NO314946B1 - Fremgangsmåte og analysesett for analyse av homocystein - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte og et analysesett for analyse av homocystein i kliniske prøver.

Homocystein er en aminosyre som fremstilles som mellomprodukt når metionin metaboliseres til cystein. Vanligvis blir homocystein som fremstilles i kroppen raskt metabolisert på én av to måter, (1) kondensasjon med serin under dannelse av cystation eller (2) omdanning til metionin, og dets konsentrasjon (og konsentrasjonen av dets oksyderte form homocystein) i den levende organisme under vanlige betingelser er praktisk talt neglisjerbar.

Homocysteininnholdet i biologiske prøver kan imidlertid være av klinisk betydning i flere situasjoner, ettersom homocystein spiller en viktig rolle i det komplekse sett av mekanismer som utgjør sulfhydrylaminosyremetabolismen, og dets akkumulering kan være en indikasjon på forskjellige forstyrrelser som foregår i disse mekanismer, innbefattet særlig medfødte metabolismefeil. F.eks. er homocysteinuria (en unormal oppbygging av homocystein i urinen) således kjent for å være en forstyrrelse av aminosyremetabolismen som skriver seg fra mangel på enzymene cystation (3-syntetase eller metyltetrahydrofolsyre-metyltransferase (som katalyserer metyleringen av homocystein til metionin).

Sulfhydrylaminosyremetabolismen henger nært sammen med den for folsyre og vitamin B12 (kobalamin), som virker som substrater eller ko-faktorer i de forskjellige involverte transformasjoner. Av denne grunn er også homocystein-akkumuleringen blitt foreslått som en indikator på funksjonsfeil hos kobalamin-eller folatavhengige enzymer, eller andre forstyrrelser eller sykdommer i forbindelse med kobalamin- eller folatmetabolismen.

Siden homocysteinomdanningen til metionin beror på en reaksjon som krever S-metyltetrahydrofolat som metyldonor, kan homocysteinmetabolismen dessuten også påvirkes av anti-folatmedikamenter, som f.eks. metotreksat, administrert for å bekjempe andre forstyrrelser, særlig kreft. Overvåking av homocystein har derfor også vært foreslått til bekjempelse av ondartede sykdommer med anti-folatmedikamenter.

Nylig har forhøyet nivå av homocystein i blodet blitt korrelert med utviklingen av aterosklerose (se Clarke et al., New Eng. J. Med. 324:1149-1155

(1991)) og endog moderat homocysteinemi blir nu ansett som en risikofaktor for hjerte- og karsykdommer. Måling av plasma- eller blodinnholdet av homocystein er således også av viktighet ved diagnose og behandling av karsykdommer.

Selv om immunologiske metoder til direkte bestemmelse av homocystein ikke er tilgjengelig etter som det ikke er noe tilgjengelig antistoff for homocystein, er det blitt foreslått flere andre metoder til bestemmelse av homocystein i kliniske prøver. Disse har alle involvert kromatografiske separasjoner og har vanligvis vært basert på én av de tre følgende prinsipper:

(1) klassisk kromatografisk aminosyreanalyse,

(2) omsetning av homocystein i prøven med enzymet S-adenosyl-L-homocysteinhydrolase i nærvær av et radioaktivt eller på annen måte merket S-adenosin ko-substrat etterfulgt av separasjon og kvantifisering av det dannede produkt (S-adenosyl-L-homocystein, SAH). Generelt anvendes kromatografisk separasjon (HPLC eller TLC) og radioaktivitetsmålinger (se Refsum et al.. Clin. Chem. 31:624-628 (1985); Kredich et al., Anal. Biochem 116:503-510 (1981); Chui, Am. J. Clin. Path. 90(4):446-449 (1988); Totani et al., Biochem. Soc. !4(6):1172-9 (1988); og Schimizu et al., Biotechnol. App. Biochem 8:153-159

(1986)) (3) omsetning av homocystein i prøven med en fluorofor, etterfulgt av HPLC-separasjon og fluorimetri (se Refsum et al., Clin. Chem. 35(9); 1921-1927 (1989)). US 460 9626 beskriver en metode for å produsere S-adenosyl-L-homocysteinhydrolase, mens EP 070033 vedrører en kvantitativ bestemmelse av adenosin. H.U. Bergmeyer (Ed.), Methods of Enzymatic Analysis, 1985, 3. utg., vol. VII, s. 110-117, beskriver nukleosidet adenosin og analysemetoder for adenosin. H.U. Bergmeyer (Ed.) supra, s. 357-364, vedrører S-adenosyl-homocystein og en analyse som benytter radioaktivt merket SAH. Disse fremgangsmåter er tidskrevende og omstendelige å gjennomføre, og alle beror på direkte kvantifisering. Nærmere bestemt er kromatografisk separasjon et vanlig trekk i fremgangsmåtene ifølge tidligere teknologi, og krever høyt spesialisert og sofistikert utstyr. Anvendelsen av slikt utstyr blir vanligvis ikke vel akseptert i rutineklinisk laboratoriepraksis, og slike fremgangsmåter er derfor ikke vanligvis mottagelige for automasjon i typiske kliniske laboratoriefremgangsmåter. Det er derfor et behov for en forbedret analyse for homocystein som er enkel, spesifikk, rask og gjennomføre, og som lett kan tilpasses for anvendelse i kliniske laboratorier, og som fremfor alt unngår behovet for kostbar og tidskrevende kromatografisk separasjon. Den foreliggende oppfinnelse søker å tilveiebringe en slik analyse. I ett trekk ifølge den foreliggende oppfinnelse tilveiebringes derfor en fremgangsmåte for analyse av homocystein i en prøve, idet nevnte fremgangsmåte omfatter trinn for å bringe prøven i kontakt med et homocysteinomdannende enzym, f.eks. en S-adenosyl-homocystein (SAH) hydrolase, og minst ett substrat for nevnte enzym forskjellig fra homocystein, og uten kromatografisk separasjon (dvs. av reagenser eller reaksjonsprodukter) for å bestemme (fortrinnsvis fotometrisk) en ikke-merket analytt valgt fra homocystein-ko-substratet og homocystein-omdanningsproduktene av den enzymatiske omdanning av homocystein med nevnte enzym. Etter å ha brakt prøven i kontakt med det homocystein-omdannende enzym og substratet, blir den fortrinnsvis inkubert i minst 30 sekunder, særlig minst 5 min. før gjennomføring av de påfølgende trinn av analysen. I et annet trekk ifølge den foreliggende oppfinnelse, tilveiebringes et analysesett for anvendelse ved analyse av homocystein i en prøve ved en fremgangsmåte ifølge krav 1, hvor nevnte sett omfatter: et homocysteinomdannende enzym; et substrat forskjellig fra homocystein for homocysteinomdannings-reaksjonen katalysert av nevnte enzym; et signaldannende middel; og eventuelt en anordning for signalbestemmelse. Det homocystein-omdannende enzym som anvendes i analysen ifølge denne oppfinnelsen, er særlig fortrinnsvis SAH-hydrolase, men andre enzymer kan også anvendes. Således kan f.eks. nevnes betain-homocysteinmetyl-transferase og andre enzymer involvert i homocysteinomdanning, (som beskrevet f.eks. av Graham i Trends Cardiovasc. Med. 1: 244-249 (1991)). Det homocystein-ko-substrat som bestemmes i fremgangsmåten ifølge denne oppfinnelse, er en forbindelse som reagerer med homocystein i den enzymkatalyserte, f.eks. en SAH-hydrolasekatalysert, homocysteinomdannings-reaksjon. Som anvendt heri skal betegnelsen "å analysere" eller "å bestemme" være ment å innbefatte både kvantitativt og kvalitativ bestemmelse i betydningen av å oppnå en absolutt verdi for mengden eller konsentrasjonen av analytten, f.eks. homocystein-ko-substrat som er tilstede i prøven, og også å oppnå en indeks, et forhold, en prosentsats, en visuell eller annen verdi som er en indikasjon på innholdet av analytt i prøven. Bestemmelsen kan være direkte eller indirekte, og de kjemiske forbindelser som i virkeligheten påvises behøver naturligvis ikke å være selve analytten, men kan f.eks. være et derivat derav, eller ytterligere en substans som diskutert nedenfor. Analysen ifølge denne oppfinnelsen anvender hensiktsmessig enten enzymatiske eller immunologiske teknikker for analyttbestemmelse. I én foretrukket enzymatisk teknikk bringes analytten i kontakt med et ytterligere enzym som den er et substrat for, og enten et ko-substrat eller et direkte eller indirekte reaksjonsprodukt av den enzymatiske omdanning av analytten ved dette ytterligere enzym blir bestemt. I en foretrukket immunologisk teknikk bestemmes analytten ved anvendelse av en fremgangsmåte som involverer konkurrerende binding til et antistoff av analytten og et ytterligere hapten (f.eks. et polyhapten eller en merket analog av analytten) og bestemmelse av det bundede eller ikke-bundede hapten. Det foretrukne homocysteinomdannende enzym som anvendes ifølge denne oppfinnelse, er S-adenosyl-homocysteinhydrolase (SAH-hydrolase) som katalyserer homocysteinreaksjonen

adenosin + homocystein * S-adenosyl-homocystein ;(SAH) ;en reaksjon som haren likevektskonstant K på 10<6>M"<1>. ;Reaksjonen kan gå i begge retninger, avhengig av reaksjonsbetingelsene, reaktantenes konsentrasjon osv.. ;I skjemaet ovenfor vil adenosin være homocystein-ko-substratet. Andre ko-substrater som f.eks. adenosinanaloger eller beslektede forbindelser kan imidlertid anvendes i analysemetoden ifølge oppfinnelsen. ;Analysen ifølge denne oppfinnelsen kan ha særlig fordel av det faktum at homocystein virker som inhibitor for SAH-hydrolase, og undertrykker hydrolyse-reaksjonen som danner homocystein og adenosin og påvirker reaksjonslikevekten ;til fordel for SAH-syntese. ;Mengden av homocystein i en prøve vil således indirekte påvirke dannelsen eller forbruket av homocystein-ko-substratet, f.eks. adenosin, av SAH-hydrolase og derved dets resulterende konsentrasjon i reaksjonsblandingen. I denne oppfinnelse kan den resulterende konsentrasjonen, eller forandringen i konsentrasjonen av homocystein-ko-substratet, f.eks. adenosin, i reaksjonsblandingen anvendes som en indikator for den opprinnelige konsentrasjon av homocystein i prøven. Hvor analytten er ko-substratet vil analysen ifølge denne oppfinnelse således adskille seg fra metoder ifølge tidligere teknologi ved at homocystein, istedenfor å bestemmes direkte, blir bestemt indirekte ved å bestemme konsentrasjonen av dets ko-substrat i sin enzymkatalyserte omdanning. Dette har den direkte fordel at påvisningsmetodene som er egnet for typiske kliniske laboratoriefremgangsmåter, men som ikke lot seg anvende i analyser for homocystein ifølge tidligere teknologi, f.eks. fotometriske metoder, kan anvendes, og således gjøre analysen ifølge denne oppfinnelse særlig egnet for rutineklinisk anvendelse. ;I den foretrukne analysemetode ifølge denne oppfinnelse kan SAH-hydrolase-reaksjonen anvendes i begge retninger. Dersom således testprøven bringes i kontakt med adenosin og SAH-hydrolase, forbrukes en mengde adenosin som tilsvarer den mengde homocystein som forbrukes, og mengden av homocystein i prøven kan således bestemmes ut i fra forandringen i adenosinkonsentrasjonen. Adenosinanaloger og/eller adenosindannende forbindelser kan anvendes istedenfor adenosin selv. ;I andre foretrukne utførelser av denne oppfinnelse kan det anvendes den motsatte retningen av reaksjonen. Testprøven kan bringes i kontakt med SAH (vanligvis i overskudd) og SAH-hydrolase. Homocystein og adenosin blir deretter dannet ved hydrolyse av SAH. Eventuelt homocystein som er tilstede i testprøven vil motvirke denne nettoreaksjon, og således inhibere dannelsen av adenosin, hvis mengde blir overvåket. ;De SAH-hydrolasesubstrater som anvendes i fremgangsmåten ifølge denne oppfinnelse, kan således være SAH eller adenosin eller analoger og forløpere derav. ;Mange enzymer er involvert i den komplekse serie av mekanismer av sulfhydrylaminosyremetabolismen og transmetyleringsreaksjonene i kroppen. Disse mekanismer og reaksjoner er alle blitt vel studert, og de regulatoriske roller for de aktuelle enzymer undersøkt. Rollen til ett slikt enzym, SAH-hydrolase, er diskutert i en oversikt av Ueland i Pharmacological Reviews 34: 223-253 (1982). Trewyn et al., i J. Biochem. Biophys. Met. 4: 299-307 (1981), beskriver en under-søkelse av den regulatoriske rolle til SAH-hydrolase, og tilveiebringer en analyse for SAH-hydrolase enzymatisk aktivitet. Garras et al. i Analytical Biochem. 199: 112-118 (1991) beskriver andre homocysteinreaksjonsmekanismer, og tilveiebringer særlig en analyse for den metioninsyntasemedierte omdanning av homocystein. Som tidligere nevnt beskriver Graham (Supra) ytterligere enzym-medierte homocysteinomdanninger. Ko-substratene og omdanningsproduktene av disse forskjellige reaksjoner kan anvendes som analytter i analysen ifølge denne oppfinnelse, særlig hvor det anvendes en immunologisk bestemmelses-måte. ;Kliniske prøver som skal analyseres ifølge denne oppfinnelse, kan avledes fra en hvilken som helst biologisk væske eller vevsekstrakt, og kan forbehandles før analysen. Vanligvis vil det imidlertid bli anvendt plasma- eller urinprøver. ;I plasmaet eller urin kan signifikante andeler av det tilstedeværende homocystein være bundet ved disulfidbinding til sirkulerende proteiner, som f.eks. albumin, og homocystein kan også være tilstede i form av andre disulfidderivater (vanligvis homocystein - cysteinkonjugater). For å oppnå et estimat av totalt homocystein tilstede i prøven, kan det derfor være ønskelig å behandle prøven med et reduksjonsmiddel for å spalte disulfidbindingene og frigjøre fritt homocystein. ;Disulfider lar seg lett og spesifikt redusere med tioler (f.eks. ditiotreitol (DTT), ditioerytritol (DTE), 2-merkapto-etanol, cystein-tioglykolat, tioglykolsyre, glutation o.l. forbindelser. Direkte kjemisk reduksjon kan oppnås ved anvendelse av borhydrider) f.eks. natriumborhydrid) eller amalgamer (f.eks. natriumamalgam) eller det kan anvendes mer spesialiserte reagenser som f.eks. fosfiner eller fosforttoater. Det er gitt en oversikt over disulfidreduksjon av Jocelyn i Methods of Enzymology 143: 243-256 (1987) hvor det er oppført et bredt område av egnede reduksjonsmidler. ;Adenosin eller de andre homocystein-ko-substrater kan bestemmes ved kjente metoder. Generelt foretrekkes metoder som beror på fotometrisk (f.eks. kolorimetrisk, spektrofotometrisk eller fluorometrisk) påvisning og immunologiske metoder, ettersom disse særlig lett kan tilpasses for anvendelse i kliniske laboratorier. Fremgangsmåter basert på enzymreaksjon eller reaksjon med mono-eller polyklonale antistoffer blir særlig foretrukket, ettersom disse er enkle og raske og kan gjennomføres relativt billig. Således kan f.eks. analytten bestemmes ved overvåking av reaksjonen med enzymer som omdanner den direkte eller indirekte til produkter som kan påvises fotometrisk, f.eks. spektrofotometrisk. Egnede enzymer som naturligvis burde være ikke-reaktive med de andre substrater av det homocysteinomdannende enzym, særlig homocystein, omfatter adenosindeaminase (som omdanner adenosin til inosin) og adenosinkinase (som omdanner adenosin og ATP til ADP og fosforylert adenosin). Slike enzymer kan videre kombineres med andre enzymer som virker til å omdanne de dannede produkter til ytterligere påvisbare produkter. ;Eksempler på immunologiske fremgangsmåter ville innbefatte metoder som involverer reaksjon av analytten med antistoffer som er spesifikke for denne og som enten selv er påvisbare eller som kan reageres videre under dannelse av påvisbare produkter, f.eks. i en sandwich-analyse. En særlig attraktiv immunologisk fremgangsmåte involverer imidlertid anvendelse av en fluoroformerket analog av analytten, fortrinnsvis et ko-substrat, f.eks. fluoresceinmerket adenosin - dette og den umerkede analytt kan bringes i kontakt med et antistoff for analytten. Dersom det resulterende produkt blir underkastet en fluorescenspolarisasjonsanalyse ved anvendelse av polarisert eksiterende stråling kan det deretter avledes en indikasjon på den umerkede analyttkonsentrasjon ut i fra graden av depolarisasjon av fluorescensstrålingen. Adenosinantistoffer er kommersielt tilgjengelige (f.eks. fra Paessel & Lorei GmbH, Frankfurt, Tyskland og Serotech Ltd., Oxford, UK) og fluorescenspolarisasjonsimmunoassay (FPIA) teknikker er vel etablert (se f.eks. US-A-4420568 og US-A-4593089 og andre publikasjoner fra Abbott Laboratories vedrørende deres TDx-teknologi). ;Eksempler på påvisningsskjema som kan anvendes i analysen ifølge denne oppfinnelse, omfatter således sammen med en konkurrerende chemiluminescerende ATP-reaksjon, f.eks. ;eller med et fluorformerket adenosin som konkurrerer om ATP/adenosinkinasen, hvor bestemmelsen blir gjennomført ved måling av fluorescenspolarisasjonen. ;Når det gjelder skjema (2) og (3) har inosin og urinsyre klare UV-absorpsjonsegenskaper, og kan således overvåkes spektrofotometrisk ved ;kinetiske målinger. ;Anvendelsen av UV-påvisning av urinsyre eller inosin har imidlertid visse begrensninger ved at følsomheten av fremgangsmåten er ganske dårlig og at den krever en UV-lyskilde og en UV-transparent prøvebeholder. Det kan således være mer beleilig å stole på kolorimetrisk påvisning eller elektroniske sensorer, og slike fremgangsmåter, særlig kolorimetri, blir vanligvis foretrukket i kliniske laboratorier. ;I denne forbindelse er reaksjonen i skjema (2) særlig anvendelig ved at ammoniakk som dannes ved adenosindeaminasereaksjonen lett kan påvises ved anvendelse av kjente kolorimetriske teknikker. Således kan f.eks. ammoniakk som dannes i prøven, omsettes under dannelse av fargede produkter hvis dannelse kan påvises spektrofotometrisk. En slik fremgangsmåte, beskrevet i Methods of Enzymatic Analyses (Bergmeyer) volum 1:1049-1056 (1970) beror på omsetningen av ammoniakk med fenol i nærvær av hypokloritt under alkaliske betingelser under dannelse av fargestoffet indofenol: ;Natriumnitroprussid kan anvendes som katalysator. Modifikasjoner av fremgangsmåten ved anvendelse av f.eks. forskjellige derivater av fenol kan også anvendes. ;Det fargede sluttprodukt blir dannet i mengder som er direkte proporsjonale med konsentrasjonen av ammoniakk, og følgelig adenosin, i prøven. ;I skjema (3) vil xantinoksydasereaksjonen egne seg til påvisning ved anvendelse av fluorogener eller kromogener, f.eks. red-oksindikatorer, ved bestemmelse av reduksjons-/oksydasjonspotensialet, eller ved måling av 02-forbruket, eller nærmere bestemt H202-dannelsen, f.eks. ved anvendelse av elektroniske sensorer. Flere red-oksindikatorer kan anvendes for dette formål, og et bredt område av fremgangsmåter er beskrevet i litteraturen for bestemmelse av H202 og 02 i løsning. I virkeligheten blir H202 hyppig påvist i kliniske analyser. ;Hensiktsmessige red-oksindikatorer omfatter metylenblått, 2,6-diklorfenol, indofenol og de forskjellige red-oksindikatorer som er oppført i tabell 1 i the Kodak Laboratory & Research Products, katalog nr. 53, selv om andre naturligvis kan anvendes. Enzymer med peroksydaseaktivitet, f.eks. pepperrotperoksydase, kan tilsettes for å lette red-oksreaksjonene. ;Dersom det ønskes et utfellende kromogen, kan det anvendes MTT-tetrazolium i kombinasjon med xantinoksydase eller andre lignende enzymer. Ved anvendelse av et utfellende kromogen eller fluorogen, kan det oppnås en avlesning av immobilisert farge eller fluorescens for å oppnå en visuell indikasjon av homocysteinkonsentrasjon. ;I skjema (4) anvendes en chemiluminescerende ATP-reaksjon for bestemmelse av adenosinkonsentrasjonen. Chemiluminescensbaserte analyser har stort potensial p.g.a. de lave påvisningsgrenser som kan oppnås og den relative enkelhet av den nødvendige instrumentering. Chemiluminescensreaksjoner kan anvendes til påvisning av analytter som f.eks. ATP eller H202, og én av de mest effektive og best kjente slike reaksjoner er ildfluebioluminescensreaksjonen ;;lldflueluciferin har benzotiazolstruktur, men det er tilgjengelig luciferiner fra andre biologiske kilder som har andre strukturer. For analytiske formål kan ATP, luciferin eller luciferase bestemmes direkte ved anvendelse av denne reaksjon. En annen chemiluminescensreaksjon som kunne anvendes hvor H202 blir dannet, som f.eks. i skjema (3), er luminolreaksjonen (luminol er 5-amino-2,3-dihydro-ftalazin-1,4-dion) med hydrogenperoksydasekatalysator som resulterer i lysemi-sjon ved 425 nm. ;Hydrogenperoksyd, f.eks. fra skjema (3) kan også bestemmes ved anvendelse av de ikke enzymatiske chemiluminescensreaksjoner av peroksyoksalat og akridiniumesteme, sistnevne i vandig løsning ved nøytral pH. ;Anvendelsen av fluoroformerket adenosin i skjema (4) og bestemmelse ved fluorescenspolarisasjonsmåling er gjennomførbar p.g.a. adenosinkinasens realtivt brede substratspesifisitet. Denne brede spesifisitet kan dessuten anvendes til å kompensere for endogent adenosin (eller andre adenosinkinasenukleosid-substrater) ved å tilsette adenosinkinase til prøven som en forbehandling, fortrinnsvis i kombinasjon med reduksjonsmidlet (f.eks. DTT). ;Slik enzymatisk forbehandling av prøven er ønskelig, ettersom analytten (f.eks. adenosin) i mange av utførelsene ifølge denne oppfinnelse allerede er tilstede i prøven i varierende mengder, og således representerer en potensiell feilkilde i denne analyse. Det kan kompenseres for bakgrunnsinnholdet av analytt ved å utføre analysen på en porsjon av prøven uten anvendelse av det homocysteinomdannende enzym (f.eks. SAH-hydrolase); en slik fremgangsmåte er imidlertid tidskrevende og gjør analysen mer omstendelig. Et alternativ er forbehandling av prøven med et middel som tjener til å omdanne eller fjerne den endogene analytt, f.eks. et enzym som adenosinkinase eller adenosindeaminase som fjerner bakgrunnsadenosinet. Som nevnt ovenfor kan en slik behandling av prøven, for å unngå unødvendig og øke den nødvendige tid for gjennomføring av analysen, hensiktsmessig utføres samtidig som den blir forbehandlet med reduksjonsmidlet for å frigjøre homocysteinet. ;1 tillegg til anvendelsen av spektrometriske eller kolorimetriske teknikker for analyttbestemmelse kan det anvendes andre fotometriske teknikker. Blant de mest anvendelige teknikker som kan anvendes, er partikkelagglutinerings- og immunoutfellingsteknikker. Dersom det anvendes polyklonale antistoffer kan det anvendes direkte partikkelagglutinering eller direkte immunoutfelling, selv om dette vanligvis ikke vil bli foretrukket hvor det anvendes SAH-hydrolase som homocysteinomdannende enzym. Utfellingsinhiberings- eller partikkelagglutinerings-inhibertngsteknikker kan imidlertid anvendes. Disse beror på anvendelsen av antistoff/haptenkombinasjoner som ved konjugering fører til utfelling eller partikkel-aggregering som kan påvises ved turbidimetrisk eller nefelometrisk måling. Der hvor dannelsen av antistoff/haptenkompiekset inhiberes av analytten, f.eks. SAH, kan SAH-innholdet bestemmes ut i fra reduksjonen i utfelling/aggregering. Reaksjonen kan uttrykkes som følger ;;Når analysen ifølge denne oppfinnelsen blir påvirket ved anvendelse av SAH-hydrolase som det homocysteinomdannende enzym, er det fordelaktig enten å lagre SAH-hydrolasen i nærvær av et reduksjonsmiddel eller å behandle den med et reduksjonsmiddel før dens anvendelse i analysen. Det er blitt funnet at lagring ellers vil forårsake inaktivering av SAH-hydrolasen, og denne anvendelse av et reduksjonsmiddel vil enten forhindre inaktivering under lagring eller forårsake reaktivering før anvendelse. ;Det kan anvendes forskjellige reduksjonsmidler (f.eks. DTT, cystein, merkaptoetanol, ditioerytritol, natriumborhydrid, osv.), DTT er imidlertid særlig egnet, f.eks ved en konsentrasjon på ca. 5 mM. DTT bør selv lagres ved lav pH, og analysesetttet kan således hensiktsmessig innbefatte en løsning av DTT ved lav pH (f.eks. ca. 3), men med lav bufferkapasitet, og en separat løsning av SAH-hydrolase, som kan være delvis eller fullstendig inaktiv, ved i alt vesentlig nøytral pH og fortrinnsvis bufret. Når disse løsninger slås sammen, blir enzymet reaktivert ved nøytral pH. Denne kombinasjon kan om ønskelig foregå i nærvær av test-prøven, eller med testprøven tilsatt kort deretter, slik at frigjøringen av homocysteinet blir gjennomført samtidig. De andre reduksjonsmidler nevnt ovenfor kan anvendes på lignende måte for både SAH-hydrolasestabilisering/- aktivering og for reduksjon av prøven for frigjøring av homocystein. ;Anvendelsen av reduksjonsmidler for å reaktivere inaktivert SAH-hydrolase utgjør et ytterligere trekk ifølge denne oppfinnelse. I et enda ytterligere trekk tilveiebringer denne oppfinnelse dessuten også et sett omfattende i et første rom en inaktiv SAH-hydrolse og i et andre rom et reduksjonsmiddel, f.eks. DTT i surt medium (f.eks. pH 3). Ved anvendelse av dette sett kan SAH-hydrolasen blandes med reduksjonsmidlet og således reaktiveres umiddelbart før dens anvendelse i analysen. ;Andre additiver kan fordelaktig anvendes for å øke SAH-hydrolasens stabilitet under lagring eller i selve analysen. Disse omfatter NAD<+>, glutation, flerverdige alkoholer og sukkere (f.eks. inositol, sorbitol, xylitol, erytritol, glycerol, etylenglykol, sukrose, laktitol, osv.), løselige polymerer som f.eks. visse dekstraner, og proteiner (f.eks. bærerproteiner). ;Når analysen ifølge denne oppfinnelse anvender antistoffer, kan disse være polyklonale, men er fortrinnsvis monoklonale. Når de ønskede antistoffer ikke allerede er kommersielt tilgjengelige, kan de fremstilles ved standard teknikk. Således kan det fremstilles antistoffer i dyr eller hybridomer, enten monoklonale eller polyklonale, f.eks. som beskrevet av James Gooding i "Monoclonal antibodies, principle and practice", Academic Press, London, 1983, kapittel 3. Monokloner må sorteres for å utvelge kloner som diskriminerer mellom det ønskede hapten og andre substrater for enzymene, f.eks. som diskriminerer mellom adenosin og SAH. Polyklonale antistoffer som er reaktive bare med analytten (f.eks. SAH) bør renses for å fjerne kryss-reagerende antistoffer, dvs. de som er reaktive med andre substrater i tillegg til analytten, f.eks. med både adenosin og SAH. Dette kan gjøres ved affinitetskromatografi, f.eks. hvor SAH er analytten, ved anvendelse av immobilisert adenosin. ;Ved fremstillingen av antistoffet anvender man som hapten enten selve analytten eller et annet molekyl som inkluderer den del av analytten som blir ansett for å være den mest hensiktsmessige bindingsregion, f.eks. en region fjernt fra de regioner som deltar i den enzymatiske reaksjon. Haptenet konjugeres beleilig med et makromolekyl som f.eks. BSA eller hemocyanin. For SAH er den ønskede epitop fortrinnsvis på eller omkring tioeterbroen, og selv om man kan anvende SAH selv ;konjugert til et makromolekyl, blir det således foretrukket å anvende et "forenkler molekyl som f.eks. ett molekyl med formelen (I) ;(hvor Ri og R2 som kan være de samme eller forskjellig er hydrogenatomer eller OR4-grupper (hvor R4 er en lavere (f.eks. Ci^, særlig C-m) alifatisk gruppe som f.eks. en alkylgruppe, fortrinnsvis en metyl- eller etylgruppe) eller Ri og R2 til sammen representerer et oksygenatom, og R3 er et amin eller en karboksylgruppe) eller et salt eller en ester (f.eks. med en Ci^-alkanol) derav, igjen koblet til et makromolekyl. ;Eksempler på forbindeler med formel I som kan anvendes som haptener inkluderer således ;Slike "forenklede" strukturer kan også adopteres for de merkede analoger nevnt ovenfor og som anvendes i analyser hvor analytten og den merkede analog er involvert i en konkurrerende bindingsreaksjon med antistoffet. Den signal-givende gruppe R, som kan være valgt fra fluoroforer, kromoforer, radiomerkede forbindelser, enzymatiske, chemiluminescerende og andre merkelapper som beleiligvis anvendes i immunanalyser, kan således være konjugert med analytten, som f.eks. R-SAH, eller med et forenklet, epitopholdig molekyl som f.eks. ;Slike merkede grupper kan naturligvis være koblet til partikler, polymerer, proteiner eller andre materialer etter ønske. ;De merkede furanose 6-tioetere og forbindelsene med formel I er nye, og danner ytterligere trekk ifølge denne oppfinnelse. ;Betraktet fra et ytterligere aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse med formel I, idet nevnte fremgangsmåte omfatter minst ett av følgende trinn: ;(a) omsetning av en forbindelse med formel II ;;hvor Ri og R2 er som definert ovenfor og R5 er en beskyttet hydroksylgruppe eller begge R5 til sammen er en alkylendioksygruppe (dvs. en beskyttet bis- ;hydroksygruppe, som f.eks. -OC(CH3)20-) med et propylhalogenid med formel lii ;(hvor R6 er en R3-gruppe eller en beskyttet R3-gruppe og Hal er et halogenatom, f.eks. et bromatom) etterfulgt av fjerning av eventuelle beskyttende grupper om ønsket; (b) (å fremstille en forbindelse med formel I, hvor R3 er en aminogruppe) ved omsetning av en forbindelse med formel II med akrylonitril og reduksjon og avbeskyttelse av det oppnådde cyanopropyl-tio-eterprodukt; og (c) forestring av en forbindelse med formel I hvor R3 er en karboksylgruppe. ;Utgangsproduktene med formel III kan fremstilles ved standard teknikker eller er kjent fra litteraturen. Utgangsproduktene med formel II kan fremstilles fra de tilsvarende 1-hydroksymetylfuranoser ved cis-hydroksygruppebeskyttelse, bromering og påfølgende omsetning med tiourea og hydrolyse. 1 -hydroksymetyl-furanosene kan være cis-hydroksygruppebeskyttet ved omsetning med konvensjonelle hydroksybeskyttende midler, f.eks. aceton. ;Eksempler på reaksjonsskjema for fremstilling av forbindelser med formel I omfatter følgende (forbindelsene (1) og (3) er kommersielt tilgjengelige) ;UV absorpsjon, absorpsjon av synlig lys, eller fluorescens av substanser i reaksjonsblandingen, eventuelt utfelt eller på annen måte separert fra reaksjonsblandingen, kan måles ved reaksjonens sluttpunkt (når signalet er stabilt) eller på ett eller flere bestemte tidspunkter, eller alternativt kan det adopteres en kinetisk måling, hvori flere målinger blir utført på forskjellige tidspunkter. ;For å gjennomføre analysen ifølge denne oppfinnelse kan de nødvendige reagenser tilsettes til reaksjonsblandingen i rekkefølge eller samtidig. I mange foretrukne utførelser kan én eller flere av reaksjonene imidlertid fordelaktig kjøres i en viss tid før tilsetningen av reagenser for den eller de påfølgende reaksjoner. Når testprøven blir omsatt med adenosin og SAH-hydrolase, får f.eks. dannelsen av SAH fra homocystein og adenosin fortrinnsvis finne sted i en viss tid før adenosinbestemmelsesfremgangsmåten blir igangsatt. ;I analyser i klinisk kjemi vil anvendelsn av standardkurver for kalibrerings-formål være standard praksis. Ved gjennomføreingen av fremgangsmåten ifølge denne oppfinnelse kan således prøver med kjent homocysteininnhold anvendes istedenfor kliniske prøver for å konstruere en standardkurve for den respons/det signal som skal måles, og homocysteininnholdet i de ukjente prøver kan deretter beregnes ved interpolering fra standardkurven. En nøyaktig kvantifisering av de signaldannende molekyler eller red-okspotensialene er således ikke nødvendig. ;Analysefremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse kan anvendes for diagnose og overvåking av patologiske eller potensielt patologiske tilstander som er relatert til eller gir seg utslag i homocysteininnholdet i kroppsfluider eller vev. Disse omfatter aterosklerose, blodsykdommer, vitaminmangel og/eller medfødte metabolismefeil. Den kan også anvendes for evaluering av virkningene av farmasøytika, som f.eks. anti-folatmedikamenter. ;I et annet trekk tilveiebringer denne oppfinnelse et analytisk produkt, eventuelt i settformat, for anvendelse ved analyse av homocystein i en prøve, idet nevnte produkt omfatter: et homocystein-omdannende enzym; et substrat for nevnte enzym forskjellig fra homocystein; et signaldannende middel; og, eventuelt midler for signalbestemmelse. ;I én foretrukket utførelse omfatter det analytiske produkt: et homocystein-omdannende enzym, f.eks. S-adenosyl-homocysteinhydrolase; ett eller flere substrater for nevnte enzym forskjellig fra homocystein; midler for å danne et påvisbart derivat av en analytt valgt fra homocystein-ko-substratet og produktene av den enzymatiske omdanning av homocystein; og, eventuelt midler for spektrofotometrisk eller kolorimetrisk bestemmelse av nevnte påvisbare derivat for å tilveiebringe en indikasjon på homocysteininnholdet i prøven. ;I en annen utførelse omfatter produktet; adenosin; S-adenosylhomocystein-hydrolase; et adenosinomdannende enzym; eventuelt et ko-substrat for nevnte adenosinomdannende enzym; og midler for å danne en fotometrisk påvisbar respons fra nevnte ko-substrat eller fra et produkt av enzymatisk omdanning av adenosin ved nevnte adenosinomdannende enzym. Det adenosinomdannende enzym kan således f.eks. være adenosinkinase, og dannelsesmidlene kan omfatte ATP, luciferin og en luciferase. Alternativt kan det adenosinomdannende enzym være adenosindeaminase, og omdanningsmidlene kan omfatte nukleosidfosforylase, xantinoksydase og en peroksydase. ;I enda en ytterligere utførelse kan setttet omfatte adenosin; S-adenosyl-homocystein; et eventuelt matrikspartikkelbundet anti-S-adenosylhomocysteinantistoff; et polyhapten for nevnte antistoff; og eventuelt midler for fotometrisk bestemmelse av agglutinering eller utfelling av antistoff:poly-haptenkomplekser. I denne utførelse kan polyhaptenet beleilig tilveiebringes av en hovedkjedepolymer hvormed er konjugert et større antall furanose 6-tioetere, som f.eks. etterlater fremspringende rester med formelen ;;Disse kan fremstilles ved f.eks. å omsette en karboksylsyre med formel I (eller et anhydrid eller syrehalogenid derav) med en polymer som har et større antall fremspringende aminer (f.eks. polylysin) eller et amin med formel I med en polymer med fremspringende karboksylgrupper. ;I disse sett kan alle eller noen av reagensene være tilstede i tørr form, likesom format/matriksen for bearbeiding av reaksjonene i reaksjonsblandingen. På lignende måte kan setttet som angitt, som midler for bestemmelse av en påvisbar analytt eller derivat, omfatte et relativt billig spektrometrisk eller kolorimetrisk apparat, f.eks. en lyskilde og et påvisningsarrangement som på forhånd er innstilt for påvisning av lysintensitet ved en bølgelengde som er karakteristisk for den påvisbare analytt, osv., eller endog en enkel kolorimetrisk kalibreringskurve. ;Oppfinnelsen skal nu beskrives ved hjelp av følgende eksempler. Analysen i eksempel 19 blir særlig foretrukket. ;Eksempel 1 ;Prøven (en vandig homocystein-løsning for kalibrering eller plasma eller urin for klinisk analyse) ble forhåndsbehandlet med et reduksjonsmiddel (f.eks. 10mM ditiotreitol). Denne prøve ble tilsatt, fortrinnsvis til en sluttkonsentrasjon av homocystein i området 10^-K)"5 mol/l, til en løsning ved 37°C omfattende kanin IgG 5 mg/ml, adenosindeaminase 20 mU/ml, nukleosidfosforylase 20 mU/ml, xantinoksydase 20 mU/ml, pepperrotperoksydase 500 mU/ml, 10 mmol/l ditiotreitol, 100 mmol/l natriumfosfat, pH justert til 7,40, og 100 mU S-adenosyl-l-homocystein-hydrolase. Enten samtidig eller i rekkefølge, men fortrinnsvis etter 10 min. inkubering for å tillate omdanning av adenosin i prøven, ble tilsatt adenosin til en sluttkonsentrasjon på 5.10"<6> mol/l. UV-absorpsjon ble målt under en 10 minutters periode, og responsen ble målt ved 292 nm på kinetisk måte, og AA ble beregnet. ;At ;For kliniske tester kan homocystein-konsentrasjonen beregnes ved interpolering til en standardkurve fremstilt ved anvendelse av de kjente standarder. ;Eksempel 2 ;Prøven (som for eksempel 1) ble forhåndsbehandlet med et reduksjonsmiddel (f.eks. 10 mM ditiotreitol). Denne prøve ble tilsatt, fortrinnsvis til en sluttkonsentrasjon av homocystein i området lO^-IO"<5> mol/l, til en løsning ved 37°C omfattende kanin IgG 5 mg/ml, adenosindeaminase 20 mU/ml, xantinoksydase 20 mU/ml, nukleosidfosforylase 20 mU/ml, pepperrotperoksydase 500 mU/ml, 10 mmol/l ditiotreitol og 100 mmol/l natriumfosfat, pH justert til 7,40, 20 mU S-adenosyl-l-homocysteinhydrolase. Deretter, fortrinnsvis etter 10 min. inkubering for å tillate at det kan foregå omdanning av adenosin i prøven, ble tilsatt S-adenosyl-l-homocystein til en sluttkonsentrasjon på 5.10"5 mol/l, og UV-absorpsjonen ble målt i løpet av et tidsrom på 10 min.. Ved 292 nm på kinetisk måte ble beregnet AA. ;At ;For kliniske tester kan homocysteinkonsentrasjonen beregnes ved interpolering til en standard kurve fremstilt ved anvendelse av kjente standarder. ;Eksempel 3 ;Analysebuffer: ;0,1M fosfatbuffer pH 7,4, omfattende 1 mg/ml kanin IgG og 10 mmol/l ditiotreitol. ;Analysefremgangsmåte: ;Til 150 ul analysebuffer ble tilsatt 3 mU S-adenosyl-l-homocysteinhydrolase og prøve (fortrinnsvis forbehandlet som beskrevet i eksemplene 1 og 2). Enzym-reaksjonen ble startet ved tilsetning av adenosin løst i analysebuffer til en sluttkonsentrasjon på 2,5 x 10"<5> mol/l. Etter 10 min. inkubering ble tilsatt 750 ul av en løsning av analysebuffer omfattende 20 mU adenosindeaminase, 20 mU nukleosidfosforylase, 20 mU xantinoksydase og 375 mU av pepperrotperoksydase. UV-absorpsjonen ved 292 nm ble målt i 5 min. på kinetisk måte. ;AA ;At ;blir beregnet. I parallell blir analysen gjentatt, men uten tilsetning av S-adenosyl-l-homocysteinhydrolase. Forskjellen mellom de to verdier for AA bestemmes, og ;At homocysteinkonsentrasjonen beregnes ved interpolering til en standard kurve. ;Eksempel 4 ;Analysefremgangsmåten gjennomføres som beskrevet i eksempel 3 opp til den første inkubering. Deretter, etter 10 min. inkubering, tilsettes en analyse-løsning omfattende fluoresceinmerket adenosin og monoklonale anti-adenosinantistoffer. Det gjenværende adenosin og det fluoresceinmerkede adenosin konkurrerer om binding til antistoffet. Mengden av merket adenosin bundet til antistoffene blir bestemt ved den konvensjonelle fluorescenspolarisasjonsteknikk, og homocysteinkonsentrasjonen beregnes ved interpolering til en standard kurve. ;Eksempel 5 ;Anal<y>sebuffer: ;0,1M fosfatbuffer pH 7,4, omfattende 1 mg/ml kanin IgG og 10 mmol/l ditiotreitol. ;SAH- hvdrolaseløsning: ;40 mU/ml S-adenosyl-l-homocystein-hydrolase løses i analysebufferen. ;Adenosinløsning: ;5x10"<8> mol/ml adenosin løses i analysebufferen. ;Adenosindeaminaseløsnin<q>: ;200 mU/ml adenosindeaminase løst i analysebufferen. ;Fenol/ nitroprussidløsnina: ;10 mg/ml fenol og 50 jjg/ml natriumnitroprussid i vann. ;Hvpoklorittløsnina: ;11 mmol/l NaOCI løses i 125 mM NaOH. ;Analvsefremgangsmåte: ;1. 75 ul av adenosinløsningen og 75 pl av SAH-hydrolaseløsningen blandes med prøven (fortrinnsvis forbehandlet som beskrevet i eksemplene 1 til 4), og holdes ved 37°C i 10 min.. 2. 100 pl adenosindeaminaseløsning tilsettes, og blandingen holdes ved 37°C i 5 min.. 3. 750 pl av fenol/nitroprussidløsning og 750 pl hypoklorittløsning tilsettes. Etter 30 min. ved 37°C måles ekstinksjonen ved 628 nm. Parallelt blir analysen gjentatt, men uten tilsetning av SAH-hydrolase. Forskjellen mellom de to eks-tinksjonsverdier ved 628 nm blir bestemt, og homocysteinkonsentrasjonen beregnes ved interpolering av denne forskjell i en standardkurve fremstilt ved anvendelse av kjente standarder. ;Eksempel 6 ;DANNELSE AV FLUOROFOR- MERKET SAH ;En 10 mmol/l løsning av SAH i dimetylformamid blir fremstilt og deretter fortynnet 1:10 i en 100 mmol/l fosfatbuffer pH = 7,5. Til denne løsning tilsettes fluoresceinisotiocyanat til en sluttkonsentrasjon på 1 mmol/l. Etter 60 min. inkubering ved omgivende temperatur blir SAH-fluoresceinkonjugatet renset ved HPLC ved anvendelse av en Kromasil C-18 kolonne ved 260 nm ved anvendelse av en gradientblanding av 25 mM ammoniumacetat (pH 7,0) og metanol. ;Eksempel 7 ;DANNELSE AV ANTI- SAH- ANTISTQFFER ;a) Dannelse av antigen: Til en 1 mmol/l løsning av SAH i 25 mmol/l fosfatbuffer pH = 7,4, med 125 mmol/l NaCl, tilsettes bovint serumalbumin til en ;sluttkonsentrasjon på 5 mg/ml. Til denne blanding tilsettes bis(sulfosuccinimidyl)-suberat til en sluttkonsentrasjon på 1 mmol/l, og blandingen etterlates for å reagere i 60 min.. (pH holdes lav i denne konjugenngsreaksjon for å stimulere konjugering på adenosylaminet istedenfor på homocysteinaminfunksjonen). Den protetnholdige fraksjon av løsningen - som også omfatter konjugatene mellom BSA og SAH - isoleres ved størrelseseksklusjonskromatografi ved anvendelse av en Pharmacia Superose 12 kolonne med fosfatbufret saltløsning som elueringsmiddel. ;b) Dannelse av hybridomer: Med det beskrevne antigen blir det dannet hybridomer ifølge fremgangsmåten beskrevet av James W. Gooding i "Monoclonal ;antibodies: Principle and Practice", Academic Press, London, 1983, kapittel 3. ;c) Seleksjon av h<y>bridomer ;(i) Hybridomer som frembringer anti-SAH-antistoffer blir identifisert som følger: IgG-innholdet av supernatanten av hybridomene måles ved konvensjonell ELISA-teknikk. Deretter blandes supernatanten i en kuvette med en buffer omfattende 50 mmol/l fosfat, 120 mmol/l NaCl, pH = 7,4, og 0,1 mg kanin IgG pr. ml, til en sluttkonsentrasjon på 0,1 umol/l mus IgG. Fluoresceinmerket SAH, dannet ifølge eksempel 6 ovenfor, blir tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 0,02 pmol/l. Etter ;10 min. inkubering måles graden av polarisering, og med et spektrofluorometer utstyrt med en fluorescenspolarisasjonsenhet ved å måle ;A = fluorescensintensiteten når polarisasjonsplanet for innfallende lys er parallelt med polarisasjonsplanet for det filter som anvendes for filtrering av det emitterte lys, ;B = fluorescensintensiteten når polarisasjonsplanet for innfallende lys er perpendikulært med polarisasjonsplanet for det filter som anvendes for filtrering av det emitterte lys, ;og anvendelse av en eksitasjonsbølgelengde på 494 nm og påvisning av det emitterte lys ved 517 nm. ;Polarisasjonsgraden beregnes som ;;En lav polarisasjonsgrad angir at de monoklonale musantistoffer ikke binder ;SAH. ;(ii) Fra hybridomene utvalgt ifølge (i), blir hybridomene som frembringer antistoffer reaktive mot adenosin og/eller homocystein identifisert som følger: Monoklonale anti-SAH-antistoffer fra hybridomsupernatanen blir strøket ut på mikrotiterbrønnoverflater som beskrevet i eksempel 9 nedenfor. Karbon-14 merket adenosin (eller karbon-14 merket homocystein), tilgjengelig fra Amersham Ltd., UK, i en buffer omfattende 25 mmol/l fosfat, 120 mmol/l NaCl og 1 mg/ml av kanin IgG og med en pH = 7,4 blir tilsatt til mikrotiterbrønnene. Etter 60 min. inkubering blir brønnene vasket 3 ganger med den samme buffer (som naturligvis ikke inneholder adenosinet eller homocysteinet). Høye radioaktivitetsverdier som holdes tilbake i brønnene angir at hybridomene frembringer antistoffer som binder seg til adenosin (eller homocystein) av seg selv. Disse antistoffer anvendes ikke i analysen. (iii) Fremstilling av monoklonalt IgG: Hybridomer som frembringer antistoffer som binder seg til SAH ifølge (i) ovenfor, men som ikke binder seg til adenosin eller homocystein ifølge (ii) ovenfor, blir utvalgt for fremstilling av monoklonalt IgG. De utvalgte hybridomer anvendes for fremstilling av ascites hos mus eller fremstilling av cellekulturer in vitra, ifølge konvensjonelle teknikker. De monoklonale antistoffer isoleres videre fra ascites eller cellekulturmedia ifølge konvensjonelle teknikker. Se James W. Gooding "Monoclonal antibodies: Principle and practice", Academic Press, Lonon, 1983. ;Eksempel 8 ;FLUORESCENSPOLARISASJONSIMMUNOANALYSE AV L- HOMOCYSTEIN ;Enzymløsning: 50 mmol/l fosfatbuffer pH = 7,4 omfattende 0,2 mg/ml kanin IgG, 120 mmol/l NaCl, 10 mmol/l ditiotreitol, 10 U/l S-adenosyl-l-homocysteinhydrolase og 0,1 mmol/l adenosin. ;Fluorescein- merket SAH- løsninq:SAH konjugert med fluorescein, dannet ifølge eksempel 6, blir løst til en sluttkonsentrasjon på 1 umol/l i 50 mmol/l fosfatbuffer pH = 7,4 med 125 mmol/l NaCl og 0,2 mg/ml kanin IgG. ;Antistoffløsning: Monoklonale anti-SAH-antistoffer (ikke reaktive med adenosin og fortrinnsvis heller ikke reaktive med homocystein), f.eks. dannet ifølge eksempel 7, løst til en sluttkonsentrasjon på 0,1 pmol/l i 50 mmol/l fosfatbuffer pH = 7,4 med 125 mmol/l NaCl og 0,2 mg/ml kanin IgG. ;Utføring av analysen: I en kyvette blandes 15 pl plasma (opprinnelig en serie av prøver med kjent homocysteininnhold) med 100 pl enzymløsning og holdes ved 37°C i 15 min.. 100 pl av løsningen av fluorescein-merket SAH blir tilsatt, etterfulgt av tilsetning av 1,0 ml av antistoffløsningen. Med et spektrofluorometer utstyrt med en fluorescenspolarisasjonsenhet måles polarisasjonsgraden som beskrevet i eksempel 7(c) (i) ovenfor, og blir avsatt mot homocystein-konsentrasjonen. ;Analysen kan også gjennomføres ved anvendelse av de merkede haptener og antistoffer fra eksemplene 11 og 13 eller 15 og 17 istedenfor dem fra eksemplene 6 og 7. ;Eksempel 9 ;MIKROTITER ENZYM- BUNDET IM MUN ANALYSE ;(a) Enzvmløsnin<g>en fra eksempel 8 blir anvendt. ;(b) Løsning av peroksydase- merket SAH: 0,5 mg pepperrotperoksydase løses i 1 ml renset vann. 200 pl av en løsning av 0,02 mol/l natriumperjodat tilsettes, blandingen omrøres i 20 min. ved omgivende temperatur og dialyseres over natten mot en 10 mM natriumacetatbuffer pH = 4,4. SAH tilsettes til en sluttkonsentrasjon på 0,1 mmol/l, og pH justeres til 6,0. Løsningen omrøres i 4 timer ved omgivende temperatur. 100 pl av friskt fremstilt 4 mg/ml vandig løsning av natriumborhydrid tilsettes, og løsningen inkuberes ved 4°C i 2 timer. Per-oksydasen og dens SAH-konjugater isoleres ved størrelseseksklusjons-kromatografi i en kolonne av Superose 6 (Pharmacia, Sverige). ;(c) Anti- SAH- antistoffer belagt på mikrotiterbrønner: ;Polyklonalt sau IgG, fra sau immunisert mot mus IgG, blir løst til en sluttkonsentrasjon på 1 mg/ml i 100 mmol/l boratbuffer pH = 9,0. 300 pl av denne løsning fylles i hver av brønnene i polystyrenmikrotiterplater. Etter 120 min. inkubering ved 37°C blir brønnene vasket 5 ganger med fosfatbufret saltløsning. Deretter blir monoklonale mus IgG anti-SAH-antistoffer dannet ifølge eksempel 7 ovenfor, løst i fosfatbufret saltløsning til en sluttkonsentrasjon på 50 pg/ml. 200 pl av denne løsning av monoklonalt IgG blir tilsatt til hver brønn og inkubert i 120 min. ved 37°C. Brønnene vaskes deretter 5 ganger med fosfatbufret saltløsning inneholdende 0,1 mg/ml av kanin IgG. ;(d) Utførin<g> av analysen. En 25 pl plasmaprøve (opprinnelig en serie av prøver med kjent homocysteinkonsentrasjon) blandes med 500 pl av enzym-løsningen og holdes ved 37°C i 15 min.. 50 pl av den peroksydase-merkede SAH-løsning blir tilsatt, og etter blanding tilsettes 250 pl av denne blanding til en av mikrotiterbrønnene belagt med anti-SAH-antistoff fremstilt ifølge (c) ovenfor alle bufret til pH 7,4. Etter 60 min. inkubering ved 37°C blir brønnene vasket 3 ganger med fosfatbufret saltløsning inneholdende 0,1 mg/ml kanin IgG. 100 pl av en 1 ;mg/ml løsning av orto-fenylendiamin i en 0,1 mol/l citratbuffer pH = 6,0 inneholdende 0,015% hydrogenperoksyd blir tilsatt til hver brønn. Etter 10-30 min. avleses iysabsorbansen for hver brønn ved 450 nm. Absorbansen avsettes mot homocystein-konsentrasjonen. ;Eksempel 10 ;Haptenfremstilling ;3- S-( 1- anhydro- D- ribofuranosyl)- tiopropylamin ;a) Aktivert hvdroksv- beskvttet merkaotan ( Forbindelse ( 8) i skiema ( E ) ovenfor) ;Én ekvivalent av metyl B-D-ribofuranosid (forbindelse (1) ovenfor som er kommersielt tilgjengelig) omsettes med en blanding av 5 ekvivalenter av trimetyl-silylmetansulfonat og én ekvivalent av bortrifluorideterat ved anvendelse av fremgangsmåten til Jun et al. (Carb. Res. 163: 247-261 (1987)). 0,5 ekvivalenter av 1-anhydro-D-riboseproduktet (forbindelse (2)) tilsettes i finpulverisert form, i små porsjoner, under kontinuerlig omrøring til en aceton/svovelsyreblanding fremstilt ved langsom tilsetning av 6,3 ml konsentrert svovelsyre til 100 ml frisk ;destillert aceton i et isbad. Isbadet fjernes og omsetningen får fortsette ved omgivende temperatur i 8 timer. Den oppnådde faste hvite krystallinske masse løses i kloroform, vaskes med vandig natriumhydrokskyd, fortynnet saltsyre og til slutt vann, tørkes og inndampes under dannelse av 2,3-isopropyliden-D-ribonderivatet av 1-anhydro-D-ribose (forbindelse (2)). Én ekvivalent av dette og to ekvivalenter av karbontetrabromid løses i tørr eter og avkjøles på is. Under konstant omrøring og avkjøling på is tilsettes langsomt to ekvivalenter av trifenylfosfin. Isbadet fjernes, og blandingen får varme seg opp til omgivende temperatur mens reaksjonen får finne sted og forårsake jevn utvikling av hydrogenbromid. Etter at omsetningen er fullstendig blir overskudd av reagens undertrykket ved tilsetning av metanol. Bromidderivatet (forbindelse (6)) isoleres ved filtrering og inndamping av filtratet. Til bromidderivatet tilsettes tiourea (én ekvivalent) løst i varmt vann og fortynnet med destillert sprit. Blandingen oppvarmes med tilbakeløp og rystes godt periodisk, og dette fortsettes inntil ca. 30 min. etter at bromidderivatet løser seg. Reaksjonsblandingen avkjøles på is og filtreres, og gir et fast stoff som behandles med alkalisk vann under dannelse av det hydroksy-beskyttede merkaptan (forbindelse (7)) i den organiske fase. Dette omdannes til den aktiverte form (forbindelse (8)) ved behandling med metoksyd i metanol. Denne blir deretter videre omsatt som beskrevet nedenfor. ;(b) 3- S- f1- anhvdro- D- ribofuranosvl) tiopropvlamin ;Én ekvivalent av forbindelsen fra eksempel 10(a) (forbindelse (8)) friskt fremstilt, omsettes med én ekvivalent akrylonitril under dannelse av en tioeter (forbindelse (9)). Denne reduseres så ved behandling med LiAIH4 i tørr eter, og det frie avbeskyttede amin (forbindelse (10)) isoleres ved behandling med vandig saltsyre. ;De tilsvarende aminopropyltioetere hvori Ri og R2 er forskjellig fra hydrogen, fremstilles på tilsvarende måte, f.eks. ved anvendelse av de kommersielt tilgjengelige forbindelser (1) og (3) som utgangsmaterialer. ;Eksempel 11 ;Haptenmerkina ;En 50 mmol/l løsning av forbindelsen fra eksempel 10 i dimetyiformamid (DMF) fortynnes 1:5 (etter volum) i 0,1 M hydrogenkarbonatløsning (pH 9,2). Til ;denne løsning tilsettes fluorescein-isotiocyanat til en sluttkonsentrasjon på ;12 mmol/l. Etter 60 min. inkubering ved omgivende temperatur renses fluoresceinkonjugatet av forbindelsen fra eksempel 10 ved RPC ved anvendelse av en Kromasil 100 Å C-18 kolonne og en gradientblanding av 20 mM ammoniumacetat (pH 7,0) og metanol. ;Eksempel 12 ;Antigenfremstilling ;Til en 1 mmol/l løsning av forbindelsen fra eksempel 10 i 50 mmol/l fosfat, 125 mmol/l NaCl (pH 7,4) buffer, tilsettes bovint serumalbumin (BSA) til en sluttkonsentrasjon på 5 mg/ml. Til denne blanding tilsettes bis(sulfosuccinimidyl)-suberat til en sluttkonsentrasjon på 1,2 mmol/l, og blandingen etterlates for å reagere i 60 min.. Den proteinholdige fraksjon, som omfatter hapten-BSA-konjugatet, isoleres ved størrelseseksklusjonskromatografi ved anvendelse av en Pharmacia Superose 12 kolonne med fosfatbufret saltløsning som elueringsmiddel. ;Eksempel 13 ;Fremstilling av antistoff ;Antistoff til forbindelsen fra eksempel 10 fremstilles analogt med eksempel 7 ovenfor ved anvendelse av antigenet fra eksempel 12. Antistoffer som ikke er reaktive med SAH og antistoffer som er reaktive med adenosin, blir forkastet, og likeså antistoffer reaktive med homocystein. ;Eksempel 14 ;Haptenfremstilling ;N-hydroksysuccinimidyl 3-S-f1-anhvdro-D- ribofuranosvl) tiobutanoat ;;Én ekvivalent av forbindelsen fra eksempel 10(a), friskt fremstilt, omsettes med én ekvivalent av etyl 4-brombutyrat under dannelse av esterforbindelsen (11). Denne hydrolyseres til den frie syre ved basisk hydrolyse med vandig natrium-hydroksyd i dioksan, og avbeskyttes ved behandling med vandig saltsyre under dannelse av den ubeskyttede frie syre (forbindelse (12)). Én ekvivalent av denne blandes med to ekvivalenter av N-hydroksysuccinimid i iskald dimetylformamid, og til dette tilsettes 1,2 ekvivalenter av dicykloheksylkarbodiimid under konstant omrøring. Omsetningen får foregå ved omgivende temperatur i 18 timer, hvoretter blandingen avkjøles, og iskald eter blir tilsatt. Den utfelte NHS-ester (forbindelse (13)) omkrystalliseres fra DMF/eter, tørkes og lagres deretter ved 4°C over et tørkemiddel. ;De tilsvarende NHS-estere hvori Ri og R2 er forskjellig fra hydrogen, fremstilles analogt, f.eks. ved anvendelse av de kommersielt tilgjengelige forbindelser (1) og (3) som utgangsmaterialer. ;Eksempel 15 ;Haptenmerkinq ;En 50 mmol/l løsning av forbindelsen fra eksmepel 14 i DMF fortynnes 1:5 (etter volum) i 0,1 M hydrogenkarbonatbuffer (pH 9,2). Til denne løsning tilsettes 5-aminoacetamidofluorescein (fluoresceinylglycinamid) til en sluttkonsentrasjon på 12 mmol/l. Etter 60 min. inkubering ved omgivende temperatur blir fluoresceinkonjugatet av 3-S-(1-anhydro-D-ribofuranosyl)tiobutansyre renset ved RPC ved anvendelse av en Kromasil 100 Å, C-18 kolonne og en gradientblanding av 20 mM ammoniumacetat (pH 7,0) og metanol. ;Eksempel 16 ;Anti<g>enfremstillna ;Til en løsning av BSA (5 mg/l i 50 mmol/l fosfat, 125 mmol/l NaCl (pH 7,4) buffer), tilsettes forbindelsen fra eksempel 14 til en sluttkonsentrasjon på 1 mmol/l. Blandingen etterlates for å reagere i 60 min., og den proteinholdige fraksjon som inneholder BSA-hapten-konjugatet, isoleres ved størrelseseksklusjonskromatografi ved anvendelse av en Pharmacia Superose 12 kolonne med fosfatbufret salt-løsning som elueringsmiddel. ;Eksempel 17 ;Fremstilling av antistoff ;Antistoffer til forbindelsen fra eksempel 14 fremstilles analogt med eksempel 7 ovenfor ved anvendelse av antigenet fra eksempel 12. Antistoffer som ikke er reaktive med SAH og antistoffer som er reaktive med adenosin blir forkastet, likesom fortrinnsvis antistoffer som er reaktive med homocystein. ;Eksempel 18 ;Fluorescenspolarisasionsimmunoanalvse ;Enzymløsning: ;50 mmol/l fosfatbuffer (pH 7,4) inneholdende 4 mg/ml kasein, 120 mmol/l NaCl, og 10 U/l S-adenosyl-L-homocystein-hydrolase. ;Ditiotreitol ( DTO- løsning: ;Ditiotreitol løses i vann til en konsentrasjon på 50 mmol/l og justeres til pH 3,0 med HCI. ;Adenosinløsnin<g>: ;1,8 mmol/l adenosin i 50 mmol/l fosfatbuffer (pH 7,4). ;Fluorescein- merket SAH- løsninq: ;50 mmol/l fosfatbuffer (pH 7,4) inneholdende SAH konjugert med fluorescein, dannet ifølge eksempel 6. ;Antistoffløsning: ;Monoklonale anti-SAH-antistoffer (f.eks. ifølge eksempel 7) løst til en slutt-onsentrasjon på 0,1 pmol/l i 50 mmol/l fosfatbuffer (pH 7,4) inneholdende 120 mmol/l NaCl og 1 mg/ml kasein. ;Utføring av analysen ;Trinn 1: ;I en kyvette blandes 15 pl prøve, 10 pl enzymløsning og 10 pl adenosin-øsning med 10 pl av den sure DTT-løsning og holdes ved 37°C i 15 min.. ;Trinn 2: ;Til kyvetten tilsettes 100 ul av den fluoresceinmerkede SAH-løsning og 1,0 ml av antistoff løsningen. Med et spektrofluorometer utstyrt med en fiuorescens-olarisasjonsenhet måles polarisasjonsgraden som beskrevet i eksempel 7(c)(i) ovenfor, og avsettes mot homocystein-konsentrasjonen. ;Eksempel 19 ;Fluorescenspolarisasjonsimmunoanalvse ;Enz<y>mløsnin<g>: ;50 mmol/l fosfatbuffer (pH 7,4) inneholdende 1 mg/ml kasein, 120 mmol/l NaCl, og 10 U/l S-adenosyl-L-homocysteinhydrolase. ;Ditiotreitol ( DTT)- løsning: ;Ditiotreitol løses i vann til en konsentrasjon på 50 mmol/l og justeres til pH 3,0 med HCI. ;Fluoresceinmerket SAH- løsning/ adenosin- løsning: ;50 mmol/l fosfatbuffer (pH 7,4) inneholdende 10 pmol/l SAH konjugert med fluorescein, dannet ifølge eksempel 6, og 1,8 mmol/l adenosin. ;Antistoff- løsning: ;Monoklonale anti-SAH-antistoffer (f.eks. ifølge eksempel 7) løses til en sluttkonsentrasjon på 0,1 pmol/l i 50 mmol/l fosfatbuffer (pH 7,4) inneholdende 120 mmol/l NaCl og 1 mg/ml kasein. ;Utførin<g> av analysen ;I en kyvette blandes 10 pl plasma, 100 pl enzymløsning og 10 pl merket SAH/adenosinløsning med 30 pl av den sure DTT-løsning, og holdes ved 37°C i 15 min.. ;Etter inkubering tilsettes 1,0 ml av antistoff løsn ingen. Med et spektrofluorometer utstyrt med en fluorescenspolarisasjonsenhet måles polarisasjonsgraden som beskrevet i eksempel 7(c)(i) ovenfor, og avsettes mot homocystein-konsentrasjonen. ;Analysene i eksemplene 18 og 19 kan også gjennomføres ved anvendelse av de merkede haptener og antistoffer fra eksemplene 11 og 13 eller 15 og 17 istedenfor dem fra eksemplene 6 og 7. ;Eksempel 20 ;Luminescensanalvse ;Analysebuffer I: ;50 mM Pipes-buffer (pH 6,6) inneholdende 1 mg/ml kasein, 10 mM DTT, 0,5 mM MgCI2 og 30 mM KCI. ;Analysebuffer II: ;40 mM Hepes-buffer (pH 7,75), 4 mmol/l EDTA, 20 mM magnesiumklorid og 0,36 mmol/l DTT. ;Anal<y>sebuffer III: ;40 mM Hepes-buffer (pH 7,75) inneholdende 1,6 pg/ml luciferase (fra Photinus pyralis), 700 pmol/l D-luciferin, 20 mmol/l magnesiumklorid, 4 mmol/l EDTA, 0,36 mmol/l DTT og 0,3 mmol/l AMP. ;Analvsefremaanasmåte: ;Til 130 pl av analysebuffer I tilsettes 3 U av S-adenosyl-1-homocystein-hydrolase, 20 pl prøve tlsettes til denne blanding, og den inkuberes i 15 min. ved 37°C. Deretter tilsettes adenosin løst i analysebuffer l til en sluttkonsentrasjon på 5x10"° mol/l. Etter 5 min. inkubering ved 37°C tilsettes 750 pl av analysebuffer I inneholdende 0,7x10"<5> mol/l ATP og 1 mU adenosinkinase, og den resulterende løsning inkuberes videre ved 37°C i 5 min.. Denne løsning fortynnes 1:100 (etter volum) med analysebuffer II, og 500 pl av denne fortynnede løsning tilsettes umiddelbart til 500 pl av analysebuffer III. Både analysebuffer II og III ble ekvilibrert til omgivende temperatur (21 °C). Den produserte luminescens avleses i et fotometer ved 550 nm. ;Parallelt kjøres en analyse uten tilstedeværelse av S-adenosyl-l-homocysteinhydrolase. For kliniske tester kan homocysteinkonsentrasjonene beregnes ved å interpolere i en standardkurve den forskjell i luminescens som frembringes med og uten S-adenosyl-1-homocysteinhydrolase tilstede. ;Eksempel 21 ;Fremstilling av polvklonalt antistoff ;Kaninpolyklonale antistoffer til antigenene fra eksemplene 12 og 16 blir fremstilt ifølge protokollen utgitt av the Dako Corporation, København, Danmark. Polyklonalt IgG blir renset fra det oppsamlede antiserum ifølge den samme protokoll. De polyklonale antistoffer blir renset for antistoffer som er reaktive med adenosin og homocysteinrester per se ved å lede antistoffene gjennom Racti-Gel-kolonner med immobiliserte adenosin- og homocysteinrester (Gel og protokoll som tilveiebrakt av Pierce Chemical Company, Belfium). Antistoffer ikke-reaktive med SAH blir også forkastet. De utvalgte antistoffer kan anvendes i analysene av de tidligere eksempler. *

Claims (38)

1. Fremgangsmåte for analyse av homocystein i en prøve, karakterisert ved anvendelse av trinn for å bringe nevnte prøve i kontakt med et homocysteinomdannende enzym og minst ett substrat for nevnte enzym forskjellig fra homocystein, og uten kromatografisk separasjon å bestemme en ikke-merket analytt valgt fra et homocystein-ko-substrat og homocystein-omdanningsproduktene av den enzymatiske omdanning av homocystein med nevnte enzym.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved å bringe nevnte prøve i kontakt med et antistoff til nevnte analytt og med et hapten for nevnte antistoff forskjellig fra nevnte ikke-merkede analytt, og hvori bestemmelse av nevnte analytt gjennomføres indirekte ved bestemmelse av nevnte hapten enten bundet eller ikke bundet til nevnte antistoff.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at nevnte hapten er et polyhapten.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at nevnte hapten er et merket molekyl med en epitopisk strukturell enhet som også er tilstede i nevnte ikke-merkede analytt.

5. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 2 til 4, karakterisert ved at nevnte antistoff er et monoklonalt antistoff.

6. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 2 til 5, karakterisert ved at nevnte antistoff er et antistoff bundet til en baerermatriks.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte prøve kontaktes med et andre enzym som tjener til omdanning av nevnte analytt og at bestemmelse av nevnte analytt gjennomføres indirekte ved bestemmelse enten av et substrat av nevnte andre enzym forskjellig fra nevnte analytt eller av et produkt av enzymatisk omdanning av nevnte analytt med nevnte andre enzym.

8. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 7, karakterisert ved at nevnte analytt er nevnte ko-substrat.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at nevnte enzym er S-adenosyl-homocysteinhydrolase og nevnte analytt er adenosin.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved videre å bringe nevnte prøve i kontakt med et adenosinomdannende enzym forskjellig fra nevnte homocysteinomdannende enzym, og nevnte analytt er adenosin, og at bestemmelsen av adenosin blir gjennomført indirekte ved bestemmelse av et ko-substrat eller et reaksjonsprodukt av adenosinomdanning med nevnte adenosinomdannende enzym.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at nevnte adenosinomdannende enzym er adenosinkinase.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at nevnte adenosinomdannende enzym er adenosindeaminase.

13. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 7, karakterisert ved at nevnte analytt er nevnte omdanningsprodukt.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at nevnte enzym er S-adenosyl-homocystein-hydrolase og nevnte analytt er S-adenosyl-homocystein.

15. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 14, karakterisert ved at nevnte prøve er en blod-, plasma- eller urinprøve forhåndsbehandlet med et disulfidbindingsspaltende reduksjonsmiddel.

16. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 15, karakterisert ved å gjennomføre bestemmelsen av nevnte analytt fotometrisk.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 16, karakterisert ved å gjennomføre nevnte bestemmelse spektrometrisk eller kolorimetrisk.

18. Fremgangsmåte ifølge krav 16, karakterisert ved å gjennomføre nevnte bestemmelse turbidimetrisk eller nefelometrisk.

19. Fremgangsmåte ifølge krav 16, karakterisert ved å gjennomføre nevnte bestemmelse ved anvendelse av fluorescenspolarisasjonspåvisning.

20. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 7, 13 til 17 og 19, karakterisert ved indirekte å gjennomføre bestemmelse av nevnte analytt ved påvisning av en kromofor eller fluorofor på merket S-adenosylhomocystein eller på en merket furanose 6-tioeter.

21. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved å behandle en prøve av blod, plasma eller urin med et reduksjonsmiddel; å bringe prøven i kontakt med adenosin og S-adenosyl-homocysteinhydrolase; å inkubere den resulterende blanding og deretter bringe den i kontakt med ATP og adenosinkinase og inkubere blandingen i minst 1 min.; å bringe den resulterende blanding i kontakt med luciferin og luciferase og påvise det dannede lys.

22. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved å behandle en prøve av blod, plasma eller urin med et reduksjonsmiddel; å bringe prøven i kontakt med adenosin og S-adenosyl-homocysteinhydrolase; å inkubere den resulternede blanding og deretter bringe den i kontakt med adenosindeaminase, nukleosidfosforylase, xantinoksydase og en peroksydase, og bestemme blandin-gens UV-absorpsjon.

23. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved å bringe nevnte prøve i kontakt med adenosin og en S-adenosyl-homocystein-hydrolase; å inkubere den resulterende blanding og bringe den i kontakt med et fluoroformerket S-adenosyl-homocystein eller en fluoroformerket furanose 6-tioeter; å bringe den resulterende blanding i kontakt med et monoklonalt anti-S-adenosylhomocysteinantistoff; å bestemme den antistoff-bundede eller ikke-antistoff-bundede fluoroformerkede forbindelse ved fluorescenspolarisasjon for å tilveiebringe en indikasjon på det opprinnelige homocysteininnhold i prøven.

24. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved å bringe nevnte prøve i kontakt med adenosin og en S-adenosyl-homocysteinhydrolase; å inkubere den resulterende blanding og deretter bringe den i kontakt med et merket S-adenosyl-homocystein eller en merket furanose 6-tioeter; å bringe den resulterende blanding i kontakt med bærermatriksbundet monoklonalt anti-S-adenosyl-homocysteinantistoff; å vaske antistoffbærermatriksen; og bestemme den antistoffbundede merkede forbindelsen fotometrisk for å tilveiebringe en indikasjon på det opprinnelige homocysteininnhold i prøven.

25. Fremgangsmåte ifølge krav 24, karakterisert ved å omsette den merkede del av den antistoffbundede merkede forbindelse under dannelse av en kromofor som deretter bestemmes fotometrisk.

26. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved å gjennomføre bestemmelsen ved å bestemme utfellingen eller agglutineringen av antistoff:polyhaptenkonjugater.

27. Analysesett for anvendelse ved analyse av homocystein i en prøve ved en fremgangsmåte ifølge krav 1, hvor nevnte sett omfatter: et homocystein-omdannende enzym; et substrat forskjellig fra homocystein for homocystein-omdanningsreaksjonen katalysert av nevnte enzym; et signaldannende middel; og eventuelt en anordning for signalbestemmelse.

28. Sett ifølge krav 27, karakterisert ved : som nevnte homocystein-omdannende enzym S-adenosyl-homocysteinhydrolase; som signaldannende substrat for nevnte enzym merket S-adenosyl-homocystein; et eventuelt bærermatriksbundet anti-S-adenosylhomocysteinantistoff; og eventuelt, som nevnte anordning for signalbestemmelse, en anordning for fotometrisk bestemmelse av nevnte merkede S-adenosyl-homocystein eller et påvisbart derivat derav, for å tilveiebringe en indikasjon av homocysteininnholdet i prøven.

29. Sett ifølge krav 27, karakterisert ved : som nevnte homocystein-omdannende enzym S-adenosyl-homocysteinhydrolase; som nevnte substrat for nevnte enzym adenosin; et adenosinomdannende enzym forskjellig fra S-adenosyl-homocysteinhydrolase; eventuelt et adenosin-ko-substrat for nevnte adenosinomdannende enzym; og som nevnte anordning for signalbestemmelse en anordning for dannelse av en fotometrisk påvisbar respons fra nevnte ko-substrat eller fra et produkt av enzymatisk omdanning av adenosin med nevnte adenosinomdannende enzym.

30. Sett ifølge krav 29, karakterisert ved at nevnte adenosinomdannende enzym er adenosinkinase, og hvori nevnte middel for dannelse omfatter ATP, luciferin og en luciferase.

31. Sett ifølge krav 29, karakterisert ved at nevnte adenosinomdannende enzym er adenosindeaminase og nevnte middel for dannelse omfatter nukleosidfosforylase, xantinoksydase og en peroksydase.

32. Sett ifølge krav 27, karakterisert ved : som nevnte homocystein-omdannende enzym S-adenosyl-homocysteinhydrolase; som nevnte substrat for nevnte enzym adenosin; et eventuelt matrikspartikkelbundet anti-S-adenosylhomocysteinantistoff; et polyhapten for nevnte antistoff; og eventuelt, som nevnte anordning for signalbestemmelse, en anordning for fotometrisk bestemmelse av agglutinering eller utfelling av antistoff:polyhaptenkomplekser.

33. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved haptenet som anvendes er en forbindelse med formel I (hvor Ri og R2 som kan være de samme eller forskjellige betegner hydrogenatomer eller OR^grupper eller Ri og R2 til sammen betegner et oksygenatom, R3 betegner en amino- eller karboksylgruppe, og R4 betegner en Ci^alifatisk gruppe) eller et salt eller en ester derav.

34. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved å anvende som nevnte hapten en merket furanose 6-tioeter, hvori den merkede gruppe omfatter en kromofor eller fluorofor eller et radioaktivt atom, og hvori tioetergruppen omfatter en trimetylentiogruppe.

35. Fremgangsmåte ifølge krav 34, karakterisert ved å anvende som nevnte merkede tioeter en merket forbindelse med formel I som definert i krav 33.

36. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved som nevnte enzym å anvende inaktivert SAH-hydrolase aktivert ved kontakt med et reduksjonsmiddel.

37. Sett ifølge krav 27, karakterisert ved inaktiv SAH-hydrolase i et første rom og i et andre rom et reduksjonsmiddel, hvorved ved sammenblanding av innholdet av nevnte første og andre rom for å frembringe aktivert SAH-hydrolase.

38. Sett ifølge krav 37, karakterisert ved at nevnte andre rom omfatter ditiotreitol i et surt medium.