und die Bestimmung des gebundenen oder ungebundenen Haptens umfasst.
  • Die Homocysteinmenge in einer Probe beeinflusst also indirekt die Bildung oder den Verbrauch des Homocystein-Co-Substrats und dadurch auch dessen resultierende Konzentration im Reaktionsgemisch. Im Rahmen dieser Erfindung kann die resultierende Konzentration oder die Veränderung der Konzentration des Homocystein-Co-Substrats im Reaktionsgemisch als Indikator für die ursprüngliche Homocystein-Konzentration in der Probe dienen. Insofern es sich bei dem Nachweisstoff um das Co-Substrat handelt, unterscheidet sich das erfindungsgemäße Bestimmungsverfahren von Verfahren des Standes der Technik also dadurch, dass anstelle der direkten Bestimmung Homocystein durch Bestimmung der Konzentration seines Co-Substrats bei der enzymkatalysierten Umwandlung indirekt bestimmt wird. Der direkte Vorteil dabei ist, dass Nachweismethoden, die für typische klinische Laborverfahren geeignet sind, die jedoch für die Homocystein-Bestimmungsverfahren des Standes der Technik nicht geeignet waren, z. B. photometrische Methoden, angewendet werden können, so dass das erfindungsgemäße Bestimmungsverfahren für klinische Routineanwendungen besonders geeignet ist.
  • In anderen bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsformen kann die Reaktion in umgekehrter Richtung durchgeführt werden.
  • An den komplexen Wegen, über die der Metabolismus und die Transmethylierungsreaktion von Sulfhydryl-Aminosäuren im Körper ablaufen, sind viele Enzyme beteiligt. Diese Wege und Reaktionen sind gut untersucht und die regulatorische Rolle der betreffenden Enzyme erforscht worden. Die Rolle eines solchen Enzyms, nämlich der SAH-Hydrolase, wird in einem Artikel von Ueland in Pharmacological Reviews, 34, 223–253 (1982) diskutiert. Trewyn et al. beschreiben in J. Biochem. Biophys. Met. 4, 299–307 (1981) eine Untersuchung der regulatorischen Rolle der SAH-Hydrolase und stellen ein Bestimmungsverfahren für die enzymatische Aktivität der SAH-Hydrolase bereit. Garras et al., beschreiben in Analytical Biochem. 199, 112–118 (1991) andere Reaktionswege des Homocysteins und stellen insbesondere ein Bestimmungsverfahren für die durch die Methionin-Synthase vermittelte Homocystein-Umwandlung bereit. Wie bereits erwähnt beschreibt Graham (siehe oben) weitere Enzym-vermittelte Homocystein-Umwandlungen. Die Co-Substrate und die Umwandlungsprodukte dieser unterschiedlichen Reaktionen können im erfindungsgemäßen Bestimmungsverfahren als Nachweisstoffe verwendet werden, insbesondere, wenn die Bestimmung auf immunologischem Wege erfolgt.
  • Erfindungsgemäß zu untersuchende klinische Proben können aus jeder biologischen Flüssigkeit oder Gewebeprobe entnommen werden und können vor der Bestimmung vorbehandelt werden. Im Allgemeinen verwendet man jedoch Plasma- oder Urinproben.
  • Im Plasma oder im Urin können signifikante Mengen des enthaltenen Homocysteins durch Disulfid-Bindungen an zirkulierende Proteine, wie Albumin, gebunden sein und außerdem kann Homocystein auch in Form anderer Disulfid-Derivate (im Allgemeinen Homocystein-Cystein-Konjugate) vorliegen. Um die in der Probe enthaltene Gesamtmenge an Homocystein schätzen zu können kann es daher sinnvoll sein, die Probe mit einem Reduktionsmittel zu behandeln, um die Disulfid-Brücken zu spalten und Homocystein freizusetzen.
  • Disulfide werden durch Thiole leicht und spezifisch reduziert (z. B. Dithiothreitol (DTT), Dithioerythritol (DTE), 2-Mercaptoethanol, Cystein-Thioglycolat, Thioglycolsäure, Glutathion und ähnliche Verbindungen). Die direkte chemische Reduktion kann durch Borhydride (z. B. Natriumborhydrid) oder Amalgame (z. B. Natriumamalgam) erfolgen oder es können spezifischere Reagenzien, wie Phosphine oder Phosphorthioate verwendet werden. Die Disulfid-Reduktion wird von Jocelyn in Methods of Enzymology 143, 243–256 (1987) beschrieben, wo eine große Anzahl an geeigneten Reduktionsmitteln aufgeführt ist.
  • Homocystein-Co-Substrate können mittels bekannter Verfahren bestimmt werden. Im Allgemeinen werden Verfahren, die auf einem photometrischen Nachweis beruhen (z. B. kolorimetrisch, spektrophotometrisch oder fluorometrisch), und immunologische Verfahren bevorzugt, da diese für die Anwendung in klinischen Labors besonders leicht angepasst werden können. Verfahren, die auf enzymatischen Reaktionen oder Reaktionen mit mono- oder polyklonalen Antikörpern beruhen, sind besonders bevorzugt, da diese einfach und schnell sind und relativ kostengünstig durchgeführt werden können. So kann man den Nachweisstoff beispielsweise dadurch bestimmen, dass man die Reaktion mit Enzymen, welche ihn direkt oder indirekt in Produkte umwandeln, die photometrisch, z. B. spektrophotometrisch, nachgewiesen werden können, überwacht. Geeignete Enzyme sollten selbstverständlich mit anderen Substraten des Homocystein-umwandelnden Enzyms, insbesondere mit Homocystein, nicht reagieren. Solche Enzyme können weiterhin mit anderen Enzymen, welche die gebildeten Produkte in weitere nachweisbare Produkte umwandeln, kombiniert werden.
  • Zu den immunologischen Verfahren gehören beispielsweise Verfahren, welche die Reaktion des Nachweisstoffes mit für ihn spezifischen Antikörpern umfassen, welche entweder selbst nachweisbar sind oder zu nachweisbaren Produkten weiter umgesetzt werden können, z. B. in einem Sandwich-Assay. Ein besonders geeignetes immunologisches Verfahren umfasst jedoch die Verwendung eines Fluorophor-markierten Analogs des Nachweisstoffes, vorzugsweise eines Co-Substrats, z. B. Fluorescein-markiertes Adenosin – wobei dieses und der nicht markierte Nachweisstoff mit einem Antikörper gegen den Nachweisstoff in Kontakt gebracht werden können. Wenn das gebildete Produkt einem Fluoreszenz-Polarisations-Assay mit polarisierter Anregungsstrahlung unterworfen wird, kann die Konzentration an unmarkiertem Nachweisstoff aus dem Depolarisationsgrad der Fluoreszenz-Strahlung hergeleitet werden. Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassay(FPIA)-Techniken sind anerkannte Verfahren (siehe z. B. US-A-4420568 und US-A-4593089 und andere Veröffentlichungen der Abbott Laboratories in Bezug auf ihre TDx-Technoiogie).
  • Die enzymatische Vorbehandlung der Probe ist vorteilhaft, da in vielen erfindungsgemäßen Ausführungsformen der Nachweisstoff in der Probe bereits in unterschiedlichen Mengen vorliegt und daher eine mögliche Fehlerquelle im Bestimmungsverfahren darstellt. Der Hintergrundgehalt des Nachweisstoffes kann dadurch kompensiert werden, dass man das Bestimmungsverfahren mit einem Teil der Probe durchführt, ohne das Homocystein-umwandelnde Enzym zu verwenden; ein solches Vorgehen ist jedoch zeitaufwändig und gestaltet das Bestimmungsverfahren mühsamer. Eine Alternative hierzu stellt die Vorbehandlung der Probe mit einem Reagenz dar, welches den endogenen Nachweisstoff umwandelt oder entfernt. Um den Zeitaufwand für das Bestimmungsverfahren nicht unnötig zu verlängern, kann, wie oben erwähnt, die Behandlung der Probe geeigneterweise zu dem Zeitpunkt erfolgen, zu welchem es mit den Reduktionsmittel zur Freisetzung des Homocysteins vorbehandelt wird.
  • Neben der Verwendung von spektrometrischen oder kolorimetrischen Verfahren zur Bestimmung des Nachweisstoffes können andere photometrische Verfahren angewendet werden. Zu den geeigneten Verfahren zählen Teilchenagglutinations- und Immunopräzipitations-Techniken. Bei der Verwendung von polyklonalen Antikörpern können die direkte Teilchenagglutination oder die direkte Immunopräzipitation angewendet werden. Präzipitations-Inhibitions- oder Teilchenagglutinations-Inhibitions-Techniken können jedoch auch angewendet werden. Diese beruhen auf der Verwendung von Antikörper/Hapten-Kombinationen, die bei der Konjugation zur Präzipitation oder Teilchenaggregation führen, was durch turbidimetrische oder nephelometrische Messungen nachgewiesen werden kann. Wenn die Antikörper/Hapten-Komplexbildung durch den Nachweisstoff inhibiert wird, kann der Nachweisstoffgehalt aus der Verringerung der Präzipitation/Aggregation bestimmt werden. Die Reaktion kann wie folgt ausgedrückt werden:
    Antikörper + Hapten → Komplexbildung
    (wahlweise Teilchen-gebunden) (vorzugsweise ein Polyhapten) (Präzipitation oder Teilchenaggregation)
  • Werden beim erfindungsgemäßen Bestimmungsverfahren Antikörper verwendet, so können diese polyklonal sein; vorzugsweise sind sie jedoch monoklonal. Wenn die gewünschten Antikörper noch nicht kommerziell erhältlich sind, so können sie durch Standardverfahren gewonnen werden. So können monoklonale oder polyklonale Antikörper aus Tieren oder Hybridomen gewonnen werden, beispielsweise wie es in James Gooding in ”Monoclonal antibodies, principle and practice”, Academic Press, London, 1983, Kapitel 3, beschrieben ist. Unter den Monoklonen müssen diejenigen Klone selektiert werden, die zwischen dem gewünschten Hapten und anderen Enzymsubstraten unterscheiden. Polyklonale Antikörper, die nur gegenüber dem Nachweisstoff reaktiv sind, sollten gereinigt werden, um Antikörper, die Kreuzreaktionen eingehen, d. h. solche, die außer mit dem Nachweisstoff auch mit anderen Substraten reagieren, zu entfernen. Dies kann mittels Affinitätschromatographie erfolgen.
  • Bei der Gewinnung des Antikörpers verwendet man als Hapten entweder den Nachweisstoff selbst oder ein anderes Molekül, welches denjenigen Teil des Nachweisstoffes umfasst, welcher als günstigster Bindungsbereich betrachtet wird, d. h. ein Bereich, der von denjenigen Bereichen, die an der enzymatischen Reaktion beteiligt sind, entfernt liegt. Das Hapten wird geeigneterweise an ein Makromolekül, wie BSA oder Hämocyanin, gebunden.
  • Bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Bestimmung können die erforderlichen Reagenzien nacheinander oder gleichzeitig zum Reaktionsgemisch gegeben werden. In vielen bevorzugten Ausführungsformen lässt man jedoch eine oder mehrere Reaktionen zunächst einige Zeit ablaufen, bevor man die Reagenzien für die nachfolgende(n) Reaktion(en) hinzufügt.
  • In der klinisch-chemischen Analyse ist die Verwendung von Standardkurven zu Kalibrierungszwecken übliche Praxis. Dementsprechend können bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens Proben mit bekanntem Homocysteingehalt anstelle der klinischen Proben verwendet werden, um eine Standardkurve für die zu messende Antwort bzw. das zu messende Signal zu erstellen, wobei der Homocysteingehalt in den unbekannten Proben dann durch Interpolation aus der Standardkurve berechnet werden kann. Daher ist eine exakte Quantifizierung der signalerzeugenden Moleküle oder des Redox-Potentials nicht erforderlich.
  • Das erfindungsgemäße Bestimmungsverfahren kann zur Diagnose und Überwachung pathologischer oder potentiell pathologischer Zustände, die mit dem Homocysteingehalt von Körperflüssigkeiten oder Geweben in Zusammenhang stehen oder sich darin äußern, verwendet werden. Diese umfassen Artherosklerose, Bluterkrankungen, Vitaminmangel und/oder angeborene Metabolismusfehler. Außerdem kann es für die Abschätzung der Wirkung von Pharmaka, z. B. von Anti-Folat-Medikamenten, eingesetzt werden.
  • Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Analyse-Produkt, wahlweise in Form eines Kits, zur Verwendung bei der direkten oder indirekten Bestimmung der Menge oder Konzentration von Homocystein in einer Probe, wobei dieses Produkt folgendes umfasst: ein Homocystein-umwandelndes Enzym, das ausgewählt ist unter Cystathionin-β-Synthetase, Methioninsynthase oder Betain-Homocystein-Methyltransferase; ein von Homocystein verschiedenes Substrat für dieses Enzym, wobei dieses Co-Substrat eine Verbindung ist, die in der vom Homocystein-umwandelnden Enzym katalysierten Homocystein-Umwandlungsreaktion mit Homocystein reagiert; ein Signal-erzeugendes Reagenz und wahlweise Mittel zur Bestimmung des Signals.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Analyseprodukt: ein Homocystein-umwandelndes Enzym, das ausgewählt ist unter Cystathionin-β-Synthetase, Methioninsynthase und Betain-Homocystein-Methyltransferase; einen oder mehrere von Homocystein verschiedene Substrate für dieses Enzym, wobei dieses Co-Substrat eine Verbindung ist, die in der vom Homocystein-umwandelnden Enzym katalysierten Homocystein-Umwandlungsreaktion mit Homocystein reagiert; Mittel zur Erzeugung eines nachweisbaren Derivats eines Nachweisstoffes, das ausgewählt ist unter dem Homocystein-Co-Substrat und den Produkten der enzymatischen Homocystein-Umwandlung; und wahlweise Mittel zur spektrometrischen oder kolorimetrischen Bestimmung des nachweisbaren Derivats, um einen Hinweis auf den Homocysteingehalt in der Probe zu erhalten.
  • In den Kits können alle oder ein Teil der Reagenzien in trockener Form vorliegen, ebenso das Format/die Matrix für die Durchführung der Reaktionen im Reaktionsgemisch. Außerdem kann das Kit, wie angedeutet, als Mittel für die Bestimmung eines nachweisbaren Nachweisstoffes oder Derivats einen relativ kostengünstigen spektrometrischen oder kolorimetrischen Apparat umfassen, z. B. eine Lichtquelle und eine Detektoranordnung zum Messen der Lichtintensität bei einer für den nachweisbaren Nachweisstoff etc. charakteristischen Wellenlänge oder sogar ein einfaches kolorimetrisches Kalibrierungsdiagramm.
  • Die Erfindung wird nun durch die nachfolgenden nicht einschränkenden Beispiele beschrieben. Das Bestimmungsverfahren aus Beispiel 19 ist besonders bevorzugt. Obwohl hier nur die Verwendung der SAH-Hydrolase beschrieben wird, versteht es sich von selbst, dass die Beispiele nicht einschränkend zu verstehen sind, und dass die übrigen aufgeführten Homocystein-umwandelnden Enzyme verwendet werden können.
  • Beispiel 1
  • Die Probe (eine wässrige Homocystein-Lösung für die Kalibrierung bzw. Plasma oder Urin für klinische Bestimmungen) wurde mit einem Reduktionsmittel (z. B. 10 mM Dithiothreitol) vorbehandelt. Diese Probe wurde vorzugsweise in einer Homocystein-Endkonzentration im Bereich von 10–6 bis 10–5 mol/l zu einer 37°C warmen, auf einen pH-Wert von 7,40 eingestellten Lösung gegeben, die 5 mg/ml IgG vom Kaninchen, 20 mU/ml Adenosindeaminase, 20 mU/ml Nukleosidphosphorylase, 20 mU/ml Xanthinoxidase, 500 mU/ml Meerrettichperoxidase, 10 mmol/l Dithothreitol, 100 mmol/l Natriumphosphat und 100 mU S-Adenosyl-1-homocysteinhydrolase enthielt. Entweder gleichzeitig oder nacheinander, vorzugsweise jedoch nach 10 Minuten Inkubationszeit zur Umsetzung von Adenosin in der Probe, wurde Adenosin in einer Endkonzentration von 5 × 10–6 mol/l hinzugefügt. Die UV-Absorption wurde in einer Zeitspanne von 10 Minuten gemessen, das Meßsignal wurde bei 292 nm im kinetischen Modus aufgenommen und der Wert ΔA/Δt wurde berechnet.
  • Für klinische Tests kann die Homocysteinkonzentration durch Interpolation in eine Standardkurve, die unter Verwendung bekannter Standards erzeugt wird, berechnet werden.
  • Beispiel 2
  • Die Probe (wie in Beispiel 1) wurde mit einem Reduktionsmittel (z. B. 10 mM Dithiothreitol) behandelt. Diese Probe wurde vorzugsweise in einer Homocystein-Endkonzentration im Bereich von 10–6 bis 10–5 mol/l zu einer 37°C warmen und auf einen pH-Wert von 7,40 eingestellten Lösung gegeben, die 5 mg/ml IgG vom Kaninchen, 20 mU/ml Adenosindeaminase, 20 mU/ml Xanthinoxidase, 20 mU/ml Nukleosidphosphorylase, 500 mU/ml Meerrettichperoxidase, 10 mmol/l Dithiothreitol, 100 mmol/l Natriumphosphat und 20 mU S-Adenosyl-1-homocysteinhydrolase enthielt. Dann wurde, vorzugsweise nach 10 Minuten Inkubationszeit zur Umsetzung von Adenosin in der Probe, S-Adenosyl-1-homocystein in einer Endkonzentration von 5 × 10–5 mol/l hinzugefügt und die UV-Absorption wurde in einer Zeitspanne von 10 Minuten gemessen. ΔA/Δt wurde bei 292 nm im kinetischen Modus berechnet.
  • Für klinische Tests kann die Homocysteinkonzentration durch Interpolation in eine Standardkurve, die durch die Verwendung bekannter Standards erzeugt wurde, berechnet werden.
  • Beispiel 3
  • Probenpuffer:
  • 0,1 M Phosphat-Puffer pH 7,4, enthaltend 1 mg/ml IgG vom Kaninchen und 10 mmol/l Dithiothreitol.
  • Bestimmungsverfahren:
  • Zu 150 μl Probenpuffer gab man 3 mU S-Adenosyl-1-homocysteinhydrolase und fügte die Probe (vorzugsweise wie in Beispiel 1 oder 2 beschrieben vorbehandelt) hinzu. Die Enzymreaktion wurde durch die Zugabe von im Probenpuffer gelöstem Adenosin in einer Endkonzentration von 2,5 × 10–5 mol/l gestartet. Nach 10 Minuten Inkubationszeit fügte man 750 μl einer Lösung aus Probenpuffer, die 20 mU Adenosindeaminase, 20 mU Nukleosidphosphorylase, 20 mU Xanthinoxidase und 375 mU Meerrettichperoxidase enthielt, hinzugefügt. Die UV-Absorption bei 292 nm wurde 5 Minuten im kinetischen Modus aufgenommen. Der ΔA/Δt-Wert wurde berechnet. Parallel dazu wurde die Bestimmung wiederholt, jedoch ohne die Zugabe von S-Adenosyl-L-homocysteinhydrolase. Die Differenz zwischen den beiden ΔA/Δt-Werten wurde bestimmt und die Homocysteinkonzentration wurde durch Interpolation in eine Standardkurve berechnet.
  • Beispiel 4
  • Das Bestimmungsverfahren wurde wie in Beispiel 3 beschrieben bis zur Erstinkubation durchgeführt. Dann wurde nach 10 Minuten Inkubationszeit eine Bestimmungslösung, die Fluorescein-markiertes Adenosin und monoklonale Adenosin-Antikörper enthielt, hinzugefügt. Das restliche Adenosin und das Fluorescein-markierte Adenosin konkurrieren bezüglich der Bindung an den Antikörper. Die Menge an markiertem Adenosin, das an die Antikörper gebunden ist, wird mittels herkömmlicher Fluoreszenz-Polarisationstechnik bestimmt und die Homocysteinkonzentration wird durch Interpolation in eine Standardkurve berechnet.
  • Beispiel 5
  • Probenpuffer:
  • 0,1 M Phosphat-Puffer pH 7,4, enthaltend 1 mg/ml IgG vom Kaninchen und 10 mmol/l Dithiothreitol.
  • SAH-Hydrolase-Lösung:
  • 40 mU/ml S-Adenosyl-1-homocysteinhydrolase werden im Probenpuffer gelöst.
  • Adenosin-Lösung:
  • 5 × 10–8 mol/ml Adenosin werden im Probenpuffer gelöst.
  • Adenosindeaminase-Lösung:
  • 200 mU/ml Adenosindeaminase werden im Probenpuffer gelöst.
  • Phenol/Nitroprussiat-Lösung:
  • 10 mg/ml Phenol und 50 μ/ml Natriumnitroprussiat in Wasser.
  • Hypochlorit-Lösung:
  • 11 mmol/l NaOCl werden in 125 mM NaOH gelöst.
  • Bestimmungsverfahren:
    • 1. 75 μl der Adenosin-Lösung und 75 μl der SAH-Hydrolase-Lösung werden mit der Probe (vorzugsweise wie in einem der Beispiele 1 bis 4 beschrieben vorbehandelt) gemischt und 10 Minuten bei 37°C gehalten.
    • 2. 100 μl der Adenosindeaminase-Lösung werden hinzufügt und das Gemisch wird 5 Minuten bei 37°C gehalten.
    • 3. 750 μl der Phenol/Nitroprussiat-Lösung und 750 μl Hypochlorit-Lösung werden hinzugefügt. Nach 30 Minuten bei 37°C wird die Extinktion bei 628 nm gemessen. Parallel dazu wird die Bestimmung wiederholt, jedoch ohne die Zugabe von SAH-Hydrolase. Die Differenz zwischen den beiden Extinktionswerten bei 628 nm wird bestimmt und die Homocysteinkonzentration wird durch Interpolation dieser Differenz in eine Standardkurve, die durch die Verwendung von bekannten Standards erzeugt wurde, berechnet.
  • Beispiel 6
  • Herstellung von Fluorophor-markiertem SAH
  • Man stellt eine 10 mmol/l-Lösung von SAH in Dimethylformamid her und verdünnt sie dann auf 1:10 in einem 100 mmol/l Phosphat-Puffer mit einem pH-Wert von 7,5. Zu dieser Lösung gibt man Fluoresceinisothiocyanat in einer Endkonzentration von 1 mmol/l. Nach 60 Minuten Inkubationszeit bei Raumtemperatur wird das SAH-Fluorescein-Konjugat mittels HPLC unter Verwendung einer Kromasil C-18-Säule bei 260 nm unter Verwendung eines Gradientengemischs aus 25 mM Ammoniumacetat (pH 7,0) und Methanol gereinigt.
  • Beispiel 7
  • Bildung von Anti-SAH-Antikörpern
    • a) Herstellung des Antigens: Zu einer 1 mmol/l Lösung aus SAH in 25 mmol/l Phosphat-Puffer mit einem pH-Wert von 7,4, der 125 mmol/l NaCl enthält, fügt man Rinderserumalbumin in einer Endkonzentration von 5 mg/ml hinzu. Zu diesem Gemisch gibt man Bis(sulfosuccinimidyl)suberat in einer Endkonzentration vom 1 mmol/l und lässt das Gemisch 60 Minuten reagieren. (Bei dieser Konjugationsreaktion wird der pH-Wert niedrig gehalten, um die Konjugation am Adenosylamin im Gegensatz zu derjenigen an die Homocystein-Aminfunktion zu stimulieren). Die proteinöse Fraktion der Lösung – die auch die Konjugate zwischen BSA und SAH enthält – wird mittels Größenausschluss-Chromatographie unter Verwendung einer Pharmacia Superose 12-Säule mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung als Eluierungsmittel isoliert.
    • b) Bildung der Hybridome: Mit dem beschriebenen Antigen werden Hybridome gemäß dem von James W. Gooding in ”Monoclonal antibodies: Principle and Practice”, Academic Press, London, 1983, Kapitel 3, beschriebenen Verfahren erzeugt.
    • c) Auswahl der Hybridome: (i) Anti-SAH-Antikörper-produzierende Hybridome werden wie folgt identifiziert: Der IgG-Gehalt des Hybridom-Überstands wird mittels herkömmlicher ELISA-Technik gemessen. Dann wird der Überstand in einer Küvette mit einem Puffer, der 50 mmol/l Phosphat, 120 mmol/l NaCl, pH = 7,4, und 0,1 mg IgG vom Kaninchen pro ml enthält, auf eine Endkonzentration von 0,1 μmol/l IgG von der Maus gemischt. Fluorescein-markiertes SAH, das gemäß obigem Beispiel 6 hergestellt wurde, wird in einer Endkonzentration von 0,02 μmol/l hinzugefügt. Nach 10 Minuten Inkubationszeit wird der Polarisationsgrad mit einem Spektralfluorometer gemessen, welcher mit einer Fluoreszenzpolarisationseinheit ausgerüstet ist, indem man A = die Fluoreszenzintensität, wenn die Polarisationsebene des einfallenden Lichts parallel zu der Polarisationsebene des für das Filtern des emittierten Lichts verwendeten Filters steht, B = die Fluoreszenzintensität, wenn die Polarisationsebene des einfallenden Lichts senkrecht zu der Polarisationsebene des für das Filtern des emittierten Lichts verwendeten Filters steht, misst, wobei man eine Anregungswellenlänge von 494 nm verwendet und das emittierte Licht bei 517 nm bestimmt.
  • Der Polarisationsgrad wird berechnet als (A – B)/(A + B)
  • Ein niedriger Polarisationsgrad bedeutet, dass die monoklonalen Mäuse-Antikörper kein SAH binden.
    • (ii) Von den gemäß (i) ausgewählten Hybridomen werden diejenigen Hybridome, die Antikörper produzieren, welche gegenüber Adenosin und/oder Homocystein reaktiv sind, wie folgt identifiziert: Die Oberflächen von Wells einer Mikrotiterplatte werden mit monoklonalen Anti-SAH-Antikörpern aus dem Hybridom-Überstand wie im nachfolgenden Beispiel 9 beschrieben beschichtet. Kohlenstoff-14-markiertes Adenosin (oder Kohlenstoff-14-markiertes Homocystein), erhältlich von Amersham Ltd, UK, in einem Puffer, welcher 25 mmol/l Phosphat, 120 mmol/l NaCl und 1 mg/ml IgG vom Kaninchen enthält und einen pH-Wert von 7,4 aufweist, wird in die Mikrotiter-Wells hinzugefügt. Nach 60 Minuten Inkubationszeit werden die Wells drei mal mit dem gleichen Puffer gewaschen (welcher selbstverständlich kein Adenosin oder Homocystein enthält). In den Wells verbleibende hohe Radioaktivitätswerte weisen darauf hin, dass die Hybridome Antikörper bilden, die selbst an Adenosin (oder Homocystein) binden. Diese Antikörper werden im Bestimmungsverfahren nicht eingesetzt.
    • (iii) Gewinnung monoklonaler IgG: Hybridome, die Antikörper bilden, welche gemäß (i) an SAH binden, die jedoch nicht gemäß (ii) an Adenosin oder Homocystein binden, werden für die Gewinnung monoklonaler IgG ausgewählt. Die ausgewählten Hybridome werden zur Erzeugung von Aszites in Mäusen oder zur Gewinnung von Zellkulturen in vitro gemäß herkömmlicher Verfahren eingesetzt. Die monoklonalen Antikörper werden des Weiteren aus den Aszites oder Zellkulturmedien gemäß herkömmlicher Verfahren isoliert. Siehe James W. Gooding ”Monoclonal antibodies, Principle and practice”, Academic Press, London, 1983.
  • Beispiel 8
  • Fluoreszenzpolarisations-Immunoassay von L-Homocystein
  • Enzym-Lösung: 50 mmol/l Phosphat-Puffer, pH = 7,4, enthaltend 0,2 mg/ml IgG vom Kaninchen, 120 mmol/l NaCl, 10 mmol/l Dithiothreitol, 10 U/l S-Adenosyl-1-Homocysteinhydrolase und 0,1 mmol/l Adenosin.
  • Fluorescein-markierte SAH-Lösung: Gemäß Beispiel 6 gebildetes, an Fluorescein-konjugiertes SAH wird in einer Endkonzentration von 1 μmol/l in 50 mmol/l Phosphat-Puffer pH = 7,4, welcher 125 mmol/l NaCl und 0,2 mg/ml IgG vom Kaninchen enthält, gelöst.
  • Antikörper-Lösung: Monoklonale Anti-SAH-Antikörper (die gegenüber Adenosin nicht reaktiv sind und vorzugsweise auch nicht gegenüber Homocystein), die beispielsweise gemäß Beispiel 7 gewonnen wurden, werden in einer Endkonzentration von 0,1 μmol/l in 50 mmol/l Phosphat-Puffer, pH = 7,4, welcher 125 mmol/l NaCl und 0,2 mg/ml IgG vom Kaninchen enthält, gelöst.
  • Durchführung der Bestimmung: In einer Küvette werden 15 μl Plasma (ursprünglich eine Reihe von Proben mit bekanntem Homocysteingehalt) mit 100 μl Enzym-Lösung gemischt und 15 Minuten bei 37°C gehalten. Man fügt 100 μl der Lösung von Fluorescein-markiertem SAH hinzu und anschließend 1,0 ml der Antikörper-Lösung. Mit einem Spektralfluorometer, welcher mit einer Fluoreszenzpolarisationseinheit ausgerüstet ist, wird der Polarisationsgrad, wie in obigem Beispiel 7 (c) (i) beschrieben, gemessen und gegen die Homocysteinkonzentration aufgetragen.
  • Die Bestimmung kann auch unter Verwendung der markierten Haptene und Antikörper aus den Beispielen 11 und 13 oder 15 und 17 anstelle derjenigen aus den Beispielen 6 und 7 durchgeführt werden.
  • Beispiel 9
  • Mikrotiter-Enzyme-linked Immunoassay
    • (a) Die Enzym-Lösung aus Beispiel 8 wird verwendet.
    • (b) Lösung von mit Peroxidase markiertem SAH: 0,5 mg Meerrettichperoxidase werden in 1 ml gereinigtem Wasser gelöst. 200 μl einer Lösung aus 0,02 mol/l Natriumperiodat wird hinzugefügt, das Gemisch wird 20 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und über Nacht gegen einen 10 mM Natriumacetat-Puffer mit einem pH-Wert von 4,4 dialysiert. SAH wird in einer Endkonzentration von 0,1 mmol/l hinzugefügt und der pH-Wert wird auf 6,0 eingestellt. Die Lösung wird 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. 100 μl einer frisch zubereiteten 4 mg/ml wässrigen Natriumborhydridlösung werden hinzugefügt und die Lösung wird 2 Stunden bei 4°C inkubiert. Die Peroxidase und ihre SAH-Konjugate werden durch Größenausschluss-Chromatographie in einer Superose 6-Säule (Pharmacia, Schweden) isoliert.
    • (c) Auf Mikrotiter-Wells aufgebrachte Anti-SAH-Antikörper: Polyklonale IgG vom Schaf aus mit Maus-IgG immunisierten Schafen werden in einer Endkonzentration von 1 mg/ml in 100 mmol/l Borat-Puffer mit einem pH-Wert von 9,0 gelöst. Je 300 μl dieser Lösung werden in die Wells von Polystyrol-Mikrotiterplatten gegeben. Nach 120 Minuten Inkubationszeit bei 37°C werden die Wells 5 mal mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung gewaschen. Danach werden gemäß obigem Beispiel 7 gewonnene monoklonale IgG Anti-SAH-Antikörper von der Maus in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung in einer Endkonzentration von 50 μg/ml gelöst. Je 200 μl dieser monoklonalen IgG-Lösung werden in die einzelnen Wells gegeben und 120 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Wells werden dann 5 mal mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, die 0,1 mg/ml IgG vom Kaninchen enthält, gewaschen.
    • (d) Durchführung der Bestimmung: Eine 25 μl Plasmaprobe (ursprünglich eine Reihe von Proben mit bekannter Homocysteinkonzentration) wird mit 500 μl der Enzym-Lösung gemischt und 15 Minuten bei 37°C gehalten. Man fügt 50 μl der Lösung von Peroxidase-markiertem SAH hinzu und gibt nach dem Mischen je 250 μl dieses Gemischs in die auf einen pH-Wert von 7,4 gepufferten Wells der gemäß (c) hergestellten, mit Anti-SAH-Antikörpern beschichteten Mikrotiterplatte. Nach 60 Minuten Inkubationszeit bei 37°C werden die Wells 3 mal mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, die 0,1 mg/ml IgG vom Kaninchen enthält, gewaschen. Je 100 μl einer 1 mg/ml ortho-Phenylendiamin-Lösung in einem 0,1 mol/l Zitrat-Puffer, pH = 6,0, welcher 0,015% Wasserstoffperoxid enthält, werden in die einzelnen Wells gegeben. Nach 10 bis 30 Minuten wird die Lichtabsorption von jedem Well bei 450 nm gemessen. Die Absorption wird gegen die Homocysteinkonzentration aufgetragen.
  • Beispiel 10
  • Haptenbildung
  • 3-S-(1-Anhydro-D-ribofuranosyl)-thiopropylamin
    Figure 00170001
  • (a) Aktiviertes Hydroxy-geschütztes Mercaptan (Verbindung (8) in obigem Schema (E))
    Figure 00170002
  • Ein Äquivalent Methyl-β-D-ribofuranosid (obige Verbindung (1), die kommerziell erhältlich ist) wird mit einem Gemisch aus 5 Äquivalenten Trimethylsilylmethansulfonat und einem Äquivalent Bortrifluoridetherat nach dem Verfahren von Jun et al. (Carb. Res. 163, 247–261 (1987)) umgesetzt. 0,5 Äquivalente des 1-Anhydro-D-ribose-Produkts (Verbindung (2)) werden in feinpulveriger Form in kleinen Portionen unter kontinuierlichem Rühren zu einem Gemisch aus Aceton/Schwefelsäure hinzugefügt, welches durch die langsame Zugabe von 6,3 ml konzentrierter Schwefelsäure zu 100 ml frisch destilliertem Aceton in einem Eisbad erhalten wird, hinzugefügt. Das Eisbad wird entfernt und die Reaktion wird bei Raumtemperatur 8 Stunden fortgesetzt. Die erhaltene feste weisse kristalline Masse wird in Chloroform gelöst, mit wässrigem Natriumhydroxid, verdünnter Salzsäure und schließlich Wasser gewaschen, getrocknet und eingedampft, wobei man das 2,3-Isopropyliden-D-ribose-Derivat von 1-Anhydro-D-ribose (Verbindung (2)) erhält. Ein Äquivalent davon und zwei Äquivalente Kohlenstofftetrabromid werden in trockenem Ether gelöst und auf Eis gekühlt. Unter kontinuierlichem Rühren und Kühlen auf Eis werden zwei Äquivalente Triphenylphosphin langsam hinzugefügt. Man entfernt das Eisbad und lässt das Gemisch auf Raumtemperatur auftauen, währenddessen die Reaktion abläuft und Bromwasserstoff langsam entweicht Nach Beendigung der Reaktion wird überschüssiges Reagenz durch die Zugabe von Methanol gequencht. Das Bromid-Derivat (Verbindung (6)) wird durch Filtration und Eindampfen des Filtrats isoliert. Zu dem Bromid-Derivat fügt man in warmer Wasser gelösten und mit rektifiziertem Spiritus verdünnten Thioharnstoff hinzu. Das Gemisch wird zum Rückfluss erwärmt und periodisch gut geschüttelt, wobei diese Behandlung bis 30 Minuten nach dem Auflösen des Bromid-Derivats fortgesetzt wird. Das Reaktionsgemisch wird auf Eis gekühlt und filtriert und man erhält einen Feststoff, welcher mit alkalischem Wasser behandelt wird, wobei man das Hydroxy-geschützte Mercaptan (Verbindung (7)) in der organischen Phase erhält. Dieses wird in die aktivierte Form (Verbindung (8)) durch Behandlung mit Methoxid in Methanol überführt. Diese wird dann wie nachfolgend beschrieben weiter umgesetzt.
  • (b) 3-S-(1-Anhydro-D-ribofuranosyl)thiopropylamin
  • Ein Äquivalent der frisch zubereiteten Verbindung aus Beispiel 10 (a) (Verbindung (8)) wird mit einem Äquivalent Acrylnitril zu einem Thioether (Verbindung (9)) umgesetzt. Dieser wird dann durch Behandlung mit LiAlH4 in trockenem Ether reduziert und das entschützte Amin (Verbindung 10)) wird durch Behandlung mit wässriger Salzsäure freigesetzt.
  • Die entsprechenden Aminopropylthioether, in welchen R1 und R2 nicht für Wasserstoff stehen, werden analog hergestellt, z. B. unter Verwendung der kommerziell erhältlichen Verbindungen (1) und (3) als Edukte.
  • Beispiel 11
  • Hapten-Markierung
  • Eine 50 mmol/l-Lösung der Verbindung aus Beispiel 10 in Dimethylformamid (DMF) wird im Volumenverhältnis 1:5 mit einer 0,1 M Hydrogencarbonat-Lösung (pH 9,2) verdünnt. Zu dieser Lösung gibt man Fluoresceinisothiocyanat in einer Endkonzentration vom 12 mmol/l. Nach 60 Minuten Inkubationszeit bei Raumtemperatur wird das Fluorescein-Konjugat der Verbindung aus Beispiel 10 mittels RPC unter Verwendung einer Kromasil 100 Å C-18-Säule und eines Gradientengemischs aus 20 mM Ammoniumacetat (pH 7,0) und Methanol gereinigt.
  • Beispiel 12
  • Antigen-Herstellung
  • Zu einer 1 mmol/l Lösung der Verbindung aus Beispiel 10 in einem Puffer aus 50 mmol/l Phosphat und 125 mmol/l NaCl (pH 7,4) gibt man Rinderserumalbumin (BSA) in einer Endkonzentration von 5 mg/ml. Zu diesem Gemisch fügt man Bis(sulfosuccinimidyl)suberat in einer Endkonzentration von 1,2 mmol/l hinzu und lässt das Gemisch 60 Minuten reagieren. Die proteinöse Fraktion, die das Hapten-BSA-Konjugat umfasst, wird mittels Größenausschluss-Chromatographie unter Verwendung einer Pharmacia Superose 12-Säule mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung als Eluierungsmittel isoliert.
  • Beispiel 13
  • Antikörper-Gewinnung
  • Antikörper gegen die Verbindung aus Beispiel 10 werden analog zu obigem Beispiel 7 gewonnen, wobei man das Antigen aus Beispiel 12 verwendet. Antikörper, die gegenüber SAH nicht reaktiv sind, und Antikörper, die gegenüber Adenosin reaktiv sind, werden verworfen, da Antikörper, die gegenüber Homocystein reaktiv sind, bevorzugt sind.
  • Beispiel 14
  • Hapten-Herstellung
  • N-Hydroxysuccinimidyl-3-S-(1-anhydro-D-ribofuranosyl)thiobutanoat
    Figure 00190001
  • Ein Äquivalent der frisch hergestellten Verbindung aus Beispiel 10 (a) wird mit einem Äquivalent Ethyl-4-brombutyrat zu der Esterverbindung (11) umgesetzt. Diese wird zur freien Säure durch basische Hydrolyse mit wässrigem Natriumhydroxid in Dioxan hydrolysiert und durch Behandlung mit wässriger Salzsäure zur ungeschützten freien Säure (Verbindung (12)) entschützt. Ein Äquivalent davon wird mit zwei Äquivalenten N-Hydroxysuccinimid in eisgekühltem Dimethylformamid gemischt und mit 1,2 Äquivalenten Dicyclohexylcarbodiimid unter kontinuierlichem Rühren versetzt. Man lässt 18 Stunden bei Raumtemperatur reagieren, kühlt anschließend das Gemisch und fügt eiskalten Ether hinzu. Der ausgefallene NHS-Ester (Verbindung 13)) wird aus DMF/Ether umkristallisiert, getrocknet und bei 4°C über einem Trockenmittel gelagert.
  • Die entsprechenden NHS-Ester, in welchen R1 und R2 nicht für Wasserstoff stehen, werden analog hergestellt, z. B. unter Verwendung der kommerziell erhältlichen Verbindungen (1) und (3) als Edukte.
  • Beispiel 15
  • Hapten-Markierung
  • Eine 50 mmol/l Lösung der Verbindung aus Beispiel 14 in DMF wird im Volumenverhältnis von 1:5 mit einem 0,1 M Hydrogencarbonat-Puffer (pH 9,2) verdünnt. Zu dieser Lösung fügt man 5-Aminoacetamidofluorescein (Fluoresceinylglycinamid) in einer Endkonzentration von 12 mmol/l hinzu. Nach 60 Minuten Inkubationszeit bei Raumtemperatur wird das Fluorescein-Konjugat von 3-S-(1-Anhydro-D-ribofuranosyl)thiobutansäure mittels RPC unter Verwendung einer Kromasil 100 Å C-18-Säule und eines Gradientengemischs aus 20 mM Ammoniumacetat (pH 7,0) und Methanol gereinigt.
  • Beispiel 16
  • Antigen-Herstellung
  • Zu einer Lösung aus BSA (5 mg/l in einem Puffer aus 50 mmol/l Phosphat und 125 mmol/l NaCl (pH 7,4)) gibt man die Verbindung aus Beispiel 14 in einer Endkonzentration von 1 mmol/l. Man lässt das Gemisch 60 Minuten reagieren und isoliert die proteinöse Fraktion, welche das BSA-Hapten-Konjugat enthält, mittels Großenausschluss-Chromatographie unter Verwendung einer Pharmacia Superose 12-Säule mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung als Eluierungsmittel.
  • Beispiel 17
  • Antikörper-Gewinnung
  • Antikörper gegen die Verbindung aus Beispiel 14 werden analog zu obigem Beispiel 7 unter Verwendung des Antigens aus Beispiel 12 gewonnen. Antikörper, welche gegenüber SAH nicht reaktiv sind, und Antikörper, welche gegenüber Adenosin reaktiv sind, werden verworfen, da Antikörper, die gegenüber Homocystein reaktiv sind, bevorzugt sind.
  • Beispiel 18
  • Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassay
  • Enzym-Lösung:
  • 50 mmol/l Phosphat-Puffer (pH 7,4), enthaltend 4 mg/ml Casein, 120 mmol/l NaCl und 10 U/l S-Adenosyl-L-homocysteinhydrolase.
  • Dithiothreitol(DTT)-Lösung:
  • Dithiothreitol wird in Wasser in einer Konzentration von 50 mmol/l gelöst und auf einen pH-Wert von 3,0 mit HCl eingestellt.
  • Adenosin-Lösung:
  • 1,8 mmol/l Adenosin in 50 mmol/l Phosphat-Puffer (pH 7,4).
  • Fluorescein-markierte SAH-Lösung:
  • 50 mmol/l Phosphat-Puffer (pH 7,4) enthaltend an Fluorescein konkugiertes SAH, hergestellt gemäß Beispiel 6.
  • Antikörper-Lösung:
  • Monoklonale Anti-SAH-Antikörper (z. B. gemäß Beispiel 7), gelöst in einer Endkonzentration von 0,1 μmol/l in 50 mmol/l Phosphat-Puffer (pH 7,4), welcher 120 mmol/l NaCl und 1 mg/ml Casein enthält.
  • Durchführung der Bestimmung
  • Schritt 1:
  • In einer Küvette werden 15 μl der Probe, 10 μl der Enzym-Lösung und 10 μl Adenosin-Lösung mit 10 μl der sauren DTT-Lösung gemischt und 15 Minuten bei 37°C gehalten.
  • Schritt 2:
  • In die Küvette fügt man 100 μl der Fluorescein-markierten SAH-Lösung und 1,0 ml der Antikörper-Lösung hinzu. Der Polarisationsgrad wird wie in obigem Beispiel 7 (c) (i) mit einem Spektralfluorometer, welcher mit einer Fluoreszenz-Polarisationseinheit ausgerüstet ist, gemessen und gegen die Homocysteinkonzentration aufgetragen.
  • Beispiel 19
  • Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassay
  • Enzym-Lösung:
  • 50 mmol/l Phosphat-Puffer (pH 7,4), enthaltend 1 mg/ml Casein, 120 mmol/l NaCl und 10 U/l S-Adenosyl-L-homocysteinhydrolase.
  • Dithiothreitol(DTT)-Lösung:
  • Dithiothreitol wird in Wasser in einer Konzentration von 50 mmol/l gelöst und auf einen pH-Wert von 3,0 mit HCl eingestellt.
  • Fluorescein-markierte SAH-Lösung/Adenosin-Lösung:
  • 50 mmol/l Phosphat-Puffer (pH 7,4), enthaltend 10 μmol/l gemäß Beispiel 6 hergestelltes, an Fluorescein konjugiertes SAH und 1,8 mmol/l Adenosin.
  • Antikörper-Lösung:
  • Monoklonale Anti-SAH-Antikörper (z. B. gemäß Beispiel 7), in einer Endkonzentration von 0,1 μmol/l in 50 mmol/l Phosphat-Puffer (pH 7,4) gelöst, welcher 120 mmol/l NaCl und 1 mg/ml Casein enthält.
  • Durchführung der Bestimmung
  • In einer Küvette werden 10 μl Plasma, 100 μl Enzym-Lösung und 10 μl markiertes SAH/Adenosin-Lösung mit 30 μl der sauren DTT-Lösung gemischt und 15 Minuten bei 37°C gehalten.
  • Nach der Inkubation fügt man 1,0 ml der Antikörper-Lösung hinzu. Der Polarisationsgrad wird wie in obigem Beispiel 7 (c) (i) mit einem Spektralfluorometer, welcher mit einer Fluoreszenz-Polarisationseinheit ausgerüstet ist, gemessen und gegen die Homocysteinkonzentration aufgetragen.
  • Die Bestimmungen der Beispiele 18 und 19 können auch unter Verwendung der markierten Haptene und Antikörper der Beispiele 11 und 13 oder 15 und 17 anstelle derjenigen aus den Beispielen 6 und 7 durchgeführt werden.
  • Beispiel 20
  • Lumineszenz-Bestimmung
  • Probenpuffer I:
  • 50 mM Pipes-Puffer (pH 6,6), enthaltend 1 mg/ml Casein, 10 mM DTT, 0,5 mM MgCl2 und 30 mM KCl.
  • Probenpuffer II:
  • 40 mM Hepes-Puffer (pH 7,75), 4 mmol/l EDTA, 20 mM Magnesiumchlorid und 0,36 mmol/l DTT.
  • Probenpuffer III:
  • 40 mM Hepes-Puffer (pH 7,75), enthaltend 1,6 μg/ml Luciferase (aus Photinus pyralis), 700 μmol/l D-Luciferin, 20 mmol/l Magnesiumchlorid, 4 mmol/l EDTA, 0,36 mmol/l DTT und 0,3 mmol/l AMP.
  • Bestimmungsverfahren:
  • Zu 130 μl Probenpuffer 1 gibt man 3 U S-Adenosyl-1-homocysteinhydrolase, fügt 20 μl der Probe zu diesem Gemisch hinzu und inkubiert 15 Minuten bei 37°C. Danach fügt man in Probenpuffer I in einer Endkonzentration von 5 × 10–6 mol/l gelöstes Adenosin hinzu. Nach 5 Minuten Inkubation bei 37°C fügt man 750 μl Probenpuffer II, welcher 0,7 × 10–5 mol/l ATP und 1 mU Adenosin-Kinase enthält, hinzu und inkubiert die erhaltene Lösung anschließend 5 Minuten bei 37°C. Man verdünnt diese Lösung in einem Volumenverhältnis von 1:100 mit dem Probenpuffer II und fügt sofort 500 μl dieser verdünnten Lösung zu 500 μl des Probenpuffers III hinzu. Die beiden Probenpuffer II und III werden auf Raumtemperatur (21°C) äquilibriert. Die entstehende Lumineszenz wird in einem Photometer bei 550 nm gemessen.
  • Parallel dazu wird ein Bestimmungsverfahren durchgeführt, in welchem keine S-Adenosyl-1-homocysteinhydrolase verwendet wird. Für klinische Test kann die Homocysteinkonzentration durch Interpolation der Differenz der Lumineszenz, die zum einen in Gegenwart und zum anderen in Abwesenheit von S-Adenosyl-1-homocysteinhydrolase entsteht, in eine Standardkurve berechnet werden.
  • Beispiel 21
  • Gewinnung von polyklonalen Antikörpern
  • Polyklonale Antikörper vom Kaninchen gegen die Antigene der Beispiele 12 und 16 werden gemäß dem Protokoll der Dako Corporation, Kopenhagen, Dänemark, gewonnen. Polyklonales IgG wird aus dem gewonnenen Antiserum gemäß selbigem Protokoll gereinigt. Die polyklonalen Antikörper werden von Antikörpern, die gegenüber Adenosin- und Homocystein-Resten per se reaktiv sind, befreit, indem man die Antikörper durch Racti-Gel-Säulen mit immobilisierten Adenosin- und Homocystein-Resten führt (Gel und Protokoll von Pierce Chemical Company, Belfium). Antikörper, die gegenüber SAH nicht reaktiv sind, werden ebenfalls verworfen. Die selektierten Antikörper können in den Bestimmungsverfahren der vorstehenden Beispiele verwendet werden.

Claims (16)

  1. Verfahren zur Bestimmung von Homocystein in einer klinischen Probe, bei dem man die Probe mit einem unter Cystathionin-β-Synthetase, Methioninsynthase oder Betain-Homocystein-Methyltransferase ausgewählten Homocystein-umwandelnden Enzym und wenigstens einem von Homocystein verschiedenen Cosubstrat für das Enzym in Kontakt bringt und ohne chromatographische Auftrennung einen nicht-markierten Nachweisstoff bestimmt, der ausgewählt ist unter dem Cosubstrat und den Homocystein-Umwandlungsprodukten der enzymatischen Umwandlung des Homocysteins durch das Enzym, wobei das Cosubstrat eine Verbindung ist, die in der vom Homocystein-umwandelnden Enzym katalysierten Homocystein-Umwandlungsreaktion mit Homocystein reagiert.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei man die Probe mit einem Antikörper für den Nachweisstoff und mit einem von dem nicht-markierten Nachweisstoff verschiedenen Hapten für den Antikörper in Kontakt bringt und wobei die Bestimmung des Nachweisstoffes indirekt durch Bestimmung entweder des an den Antikörper gebundenen Haptens oder des nicht-gebundenen Haptens erfolgt.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei es sich bei dem Hapten um ein Polyhapten handelt.
  4. Verfahren nach Anspruch 2, wobei es sich bei dem Hapten um ein markiertes Molekül mit einer Epitopstruktureinheit handelt, die auch in dem nicht-markierten Antikörper vorkommt.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei es sich bei dem Antikörper um einen monoklonalen Antikörper handelt.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, wobei es sich bei dem Antikörper um einen an eine Trägermatrix gebundenen Antikörper handelt.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem man die Probe mit einem zweiten Enzym in Kontakt bringt, das zur Umwandlung des Nachweisstoffes dient, und wobei die Bestimmung des Nachweisstoffes indirekt durch Bestimmung entweder eines von dem Nachweisstoff verschiedenen Substrates des zweiten Enzyms oder eines Produkts der enzymatischen Umwandlung des Nachweisstoffes durch das zweite Enzym erfolgt.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei es sich bei dem Nachweisstoff um ein Cosubstrat handelt.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei es sich bei dem Nachweisstoff um ein Umwandlungsprodukt handelt.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei es sich bei der Probe um eine mit einem Reduktionsmittel vorbehandelte Blut-, Plasma- oder Harnprobe handelt.
  11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Bestimmung des Nachweisstoffes photometrisch erfolgt.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Bestimmung spektrometrisch oder colorimetrisch erfolgt.
  13. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Bestimmung turbidimetrisch oder nephelometrisch erfolgt.
  14. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Bestimmung unter Anwendung des Fluoreszenzpolarisationsnachweises erfolgt.
  15. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Bestimmung durch Bestimmung der Präzipitation oder Agglutination von Antikörper-Polyhapten-Konjugaten erfolgt.
  16. Analysenkit zur Anwendung zur direkten oder indirekten Bestimmung der Menge oder Konzentration von Homocystein in einer Probe, umfassend ein unter Cystathionin-β-Synthetase, Methioninsynthase oder Betain-Homocystein-Methyltransferase ausgewähltes Homocystein-umwandelndes Enzym; ein von Homocystein verschiedenes Cosubstrat für das Enzym, wobei das Cosubstrat eine Verbindung ist, die in der vom Homocystein-umwandelnden Enzym katalysierten Homocystein-Umwandlungsreaktion mit Homocystein reagiert; ein Signal erzeugendes Reagens; und wahlweise Mittel zur Bestimmung des Signals.
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