HU219607B - Homocisztein vizsgálati eljárás és analitikai készlet - Google Patents

Homocisztein vizsgálati eljárás és analitikai készlet Download PDF

Info

Publication number
HU219607B
HU219607B HU9402170A HU9402170A HU219607B HU 219607 B HU219607 B HU 219607B HU 9402170 A HU9402170 A HU 9402170A HU 9402170 A HU9402170 A HU 9402170A HU 219607 B HU219607 B HU 219607B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
homocysteine
adenosine
enzyme
sample
antibody
Prior art date
Application number
HU9402170A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9402170D0 (en
HUT67550A (en
Inventor
Erling Sundrehagen
Original Assignee
Axis Biochemicals As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27266081&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU219607(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from NO920282A external-priority patent/NO920282D0/no
Priority claimed from GB929204922A external-priority patent/GB9204922D0/en
Application filed by Axis Biochemicals As filed Critical Axis Biochemicals As
Publication of HU9402170D0 publication Critical patent/HU9402170D0/hu
Publication of HUT67550A publication Critical patent/HUT67550A/hu
Publication of HU219607B publication Critical patent/HU219607B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/02—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures
    • C07H15/14—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to a sulfur, selenium or tellurium atom of a saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/26—Acyclic or carbocyclic radicals, substituted by hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G01N33/542—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with steric inhibition or signal modification, e.g. fluorescent quenching
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • G01N33/5735—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes co-enzymes or co-factors, e.g. NAD, ATP
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6806—Determination of free amino acids
    • G01N33/6812—Assays for specific amino acids
    • G01N33/6815—Assays for specific amino acids containing sulfur, e.g. cysteine, cystine, methionine, homocysteine

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
  • Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)

Abstract

A találmány tárgya eljárás homocisztein meghatározására valamelymintában oly módon, hogy a mintát egy homociszteint átalakító enzimmelés az enzim legalább egy, a homociszteintől eltérő szubsztrátjávalhozzák érint- kezésbe, és a reagensek vagy reakciótermékekkromatográfiás elválasztása nélkül meghatározzák a homociszteinkoszubsztrátja és a homocisztein fenti enzim általi enzimatikusátalakításának reakciótermékei közül választott, jelzetlenmeghatározandó anyagot. A találmány továbbá analitikai készletrevonatkozik, homocisztein meghatározására egy mintában a fentieljárással, amely készlet tartalmaz – egy homociszteint konvertálóenzimet, – az enzim egy, a homociszteintől eltérő szubsztrátját azenzim által katalizált homociszteint átalakító reakcióhoz, – egyjelképző szert, és – adott esetben a jel mérésére alkalmas eszközt. ŕ

Description

A találmány tárgya eljárás homocisztein vizsgálatára klinikai mintákban.
A homocisztein egy köztes aminosav, amely akkor képződik, amikor a metionin ciszteinné metabolizálódik. A szervezetben képződött homocisztein általában gyorsan továbbalakul az alábbi két út egyikén: (1) szerinnel kondenzálódva cisztationt képez, vagy (2) metioninná alakul; és koncentrációja (és a homocisztein oxidált formájának koncentrációja) az élő szervezetben normális körülmények között lényegében elhanyagolható.
A homocisztein koncentrációja biológiai mintákban azonban klinikai jelentőséggel bírhat számos esetben, mivel a homocisztein jelentős szerepet játszik a szulfhidril-aminosavak metabolizmusát felépítő biokémiai reakciók komplexében, és felhalmozódása különféle rendellenességeket jelezhet ezekben a biokémiai reakciókban, beleértve a metabolizmus örökletes hibáit is. így például ismert, hogy a homocisztinuria (a homocisztein abnormális képződése a vizeletben) az aminosavmetabolizmus rendellenessége, ami a cisztation-p-szintetáz vagy a homocisztein metioninná történő metilezését katalizáló metil-tetrahidrofolsav metil-transzferáz enzimek hiányából ered.
A szulfhidril-aminosavak metabolizmusa szoros kapcsolatban van a folsavéval és a B^-vitaminéval (kobalamin), amelyek szubsztrátként vagy kofaktorként működnek a lejátszódó különféle transzformációkban. Ezért a homocisztein felhalmozódása a kobalamin vagy folátdependens enzimek hibás működésének, vagy a kobalamin- vagy folátmetabolizmussal kapcsolatos egyéb rendellenességeknek vagy betegségeknek indikátora is lehet.
Ezen túlmenően, mivel a homocisztein metioninná történő átalakulása metildonorként S-metil-tetrahidrofolátot igénylő reakción alapul, a homociszteinmetabolizmust egyéb rendellenességek, nevezetesen a rák kezelésére adagolt antifolátszer - például a metotrexát - is befolyásolhatja. A homocisztein kimutatása ezért a daganatos betegségek antifolátszerekkel való kezelése esetén is javallott.
Napjainkban a homocisztein megnövekedett koncentrációját a vérben az atherosclerosis kifejlődésével hozzák kapcsolatba [Clarké és munkatársai, New England J. Med. 324, 1149-1155 (1991)], és még a kismértékű homociszteinémiát is rizikófaktornak tekintik a szív- és érrendszeri betegségek kialakulásában. A homocisztein koncentrációjának meghatározása a plazmában vagy a vérben ezért az érrendszeri betegségek diagnosztizálásában is jelentőséggel bír.
Noha a homocisztein közvetlen meghatározására nem állnak rendelkezésre immunológiai módszerek, mivel nincs homociszteinnel szembeni antitest, számos egyéb módszer ismert a homocisztein meghatározására klinikai mintákban. Ezek mindegyike kromatográfiás elválasztást igényel, és általában az alábbi három alapelv egyikén alapul:
(1) klasszikus kromatográfiás aminosavanalízis;
(2) a mintában lévő homocisztein reagáltatása S-adenozil-L-homocisztein-hidroláz enzimmel egy radioaktívan vagy egyéb módon jelzett S-adenozin koszubsztrát jelenlétében, majd a képződött termék (S-adenozil-L-homocisztein, SAH) elválasztása és mennyiségének meghatározása: általában kromatográfiás elválasztást (HPLC vagy TLC) és radioaktivitás-mérést alkalmaznak [lásd Refsum és munkatársai, Clin. Chem. 31, 624-628 (1985); Kredich és munkatársai, Anal. Biochem. 116, 503-510 (1981); Chui, Am. J. Clin. Path. 90 (4), 446-449 (1988); Totani és munkatársai, Biochem. Soc. 14 (6), 1172-1179 (1988); és Schimizu és munkatársai, Biotechnoi. Appl. Biochem. 8, 153-159 (1986)];
(3) a mintában lévő homocisztein reagáltatása fluoroforral, majd HPLC-eljárással elválasztás és fluorimetria [Refsum és munkatársai, Clin. Chem. 35 (9), 1921-1927(1989)].
Ezek az eljárások időigényesek, és kivitelezésük nehézkes, továbbá mindegyikük közvetlen mennyiségi meghatározáson alapul. Pontosabban az ismert eljárások közös jellemzője a kromatográfiás elválasztás, amely erősen specifikus és bonyolult berendezést igényel.
Az ilyen berendezések alkalmazását általában nem tartják kívánatosnak a rutin klinikai laboratóriumi gyakorlatban, és ezek az eljárások általában nem alkalmasak automatizálásra a szokásos klinikai laboratóriumi eljárásokban.
Ezért van szükség egy olyan javított eljárásra a homocisztein vizsgálatára, amely egyszerű, specifikus, gyorsan kivitelezhető, könnyen adaptálható klinikai laboratóriumi alkalmazásra, és mindenekelőtt nem kell hozzá drága és időigényes kromatográfiás elválasztás. A találmány célja a fenti követelményeknek megfelelő eljárás kidolgozása volt.
A találmány egyik tárgya tehát eljárás homocisztein vizsgálatára egy mintában oly módon, hogy a mintát egy homociszteint átalakító enzimmel, például egy Sadenozil-homocisztein (SAH)-hidrolázzal és az enzim legalább egy homociszteintől eltérő szubsztrátjával hozzuk érintkezésbe, és a reagensek vagy reakciótermékek kromatográfiás elválasztása nélkül (előnyösen fotometriásan) meghatározunk egy jelzetlen meghatározandó anyagot, amely a homocisztein koszubsztrátja vagy a homocisztein fenti enzim általi enzimatikus átalakításának egyik reakcióterméke lehet.
A mintát a homociszteint átalakító enzimmel és a szubsztráttal való elegyítés után előnyösen legalább 30 másodpercen, még előnyösebben legalább 5 percen keresztül inkubáljuk, mielőtt a vizsgálat soron következő lépését végrehajtanánk.
A találmány szerinti eljárásban homociszteint átalakító enzimként előnyösen SAH-hidrolázt alkalmazunk, de alkalmazhatunk más enzimeket is. Példaként említhetjük a betain-homocisztein metil-transzferázt és a homocisztein átalakításában részt vevő egyéb enzimeket [lásd például Graham, Trends Cardiovasc. Med. 1, 244-249 (1991)].
A találmány szerinti eljárásban meghatározott homociszteinkoszubsztrát olyan vegyület, amely a homociszteinnel reagál az enzim katalizálta - például SAH-hidroláz katalizálta - homociszteinátalakítási reakcióban.
Meghatározás alatt a leírásban mind kvantitatív, mind kvalitatív meghatározást értünk, azaz vagy egy ab2
HU 219 607 Β szolút értéket kapunk a mintában jelen lévő meghatározandó anyag, például a homociszteinkoszubsztrát mennyiségére vagy koncentrációjára, vagy egy indexet, arányt, százalékot, vizuális vagy egyéb értéket, amely jelzi a meghatározandó anyag koncentrációját a mintában. A meghatározás lehet közvetlen vagy közvetett, és a ténylegesen detektált kémiai vegyület természetesen nem feltétlenül maga a meghatározandó anyag, hanem annak egy származéka, vagy egyéb anyag is lehet, amelyet az alábbiakban ismertetünk.
A találmány szerinti vizsgálatban célszerűen vagy enzimatikus vagy immunológiai módszert alkalmazunk a meghatározandó anyag meghatározására. Egy előnyös enzimatikus eljárás szerint a meghatározandó anyagot egy másik enzimmel hozzuk érintkezésbe, amelynek a meghatározandó anyag a szubsztrátja, és vagy egy koszubsztrátot, vagy a meghatározandó anyag ezen másik enzim általi enzimatikus átalakításának közvetlen vagy közvetett reakciótermékét határozzuk meg olyan eljárással, amely a meghatározandó anyag és egy további haptén (például egy polihaptén vagy a meghatározandó anyag jelzett analógja) antitesthez való kompetitív kötődéséből, és a kötött vagy kötetlen haptén meghatározásából áll.
A találmány értelmében alkalmazott előnyös homociszteint átalakító enzim az S-adenozil-homociszteinhidroláz (SAH-hidroláz), amely a homocisztein alábbi reakcióját katalizálja:
adenozin+homocisztein S-adenozil-homocisztein (SAH), a reakció egyensúlyi állandója (K.) 10« Μ-».
A reakció mindkét irányban lejátszódhat, a reakciókörülményektől, a reaktánsok koncentrációjától stb. függően.
A fenti reakcióban az adenozin a homocisztein koszubsztrátja. A találmány szerinti vizsgálatban egyéb koszubsztrátokat, például adenozinanalógokat vagy rokon vegyületeket is alkalmazhatunk.
A találmány szerinti vizsgálat nagy előnye, hogy a homocisztein az SAH-hidroláz inhibitoraként hat, gátolja a homocisztein és adenozin keletkezéséhez vezető hidrolitikus reakciót, és az egyensúlyi reakciót az SAHszintézis irányába tolja el.
A mintában levő homocisztein mennyisége így közvetlenül befolyásolja a homociszteinkoszubsztrát, például az adenozin SAH-hidroláz általi keletkezését vagy fogyását, és ezáltal annak koncentrációját a reakcióelegyben. A találmány értelmében a homocisztein koszubsztrátja, például az adenozin kapott koncentrációja vagy koncentrációjának változása a reakcióelegyben a mintában lévő homocisztein kiindulási koncentrációjának indikátoraként alkalmazható. Ezért abban az esetben, ha a meghatározandó anyag a koszubsztrát, a találmány szerinti vizsgálat annyiban különbözik az ismert eljárásoktól, hogy a homocisztein közvetlen meghatározása helyett a homociszteint közvetett módon határozzuk meg, koszubsztrátja koncentrációjának meghatározásával enzim katalizálta konverziója során. Ennek közvetlen előnye, hogy alkalmazhatók a szokásos klinikai laboratóriumi eljárásokban használt módszerek, például a fotometriás eljárások - amelyek az ismert homocisztein vizsgálatokban nem alkalmazhatók -, ezáltal a találmány szerinti eljárás különösen alkalmas rutin klinikai vizsgálatok kivitelezésére.
A találmány szerinti vizsgálat előnyös kiviteli alakjában az SAH-hidroláz-reakció mindkét irányban alkalmazható. így ha a vizsgálati mintát adenozinnal és SAH-hidrolázzal hozzuk érintkezésbe, az adenozin egy része elfogy, ami megfelel az elfogyott homocisztein mennyiségének, és a homocisztein mennyiségét a mintában ezáltal az adenozin koncentrációjának változásából meghatározhatjuk. Az adenozin helyett alkalmazhatók az adenozin analógjai és/vagy adenozint termelő vegyületek is.
A találmány másik előnyös kiviteli módja szerint az ellentétes irányú reakciót alkalmazhatjuk. A vizsgálati mintát SAH-val (általában feleslegben) és SAH-hidrolázzal hozzuk érintkezésbe. Az SAH hidrolíziséből ekkor homocisztein és adenozin keletkezik. A vizsgálati mintában jelen lévő homocisztein ezen reakció ellen hat, és így gátolja az adenozin képződését, amelynek mennyiségét nyomon követjük.
A találmány szerinti eljárásban alkalmazott SAHhidroláz szubsztrátok például SAH vagy adenozin vagy ezek analógjai vagy prekurzorai lehetnek.
A szulfhidril-aminosavak metabolizmusának komplex reakcióútjaiban és a szervezetben lejátszódó transzmetilezési reakciókban számos enzim részt vesz. Ezeket a reakcióutakat és reakciókat alaposan tanulmányozták, és vizsgálták a részt vevő enzimek szabályozószerepét. Az egyik ilyen enzim, az SAH-hidroláz szerepét összefoglalóan Ueland ismerteti [Pharmaceutical Reviews 34, 223-253 (1982)]. Trewyn és munkatársai [J. Biochem. Biophys. Met. 4, 299-307 (1981)] leírja az SAH-hidroláz szabályozószerepének vizsgálatát, és egy eljárást az SAH-hidroláz enzimatikus aktivitásának vizsgálatára. Garras és munkatársai [Analytical Biochem. 199, 112-118 (1991)] más homocisztein-reakcióutakat írnak le, és közelebbről ismertetnek egy vizsgálati eljárást a homocisztein metionin-szintáz mediálta átalakítására. Mint fent említettük, Graham (supra) ismertet további enzim katalizálta homociszteinátalakításokat. A fenti különféle reakciók koszubsztrátjai és az átalakítások termékei alkalmazhatók meghatározandó anyagként a találmány szerinti vizsgálatban, különösen akkor, ha a meghatározást immunológiai eszközökkel végezzük.
A találmány szerinti eljárással vizsgálandó klinikai minta bármely biológiai folyadékból vagy szövetkivonatból származhat, és a vizsgálat előtt előkezelhetjük azt. Általában azonban plazma- vagy vizeletmintákat alkalmazunk.
A plazmában vagy vizeletben jelen lévő homocisztein jelentős mennyisége diszulfidkötéssel kapcsolódhat a keringő proteinekhez (például albuminhoz), és a homocisztein egyéb diszulfidszármazékok (általában homocisztein-cisztein konjugátumok) formájában is jelen lehet. A mintában lévő összes homocisztein mennyiségének meghatározására ezért kívánatos lehet a minta redukálószerrel való kezelése a diszulfidkötések hasítá3
HU 219 607 Β sa és a szabad homocisztein felszabadítása érdekében. A diszulfidok könnyen és specifikusan redukálhatok tiolokkal [például ditiotreittel (DTT), ditioeritrittel (DTE), 2-merkapto-etanollal, cisztein-tioglikoláttal, tioglikolsawal, glutationnal és hasonló vegyületekkel]. Közvetlen kémiai redukciót is végrehajthatunk bór-hidridekkel (például nátrium-bór-hidriddel), vagy amalgámokkal (például nátrium-amalgámmal), de még specifikusabb reagensek, például foszfmok vagy foszfortioátok is alkalmazhatók. A diszulfid redukcióját Jocelyn ismerteti átfogóan [Methods in Enzymology 143, 243-256 (1987)], a megfelelő redukálószerek széles skálájának felsorolásával.
Az adenozint vagy a homocisztein egyéb koszubsztrátját ismert eljárásokkal határozhatjuk meg. Általában előnyösek a fotometriás (például kolorimetriás, spektrofotometriás vagy fluorometriás) detektáláson alapuló és az immunológiai módszerek, mivel ezek különösen könnyen adaptálhatók a klinikai laboratóriumi alkalmazásra. Különösen előnyösek az enzimatikus reakción vagy a mono- vagy poliklonális antitestekkel való reakción alapuló eljárások, mivel ezek egyszerűek és gyorsak, és kivitelezésük viszonylag olcsó. így például a meghatározandó anyag mérésére a reakciót olyan enzimekkel követjük, amelyek azt közvetlenül vagy közvetve olyan termékekké alakítják, amelyek fotometriásan, például spektrofotometriásán detektálhatok. A megfelelő enzimek - amelyek természetesen nem reagálhatnak a homociszteint konvertáló enzim egyéb szubsztrátjaival, különösen a homociszteinnel - közé tartozik például az adenozin-dezamináz (amely az adenozint és ATP-t ADP-vé és foszforilezett adenozinná alakítja). Ezek az enzimek egyéb enzimekkel is kombinálhatok, amelyek a képződött terméket más, detektálható termékké alakítják.
Az immunológiai vizsgálat például olyan eljárás lehet, amelyben a meghatározandó anyag az arra specifikus antitestekkel reagál, amelyek önmaguk meghatározhatók, vagy tovább reagáltathatók detektálható termékek kialakítása céljából, például szendvicsvizsgálattal. Egyik különösen látványos immunológiai eljárás szerint azonban a meghatározandó anyag valamely fluoroforral jelzett analógját, előnyösen koszubsztrátját, például fluoreszceinnel jelzett adenozint alkalmazunk, és ezt és a jelzetlen meghatározandó anyagot reagáltatjuk a meghatározandó anyag elleni antitesttel. Ha a kapott terméket fluoreszcenciapolarizációs vizsgálatnak vetjük alá polarizált geijesztett sugárzás alkalmazásával, a jelzetlen meghatározandó anyag koncentrációjára a fluoreszcens sugárzás depolarizációjának fokából következtethetünk. Az adenozinantitestek kereskedelmi forgalomban kaphatók (például Paessel és Lőréi GmbH, Frankfurt, NSZK; és Serotech Ltd., Oxford, Egyesült Királyság) és a fluoreszcenciapolarizációs immunvizsgálatok (FPIA) jól ismertek (lásd például az US-A4420568 és US-A-4593089 számú szabadalmi leírásokat, és az Abbott Laboratories egyéb, TDx technológiára vonatkozó publikációit).
A találmány szerinti vizsgálati eljárásban a detektálási reakciók például az alábbiak:
antitest (1) adenozin+ -> FPIA + fluoreszceinnel jelzett adenozin detektálás (2) adenozin -> mozin+NH3 adenozin-dezamináz (3) adenozin-> mozin-> hipoxantin adenozin- purin nukleodezamináz zid- foszforiláz
O2 H2O2 O2 H2O2 —-=¾ xantin —-=¾ húgysav xantin- xantinoxidáz oxidáz (4) adenozin+ATP -> adenozin-5’-P+ADP adenozinkináz egy kompetitív kemilumineszcenciás ATP-reakcióval együtt, például luciferáz
ATP+luciferin+O2 -> oxiluciferin+PPj+ +AMP+CO2+fény vagy egy fluoroforral jelzett adenozinnal, amely az
ATP/adenozin-kinázzal verseng, a meghatározást fluoreszcenciapolarizációs méréssel végezve.
Ami a (2) és (3) reakciót illeti, az inozin és a húgysav jellegzetes UV-abszorpciós tulajdonságokkal rendelkezik, és így spektrofotometriásán meghatározható kinetikai mérésekkel.
Azonban a húgysav vagy inozin UV-detektálásának vannak bizonyos korlátái, mivel a módszer érzékenysége eléggé kicsi, és UV fényforrásra és UV fényt áteresző mintatartóra van szükség. Ezért célszerűbb lehet a kolorimetriás detektáláson vagy elektronikus szenzorokon alapuló módszer, amelyek - különösen a kolorimetria - általában elterjedtek a klinikai laboratóriumokban.
E tekintetben a (2) reakció különösen megfelel, mivel az adenozin-dezamináz katalizálta reakcióban képződött ammónia ismert kolorimetriás módszerekkel detektálható. így például a mintában keletkezett ammóniából megfelelő reaktánsokkal színes termékek képezhetők, amelyek képződése spektrofotometriásán detektálható. Egyik ilyen eljárás szerint az ammóniát fenollal reagáltatva hipoklorit jelenlétében, lúgos körülmények között színes indofenolszármazékot kapunk az 1. reakcióvázlatnak megfelelően [Bergmeyer, Methods of Enzymatic Analysis 1, 1049-1056 (1970)]. Katalizátorként nitro-prusszid-nátriumot alkalmazhatunk. Az eljárás módosított változatai is alkalmazhatók például a fenol különféle származékai alkalmazásával.
A színes végtermék képződött mennyisége egyenesen arányos a mintában lévő ammónia, és ezért az adenozin koncentrációjával.
A (3) reakcióban a xantin-oxidáz-reakció maga is fluorogéneket vagy kromogéneket, például redoxiindikátorokat alkalmazó detektáláshoz vezet a redukciós/oxidációs potenciál mérésével, vagy az O2-fogyás mérésé4
HU 219 607 Β vei, vagy pontosabban a H2O2-képződés mérésével, például elektronikus szenzorok alkalmazásával. Erre a célra számos redoxiindikátor alkalmazható, és a szakirodalomban számos eljárást ismertetnek a H2O2 és O2 meghatározására oldatban. Valóban gyakran detektálják a H2O2-ot a klinikai vizsgálatokban.
Alkalmas redoxiindikátor például a metilénkék, a 2,6-diklór-fenol, az indofenol, és a Kodak Laboratory and Research Products (katalógusszáma 53) 1. táblázatában feltüntetett redoxiindikátorok, de alkalmazhatók egyéb ilyen indikátorok is. A redoxireakciók peroxidázaktivitással rendelkező enzimek, például torma-peroxidáz hozzáadásával segíthetők elő.
Ha precipitáló kromogénre van szükség, MTT-tetrazoliumot alkalmazhatunk xantin-oxidázzal vagy egyéb, hasonló enzimmel kombinálva. A precipitáló kromogén vagy fluorogén alkalmazásával az immobilizált szín vagy fluoreszcencia leolvasható a homocisztein koncentrációjának vizuális jeleként.
A (4) reakció szerint kemilumineszcenciás ATP-reakciót alkalmazunk az adenozin koncentrációjának meghatározására. A kemilumineszcencián alapuló mérések óriási előnye, hogy igen alacsony mérési küszöbök érhetők el, és a szükséges berendezés viszonylag egyszerű. Kemilumineszcenciareakciók alkalmazhatók különféle meghatározandó anyagok, például ATP vagy H2O2 kimutatására, és az egyik leghatékonyabb és legjobban ismert ilyen reakció a tűzlégy biolumineszcenciareakció:
luciferáz
ATP+luciferin+O2-> oxiluciferin+PPj+ +AMP+CO2+fény
A tűzlégy luciferinnek benzotiazol-szerkezete van, de vannak egyéb, biológiai forrásból származó luciferinek, amelyek szerkezete eltérő. Analitikai célokra az ATP, a luciferin és a luciferáz közvetlenül vizsgálható a fenti reakció alkalmazásával. Egy másik kemilumineszcenciás reakció - amely H2O2 képződése esetén alkalmazható, például a (3) reakcióban - a luminol (más néven 5-amino-2,3-dihidro-ftalazin-l,4-dion) reakciója hidrogén-peroxidáz-katalizátorral, amely 425 nm-en fényemissziót eredményez.
A hidrogén-peroxid - például a (3) reakcióból - a peroxi-oxalát és az akridinium-észterek (az utóbbiak vizes oldatban, semleges pH-η) nem enzimatikus kemilumineszcenciás reakciói alkalmazásával is meghatározható.
A fluoroforral jelzett adenozin alkalmazása a (4) reakcióban, és a meghatározás fluoreszcenciapolarizációs méréssel az adenozin-kináz viszonylag széles szubsztrátspecificitása következtében kivitelezhető. Ez a széles specificitás továbbá az endogén adenozin (vagy egyéb adenozin-kináz nukleozidszubsztrát) kompenzálására is alkalmas oly módon, hogy a mintához előkezelésként adenozin-kinázt adunk, előnyösen redukálószerrel (például DTT-vel) kombinálva.
A minta fenti enzimatikus előkezelése kívánatos, mivel - a találmány szerinti megoldások közül sok esetben - a meghatározandó anyag (például az adenozin) különböző mennyiségben már eleve jelen van a mintában, ezáltal a módszer potenciális hibaforrását képezi. A meghatározandó anyag háttér-koncentrációja kiküszöbölhető azáltal, hogy a vizsgálatot a minta egy részével a homociszteint átalakító (például SAH-hidroláz) enzim alkalmazása nélkül végezzük; azonban az ilyen eljárás időigényes, és a vizsgálatot fáradságosabbá teszi. Másik megoldás szerint a mintát előkezeljük egy olyan szerrel, amely az endogén meghatározandó anyagot átalakítja vagy eltávolítja, például a háttéradenozint egy enzimmel, így például adenozin-kinázzal vagy adenozin-dezaminázzal távolítjuk el. Mint már említettük, a vizsgálat időtartama felesleges növelésének elkerülésére a minta ilyen kezelését célszerűen akkor végezhetjük el, amikor a mintát a redukálószerrel kezeljük a homocisztein felszabadítása céljából.
A meghatározandó anyag mérésére alkalmazott spektrometriás vagy kolorimetriás módszerek mellett egyéb fotometriás módszerek is alkalmazhatók. A legjobban alkalmazható módszerek között említhetjük a részecskeagglutinációs és az immunprecipitációs módszereket. Ha poliklonális antitesteket alkalmazunk, közvetlen részecskeagglutinációt és immunprecipitációt alkalmazhatunk, noha abban az esetben, ha a homocisztein felszabadítását SAH-hidrolázzal végeztük, ez általában nem előnyös. Azonban alkalmazhatunk precipitációgátláson és részecskeagglutináció-gátláson alapuló módszereket. Ezek antitest/haptén kombinációkon alapulnak, amelyek konjugálással turbidimetriás vagy nefelometriás méréssel detektálható precipitációhoz vagy részecskeagglutinációhoz vezetnek. Abban az esetben, ha az antitest/haptén komplex kialakulását a meghatározandó anyag, például az SAH gátolja, az SAH-tartalom a precipitáció/aggregáció csökkenéséből határozható meg. A reakció az alábbiak szerint fejezhető ki:
antitest + haptén -> komplexképződés (adott esetben (előnyösen (precipitáció vagy részecskéhez polihaptén) részecskekötött) aggregáció)
Ha a találmány szerinti vizsgálatot homociszteint konvertáló enzimként SAH-hidroláz alkalmazásával végezzük, a SAH-hidrolázt előnyösen redukálószer jelenlétében tároljuk, vagy a találmány szerinti vizsgálatban való alkalmazása előtt redukálószerrel kezeljük. Azt tapasztaltuk, hogy a tárolás egyébként az SAH-hidroláz aktivitásának elvesztéséhez vezet, és a redukálószer fenti alkalmazása vagy megakadályozza a tárolás során bekövetkező inaktiválódást, vagy az enzim reaktiválását váltja ki annak alkalmazása előtt.
Különböző redukálószerek (például DTT, cisztein, merkapto-etanol, ditioeritrit, nátrium-bór-hidrid stb.) alkalmazhatók, azonban különösen előnyös a DTT például körülbelül 5 mmol/1 koncentrációban. A DTT-t magát alacsony pH-η kell tárolni, ezért a vizsgálókészlet célszerűen DTT-oldatot tartalmaz alacsony pH-η (például pH 3 körüli értéken), de alacsony pufferkapacitással, és ettől elkülönítetten tartalmazza az SAH-hidrolázoldatot - amely részlegesen vagy teljesen inaktív lehet - lényegében semleges pH-η és előnyösen pufferolva. Amikor ezeket az oldatokat kombináljuk, az enzim semleges pH-η reaktiválódik. A kombináció kívánt esetben a vizsgálati minta jelenlétében történik, vagy a vizsgála5
HU 219 607 Β ti mintát röviddel utána hozzáadjuk, ezáltal egyidejűleg végbemegy a homocisztein felszabadulása. A fent említett egyéb redukálószerek hasonlóképpen alkalmazhatók mind az SAH-hidroláz stabilizálására/aktiválására, mind a minta redukálására a homocisztein felszabadítása céljából.
A redukálószerek alkalmazása az inaktivált SAHhidroláz reaktiválására szintén a találmány tárgyát képezi. A találmány tárgyát képezi továbbá egy készlet is, amely egyik rekeszében egy inaktív SAH-hidrolázt, másik rekeszében egy redukálószert, például DTT-t tartalmazó savas közegben (például pH 3 értéken). A készlet alkalmazásakor az SAH-hidrolázt a redukálószerrel keverhetjük, és így reaktiválhatjuk közvetlenül a vizsgálatban való alkalmazása előtt.
Egyéb adalékanyagok is alkalmazhatók előnyösen az SAH-hidroxiláz stabilitásának növelésére a raktározás során vagy magában a vizsgálatban. Ilyen adalékanyag például a NAD+, glutation, poliol-alkoholok és cukrok (például inozit, szorbit, xilit, eritrit, glicerin, etilénglikol, szacharóz, laktit, stb.), az oldható polimerek, például bizonyos dextránok, és proteinek (például hordozóproteinek).
Ha a találmány szerinti vizsgálatban antitesteket alkalmazunk, ezek poliklonálisak vagy előnyösen monoklonálisak lehetnek. Abban az esetben, ha a kívánt antitestek kereskedelmi forgalomból nem szerezhetők be, ismert eljárásokkal előállíthatok. Az antitesteket - monoklonálisakat vagy poliklonálisakat - állatokban vagy hibridómákban termelhetjük például James Gooding ismertetése szerint (Monoclonal antibodies: Principle and practice, Academic Press, London, 1983, 3. fejezet). A monoklónokat osztályozni kell ahhoz, hogy kiválaszthassuk azokat a kiónokat, amelyek képesek megkülönböztetni a kívánt haptént és az enzim(ek) egyéb szubsztrátjait, például amelyek megkülönböztetik az adenozint az SAH-tól. A csak a meghatározandó anyaggal (például SAH-val) reagáló poliklonális antitesteket meg kell tisztítani a keresztreakciót adó antitestektől, azaz azoktól, amelyek a meghatározandó anyagon kívül egyéb szubsztrátokkal is (például mind adenozinnal, mind SAH-val) reakcióba lépnek. A tisztítást affinitási kromatográfiás eljárással végezhetjük, például immobilizált adenozint alkalmazva abban az esetben, ha a meghatározandó anyag az SAH.
Az antitestek előállítására hapténként vagy magát a meghatározandó anyagot alkalmazzuk, vagy egy másik molekulát, amely tartalmazza a meghatározandó anyag legmegfelelőbb kötőrégiónak tekintett részét, például egy olyan régiót, amely távol esik az enzimreakcióban részt vevő régióktól. A haptént célszerűen egy makromolekulához, például BSA-hoz vagy hemicianinhoz kötjük. Az SAH számára a kívánt epitóp előnyösen a tioéterhídnál, vagy annak közelében van, ezért használhatjuk magát az (A) képletű SAH-t egy makromolekulával konjugálva, vagy előnyösen egy (I) általános képletű „egyszerűsített” vegyületet - a képletben R] és R2 azonos vagy eltérő, és hidrogénatomot vagy
-OK, csoportot jelent (ahol R4 jelentése rövid szénláncú (például 1-6 szénatomos, különösen 1-4 szénatomos) alifás csoport, például alkilcsoport, előnyösen metil- vagy etilcsoport, vagy
R, és R2 együtt oxigénatomot jelent, és
R3 jelentése amin- vagy karboxilmaradék vagy annak egy sóját vagy észterét, például egy 1-4 szénatomos alkanollal alkotott észterét alkalmazzuk, szintén egy makromolekulához kapcsolva.
Hapténként alkalmazható (I) általános képletű vegyületek például az (I— 1), (1-2), (1-3), (1-4), (1-5) és (1-6) képletű vegyületek.
Ilyen „egyszerűsített” szerkezetek a jelzett analógokra is alkalmazhatók, amelyeket azokban a fent említett vizsgálatokban alkalmazunk, ahol az meghatározandó anyag és a jelzett analóg között az antitesthez való kompetitív kötődési reakció megy végbe. így a jelet adó R* maradékot - amely egy fluorofor, kromofor, radioaktív jelzés, enzimatikus, kemilumineszcenciás vagy az immunológiai vizsgálatokban szokásosan alkalmazott egyéb jelzés lehet - a meghatározandó anyaggal kapcsolhatjuk (mint például az R*-SAH esetén), vagy az egyszerűsített, epitópot tartalmazó molekulával konjugálhatjuk (mint például az (Γ) általános képletű vegyületekben).
A fenti jelzett maradékokat természetesen részecskékkel, polimerekkel, proteinekkel vagy egyéb anyagokkal is kapcsolhatjuk kívánt esetben.
A jelzett fúranóz-6-tioéterek és az (I) általános képletű vegyületek újak, és ezek szintén a találmány tárgyát képezik.
Ebből a szempontból a találmány az (I) általános képletű vegyületek előállítására szolgáló eljárásra is vonatkozik, amelynek értelmében (a) egy (II) általános képletű vegyületet - a képletben
Rj és R2 jelentése a fent megadott, és mindegyik R5 védett hidroxilcsoportot jelent, vagy két R5 együtt alkilén-dioxi-csoportot [azaz egy védett biszhidroxicsoportot, mint az -OC(CH3)2)O-] képez - egy (III) általános képletű propil-halogeniddel - a képletben
R6 jelentése R3 vagy egy védett R3 és
Hal jelentése halogénatom, például brómatom - reagáltatunk, majd kívánt esetben a jelen lévő védőcsoporto(ka)t eltávolítjuk, vagy (b) olyan (I) általános képletű vegyületek előállítására, amelyek képletében R3 jelentése aminocsoport, egy (II) általános képletű vegyületet akrilonitrillel reagáltatunk, és a kapott ciano-propil-tioéter-terméket redukáljuk, és a védőcsoportot eltávolítjuk, és kívánt esetben (c) egy (I) általános képletű vegyületet, amelynek képletében R3 jelentése karboxilcsoport, észterezünk. A (III) általános képletű kiindulási vegyületek a szakirodalomból ismertek, vagy ismert eljárásokkal állíthatjuk elő ezeket. A (II) általános képletű kiindulási vegyületek a megfelelő l-(hidroxi-metil)-fúranózokból állíthatók elő a cisz-hidroxil-csoport védésével, brómozással, majd tiokarbamiddal történő reagáltatással, és hidrolízissel. Az l-(hidroxi-metil)-furanózokban a cisz-hidroxil-csoport védését szokásos hidroxilvédő
HU 219 607 Β reaktánsokkal, például acetonnal való reagáltatással végezhetjük.
Az (I) általános képletű vegyületeket például az
A)-J) reakcióvázlatok szerinti eljárásokkal állíthatjuk elő [az (1) és (3) képletű vegyületek kereskedelmi forgalomban kaphatók].
UV-abszorpció, látható fény abszorpciója, vagy a reakcióelegyben lévő - adott esetben precipitált vagy a reakcióelegyből egyéb módon elválasztott - anyagok fluoreszcenciája meghatározható a reakció végpontján (amikor a szignál stabil) vagy egy vagy több meghatározott időpontban, vagy kinetikus mérés alkalmazható, amikor különböző időpontokban több mérést végzünk.
A találmány szerinti vizsgálat kivitelezésére a reakcióelegyhez egymás után, vagy egyszerre hozzáadjuk a szükséges reaktánsokat. Azonban számos előnyös kiviteli mód szerint egy vagy több reakciót előnyösen bizonyos ideig hagyunk lejátszódni a soron következő reakció(k)hoz szükséges reaktáns hozzáadása előtt. Például abban az esetben, ha a vizsgálati mintát adenozinnal és SAH-hidrolázzal reagáltatjuk, az SAH képződését homociszteinből és adenozinból előnyösen hagyjuk egy ideig végbemenni, mielőtt az adenozin meghatározására szolgáló eljárást elkezdenénk.
A klinikai kémiai analitikai eljárásokban szokásos gyakorlat a standard görbék felvétele kalibrációs célokra. így a találmány szerinti eljárás kivitelezése során ismert homociszteintartalmú mintákat alkalmazhatunk a klinikai minták helyett a válasz/mérendő jel meghatározására a standard görbe felvételéhez, és ezután az ismeretlen minta homociszteintartalmát interpolációval határozhatjuk meg a standard görbéből. Ezért a jelet adó molekula vagy a redoxipotenciálok egzakt mennyiségének meghatározására nincs szükség.
A találmány szerinti vizsgálat a testfolyadékok vagy -szövetek homociszteintartalmával összefüggő, vagy abban megnyilvánuló patológiás vagy potenciálisan patológiás állapotok kimutatására alkalmazható. Idetartozik például az atherosclerosis, a vér betegségei, vitaminhiányok és/vagy a metabolizmus veleszületett hibái. A találmány szerinti vizsgálat a gyógyszerek, például az antifolátszerek hatásainak kiértékelésére is alkalmazható.
A találmány analitikai termékre is vonatkozik, adott esetben készlet formájában, homocisztein vizsgálatára egy mintában, amely termék
- egy homociszteint konvertáló enzimből,
- az enzim homociszteintől eltérő szubsztrátjából,
- egy jelképző szerből, és
- adott esetben a jel mérésére alkalmas eszközből áll.
Egyik előnyös kiviteli alak szerint az analitikai termék a minta homociszteintartalmának meghatározására
- egy homociszteint konvertáló enzimből, például Sadenozil-homocisztein-hidrolázból,
- az enzim egy vagy több, homociszteintől eltérő szubsztrátjából,
- a homocisztein koszubsztrátja és a homocisztein enzimatikus konverziójának termékei közül választott meghatározandó anyag detektálható származékának előállítására szolgáló eszközből, és
- adott esetben a detektálható származék spektrometriás vagy kolorimetriás mérésére alkalmas eszközökből áll.
Egy másik kiviteli alak szerint a tennék
- adenozinból,
- egy adenozint konvertáló enzimből,
- adott esetben az adenozint konvertáló enzim egy koszubsztrátjából, és
- a fenti koszubsztrátból vagy az adenozin fenti adenozint konvertáló enzim általi enzimatikus konverziójának termékeiből fotometriásan detektálható válasz képzésére alkalmas eszközökből áll.
Az adenozint konvertáló enzim például adenozinkináz, és a detektálható válasz képzésére alkalmas eszköz például ATP, luciferin és egy luciferáz lehet. Alternatív megoldásként az adenozint konvertáló enzim adenozin-dezamináz, és a konvertálásra alkalmas eszköz például nukleozid-foszforiláz, xantin-oxidáz és egy peroxidáz lehet.
A további kiviteli alak szerint a készlet
- adenozinból,
- S-adenozil-homociszteinből,
- adott esetben mátrixrészecskékhez kötött anti-S-adenozil-homocisztein-antitestből,
- egy, a fenti antitest számára alkalmas polihapténből, és
- adott esetben az antitest/polihaptén komplexek agglutinációjának vagy precipitációjának fotometriás meghatározására alkalmas eszközökből áll.
E kiviteli alak szerint a polihaptén célszerűen egy vázat alkotó polimer lehet, amelyhez több füranóz-6tioéter kapcsolódik, például (a) általános képletű oldalláncok formájában.
A fenti vegyületeket például úgy állítjuk elő, hogy egy (I) általános képletű karbonsavat (vagy annak anhidridjét vagy savhalogenidjét) több lelógó aminocsoportot tartalmazó polimerrel (például polilizinnel) reagáltatunk, vagy egy (I) általános képletű amint reagáltatunk lelógó karboxilcsoportokat tartalmazó polimerrel.
A készletben mindegyik vagy néhány reagens száraz állapotban lehet, mint forma/mátrix a reakcióelegyben végbemenő reakciók lejátszatására. Hasonlóképpen a készlet - mint említettük - a detektálható meghatározandó anyag vagy származéka meghatározására viszonylag olcsó spektrometriás vagy kolorimetriás készüléket, például egy fényforrásból és detektorból álló berendezést is tartalmazhat a fényintenzitás mérésére a detektálandó anyag jellegzetes hullámhosszán stb., sőt még egy egyszerű kolorimetriás kalibrációs kártyát is.
A találmányt közelebbről - a korlátozás szándéka nélkül - az alábbi példákkal kívánjuk ismertetni. Különösen előnyös a 19. példa szerinti vizsgálat.
1. példa
A mintát (vizes homociszteinoldatot kalibrálásra vagy plazmát vagy vizeletet klinikai vizsgálatra) redukálószerrel (például 10 mmol/1 koncentrációjú ditiotreittel) előkezeljük. Ezt a mintát - előnyösen 10 6—10 5 mol/1 homocisztein-végkoncentrációban 5 mg/ml nyúlból
HU 219 607 Β származó IgG-t, 20 milliegység/ml adenozin-dezaminázt, 20 milliegység/ml nukleozid-foszforilázt, 20 milliegység/ml xantin-oxidázt, 500 milliegység/ml torma-peroxidázt, 10 mmol/1 ditiotreitet, 100 mmol/1 pH 7,4-re állított nátrium-foszfátot és 100 milliegység S-adenozil-l-homocisztein-hidrolázt tartalmazó oldathoz adjuk 37 °C-on. Ezzel egyidejűleg, vagy egymás után - előnyösen 10 percen keresztüli inkubálás után a mintában levő adenozin konverziójának biztosítására adenozint adunk a mintához 5 · 10 6 mol/1 végkoncentrációban. 10 percen keresztül méijük az UV-abszorpciót, és a választ 292 nm-en kinetikus módon mérjük, és kiszámítjuk a AA/At értéket.
Klinikai vizsgálatok céljára a homocisztein koncentrációját ismert standardok alkalmazásával felvett standardgörbéből számíthatjuk ki interpolációval.
2. példa
A mintát (lásd 1. példát) redukálószerrel (például 10 mmol/1 koncentrációjú ditiotreittel) előkezeljük. Ezt a mintát - előnyösen 10 6—10 3 * 5 mol/1 homociszteinvégkoncentrációban - 5 mg/ml nyúlból származó IgG-t, 20 milliegység/ml adenozin-dezaminázt, 20 milliegység/ml nukleozid-foszforilázt, 500 milliegység/ml torma-peroxidázt, 10 mmol/1 ditiotreitet, 100 mmol/1 pH 7,4-re állított nátrium-foszfátot és 20 milliegység S-adenozil-l-homocisztein-hidrolázt tartalmazó oldathoz adjuk 37 °C-on. Ezzel egyidejűleg, vagy egymás után - előnyösen 10 percen keresztüli inkubálás után a mintában levő adenozin konverziójának biztosítására - adenozint adunk a mintához 5 · 10~5 mol/1 végkoncentrációban. 10 percen keresztül mérjük az UV-abszorpciót, és a választ 292 nm-en kinetikus módon mérjük, és kiszámítjuk a AA/At értéket.
Klinikai vizsgálatok céljára a homocisztein koncentrációját ismert standardok alkalmazásával felvett standardgörbéből számíthatjuk ki interpolációval.
3. példa
Vizsgálati puffer: 1 mg/ml nyúlból származó IgG-t és 10 mmol/1 ditiotreitet tartalmazó, 0,1 mol/1 koncentrációjú foszfátpuffer (pH 7,4).
Vizsgálat kivitelezése
150 pl vizsgálati pufferhez 3 milliegység S-adenozil-l-homocisztein-hidrolázt és (előnyösen az 1. és 2. példa szerint előkezelt) mintát adunk. Az enzimreakciót a vizsgálati pufferben oldott adenozin 2,5 10 5 végkoncentrációban való hozzáadásával indítjuk el. 10 percen keresztüli inkubálás után hozzáadunk 20 milliegység adenozin-dezaminázt, 20 milliegység nukleozid-foszforilázt, 20 milliegység xantin-oxidázt és 375 milliegység torma-peroxidázt tartalmazó 750 pl vizsgálati pufferoldatot. Az UV-abszorpciót 292 nm-en 5 percen keresztül mérjük kinetikus módon. Kiszámítjuk a AA/At értéket. Párhuzamosan a fenti vizsgálatot megismételjük, de S-adenozil-l-homocisztein-hidroláz hozzáadása nélkül. Kiszámítjuk a két AA/At érték különbségét, és a homocisztein koncentrációját a standardgörbéből interpolációval meghatározzuk.
4. példa
A vizsgálat kivitelezését a 3. példában leírtak szerint végezzük az első inkubálásig. Ekkor 10 percen keresztüli inkubálás után fluoreszceinnel jelzett adenozint és monoklonális antiadenozinantitesteket tartalmazó vizsgálati oldatot adunk hozzá. A maradék adenozin és a fluoreszceinnel jelzett adenozin verseng az antitesthez való kötődésért. Az antitestekhez kötődött, jelzett adenozin mennyiségét ismert fluoreszcenciapolarizációs módszerrel meghatározzuk, és a homociszteinkoncentrációt egy standardgörbéből interpolálással meghatározzuk.
5. példa
Vizsgálati puffer: 1 mg/ml nyúlból származó IgG-t és 10 mmol/1 ditiotreitet tartalmazó 0,1 mol/1 koncentrációjú foszfátpuffer (pH 7,4).
SAH-hidroláz-oldat: 40 milliegység/ml S-adenozil-1homocisztein-hidroláz a vizsgálati pufferben oldva
Adenozinoldat: 5-10-8 mol/1 adenozin a vizsgálati pufferben oldva.
Adenozin-dezamináz-oldat: 200 milliegység/ml S-adenozil-l-homocisztein-hidroláz a vizsgálati pufferben oldva.
Fenol/nitro-prusszid oldat ·. 10 mg/ml fenol és 50 pg/ml nitro-prusszid-nátrium vízben oldva.
Hipokloritoldat: 11 mmol/1 NaOCl 125 mmol/1 koncentrációjú NaOH-ban oldva.
Vizsgálat kivitelezése
1. 75 pl adenozinoldatot és 75 pl SAH-hidroláz-oldatot a vizsgálati (előnyösen az 1 -4. példa szerint előkezelt) mintával elegyítünk, és 10 percen keresztül 37 °C-on tartjuk.
2. Hozzáadunk 100 pl adenozin-dezamináz-oldatot, és az elegyet 5 percen keresztül 37 °C-on tartjuk.
3. Hozzáadunk 750 pl fenol/nitro-prusszid oldatot és 750 pl hipokloritoldatot. 30 percen keresztül 37 °Con tartjuk, majd 628 nm-en méljük az extinkciót. Párhuzamosan a vizsgálatot megismételjük, de SAHhidroláz hozzáadása nélkül. A 628 nm-en mért két extinkcióérték közötti különbséget meghatározzuk, és a homocisztein koncentrációját a fenti különbségből az ismert standardok alkalmazásával felvett standardgörbéből interpolálással meghatározzuk.
6. példa
Fluoroforral jelzett SAH kialakítása Előállítunk egy 10 mmol/1 koncentrációjú SAH-oldatot dimetil-formamiddal, majd 100 mmol/1 koncentrációjú nátrium-foszfát-pufferrel (pH 7,5) 1:10 arányban hígítjuk. A kapott oldathoz 1 mmol/1 végkoncentrációban fluoreszcein-izotiocianátot adunk. Az elegyet szobahőmérsékleten 60 percen keresztül inkubáljuk, majd az SAH-fluoreszcein konjugátumot HPLC-eljárással tisztítjuk, Chromasil C-18 oszlop alkalmazásával 260 nm-en, 25 mmol/1 ammónium-acetátból (pH 7,0) és metanolból kialakított gradienselegy alkalmazásával.
HU 219 607 Β
7. példa
Anti-SAH-antitestek kialakítása
a) Antigén kialakítása mmol/1 koncentrációjú SAH-oldathoz 125 mmol/1
NaCl-ot tartalmazó, 25 mmol/1 koncentrációjú foszfátpufferben (pH 7,4) 5 mg/ml végkoncentrációban marhaszérum-albumint adunk. A kapott elegyhez 1 mmol/1 végkoncentrációban bisz(szukcinimidil)-szuberátot adunk, és a reakcióelegyet 60 percen keresztül hagyjuk reagálni. (A fenti kapcsolási reakció alatt a pH-t alacsony értéken tartjuk, ezáltal az adenozin aminocsoportján való kapcsolást segítjük elő a homocisztein aminocsoportjához való kapcsolódással szemben.) Az oldat protein jellegű frakcióját - amely a BSA és SAH közötti konjugátumot is tartalmazza - méret szerinti kizárásos kromatográfiás eljárással izoláljuk, Pharmacia Superose 12 oszlop alkalmazásával, az eluálást foszfáttal pufferolt sóoldattal végezzük.
b) Hibridómák kialakítása
A fenti antigénnel hibridómákat képezünk a James
W. Gooding által ismertetett eljárással (Monoclonal antibodies: Principle and practice, Academic Press, London, 1983, 3. fejezet).
c) Hibridómák szelektálása (i) Az anti-SAH-antitesteket termelő hibridómákat az alábbiak szerint azonosítjuk. A hibridómák felülúszójának IgG-tartalmát ismert ELISA-módszerrel mérjük. A felülúszót egy küvettában 50 mmol/1 foszfátot, 120 mmol/1 nátrium-kloridot és 0,1 mg/ml nyúl-IgG-t tartalmazó pufferrel (pH 7,4) elegyítjük 0,1 pmol/l egér-IgG-végkoncentrációban. A 6. példa szerint előállított fluoreszceinnel jelzett SAH-t 0,02 pmol/l végkoncentrációban hozzáadjuk. 10 percen keresztüli inkubálás után a polarizáció fokát fluoreszcenciapolarizációs egységgel felszerelt spektrofotométerrel mérjük úgy, hogy méljük
A=a fluoreszcencia intenzitását, amikor a beeső fény polarizációs síkja párhuzamos az emittált fény szűrésére használt szűrő polarizációs síkjával,
B=a fluoreszcencia intenzitását, amikor a beeső fény polarizációs síkja merőleges az emittált fény szűrésére használt szűrő polarizációs síkjával, és 494 nm gerjesztő hullámhosszot alkalmazunk, és az emittált fényt 517 nm-en detektáljuk.
A polarizáció fokát az (A-B)/(A+B) egyenlet segítségével számítjuk ki. Az alacsony polarizációs fok azt jelzi, hogy a monoklonális egérantitest nem kötődik az SAH-hoz.
(ii) Az (i) pontban leírtak szerint szelektált hibridómákból az alábbiak szerint azonosítjuk a hibridómákat, amelyek adenozinnal és/vagy homociszteinnel reagáló antitesteket termelnek. A hibridóma-felülúszóból származó monoklonális anti-SAH-antitestekkel bevonjuk a mikrotitrálólemez rezervoárjainak felületét a 9. példában alább ismertetett módon. 25 mmol/1 foszfátot, 120 mmol/1 nátrium-kloridot és 0,1 mg/ml nyúlIgG-t tartalmazó pufferben (pH 7,4) 14C-nel jelzett adenozint (vagy 14C-nel jelzett homociszteint) (gyártja az Amersham Ltd., UK) adunk a mikrotitráló rezervoárjaiba. 60 percen keresztüli inkubálás után a rezervoárokat háromszor mossuk a fenti pufferrel (amely természetesen adenozint vagy homociszteint nem tartalmaz). A rezervoárokban visszamaradó nagymértékű radioaktivitás jelzi, hogy a hibridómák maguktól adenozinhoz (vagy homociszteinhez) kötődő antitesteket termelnek. Ezeket az antitesteket nem alkalmazzuk a vizsgálatban.
(iii) Monoklonális IgG előállítása. Azokat a hibridómákat, amelyek olyan antitesteket termelnek, amelyek a fenti (i) pont szerint SAH-hoz kötődnek, de nem kötődnek adenozinhoz vagy homociszteinhez az (ii) pont szerint, monoklonális IgG-termelésre szelektáljuk. A szelektált hibridómákat alkalmazzuk aszcitesz kiváltására egérben, vagy sejttenyészetek előállítására in vitro, ismert módszerek szerint. A monoklonális antitesteket az aszciteszből vagy a sejttenyésztő közegből izoláljuk ismert eljárásokkal (lásd James W. Gooding: Monoclonal antibodies: Principle and practice, Academic Press, London, 1983).
8. példa
L-Homocisztein fluoreszcenciapolarizációs immunvizsgálata
Enzimoldat: 0,2 mg/ml nyúl-IgG-t, 120 mmol/1
NaCl-ot, 10 mmol/1 ditiotreitet, 10 egységű S-adenozil-l-homocisztein-hidrolázt és 0,1 mmol/1 adenozint tartalmazó 50 mmol/1 foszfátpuffer (pH
7,4)·
Fluoreszceinnel jelzett SAH-oldat: a 6. példa szerinti előállított, fluorszceinnel kapcsolt SAH-t 1 pmol/l végkoncentrációban oldjuk 50 mmol/1 koncentrációjú foszfátpufferben (pH 7,4), amely 125 mmol/1 NaCl-ot és 0,2 mg/ml nyúl-IgG-t tartalmaz
Antitestoldat: monoklonális anti-SAH-antitesteket (amelyek adenozinnal nem reagálnak, és előnyösen homociszteinnel sem reagálnak), amelyeket például a 7. példa szerint állítunk elő, 0,1 pmol/l végkoncentrációban oldunk 50 mmol/1 koncentrációjú foszfátpufferben (pH 7,4), amely 125 mmol/1 NaCl-ot és 0,2 mg/ml nyúl-IgG-t tartalmaz.
Vizsgálat kivitelezése
Egy küvettában 15 μΐ plazmát (először ismert homociszteintartalmú minták sorozatát) 100 μΐ enzimoldattal elegyítjük, és 15 percen keresztül 37 °C-on tartjuk. Hozzáadunk 100 μΐ fluoreszceinnel jelzett SAH-oldatot, majd 1,0 ml antitestoldatot. A polarizáció fokát a 7. példa (c) lépésének (i) részében leírtak szerint fluoreszcenciapolarizációs egységgel felszerelt spektrofotométerrel méijük, és a homociszteinkoncentráció függvényében ábrázoljuk.
A vizsgálatot a 11. és 13., vagy 15. és 17. példa szerinti jelzett haptének és antitestek alkalmazásával is végezhetjük a 6. és 7. példa szerintiek helyett.
HU 219 607 Β
9. példa
Enzimkötött immunvizsgálat mikrotitrálólemezen (a) Enzimoldat
A 8. példa szerinti enzimoldatot alkalmazzuk.
(b) Peroxidázzal jelzett SAH-oldat előállítása
0,5 mg torma-peroxidázt 1 ml tisztított vízben oldunk. Hozzáadunk 200 pl 0,02 mol/1 koncentrációjú nátrium-perjodát-oldatot, és az elegyet szobahőmérsékleten 20 percen keresztül keverjük, és 1 éjszakán keresztül 10 mmol/1 koncentrációjú nátrium-acetát-pufferrel (pH 4,4) szemben dializáljuk. 0,1 mmol/1 végkoncentrációban SAH-t adunk hozzá, és a pH-t 6,0 értékre állítjuk. Az oldatot szobahőmérsékleten 4 órán keresztül keverjük. Hozzáadunk 100 μΐ frissen készített 4 mg/ml koncentrációjú vizes nátrium-bór-hidrid-oldatot, és a reakcióelegyet 4 °C-on 2 órán keresztül inkubáljuk. A peroxidázt és annak SAH-konjugátumait méret szerinti kizárásos kromatográfiás eljárással izoláljuk Superose 6 (Pharmacia, Svédország) oszlopon.
(c) Mikrotitrálórezervoárok bevonása anti-SAH-antitestekkel
Egér-IgG ellen immunizált birkából származó poliklonális birka-IgG-t 1 mg/ml végkoncentrációban oldunk 100 mmol/1 borátpufferben (pH 9,0). A fenti oldatból 300 μΐ-t töltünk a polisztirol mikrotitrálólemez minden egyes rezervoárjába. 37 °C-on 120 percen keresztül tartó inkubálás után a rezervoárokat ötször mossuk foszfáttal pufferolt sóoldattal. Ezután a 7. példa szerint előállított monoklonális egér-IgG anti-SAH-antitesteket 50 pg/ml végkoncentrációban oldjuk foszfáttal pufferolt sóoldatban. A kapott monoklonális IgG-oldatból 200 μΐ-t adunk minden egyes rezervoárba, és 37 °C-on 120 percen keresztül inkubáljuk. A rezervoárokat ezután ötször mossuk 0,1 mg/ml nyúl-IgG-t tartalmazó, foszfáttal pufferolt sóoldattal.
(d) Vizsgálat kivitelezése pl plazmamintát (először ismert homociszteinkoncentrációjú minták sorozatát) 500 pl enzimoldattal elegyítünk, és 15 percen keresztül 37 °C-on tartjuk. Hozzáadunk 50 pl peroxidázzal jelzett SAH-oldatot, összekeveijük, és a kapott elegy 500 μΐ-ét méljük a fenti (c) lépés szerint anti-SAH-antitesttel bevont mikrotitráló minden egyes rezervoáijában, amelyeket pH 7,4re pufferoltunk. 37 °C-on 60 percen keresztüli inkubálás után a rezervoárokat háromszor mossuk 0,1 mg/ml nyúl-IgG-t tartalmazó, foszfáttal pufferolt sóoldattal. Minden egyes rezervoárba bemérünk 100 μΐ 1 mg/ml koncentrációjú, 0,015% hidrogén-peroxidot tartalmazó 0,1 mol/1 citrátpufferrel (pH 6,0) készített orto-feniléndiamin-oldatot. 10-30 perc elteltével 450 nm-en mérjük a fényabszorpciót minden egyes rezervoárban. Az abszorpciót a homocisztein koncentrációjának függvényében ábrázoljuk.
10. példa
Haptén előállítása
3-S-(l-Anhidro-D-ribofuranozil)-tio-propil-amin [(1—1) képletű vegyület] (a) aktivált, hidroxilvédett merkaptán [az E) reakcióvázlat szerinti (8) általános képletben: R] = R.2 = H] ekvivalens metil-p-D-ribofuranozidot [(1) képletű vegyületet, amely kereskedelmi forgalomban kapható] 5 ekvivalens trimetil-szilil-metánszulfonát és 1 ekvivalens bór-trifluorid-éterát elegyével reagáltatunk Jun és munkatársai módszere szerint [Carb. Rés. 163, 247-261 (1987)]. 0,5 ekvivalens 1-anhidro-D-ribózt [(2) képletű vegyületet] finomra porított formában, kis részletekben, folyamatos keverés közben aceton/kénsav elegyhez adunk, amelyet úgy állítunk elő, hogy 6,3 ml tömény kénsavat jeges fürdőn lassan hozzáadunk 100 ml frissen desztillált acetonhoz. A jeges fürdőt eltávolítjuk, és a reakciót szobahőmérsékleten 8 órán keresztül hagyjuk lejátszódni. A kapott szilárd, fehér, kristályos anyagot kloroformban oldjuk, vizes nátrium-hidroxid-oldattal, híg sósavoldattal, végül vízzel mossuk, szárítjuk és bepároljuk. Az 1-anhidro-D-ribóz 2,3-izopropilidénszármazékát [(5) képletű vegyület] kapjuk. Ennek 1 ekvivalensét és 2 ekvivalens szén-tetrabromidot vízmentes dietil-éterben oldjuk, és jégen lehűtjük. Állandó keverés közben, lassan hozzáadunk 2 ekvivalens trifenil-foszfint. A jeges fürdőt eltávolítjuk, és az elegyet szobahőmérsékletre hagyjuk melegedni. A reakció lejátszódása közben enyhe hidrogénbromid-fejlődést észlelünk. A reakció befejeződése után a reakcióelegyhez metanolt adunk. A bromidszáimazékot [(6) képletű vegyületet] szűréssel, és a szűrlet bepárlásával elválasztjuk. A bromidszármazékhoz 1 ekvivalens tiokarbamidot adunk meleg vízben oldva és rektifikált alkohollal hígítva. Az elegyet visszafolyató hűtő alatt forraljuk, és időnként alaposan összerázzuk, a műveletet a bromidszármazék oldódása után körülbelül 30 percen keresztül folytatjuk. A reakcióelegyet jégen lehűtjük, és szűrjük. A kapott szilárd anyagot lúgos vízzel kezelve a szerves fázisban kapjuk a hidroxilvédett merkaptánt [(7) képletű vegyületet]. Ezt metanolban metoxiddal kezelve aktív formává [(8) képletű vegyületté] alakítjuk. A kapott vegyületet az alábbiak szerint reagáltatjuk.
(b) 3-[S-(l-Anhidro-D-ribofuranozil)-tio]-propil-amin ekvivalens 10. példa (a) lépése szerint frissen előállított vegyületet [(8) képletű vegyület] 1 ekvivalens akrilonitrillel reagáltatva tioétert [(9) képletű vegyületet] kapunk, amelyet vízmentes dietil-éterben LíA1H4del kezelve redukálunk, majd a szabad, védőcsoport nélküli amint [(10) képletű vegyületet] vizes sósavoldattal végzett kezeléssel izoláljuk.
A megfelelő amino-propil-tioétereket, amelyekben Rj és R2 jelentése hidrogénatomtól eltérő, analóg módon eljárva állítjuk elő, kiindulási anyagként például a kereskedelmi forgalomban kapható (1) és (2) képletű vegyületek alkalmazásával.
77. példa
Jelzett haptén előállítása
A 10. példa szerinti vegyület dimetil-formamiddal készült, 50 mmol/1 koncentrációjú oldatát 0,1 mol/1 koncentrációjú hidrogén-karbonát-oldattal (pH 9,2) 1:5 térfogatarányban hígítjuk. A kapott oldathoz 12 mmol/1 végkoncentrációban fluoreszcein-izotiocianátot adunk. Szobahőmérsékleten 60 percen keresztüli inkubálás után a 10. példa szerinti vegyület fluoreszceinnel alkotott konjugátumát RPC-eljárással tisztítjuk, Kromasil
HU 219 607 Β
100 Á C-18 oszlop és 20 mmol/1 koncentrációjú ammónium-acetátból (pH 7,0) és metanolból kialakított gradienselegy alkalmazásával.
12. példa
Antigén előállítása
A 10. példa szerinti vegyület 50 mmol/1 foszfátot és 125 mmol/1 NaCl-ot tartalmazó pufferrel (pH 7,4) készült, 1 mmol/1 koncentrációjú oldatához 5 mg/ml végkoncentrációban marhaszérum-albumint (BSA) adunk. Az így kapott elegyhez bisz(szulfo-szukcinimidil)szuberátot adunk 1,2 mmol/1 végkoncentrációban, és a reakcióelegyet 60 percen keresztül hagyjuk reagálni. A protein jellegű frakciót - amely a haptén-BSA konjugátumot is tartalmazza - méret szerinti kizáráson alapuló kromatográfiás eljárással tisztítjuk, Pharmacia Superose 12 oszlopot és eluensként foszfáttal pufferolt sóoldatot alkalmazva.
13. példa
Antitest előállítása
A 10. példa szerinti vegyülettel szembeni antitesteket a 7. példa szerinti eljárással analóg módon állítjuk elő, a 12. példa szerinti antigén alkalmazásával. Azokat az antitesteket, amelyek SAH-val nem reagálnak, és adenozinnal reagálnak, nem alkalmazzuk, mivel a homociszteinnel reagáló antitestek előnyösek.
14. példa
Haptén előállítása
N-hidroxi-szukcinimidil-3-[S-(l-anhidro-D-ribofuranozil)-tio]-butanoát [(13) általános képletű vegyületben: R, = R2=HJ ekvivalens 10. példa (a) lépése szerint frissen előállított vegyületet 1 ekvivalens etil-4-bróm-butiráttal reagáltatva (11) képletű észtert kapunk. Ezt szabad savvá hidrolizáljuk lúgos hidrolízissel, vizes nátrium-hidroxid-oldat alkalmazásával dioxánban, és a védőcsoportot vizes sósavoldattal végzett kezeléssel eltávolítva kapjuk a (12) képletű szabad savat. Ennek 1 ekvivalens mennyiségét 2 ekvivalens N-hidroxi-szukcinimiddel elegyítjük jéghideg dimetil-formamidban, és állandó keverés közben hozzáadunk 1,2 ekvivalens diciklohexil-karbodiimidet. A reakciót szobahőmérsékleten 18 órán keresztül hagyjuk végbemenni, majd az elegyet hűtjük, és jéghideg dietil-étert adunk hozzá. A csapadék formájában kivált NHS-észtert [(13) képletű vegyületet] dimetil-formamid/dietil-éter elegyből átkristályosítjuk, szárítjuk, majd 4 °C-on exszikkátorban tároljuk.
Azokat a megfelelő NHS-észtereket, amelyekben Rj és R2 jelentése hidrogénatomtól eltérő, analóg módon eljárva állítjuk elő, kiindulási anyagként a kereskedelmi forgalomból beszerezhető (1) és (3) képletű vegyületek alkalmazásával.
75. példa
Jelzett haptén előállítása
A 14. példa szerinti vegyület dimetil-formamiddal készült, 50 mmol/1 koncentrációjú oldatát 0,1 mol/1 koncentrációjú hidrogén-karbonát-pufferrel (pH 9,2) 1:5 térfogatarányban hígítjuk. A kapott oldathoz 12 mmol/1 végkoncentrációban 5-(amino-acetamido)-fluoreszceint (fluoreszceinil-glicinamidot) adunk. Szobahőmérsékleten 60 percen keresztüli inkubálás után a 3-[S-(l-anhidro-D-ribofúranozil)-tio]-butánsav fluoreszceinnel alkotott konjugátumát RPC-eljárással tisztítjuk, Kromasil 100 Á C-18 oszlop és 20 mmol/1 koncentrációjú ammónium-acetátból (pH 7,0) és metanolból kialakított gradienselegy alkalmazásával.
16. példa
Antigén előállítása mg/1 koncentrációjú, 50 mmol/1 foszfátot és
125 mmol/1 NaCl-ot tartalmazó pufferrel (pH 7,4) készült BSA-oldathoz 1 mmol/1 végkoncentrációban hozzáadjuk a 14. példa szerinti vegyületet. A reakcióelegyet 60 percen keresztül hagyjuk reagálni, majd a protein jellegű frakciót - amely a BSA-haptén konjugátumot is tartalmazza - méret szerinti kizáráson alapuló kromatográfiás eljárással tisztítjuk, Pharmacia Superose 12 oszlopot és eluensként foszfáttal pufferolt sóoldatot alkalmazva.
7. példa
Antitest előállítása
A 14. példa szerinti vegyülettel szembeni antitesteket a 7. példa szerinti eljárással analóg módon állítjuk elő, a 16. példa szerinti antigén alkalmazásával. Azokat az antitesteket, amelyek SAH-val nem reagálnak, és adenozinnal reagálnak, nem alkalmazzuk, mivel a homociszteinnel reagáló antitestek előnyösek.
18. példa
Fluoreszcenciapolarizációs immunvizsgálat Enzimoldat: 4 mg/ml kazeint, 120 mmol/1
NaCl-ot és 10 egység/1 S-adenozil-1homocisztein-hidrolázt tartalmazó, 50 mmol/1 foszfátpuffer (pH 7,4).
Ditiotreit (DTT)-oldat: a ditiotreitet 50 mmol/1 koncentrációban oldjuk vízben, és pH 3,0-ra állítjuk HCl-dal.
Adenozinoldat: 1,8 mmol/1 adenozin 50 mmol/1 foszfátpufferben oldva.
Fluoreszceinnel jelzett SAH-oldat: a 6. példa szerinti előállított, fluoreszceinnel kapcsolt SAH-t tartalmazó, 50 mmol/1 koncentrációjú foszfátpuffer (pH 7,4).
Antitestoldat: monoklonális anti-SAH-antitestek (amelyeket például a 7. példa szerint állítunk elő) 0,1 pmol/l végkoncentrációban oldva 120 mmol/1 NaCl-ot és 1 mg/ml kazeint tartalmazó 50 mmol/1 koncentrációjú foszfátpufferben (pH 7,4).
Vizsgálat kivitelezése
1. lépés:
Egy küvettában 15 μΐ mintát, 10 μΐ enzimoldatot és μΐ adenozinoldatot 10 μΐ savas DTT-oldattal elegyítünk, és 15 percen keresztül 37 °C-on tartjuk.
HU 219 607 Β
2. lépés:
A küvetta tartalmához 100 μΐ fluoreszceinnel jelzett SAH-oldatot, majd 1,0 ml antitestoldatot adunk. A polarizáció fokát a 7. példa (c) lépésének (i) részében leírtak szerint fluoreszcenciapolarizációs egységgel felszerelt spektrofotométerrel mérjük, és a homociszteinkoncentráció függvényében ábrázoljuk.
19. példa
Fluoreszcenciapolarizációs immunvizsgálat Enzimoldat: 4 mg/ml kazeint, 120 mmol/1
NaCl-ot és 10 egység/1 S-adenozil-1homocisztein-hidrolázt tartalmazó, 50 mmol/1 foszfátpuffer (pH 7,4).
Ditiotreit (DTT)-oldat: a ditiotreitet 50 mmol/1 koncentrációban oldjuk vízben, és pH 3,0-ra állítjuk HCl-dal.
Fluoreszceinnel jelzett SAH-oldat/adenozinoldat:
pmol/l 6. példa szerint előállított, fluoreszceinnel kapcsolt SAH-t és 1,8 mmol/1 adenozint tartalmazó, 50 mmol/1 koncentrációjú foszfátpuffer (pH 7,4).
Antitestoldat: monoklonális anti-SAH-antitestek (amelyeket például a 7. példa szerint állítunk elő) 0,1 pmol/l végkoncentrációban oldva 120 mmol/1 NaCl-ot és 1 mg/ml kazeint tartalmazó, 50 mmol/1 koncentrációjú foszfátpufferben (pH
7,4).
Vizsgálat kivitelezése
Egy küvettában 10 μΐ plazmát, 100 μΐ enzimoldatot és 10 μΐ jelzett SAH/adenozin oldatot 30 μΐ savas DTToldattal elegyítünk, és 15 percen keresztül 37 °C-on tartjuk.
Az inkubálás befejezése után hozzáadunk 1,0 ml antitestoldatot. A polarizáció fokát a 7. példa (c) lépésének (i) részében leírtak szerint fluoreszcenciapolarizációs egységgel felszerelt spektrofotométerrel mérjük, és a homociszteinkoncentráció függvényében ábrázoljuk.
A 18. és 19. példa szerinti vizsgálatot a 11. és 13. vagy 15. és 17. példa szerinti jelzett haptének és antitestek alkalmazásával is kivitelezhetjük a 6. és 7. példa szerint előállítottak helyett.
20. példa
Lumineszcenciás vizsgálat
I. vizsgálati puffer: 1 mg/ml kazeint, 10 mmol/1 DTT-t,
0,5 mmol/1 MgCl2-ot és 30 mmol/1 KCl-ot tartalmazó, 50 mmol/1 koncentrációjú Pipes-puffer (pH 6,6).
II. vizsgálati puffer: 4 mmol/1 EDTA-t, 20 mmol/1
MgCl2-ot és 0,36 mmol/1 DTT-t tartalmazó, 40 mmol/1 koncentrációjú Hepes-puffer (pH 7,75).
III. vizsgálati puffer: 1,6 pg/ml luciferázt (Photinus pyralisból), 700 pmol/l D-luciferint, 20 mmol/1 MgCl2-ot, 4 mmol/1 EDTA-t, 0,36 mmol/1 DTT-t és 0,3 mmol/1 AMP-t tartalmazó, mmol/1 koncentrációjú Hepes-puffer (pH 7,75).
Vizsgálat kivitelezése
130 μΐ I. vizsgálati pufferhez 3 egység S-adenozilhomocisztein-hidrolázt adunk, az elegyhez 20 pl vizsgálati mintát adunk, és 15 percen keresztül 37 °C-on inkubáljuk. Ezután az I. vizsgálati pufferben 5 · 10~6 mol/1 végkoncentrációban oldott adenozint adunk az elegyhez. 5 percen keresztüli inkubálás után 0,7 · 10-5 mol/1 ATP-t és 1 milliegység adenozin-kinázt tartalmazó 750 pl
I. vizsgálati puffért adunk hozzá, és a kapott oldatot 37 °C-on további 5 percen keresztül inkubáljuk. Az oldatot 1:100 térfogatarányban hígítjuk a II. vizsgálati pufferrel, és a hígított oldat 500 μΐ-ét azonnal hozzáadjuk 500 μΐ III. vizsgálati pufferhez. AII. és III. vizsgálati puffért is szobahőmérsékleten (21 °C) ekvilibráljuk. A kialakult lumineszcenciát 550 nm-en fotométerrel mérjük.
Párhuzamos vizsgálatot végzünk S-adenozil-homocisztein-hidroláz nélkül. Klinikai vizsgálatokban a homociszteinkoncentrációkat az S-adenozil-homociszteinhidrolázzal, és a nélkül mért értékek különbségének standardgörbére történő interpolálásával számítjuk ki.
21. példa
Poliklonális antitestek előállítása
A 12. és 16. példa szerinti antigénekkel szembeni nyúl-poliklonálisantitesteket a Dako Corporation (Koppenhága, Dánia) által publikált protokoll szerint termeljük. A poliklonális IgG-t az összegyűjtött antiszérumból ugyanezen protokoll szerint tisztítjuk. A poliklonális antitesteket az adenozin- és homociszteinmaradékokkal reagáló antitestektől úgy tisztítjuk meg, hogy az antitesteket immobilizált adenozin- és homociszteinmaradékokat tartalmazó Racti-Gel oszlopon (gyártja a Pierce Chemical Company, Belgium) vezetjük át a gyártócég protokollja szerint. Az SAH-val nem reagáló antitesteket sem alkalmazzuk. A szelektált antitestek a fenti példákban ismertetett vizsgálatokban alkalmazhatók.
A homocisztein (Hcy) vizsgálatára alkalmas, alább ismertetett eljárásokban a homocisztein és az egyéb vegyületek közötti diszulfidkötéseket redukálószerrel 37 °C-on, pufferben, 5-60 percen keresztül végzett inkubálással hasítjuk. Megfelelő redukálószer a ditiotreit (DTT) 3 mmol/1 végkoncentrációban.
A homocisztein meghatározására az alábbi megfelelő enzimeket alkalmaztuk: betain-homociszteinmetil-transzferáz dimetiltetin-homocisztein metil-transzferáz metionin-szintetáz homociszteináz cisztation-p-szintetáz.
22. példa
Homocisztein meghatározása betain-homocisztein metil-transzferáz alkalmazásával A vizsgálat elve:
homocisztein+betain-> metionin+dimetil-glicin betain-homocisztein metiltranszferáz
HU 219 607 Β metionin+ATP-> S-adenozil-metionin+ metionin-ade- +pirofoszfát nozil-szintetáz
Oden és munkatársai [Biochemistry 22, 2978-2986 (1983)] szerint a metionin-adenozil-szintetáz enzim humán eritrociták citoszoljában van jelen. A citoszolpreparátumot az alábbiak szerint készítjük.
1. Metionon-adenozil-szintetáz előállítása Önkéntesekből kétszer 5 ml vérmintát veszünk Liheparin mint antikoaguláns alkalmazásával, és 1000 gvel 10 percen keresztül centrifugáljuk. A felülúszót (vérlemezkében gazdag plazma) és a fehérvérsejtek felső rétegét pipettával eltávolítjuk. A maradék 3 ml eritrocitát nagyobb centrifugacsőbe visszük át, és 30 ml jéghideg mosófolyadékot [50 mmol/1 nátrium-foszfát-puffer (pH 7,4), 50 mmol/1 NaCl] adunk hozzá, óvatosan összekeverjük, és 2500 g-vel 2 °C-on 12 percen keresztül centrifugáljuk. A felülúszót eltávolítjuk, további 30 ml mosóközeget adunk hozzá, és a centrifúgálást és újraszuszpendálást háromszor megismételjük. A mosott eritrocitákat tartalmazó végső üledéket kétszer 5 ml jéghideg vízben újraszuszpendálva, és jégen 2 órán keresztül inkubálva lizáljuk. Ezután a szuszpenziót 20 000 gvel 30 percen keresztül centrifugáljuk SW55TÍ rotorban, hogy a sejtmembránokat és törmeléket eltávolítsuk. A felülúszót 1 éjszakán keresztül 4 °C-on 3 liter 30 mmol/1 KC1 - 40 mmol/1 HEPES-pufferrel (pH 7,4) szemben dializáljuk. A végső felülúszót összegyűjtjük, és a további vizsgálatokban ezt használjuk fel.
2. Reakcióelegy előállítása
120 μΐ 10 mmol/1 ATP - 2 mmol/1 bétáin - 30 mmol/1 MgCl2 - 26 mmol/1 K.C1 - 35 mmol/1 HEPES-puffer (PH 7,5)
110 μΐ eritrocitalizátum μΐ betain-homocisztein metil-transzferáz-oldat (2250 egység/ml) μΐ szérumminta, 0-25-50, illetve 100 pmol/l hozzáadott homociszteinnel
A DTT-t 3 mmol/1 végkoncentrációban adjuk az elegyhez. A reakcióelegyet 2, 5 és 24 órás 37 °C-on végzett inkubálás után analizáljuk S-adenozil-metioninra kompetitív immunvizsgálatot alkalmazva, S-adenozil-homocisztein (SAH) elleni monoklonális antitest alkalmazásával, amely 20% keresztreaktivitást mutat S-adenozil-metioninnal szemben. Az analíziseket BSA-S-adenozil-L-homociszteinnel bevont mikrotitrálólemezen végezzük. Az egyes reakcióelegyek 25 μΐ-ét 200 μΐ 100 mmol/1 nátrium-foszfát-pufferrel (pH 7,4) készült antitestoldattal inkubáljuk 20 °C-on 20 percen keresztül. A rezervoárokban lévő folyadékot eltávolítjuk, és a rezervoárokat háromszor mossuk a legutóbb említett pufferrel, majd 20 percen keresztül inkubáljuk nyúl-antiegérantitest és torma-peroxidáz (HRP) konjugátummal. Mosás után 200 μΐ szubsztrátot (tetrametil-benzidin) adunk a rezervoárokba, és a mikrotitrálólemezeket 15 percen keresztül inkubáljuk, majd 0,8 mol/1 koncentrációjú kénsavoldat hozzáadásával a reakciót leállítjuk. A színt 450 nm-en olvassuk le mikrotitrálólemez-leolvasóban. Az eredményekből az 1. ábrán látható dózis-válasz görbét kaptuk a hozzáadott homociszteinre, 24 órás inkabálás után.
A kísérletet megismételtük úgy, hogy az ATP-koncentrációt 0,1 mmol/l-re csökkentettük. Ez alacsonyabb háttérértéket eredményezett. A 3 órás inkubálás után kapott dózis-hatás görbe a 2. ábrán látható.
A homocisztein konverziója útján keletkezett metionint mikrobiológiailag is meghatározhatjuk (lásd 27. példa).
23. példa
Homocisztein vizsgálata dimetiltetin-homocisztein metil-transzferáz alkalmazásával A vizsgálat elve:
homocisztein+dimetiltetin-> metiltetin+metionin dimetiltetin-homocisztein metil-transzferáz metionin+ATP-> S-adenozil-metionin+pirofoszfát metionin-adenoziltranszferáz
A szérummintához dimetiltetint és dimetiltetin-homocisztein metil-transzferáz enzimet adunk, és inkubáljuk. A keletkezett metionin mennyiségét metioninfuggő baktériumok szaporodási sebességének kiértékelésével, fluoreszcenciás vizsgálattal vagy immunvizsgálattal határozzuk meg.
Kísérleti módszer
1. Redukálószert [3 mmol/1 DTT vagy TCEP, 100 mmol/1 nátrium-foszfát, 0,15 mmol/ NaCl-pufferben, pH 7-9 az alkalmazott redukálószertől függően] tartalmazó 100 μΐ pufferoldathoz 50 μΐ Hcy-mintát vagy kalibrátorokat (ismert koncentrációjú Hcy-t) adunk, és az elegyet 37 °C-on 10 percen keresztül inkubáljuk.
2. Az inkubálás befejeztével hozzáadunk dimetiltetin-homocisztein metil-transzferázt tartalmazó 50 μΐ pufferoldatot (50 egység enzim, 50 mmol/1 nátriumfoszfát, 0,15 mol/1 NaCl, pH 7,5 pufferben). Az elegyet 37 °C-on 30 percen keresztül inkubáljuk [a szabad Hcy (azaz redukált Hcy) L-metioninná metileződik].
3. A 2. inkubálási lépés után metionin-adenoziltranszferázt tartalmazó 50 μΐ oldatot (50 egység enzim 50 mmol/1 nátrium-foszfát, 0,15 mol/1 NaCl, pH 7,5 pufferben, amely 100 pmol/l ATP-t, 0,5 mmol/1 KCl-ot és 0,5 mmol/1 MgCl-ot tartalmaz), és a kapott oldatot 37 °C-on 30 percen keresztül inkubáljuk [a Met S-adenozil-L-metioninná (SAM) alakul át].
4. A 3. lépésben képződött SAM mennyiségét mikrotitrálólemezen végzett enzim-immunvizsgálattal határozzuk meg az alábbiak szerint:
a) inkubálás után a minta 25 μΐ-ét átvisszük a mikrotitrálólemez marhaszérum-albumin-SAM konjugátummal (BSA-SAM) bevont rezervoárjaiba.
b) Minden egyes rezervoárba bemérünk 200 μΐ egéranti-SAM-antitestet [körülbelül 100 pg/ml, 100 mmol/1 nátrium-foszfát, 0,15 mol/1 NaCl (pH 7,5) oldatban, amely 0,1 mg/ml marha-y-globulint, 2 mg/ml BSA-t és 0,5 ml/1 Tween 20-at tartalmaz] („vizsgálati puffer”), és
HU 219 607 Β szobahőmérsékleten (18-25 °C-on) 30 percen keresztül inkubáljuk.
c) A rezervoárokat háromszor mossuk 400 μΐ mosóoldattal (1:10 arányban hígított vizsgálati puffer), majd 200 μΐ HRP-konjugált antiegérantitestet (körülbelül 1,5 pg/ml ,,stabilizálópuffer”-ben) adunk hozzá. A rezervoárokat szobahőmérsékleten 30 percen keresztül inkubáljuk, majd háromszor mossuk 400 μΐ mosóoldattal.
d) Az egyes rezervoárokba 200 μΐ HRP-szubsztrátot mérünk, és a lemezt szobahőmérsékleten 10 percen keresztül inkubáljuk.
e) A HRP-reakciót 100 μΐ 0,8 mol/l kénsav hozzáadásával leállítjuk, és kapott sárga színt 450 nm-en mérjük.
Kalibrációs módszer
A vizsgálatban alkalmazott kalibrátorokat úgy állítjuk elő, hogy kristályos L-monocisztint 10 mmol/1 nátrium-foszfát, 0,15 mol/l NaCl- (pH 7,5) oldatban ismert koncentrációban (50 pmol/l-ig, például 2, 4, 8, 20, 30 és 50 pmol/l koncentrációban) oldunk. A Hcykalibrátorok koncentrációit (log10-értékek) a mért abszorpcióértékekkel szemben ábrázolva megszerkesztjük a kalibrációs görbét, és az adatokat 4 paraméteres logisztikus egyenlet alkalmazásával illesztjük. A kapott görbét ezután az ismeretlen minták Hcy-értékeinek meghatározására alkalmazzuk az abszorpció mérése alapján.
Az 50 pmol/l-nél több szabad Hcy-t tartalmazó mintákat pufferrel (10 mmol/1 nátrium-foszfát, 0,15 mol/l NaCl, pH 7,5) hígítjuk a vizsgálat előtt.
24. példa
Homocisztein vizsgálata metionin-szintetázzal
A vizsgálat elve:
homocisztein+N5- metionin+ tetrahidrofolát > +tetrahidrofolát metionin-szintetáz Bj 2-vitamin
A szérummintához N5-tetrahidrofolátot, metioninszintetáz enzimet és B12-vitamint (kobalamint) adunk, és inkubáljuk. A képződött metionin mennyiségét metioninfuggő baktériumok szaporodási sebességének mérésével, fluoreszcenciás módszerrel vagy immunvizsgálattal határozzuk meg.
A reakcióelegy 500 pmol/l l-N5-metil-tetrahidrofolátot, 50 pmol/l ciano-kobalamint, 300 pmol/l S-adenozil-metionint, 125 mmol/12-merkapto-etanolt, metionin-szintetázt és 50 mmol/1 kálium-foszfát-puffert (pH
7,4) tartalmaz, az elegyet körülbelül 20 percen keresztül 37 °C-on inkubálva a homocisztein teljes mértékben metioninná alakul át.
25. példa
Homocisztein vizsgálata homociszteinázzal
A vizsgálat elve:
homocisztein-> 2-ketovajsav+NH3+H2S homociszteináz
Vizsgálat kivitelezése:
1. Homocisztein konverziója homociszteinázzal és a képződött H2S mérése homocisztein-> 2-ketovajsav+NH3+H2S homociszteináz
K3Fe(CN)6
H2S+N,N-dibutil--> 3,7-(N,N-dibutil-amino)1,4-fenil-diamin fenotiazin
Eljárás:
1. A plazmamintákat úgy kapjuk, hogy a vért 0,11 mol/l koncentrációjú nátrium-citrát-oldatba veszszük le, majd centrifugáljuk. Egy 9 pmol/l homociszteint tartalmazó plazmamintából négy alikvotot veszünk, és az alikvotokat 25, 50, 75 és 100 pmol/l tisztított homociszteinnel egészítjük ki.
2. Az egyes mintákból két 0,1 ml-es alikvotot adunk 0,9 ml oldathoz, amely 1 mmol/1 ditiotreitet, 0,2 mmol/1 nátrium-citrátot, 2% Triton Χ-100-at, 40 mmol/1 nátrium-borát-puffert (pH 9,0) tartalmaz. Az elegyeket 37 °C-on 60 percen keresztül inkubáljuk, hogy felszabadítsuk az összes homociszteint, amely diszulfidkötésen keresztül kapcsolódik egyéb vegyületekhez.
3. 0,06 mg/ml homociszteináz enzimet tartalmazó 10 mmol/1 kálium-foszfát-pufferrel (pH 7,6) készült oldatból 20 pl-t adunk az inkubációs elegyek egyes párjainak egyik tagjához, és pontosan 10 percen keresztül inkubáljuk 37 °C-on. Ekkor a homocisztein 2-ketovaj savvá, ammóniává és H2S-sé alakul át az enzimmel kezelt elegyekben, míg a nem kezelt elegyek képezik a vakpróbát.
4.40 pl, 6 mol/l HCl-dal készült 14,65 mg/ml koncentrációjú N,N-dibutil-l,4-fenil-diamin-hidrokloridoldatot és 20 pl 10 mmol/1 koncentrációjú kálium-foszfát-pufferrel (pH 7,6) készült 100 mmol/1 koncentrációjú K3Fe(CN)6-oldatot adunk egyidejűleg hozzá, és az oldatot gyorsan összekeverjük. Az enzim hatására keletkezett H2S hatására ekkor színes fenotiazinszármazék képződik. A reakcióelegyet 37 °C-on 10 percen keresztül inkubáljuk, majd az egyes reakcióelegyek abszorpcióját spektrofotométerben 675 nm-en mérjük, és vakpróbákkal kapott eredményeket az enzimmel kezelt mintákkal kapott eredményekből levonjuk. Az alábbi eredményeket kapjuk.
Homocisztein koncentrációja Abszorpció 675
pmol/l
25 0,036
50 0,084
75 0,130
100 0,170
Az eredményeket grafikusan ábrázolva (3. ábra) látható, hogy fennáll egy dózis-hatás összefüggés, tehát a vizsgálat alkalmas homocisztein plazmában történő meghatározására.
2. Homocisztein konverziója homociszteinázzal, és a képződött NH3 mérése homocisztein-> 2-ketovajsav+NH3+H2S homociszteináz
Na2(Fe(CN)5NO), NaOCl
NH3+fenol-> indofenolkék vegyület
Eljárás
1. A plazmamintákat úgy kapjuk, hogy a vért 0,11 mol/l koncentrációjú nátrium-citrát-oldatba vesszük
HU 219 607 Β le, majd centrifugáljuk. Egy 9 pmol/l homociszteint tartalmazó plazmamintából négy alikvotot veszünk, és az alikvotokat 25, 50, 75 és 100 pmol/l tisztított homociszteinnel egészítjük ki.
2. Az egyes mintákból két 0,1 ml-es alikvotot adunk 0,9 ml oldathoz, amely 1 mmol/1 ditiotreitet, 0,2 mmol/1 nátrium-citrátot, 2% Triton Χ-100-at, 40 mmol/1 nátrium-borát-puffert (pH 9,0) tartalmaz. Az elegyeket 37 °C-on 60 percen keresztül inkubáljuk, hogy felszabadítsuk az összes homociszteint, amely diszulfidkötésen keresztül kapcsolódik egyéb vegyületekhez.
3. 0,06 mg/ml homociszteináz enzimet tartalmazó 10 mmol/1 kálium-foszfát-pufferrel (pH 7,6) készült oldatból 20 pl-t adunk az inkubációs elegyek egyes párjainak egyik tagjához, és pontosan 10 percen keresztül inkubáljuk 37 °C-on. Ekkor a homocisztein 2-ketovajsavvá, ammóniává és H2S-sé alakul át az enzimmel kezelt elegyekben, míg a nem kezelt elegyek képezik a vakpróbát.
4. Az egyes inkubációs elegyek 350 pl-ét 50 mmol/1 NaOCl-ot és 125 mmol/1 NaOH-ot tartalmazó 350 pl és 350 pl 100 mmol/1 fenolt és 0,17 mmol/1 Na2Fe(CN)5NO-t (nitro-prusszid-nátriumot) tartalmazó oldattal elegyítjük, és az elegyet körülbelül 20 °C-on, 45 percen keresztül inkubáljuk. Az NH3-at tartalmazó mintákban kék színű indofenilvegyület keletkezik. Az egyes enzimmel kezelt elegyeket spektrofotométerben 628 nm-en a megfelelő vakpróbákkal szemben mérjük.
Az eredményeket grafikusan ábrázolva (4. ábra) látható, hogy fennáll egy dózis-hatás kapcsolat, tehát a vizsgálat homocisztein plazmában történő meghatározására alkalmas.
A homociszteinmintában lévő koncentrációjától függően az inkubációs elegy mennyiségét a 4. lépésben 50-350 pl-ig változtathatjuk, és így az inkubációs periódus 15 és 45 perc között változhat.
26. példa
Homocisztein meghatározása cisztationin-fi-szintetázzal
A vizsgálat elve:
homocisztein+szerin-> cisztationin cisztationin-p-szintetáz
A szérummintához szerint és cisztationin-P-szintetáz enzimet adunk, inkubáljuk, és a keletkezett cisztationin mennyiségét az alábbi módszerek valamelyikével meghatározzuk.
a) Cisztationin-> homoszerin+cisztein cisztationintranszszulfuráz
A cisztationin-transzszulfuráz enzimet a fenti reakcióelegyhez adjuk, inkubáljuk, és mérjük a képződött cisztein mennyiségét.
b) Cisztationin-> 2-ketovajsav+cisztein cisztationin-liáz,
B6-vitamin
A cisztationin-liáz enzimet és a B6-vitamint (piridoxál-foszfát) a fenti reakcióelegyhez adjuk, inkubáljuk, majd mérjük a képződött cisztein vagy 2-ketovajsav mennyiségét.
Vizsgálat kivitelezése: cisztein meghatározása
A fent említett módszerek valamelyikével kapott homocisztein konverziójából származó ciszteint tartalmazó 0,5 ml mintát 0,5 ml jégecettel és 0,5 ml, 25 mg/ml ninhidrint, 60% ecetsavat és 0,24 mol/1 foszforsavat tartalmazó oldattal elegyítünk. Az elegyet forró vizes fürdőn 10 percen keresztül melegítjük, és körülbelül 20 °C-ra lehűtjük. Az egyes reakcióelegyek tartalmát 5 ml-re hígítjuk 95%-os etanollal, és összekeverjük. Az abszorpciót 500 nm-en mérjük spektrofotométerben, megfelelő vakpróbával szemben, amelyben a homociszteint átalakító enzimek egyikét vagy másikát a kiindulási reakcióelegyből elhagytuk. A cisztein moláris mennyiségét egy standardgörbéből határozzuk meg, és ez közvetlenül megfelel a szérummintában eredetileg jelen lévő homocisztein moláris mennyiségének.
Vizsgálat kivitelezése: 2-ketovajsav meghatározása
a) Ketobutirát-dehidrogenáz alkalmazása
A képződött 2-ketovajsavat tartalmazó reakcióelegyhez NADH-t adunk ketobutirát-dehidrogenáz enzimmel együtt, amely az alábbi reakciót katalizálja:
2-ketobutirát+ 2-hidroxi-butirát+ +NADH * +NADH ketobutirátdehidrogenáz
Az eredményt a 340 nm-en mért abszorpció csökkenéseként olvassuk le, ami a NADH csökkenésének tulajdonítható.
b) Propionil-CoA-szintetáz alkalmazása
A képződött 2-ketovajsavat tartalmazó reakcióelegyhez NAD-ot adunk, propionil-CoA-szintetáz enzimmel együtt, amely az alábbi reakciót katalizálja:
2-ketovajsav+ propionil-CoA+ +NAD+CoASH * +NAD propionil-CoAszintetáz
Az eredményt a NADH képződésének tulajdonítható abszorpciónövekedésként mérjük 340 nm-en.
27. példa
Metionin mikrobiológiai meghatározása (a 22-24. példák szerinti vizsgálatokban alkalmazható)
E. coli 15-3 (pro-22, met F63) törzset 50 ml
Vogel-Bonner (VB) minimál tápközegben tenyésztünk, amely 0,2% glükózt, 50 pg/ml prolint, 50 pg/ml metionint és 0,001% tiamint tartalmaz. A sejteket 600 nm-en körülbelül 1,0 abszorpciós érték eléréséig tenyésztjük, majd a tenyészetet 5000 g-vel 5 percen keresztül centrifugálva összegyűjtjük sejteket. A metionint tartalmazó felülúszót elöntjük, és a sejteket 50 ml VB tápközegben újraszuszpendáljuk, és két ciklusban centrifugáljuk. A végső mosásban a sejteket 20% glicerint tartalmazó 5 ml VB tápközegben szuszpendáljuk, és -80 °C-on fagyasztva tároljuk a metionin mikrobiológiai meghatározásáig.
A reakcióelegyeket (amelyekben a homociszteinből metionin keletkezett) forró vízfürdőn tartjuk 5 percen keresztül. Ezután az egyes reakcióelegyeket centrifugacsövekbe helyezzük, és 12 000 g-vel 15 percen ke15
HU 219 607 Β resztül centrifugálva kiülepítjük a denaturált proteineket. A felülúszót alkalmazzuk ezután a metionin vizsgálatára.
A metionin mikrobiológiai vizsgálatát mikrotitrálólemezen végezzük, ahol minden egyes rezervoárba 200 pl minimáltápközeget mérünk, amely 5 χ 106 telepképző egység E. coli 15-3-at tartalmaz. A tenyésztőközeg VB sókat, 0,2% glükózt, 50 pg/ml L-prolint és 0,001% tiamint tartalmaz.
Az enzimreakcióból származó, fentiek szerint kezelt felülúszókat összesen 100 pl térfogatban mérjük a rezervoárokba, adott esetben desztillált vízzel végzett további hígítás után, a metionin koncentrációjától függően. A vakpróbát egy olyan reakcióelegyből állítjuk elő, amelyben a homociszteint metioninná történő átalakításához elengedhetetlenül szükséges enzimet vagy koszubsztrátot elhagytuk.
A mikrotitrálólemezeket 37 °C-on 30 órán keresztül inkubáljuk. A sejteket újraszuszpendáljuk, és az abszorpciót 450 nm-en méljük minden egyes rezervoárban. A vakpróba abszorpciójával csökkentett abszorpcióérték egyenesen arányos a reakcióelegyben keletkezett metionin mennyiségével. A pontos koncentrációt egy standardgörbéből határozhatjuk meg, amelyet úgy kapunk, hogy az enzimreakcióban kapott felülúszók helyett metionin ismert koncentrációit tartalmazó mintákat alkalmazunk.
28. példa
Metionin fluoreszcenciás meghatározása (a 22-24. példákban ismertetett vizsgálatokban alkalmazható) A fentiekben ismertetett enzimreakciók bármelyikében keletkezett, metionint tartalmazó elegy 100 μΐ-ét nitrogénnel átfúvatjuk, és 50 μΐ bisz(3,5,5-trimetil-ciklohexil)-ftalát hozzáadása után 37 °C-on, sötétben 10-30 percen keresztül tovább inkubáljuk, majd a reakciót 10 μΐ 4 mol/1 perklórsav hozzáadásával leállítjuk. 1 perc elteltével a savat 10 μΐ 4 mol/1 KOH-ot és 3,3 mmol/1 kálium-hidrogén-karbonátot tartalmazó oldat hozzáadásával semlegesítjük, majd centrifugálással eltávolítjuk a csapadékot.
O-ftáldialdehid (OPA-)reagenst készítünk oly módon, hogy OPA-t 56 mmol/1 koncentrációban metanolban oldjuk, és a kapott oldat 1 ml-ét 9 ml 0,1 mol/1 koncentrációjú nátrium-borát-pufferrel (pH 9,5) és 40 μΐ 2merkapto-etanollal elegyítjük.
μΐ fenti semlegesített reakcióelegyet 175 μΐ OPA-reagenssel összekeverünk. Az elegyet 23 °C-on tartjuk 2 percen keresztül, majd az elegy 220 μΐ-ét 30% metanolt tartalmazó 50 mmol/1 koncentrációjú nátrium-foszfát-pufferrel (pH 5,0) ekvilibrált ODS Hypersil oszlopra injektáljuk. Az oszlopokat ezután 30-55% metanol/foszfát puffer lineáris gradienssel (0-12 perc), majd 55-80% metanol/foszfát puffer lineáris gradienssel (12-15 perc) eluáljuk, 2 ml/perc átfolyási sebességnél. Az o-ftálaldehid adduktumai metioninnal és norvalinnal 13,5, illetve 15,5 perc retenciós időt mutatnak. A metionincsúcsot integráljuk, és standardgörbével összehasonlítva végezzük a mennyiségi meghatározást.
29. példa
Metionin meghatározása enzimatikus módszerrel
A metionin meghatározását a metionin enzimatikus átalakításával is végezhetjük az alábbiak szerint. Metionin+ATP-> S-adenozil-metionin+szervetlen pirofoszfát metionin-adenoziltranszferáz
A 22-24. példa bármelyike szerinti reakcióelegyhez ATP-t és metionon-adenozil-transzferáz enzimet adunk, és az alábbi komponenseket mérjük:
- ATP fogyása
- pirofoszfát képződése
- S-adenozil-metionin képződése
A TP meghatározása
Az ATP fogyásának meghatározására kereskedelmi forgalomban hozzáférhető készletet, például a Boehringer Mannheim cég által gyártott ATP biolumineszcenciavizsgálati készletet alkalmazhatjuk, azaz az ATP-t egy vakpróbában meghatározzuk, és összehasonlítjuk a teljes mintával/reagenseleggyel. A vizsgálat a luciferáz enzimen alapul, amely az alábbi reakciót katalizálja.
ATP+luciferin-> luciferil-adenilát+ +szervetlen pirofoszfát luciferáz
A luciferil-adenilát ezután luciferinné és AMP-vé alakul oxigén hatására, amelyet fényemisszió (biolumineszcencia) kísér, és amelyet luminométerrel vagy spektrofluorométerrel meg lehet határozni.
Szervetlen pirofoszfát meghatározása
A szervetlen pirofoszfátot (PPi) az alábbi enzimatikus átalakításokkal mérhetjük.
PPi+glükóz -> glükóz-6-foszfát+Pi glükóz-6-foszfatáz
Glükóz-6-foszfát + 6-foszfoglükonolakton+ +NADP * +NADP glükóz-6-foszfátdehidrogenáz
Tehát a reakcióelegyhez, amelyben a szervetlen pirofoszfát képződött, glükózt, NADP-t és glükóz-6foszfatáz és glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz enzimeket adva NADPH keletkezik, amelyet 340 nm-en meghatározhatunk.
S-adenozil-metionin meghatározása
Az S-adenozil-homociszteinnel szembeni Axis-antitest keresztreakciót ad S-adenozil-metioninnal, és így immobilizált S-adenozil-homociszteinnel vagy immobilizált S-adenozil-metioninnal kompetitív reakcióban alkalmazható a képződött szabad S-adenozil-metionin mennyiségének mérésére.
30. példa
Tetrahidrofolát meghatározása (amely a 24. példa szerinti meghatározásban alkalmazható)
A 24. példa szerinti meghatározásban a metionin mérése helyett úgy is eljárhatunk, hogy a tetrahidrofolátot egy ciklikus reakcióban átalakítjuk, amelynek eredmé16
HU 219 607 Β nyeként N5-metil-tetrahidrofolát keletkezik, és ezzel egyidejűleg egy molekula NADH fogy a metioninná alakult homocisztein minden egyes molekulájára. Tetrahidrofolát+ N5,N'°-metilén-tetra+szerin * hidrofolát+ +glicin
Úszóin:
tetrahidrofolát-5,10hidroxi-metil-transzferáz
N5,N10-metilén- N5-tetrahidrofolát+ tetrahidrofolát -> +NAD +NADH
N 5J4l0-metilén-tetrahidrofolát-dehidrogenáz
A 24. példa szerinti reakcióelegyhez NADH-t és Lszerin: tetrahidrofolát-5,10-hidroxi-metil-transzferáz és N5,N1 °-metil-tetrahidrofolát-dehidrogenáz enzimeket adunk. Méljük az NADH csökkenését 340 nm-en, spektrofotométerben.

Claims (38)

1. Eljárás homocisztein meghatározására valamely mintában, azzal jellemezve, hogy a mintát egy homociszteint átalakító enzimmel és az enzim legalább egy, a homociszteintől eltérő szubsztrátjával hozzuk érintkezésbe, és a reagensek vagy reakciótermékek kromatográfiás elválasztása nélkül meghatározzuk a homocisztein koszubsztrátja és a homocisztein fenti enzim általi enzimatikus átalakításának reakciótermékei közül választott, jelzetlen meghatározandó anyagot,
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a mintát a meghatározandó anyag elleni antitesttel és az antitest valamely, a jelzetlen meghatározandó anyagtól eltérő hapténjével hozzuk érintkezésbe, és a meghatározandó anyag meghatározását közvetett módon, az antitesthez kötött vagy nem kötött haptén meghatározásával hajtjuk végre.
3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hapténként egy polihaptént alkalmazunk.
4. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hapténként egy jelzett molekulát alkalmazunk, amely egy, a jelzetlen meghatározandó anyagban is jelen lévő epitóp szerkezeti egységgel rendelkezik.
5. A 2-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy antitestként monoklonális antitestet alkalmazunk.
6. A 2-5, igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy antitestként egy hordozómátrixhoz kötött antitestet alkalmazunk.
7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a mintát egy, a meghatározandó anyag átalakítására szolgáló második enzimmel is érintkezésbe hozzuk, és a meghatározandó anyag meghatározását közvetett módon, vagy a második enzim valamely, a meghatározandó anyagtól eltérő szubsztrátjának, vagy a meghatározandó anyag második enzim általi enzimatikus konverziója valamely termékének meghatározásával hajtjuk végre.
8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a meghatározandó anyag a fenti koszubsztrát.
9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az enzim az S-adenozil-homocisztein-hidroláz, és a meghatározandó anyag az adenozin.
10. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a mintát egy, a homociszteint átalakító enzimtől eltérő, adenozint átalakító enzimmel is érintkezésbe hozzuk, a meghatározandó anyag az adenozin, és az adenozin meghatározását közvetett módon, egy koszubsztrát vagy az adenozin adenozint átalakító enzim általi konverziójának valamely reakcióterméke meghatározásával hajtjuk végre.
11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az adenozint átalakító enzim az adenozin-kináz.
12. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az adenozint átalakító enzim az adenozin-dezamináz.
13. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a meghatározandó anyag a konverzió reakcióterméke.
14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az enzim az S-adenozil-homocisztein-hidroláz, és a meghatározandó anyag az S-adenozil-homocisztein.
15. Az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a minta egy diszulfidkötést hasító redukálószerrel előkezelt vér-, plazma- vagy vizeletminta.
16. Az 1-15. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a meghatározandó anyag meghatározását fotometriásan végezzük.
17. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a meghatározást spektrofotometriásán vagy kolorimetriásan végezzük.
18. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a meghatározást turbidimetriásan vagy nefelometriásan végezzük.
19. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a meghatározást fluoreszcenciapolarizációs detektálással végezzük.
20. Az 1-7., 13-17. és 19. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a meghatározandó anyag meghatározását közvetett módon, a jelzett S-adenozil-homociszteinen vagy jelzett furanóz-6-tioéteren lévő kromofor vagy fluorofor detektálásával hajtjuk végre.
21. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vér-, plazma- vagy vizeletmintát egy redukálószerrel kezeljük; a mintát S-adenozil-homocisztein-hidrolázzal hozzuk érintkezésbe; a kapott elegyet inkubáljuk, majd ATP-vel és adenozin-kinázzal hozzuk érintkezésbe, és az elegyet legalább 1 percen keresztül inkubáljuk; a kapott elegyet luciferinnel és egy luciferázzal hozzuk érintkezésbe, és a generált fényt detektáljuk.
22. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vér-, plazma- vagy vizeletmintát egy redukálószerrel kezeljük; a mintát S-adenozil-homocisztein-hidrolázzal hozzuk érintkezésbe; a kapott elegyet
HU 219 607 Β inkubáljuk, majd adenozin-dezaminázzal, nukleozidfoszforilázzal, xantin-oxidázzal és egy peroxidázzal hozzuk érintkezésbe, és meghatározzuk az elegy UVabszorpcióját.
23. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a mintát adenozinnal és egy S-adenozil-homocisztefin-hidrolázzal hozzuk érintkezésbe; a kapott elegyet inkubáljuk, majd egy fluoroforral jelzett S-adenozil-homociszteinnel vagy egy fluoroforral jelzett furaηόζ-6-tioéterrel hozzuk érintkezésbe; a kapott elegyet egy monoklonális anti-S-adenozil-homocisztein-antitesttel hozzuk érintkezésbe; és fluoreszcenciapolarizációval meghatározzuk az antitesthez kötött vagy antitesthez nem kötött, fluoroforral jelzett vegyületet, amiből a minta eredeti homociszteintartalmára következtetünk.
24. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a mintát adenozinnal és egy S-adenozil-homocisztein-hidrolázzal hozzuk érintkezésbe; a kapott elegyet inkubáljuk, majd jelzett S-adenozil-homociszteinnel vagy jelzett furanóz-6-tioéterrel hozzuk érintkezésbe; a kapott elegyet egy hordozómátrixhoz kötött monoklonális anti-S-adenozil-homocisztein-antitesttel hozzuk érintkezésbe; az antitestet hordozó mátrixot mossuk; és az antitesthez kötődött jelzett vegyületet fotometriásan meghatározzuk, amiből a minta eredeti homociszteintartalmára következtetünk.
25. A 24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az antitesthez kötődött jelzett vegyület jelzését reagáltatva kromofort állítunk elő, amelyet azután fotometriásan meghatározunk.
26. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a meghatározást az antitest/polihaptén konjugátumok precipitációjának vagy agglutinációjának meghatározásával hajtjuk végre.
27. Analitikai készlet homocisztein meghatározására egy mintában az 1. igénypont szerinti eljárással, amely készlet tartalmaz
- egy homociszteint konvertáló enzimet,
- az enzim valamely homociszteintől eltérő szubsztrátját az enzim által katalizált homociszteint átalakító reakcióhoz,
- egy jelképző szert, és
- adott esetben a jel mérésére alkalmas eszközt.
28. A 27. igénypont szerinti készlet, amely homociszteint konvertáló enzimként S-adenozil-homocisztein-hidrolázt; az enzim számára jelképző szubsztrátként jelzett S-adenozil-homociszteint; egy adott esetben hordozómátrixhoz kötött anti-S-adenozil-homocisztein-antitestet; és adott esetben a jel mérésére alkalmas eszközként a minta homociszteintartalmának kimutatására a jelzett S-adenozil-homocisztein vagy annak detektálható származéka fotometriás meghatározására alkalmas eszközt tartalmaz.
29. A 27. igénypont szerinti készlet, amely homociszteint konvertáló enzimként S-adenozil-homocisztein-hidrolázt; az enzim számára szubsztrátként adenozint; egy, az S-adenozil-homocisztein-hidroláztól eltérő, adenozint átalakító enzimet; adott esetben az adenozint átalakító enzim számára egy adenozinkoszubsztrátot; és a jel mérésére alkalmas eszközként az adenozin adenozint átalakító enzim általi enzimatikus konverziójának valamely termékéből vagy a koszubsztrátból származó, fotometriásan detektálható válasz képzésére alkalmas eszközt tartalmaz.
30. A 29. igénypont szerinti készlet, amelyben az adenozint átalakító enzim az adenozin-kináz, és a válasz képzésére alkalmas eszköz az ATP, a luciferin és egy luciferáz.
31. A 29. igénypont szerinti készlet, amelyben az adenozint átalakító enzim az adenozin-dezamináz, és a válasz képzésére alkalmas eszköz a nukleozid-foszforiláz, xantin-oxidáz és egy peroxidáz.
32. A 27. igénypont szerinti készlet, amely homociszteint konvertáló enzimként S-adenozil-homocisztein-hidrolázt; az enzim szubsztrátjaként adenozint; egy adott esetben mátrixrészecskéhez kötött anti-S-adenozil-homocisztein-antitestet; az antitesttel számára egy polihaptént; és adott esetben a jel meghatározására alkalmas eszközként az antitest/polihaptén komplexek agglutinációjának vagy precipitációjának fotometriás meghatározására szolgáló eszközt tartalmaz.
33. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hapténként egy (I) általános képletű vegyületet a képletben
R] és R2 azonos vagy eltérő, és hidrogénatomot vagy -OR4 csoportot jelent, vagy
R] és R2 együtt oxigénatomot jelent,
R3 jelentése amino- vagy karboxilcsoport, és R4 jelentése 1-6 szénatomos alifás csoport vagy annak egy sóját vagy észterét alkalmazunk.
34. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hapténként egy jelzett furanóz-6-tioétert alkalmazunk, amelyben a jelzett maradék egy kromofort vagy fluorofort vagy radioaktív atomot, és a tioéter-maradék egy trimetilén-tio-maradékot foglal magában.
35. A 34. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy jelzett tioéterként egy 33. igénypontban megadott (I) általános képletű jelzett vegyületet alkalmazunk.
36. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy enzimként inaktivált SAH-hidrolázt alkalmazunk, amelyet redukálószenei érintkezésbe hozva aktiválunk.
37. A 27. igénypont szerinti készlet, amely egy első rekeszében inaktív SAH-hidrolázt, és egy második rekeszében egy redukálószert tartalmaz, a két rekesz tartalmának összekeverésével aktivált SAH-hidroláz előállítására.
38. A 37. igénypont szerinti készlet, amely második rekeszében ditiotreitet tartalmaz savas közegben.
HU9402170A 1992-01-22 1993-01-22 Homocisztein vizsgálati eljárás és analitikai készlet HU219607B (hu)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NO920282A NO920282D0 (no) 1992-01-22 1992-01-22 Fremgangsmaate ved proeving av cystein
US83311892A 1992-02-10 1992-02-10
GB929204922A GB9204922D0 (en) 1992-03-06 1992-03-06 Assay
PCT/GB1993/000138 WO1993015220A1 (en) 1992-01-22 1993-01-22 Homocysteine assay

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9402170D0 HU9402170D0 (en) 1994-09-28
HUT67550A HUT67550A (en) 1995-04-28
HU219607B true HU219607B (hu) 2001-05-28

Family

ID=27266081

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9402170A HU219607B (hu) 1992-01-22 1993-01-22 Homocisztein vizsgálati eljárás és analitikai készlet

Country Status (18)

Country Link
EP (2) EP0726322B2 (hu)
JP (1) JP2870704B2 (hu)
AT (2) ATE237696T1 (hu)
AU (1) AU676480B2 (hu)
BR (1) BR9305780A (hu)
CA (1) CA2128512C (hu)
CZ (1) CZ287334B6 (hu)
DE (2) DE69304511T2 (hu)
DK (2) DK0726322T4 (hu)
ES (2) ES2094524T3 (hu)
FI (1) FI106728B (hu)
GR (1) GR3021365T3 (hu)
HU (1) HU219607B (hu)
NO (1) NO314946B1 (hu)
PT (1) PT726322E (hu)
RU (1) RU2121001C1 (hu)
SK (1) SK281517B6 (hu)
WO (1) WO1993015220A1 (hu)

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5478729A (en) * 1994-04-28 1995-12-26 Syntex (U.S.A.) Inc. Immunoassay for homocysteine
GB9617683D0 (en) * 1996-08-23 1996-10-02 Univ Glasgow Homocysteine desulphurase
DE19713088C1 (de) * 1997-03-27 1998-11-26 Reiner Dr Probst Verfahren und Blutabnahmegefäß zur Aufbereitung von Blutproben für die Homocystein- und/oder Folatbestimmung
AU8153098A (en) * 1997-06-23 1999-01-04 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Homocysteine assay
US6140102A (en) * 1997-07-24 2000-10-31 Anticancer, Inc. High specificity homocysteinases and genes therefor
US6468762B1 (en) 1997-07-24 2002-10-22 Anticancer, Inc. High specificity homocysteinases
US5985540A (en) * 1997-07-24 1999-11-16 Anticancer, Inc. High specificity homocysteine assays for biological samples
US6066467A (en) * 1997-07-24 2000-05-23 Anticancer, Inc. High specificity homocysteine assays for biological samples
WO2000000821A1 (en) 1998-06-29 2000-01-06 Ullman Edwin F Assay for homocysteine
GB9900159D0 (en) * 1999-01-05 1999-02-24 Axis Biochemicals Asa Assay
AU2404500A (en) * 1999-01-08 2000-07-24 Medical Analysis Systems, Inc. Compositions and methods for stabilizing thiol-containing biomolecules
ATE380253T1 (de) 1999-02-01 2007-12-15 Anticancer Inc Homogene enzymatische bestimmungsmethode für vitamin b6
US7192729B2 (en) 1999-07-06 2007-03-20 General Atomics Methods for assaying homocysteine
US6376210B1 (en) 1999-07-06 2002-04-23 General Atomics Methods and compositions for assaying analytes
CA2377665A1 (en) * 1999-07-06 2001-01-11 General Atomics Methods and compositions for assaying analytes
GB0008784D0 (en) * 2000-04-10 2000-05-31 Axis Shield Plc Assay
US6610504B1 (en) 2000-04-10 2003-08-26 General Atomics Methods of determining SAM-dependent methyltransferase activity using a mutant SAH hydrolase
EP1849875B1 (en) 2000-06-30 2008-11-19 Alfresa Pharma Corporation Method for determining total homocysteine
CA2514877A1 (en) * 2003-01-30 2004-08-12 Bellbrook Labs, Llc Assay method for group transfer reactions
JP2006149203A (ja) * 2003-02-19 2006-06-15 Alfresa Pharma Corp ホモシステインの測定方法
US7097968B2 (en) * 2003-07-10 2006-08-29 General Atomics Methods and compositions for assaying homocysteine
US8476034B2 (en) 2003-07-10 2013-07-02 General Atomics Methods and compositions for assaying homocysteine
US7384760B2 (en) 2004-04-30 2008-06-10 General Atomics Methods for assaying inhibitors of S-adenosylhomocysteine (SAH) hydrolase and S-adenosylmethionine (SAM)-dependent methyltransferase
GB0503836D0 (en) * 2005-02-24 2005-04-06 Axis Shield Asa Method
JP2007170992A (ja) * 2005-12-22 2007-07-05 Abbott Japan Co Ltd ホモシステインの免疫学的測定方法
JP5803104B2 (ja) * 2010-12-28 2015-11-04 東ソー株式会社 安定化されたｓ−アデノシルホモシステイン加水分解酵素調製物
JP6056138B2 (ja) 2010-12-28 2017-01-11 東ソー株式会社 免疫学的測定方法
JP5919914B2 (ja) * 2012-03-15 2016-05-18 東ソー株式会社 ホモシステイン測定用前処理試薬

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5811857A (ja) * 1981-07-15 1983-01-22 Yamasa Shoyu Co Ltd アデノシンの定量法
JPS6030679A (ja) * 1983-07-29 1985-02-16 Nippon Zeon Co Ltd Ｓ−アデノシル−ｌ−ホモシステインハイドロラ−ゼの製造法

Also Published As

Publication number Publication date
ES2094524T3 (es) 1997-01-16
EP0726322B2 (en) 2011-12-07
RU2121001C1 (ru) 1998-10-27
ATE142271T1 (de) 1996-09-15
JP2870704B2 (ja) 1999-03-17
FI943462A (fi) 1994-09-14
CA2128512A1 (en) 1993-08-05
CZ176394A3 (en) 1994-12-15
ATE237696T1 (de) 2003-05-15
NO314946B1 (no) 2003-06-16
DE69304511D1 (de) 1996-10-10
FI106728B (fi) 2001-03-30
EP0623174B1 (en) 1996-09-04
EP0726322A1 (en) 1996-08-14
DE69332891D1 (de) 2003-05-22
DK0726322T4 (da) 2012-03-19
EP0623174A1 (en) 1994-11-09
GR3021365T3 (en) 1997-01-31
SK281517B6 (sk) 2001-04-09
HU9402170D0 (en) 1994-09-28
AU676480B2 (en) 1997-03-13
RU94038061A (ru) 1996-05-27
FI943462A0 (fi) 1994-07-21
NO942729D0 (no) 1994-07-21
JPH08506478A (ja) 1996-07-16
DE69332891T2 (de) 2004-02-19
CZ287334B6 (en) 2000-10-11
DE69304511T2 (de) 1997-01-23
DE69332891T3 (de) 2012-06-14
CA2128512C (en) 1999-12-07
WO1993015220A1 (en) 1993-08-05
EP0726322B1 (en) 2003-04-16
ES2196116T3 (es) 2003-12-16
HUT67550A (en) 1995-04-28
BR9305780A (pt) 1997-02-18
AU4340893A (en) 1993-09-01
SK87894A3 (en) 1995-04-12
ES2196116T5 (es) 2012-04-11
NO942729L (no) 1994-09-15
PT726322E (pt) 2003-09-30
DK0726322T3 (da) 2003-07-28
DK0623174T3 (da) 1997-01-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5958717A (en) Immunoassay for homocysteine
HU219607B (hu) Homocisztein vizsgálati eljárás és analitikai készlet
EP1644741B1 (en) Methods and compositions for assaying homocysteine
US4380580A (en) Heterogenous chemiluminescent specific binding assay
US8476034B2 (en) Methods and compositions for assaying homocysteine
US5885767A (en) Methods and compositions for quantitating L-homocysteine and/or l-methionine in a solution
US4834918A (en) Process and reagent for increasing the quantum yield in chemiluminescent reactions
CN112595851B (zh) 一种强稳定性的同型半胱氨酸测定试剂盒及其制备方法
Ferrari et al. A spectrophotometric assay for phosphoribosylpyrophosphate synthetase
JPH0220297A (ja) コリンエステラーゼ活性の定量法及び定量用試薬