DE60131281T2 - Verfahren zum messen von gesamt-homocystein - Google Patents

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Description

  • Bereich der Technik
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Gesamthomocystein.
  • Stand der Technik
  • Es wird berichtet, dass Homocystein, welches eines der metabolischen Zwischenprodukte im Methioninmetabolismus ist, vaskuläre endotheliale Zytotoxizität aufweist und einer der Risikofaktoren für arteriosklerotische Erkrankungen, unabhängig von den anderen Risikofaktoren, ist. Es war auch ersichtlich, dass zusätzlich zu schwerwiegender Hyperhomocystinämie (Homocystinurie), welche durch einen Mangel an metabolischen Homocysteinenzymen verursacht wird, moderate Hyperhomocystinämie durch eine Abnahme der metabolischen Enzymaktivität aufgrund von Abnormität von Genen, Niereninsuffizienz, Alter, Rauchen, Mangel an Bewegung und dergleichen verursacht wird (Jacobsen, Clin. Chem. 44: 8(B), 1998). Darüber hinaus wird auch berichtet, dass Hyperhomocystinämie durch die Aufnahme von Vitamin B6, Folsäure und dergleichen verbessert wird (JAMA 270: 693, 1993). Deshalb besteht nicht nur für eine neonatale Massendurchmusterung (engl. mass screening), sondern auch für eine Vorbeugung von arteriosklerotischen Erkrankungen des Erwachsenen oder einen Nachweis von Vitaminmangelerkrankungen ein Bedarf für ein einfaches Verfahren zum Behandeln einer großen Anzahl an Prüfproben.
  • Der Großteil von Homocystein im Blut (99%) liegt in der Form von oxidierten Disulfidverbindungen (wie ein Komplex mit Protein, Homocystin, Cystein-Homocystein) vor (Jacobsen, Clin. Chem. 44: 8(B), 1998). „Gesamthomocystein" betrifft die Gesamtmenge an oxidierten und reduzierten Homocysteinen und im Allgemeinen ist es notwendig, Homocystein in einer Probe zu reduziertem Homocystein durch ein Reduktionsmittel umzuwandeln, um das Gesamthomocystein zu bestimmen.
  • Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) und Immuntest werden normalerweise zum Bestimmen von Homocystein verwendet. Jedoch werden die HPLC-Geräte, welche bei Hochleistungsflüssigkeitschromatographie verwendet werden, im Allgemeinen nicht beim klinischen Test verwendet und es erfordert Zeit, Arbeit und Kosten, die Geräte zu betreiben. Beim Immuntest wird die Bestimmung, obwohl die Geräte automatisiert sind (Shipchandler, Clin. Chem., 41, 7, 991–994, 1995), durch Kombinieren eines Verfahrens zum Umwandeln von Homocystein zu S-Adenosyl-L-homocystein durch eine Enzymreaktion und eines Verfahrens zum Nachweisen davon durch einen Immuntest durchgeführt, so dass ein Gerät erforderlich ist, welches ausschließlich für diesen Zweck verwendet wird.
  • Bestimmungsverfahren für Homocystein, welche auf einem Immuntest basieren, werden in der Japanischen Patentveröffentlichungsoffenlegung (Tokuhyo) Nr. 9-512634 und (Tokkai) Nr. 10-114797 vorgeschlagen. Bei dem Verfahren, welches in der Japanischen Patentveröffentlichungsoffenlegung Nr. 9-512634 offenbart wird, wird Homocystein immunologisch durch chemisches Modifizieren des Homocystein zur Steigerung der Antigenität bestimmt, was eine große Anzahl an Verfahren erfordert und kompliziert ist. Die Japanische Patentveröffentlichungsoffenlegung Nr. 10-114797 offenbart ein Verfahren zur Bestimmung von Homocystein, aber dieses Verfahren bestimmt direkt nur das an Albumin gebundene Homocystein und bestimmt nicht die Gesamtmenge an Homocystein. In diesem Verfahren können nur etwa 70% des gesamten Homocysteins bestimmt werden.
  • Auf der anderen Seite werden biochemische Bestimmungsverfahren für Homocystein im Japanischen Patent Nr. 2870704 , US Patent Nr. 5,998,191 und 5,885,767 offenbart. Das im Japanischen Patent Nr. 2870704 offenbarte Verfahren ist dadurch charakterisiert, dass dem Homocystein in einer Probe, welche mit einem Reduktionsmittel behandelt wurde, ermöglicht wird, mit Adenosin und S-Adenosyl-L-homocysteinhydrolase in Kontakt zu sein, und die Menge an Adenosin in dem verbleibenden Gemisch bewertet wird. Jedoch wird in diesem Verfahren kein Inhibitor der S-Adenosyl-L-homocysteinhydrolase verwendet und deshalb ist es notwendig, die Bestimmung in einer kinetischen Weise durchzuführen. Darüber hinaus weist dieses Verfahren das Problem auf, dass hergestelltes Wasserstoffperoxid nicht zu einem allgemein verwendeten oxidativen Farbentwicklungsmittel in der Gegenwart eines Reduktionsmittels, welches für ein Reduktionsverfahren verwendet wird, führen kann, welches ein wesentliches Verfahren zur Bestimmung des Gesamthomocysteins ist. Deshalb kann ein automatisches Analysegerät für allgemeine Zwecke nicht verwendet werden. Jedoch offenbaren diese Patentbeschreibungen kein Verfahren zur Vermeidung dieser Probleme.
  • Die Verfahren, welche in der Japanischen Patentveröffentlichungsoffenlegung (Tokuhyo) Nr. 2000-502262 , US Patent Nr. 5,998,191 und 5,885,767 offenbart werden, sind durch das Umsetzen von Homocystein mit Homocysteindesulfurase, Homocysteinase oder Methionin-γ-lyase, wobei das hergestellte Hydrogensulfid, Ammoniak oder 2-Oxobuttersäure nachgewiesen werden, charakterisiert. Jedoch weisen diese Verfahren Probleme auf, wie: das Erfordern einer großen Anzahl an Verfahren; das Verwenden eines Bleiions, welches ein gefährliches Schwermetall ist, für den Nachweis des Hydrogensulfids; und das Beeinflussen durch Cystein und Methionin, welche Strukturanaloga von Homocystein sind und in einer biologischen Probe in einer größeren Menge als Homocystein vorhanden sind.
  • Folglich weisen die herkömmlichen Verfahren zum Bestimmen von Homocystein Probleme auf, wie das Erfordern eines speziellen Gerätes und eines komplizierten Betriebs und das Aufweisen von nicht ausreichender Empfindlichkeit und Spezifität, so dass ein Verfahren zum schnellen, einfachen Bestimmen einer Spurenkonzentration von Homocystein mit hoher Empfindlichkeit bisher noch nicht etabliert wurde.
  • Offenbarung der Erfindung
  • Deshalb ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung eines neuen Verfahrens zur schnellen, einfachen Bestimmung von Homocystein mit hoher Empfindlichkeit, welches in einer biologischen Probe oder dergleichen vorhanden ist, und eines Kits zur Verwendung bei diesem Bestimmungsverfahren.
  • Die Erfinder der vorliegenden Erfindung waren erfolgreich beim Nachweisen oder Bestimmen von Homocystein durch Umsetzen des verbleibenden Methyldonors, des hergestellten methylierten Homocysteins oder eines Enzymreaktionsprodukts davon mit einem D-Aminosäure-umwandelnden Enzym, wobei eine Oxosäure und/oder Ammoniak hergestellt werden, und Nachweisen oder Bestimmen der hergestellten Oxosäure und/oder Ammoniak. Mit dem Verfahren zur Bestimmung von Homocystein der vorliegenden Erfindung kann Ho mocystein in einer biologischen Probe, insbesondere in Körperfluiden wie Blut und Urin, schnell und einfach nachgewiesen und bestimmt werden.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweisen oder Bestimmen von Homocystein in einer Probe, einschließend:
    • (a) das Reduzieren des Homocysteins in der Probe durch eine Thiolverbindung,
    • (b) das Umsetzen des reduzierten Homocysteins mit einer Methyltransferase und einem Methyldonor, wobei ein methyliertes Homocystein hergestellt wird, und
    • (c) das Nachweisen oder Bestimmen des verbleibenden Methyldonors, des hergestellten methylierten Homocysteins oder eines Enzymreaktionsprodukts davon durch Umsetzen des verbleibenden Methyldonors, des hergestellten methylierten Homocysteins oder eines Enzymreaktionsprodukts davon mit einem D-Aminosäure-umwandelnden Enzym, wobei eine Oxosäure und/oder Ammoniak hergestellt werden, und Nachweisen oder Bestimmen der hergestellten Oxosäure und/oder Ammoniak.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Methyltransferase Homocysteinmethyltransferase und der Methyldonor ist D-Methioninmethylsulfonium.
  • In einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist im Schritt (c) das methylierte Homocystein D-Methionin und das D-Methionin wird durch Umsetzen davon mit einem D-Aminosäureumwandelnden Enzym bestimmt.
  • In einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist das D-Aminosäure-umwandelnde Enzym D-Aminosäureoxidase.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird im Schritt (c) das durch eine Umsetzung mit der D-Aminosäureoxidase hergestellte Wasserstoffperoxid durch Farbentwicklung unter Verwendung von Peroxidase und eines oxidativen Farbentwicklungsmittels nachgewiesen oder bestimmt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist das SH-Reagenz ein Maleimidderivat.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden im Schritt (c) eine Abnahme von NAD(P)H oder eine Zunahme von NAD(P) durch Umsetzen der hergestellten Oxosäure und/oder Ammoniak mit Dehydrogenase unter Verwendung von NAD(P)H als ein Coenzym nachgewiesen oder bestimmt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden im Schritt (c) die Oxosäure und/oder Ammoniak, welche durch eine Umsetzung mit der D-Aminosäureoxidase hergestellt wurden, nachgewiesen oder bestimmt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden im Schritt (c) eine Abnahme von NAD(P)H oder eine Zunahme von NAD(P) durch Umsetzung der hergestellten Oxosäure und/oder Ammoniak, welche durch eine Umsetzung mit der D-Aminosäureoxidase hergestellt wurden, mit Dehydrogenase unter Verwendung von NAD(P)H als ein Coenzym nachgewiesen oder bestimmt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Dehydrogenase Leucindehydrogenase und eine Abnahme von NAD(P)H wird durch Umsetzen der hergestellten Oxosäure mit der Leucindehydrogenase in der Gegenwart von Ammoniak und NAD(P)H nachgewiesen oder bestimmt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Dehydrogenase Lactatdehydrogenase und eine Abnahme von NAD(P)H wird durch Umsetzen der hergestellten Oxosäure mit der Lactatdehydrogenase in der Gegenwart von NAD(P)H nachgewiesen oder bestimmt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Dehydrogenase Glutamatdehydrogenase und eine Abnahme von NAD(P)H wird durch Umsetzen des hergestellten Ammoniaks mit der Glutamatdehydrogenase in der Gegenwart von 2-Oxoglutarsäure und NAD(P)H nachgewiesen oder bestimmt.
  • In einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist die Dehydrogenase Lactatdehydrogenase und Glutamatdehydrogenase und eine Abnahme von NAD(P)H wird durch eine Umsetzung mit der Lactatdehydrogenase und der Glutamatdehydrogenase in der Gegenwart von 2-Oxoglutarsäure und NAD(P)H nachgewiesen oder bestimmt.
  • In einer stärker bevorzugten Ausführungsform werden die Schritte (a) und (b) zur selben Zeit durchgeführt.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen Reagenzkit zur Homocysteinbestimmung, welcher eine Thiolverbindung, eine Methyltransferase, die Homocystein als einen Methylakzeptor verwendet, einen Methyldonor und ein D-Aminosäure-umwandelndes Enzym umfasst.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform schließt der Kit ferner NAD(P)H, Dehydrogenase unter Verwendung von NAD(P)H als ein Coenzym und ein Ammoniumsalz oder eine 2-Oxosäure als ihr Cosubstrat ein.
  • In einer stärker bevorzugten Ausührungsform ist die Dehydrogenase Leucindehydrogenase und das Cosubstrat des Enzyms ist ein Ammoniumsalz.
  • In einer anderen stärker bevorzugten Ausführungsform ist die Dehydrogenase Glutamatdehydrogenase und das Cosubstrat des Enzyms ist eine 2-Oxoglutarsäure.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Dehydrogenase Lactatdehydrogenase.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Methyltransferase Homocysteinmethyltransferase und der Methyldonor ist D-Methioninmethylsulfonium.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist das D-Aminosäure-umwandelnde Enzym D-Aminosäureoxidase.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die D-Aminosäureoxidase in einem anderen Behälter von einem für die Thiolverbindung und die Homocysteinmethyltransferase enthalten.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist das SH-Reagenz ein Maleimidderivat.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 ist ein schematisches Diagramm der Umsetzung, wenn Homocysteintransferase und D-Methioninmethylsulfonium als ein Homocystein-umwandelndes Enzym und ein Homocystein-Cosubstrat verwendet werden.
  • 2 ist ein Graph, der den zeitlichen Verlauf der Umsetzung von D-Aminosäureoxidase, welche von Schweinenieren abgeleitet wurde, in Bezug auf D-Methionin und D-Methioninmethylsulfonium zeigt.
  • 3 ist ein Graph, der den zeitlichen Verlauf der Umsetzung von D-Aminosäureoxidase, welche von Pilzen abgeleitet wurde, in Bezug auf D-Methionin und D-Methioninmethylsulfonium zeigt.
  • 4 ist ein Graph, der die Wirkungen eines SH-Reagenzes auf ein D-Methionin-Bestimmungssystem unter Verwendung eines oxidativen Farbentwicklungsmittels in der Gegenwart eines Reduktionsmittels zeigt.
  • 5 ist ein Graph, der die Dosisabhängigkeit zeigt, wenn eine Homocystin-Prüfprobe als eine Probe verwendet wird.
  • 6 ist ein Graph, der die Extinktion in jedem Fall zeigt, wobei ein Reagenz mit zugegebenem D-Methioninmethylsulfonium verwendet wird und wobei ein Reagenz ohne dieses verwendet wird, wenn Homocystein in einer Serumprobe bestimmt wird.
  • 7 ist ein Graph, der die Ergebnisse der Bestimmung von Homocystein in einer Serumprobe unter Verwendung eines hoch-empfindlichen Farbentwicklungsmittels zeigt.
  • 8 ist ein Graph, der die Korrelation der Werte, welche durch Bestimmen von Homocystein in einer Serumprobe durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung (MTase-Verfahren I) und das herkömmliche HPLC-Verfahren erhalten wurden, zeigt.
  • 9 ist ein Graph, der die Dosisabhängigkeit eines D-Methionin-Bestimmungssystems unter Verwendung von D-Aminosäureoxidase und Leucindehydrogenase zeigt.
  • 10 ist ein Graph, der die Dosisabhängigkeit eines Homocystein-Bestimmungssystems (das Verfahren der vorliegenden Erfindung: MTase-Verfahren II) unter Verwendung von Homocysteinmethyltransferase, D-Aminosäureoxidase und Leucindehydrogenase zeigt.
  • 11 ist ein Graph, der die Dosisabhängigkeit eines Homocystein-Bestimmungssystems (das Verfahren der vorliegenden Erfindung: MTase-Verfahren II) unter Verwendung von Homocysteinmethyltransferase, D-Aminosäureoxidase und Glutamatdehydrogenase zeigt.
  • 12 ist ein Graph, der die Dosisabhängigkeit eines 4-Methylthio-2-oxobuttersäure-Bestimmungssystems unter Verwendung von Lactatdehydrogenase zeigt.
  • Beste Weise zur Durchführung der Erfindung
  • Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist durch das Umsetzen von Homocystein in einer Probe mit einer Methyltransferase in der Gegenwart eines Methyldonors und dann Bestimmen des hergestellten D-Aminosäurederivats oder D-Aminosäureanalogons charakterisiert. Beispiele des Methyldonors schließen D-Methioninmethylsulfonium, S-Adenosyl-D-methionin und D-Ethioninmethylsulfonium ein. Bevorzugt kann D-Methioninmethylsulfonium verwendet werden.
  • Die Grundlagen der Bestimmung der vorliegenden Erfindung werden mit Bezug auf 1 beschrieben, wobei eine Methyltransferase und D-Methioninmethylsulfonium als das Homocystein-umwandelnde Enzym und das Homocystein-Cosubstrat verwendet werden.
  • Beispiele unter Verwendung eines SH-Reagenzes zur Bestimmung von Homocystein werden in der Japanischen Patentveröffentlichungsoffenlegung (Tokuhyo) Nr. 9-512634 und US Patent Nr. 6,020,206 beschrieben. Wie vorstehend beschrieben, ist Ersteres ein Verfahren, welches das chemische Modifizieren von Homocystein zur Steigerung der Immunogenität und das Nachweisen davon in immunologischer Weise einschließt, und bei dem Verfahren wird eine SH-Verbindung als das Modifizierungsmittel verwendet. Das Letztere ist ein Ver fahren, welches das Umwandeln von Homocystein zu Homocysteinthiolacton, um die Thiolgruppe zu schützen, das Entfernen von anderen Verbindungen mit einer Thiolgruppe, wie Cystein, welche in der Probe enthalten sind, mit einem SH-Reagenz, das Öffnen des Rings des Thiolactons und das Bestimmen des Homocysteins einschließt. Beide Verfahren weisen vollständig unterschiedliche Grundlagen der Bestimmung zu denen der vorliegenden Erfindung auf und das SH-Reagenz wird für einen anderen Zweck als den der vorliegenden Erfindung verwendet. Darüber hinaus gibt es für die Bestimmung von freien Fettsäuren einige Beispiele, wobei ein SH-Reagenz verwendet wird, um ein Cosubstrat CoA daran zu hindern, die Bestimmung unter Verwendung eines oxidativen Farbentwicklungsmittels zu beeinflussen ( Japanische Patentveröffentlichungsoffenlegung (Tokkai) Nr. 55-64800 und 57-8797 ). Jedoch wird die Bestimmung in Bezug auf unterschiedliche Punkte durchgeführt, so dass nicht vorausgesagt werden kann, ob das SH-Reagenz in der vorliegenden Erfindung wirksam ist oder nicht.
  • Beispiele des SH-Reagenzes schließen ein Oxidationsmittel wie das Ellman-Reagenz, ein Mercaptid-bildendes Mittel wie p-Quecksilberbenzoesäure, und ein Alkylierungsmittel wie Iodessigsäure und N-Ethylmaleimid, wie in Seikagakujiten (Biochemical Dictionary) (3. Ausgabe, S. 182, Tokyo Kagaku Dojin, 1998) beschrieben, ein. Bevorzugt kann ein Alkylierungsmittel und stärker bevorzugt eine Maleimidverbindung und am stärksten bevorzugt N-Ethylmaleimid verwendet werden.
  • Jede Probe kann als die Testprobe verwendet werden, welche dem Verfahren der vorliegenden Erfindung unterworfen wird, solange man annimmt, dass sie Homocystein enthält. Das Homocystein kann in der Form von nicht nur reduziertem Homocystein, sondern auch von oxidiertem Homocystein, welches an ein anderes Molekül durch eine Disulfidbindung gebunden ist, wie ein Komplex mit Protein, ein Homocysteindimer und ein Homocystein-Cystein-Dimer, vorhanden sein. Zum Beispiel können Serum, Plasma, Blut, Urin und eine Verdünnung davon verwendet werden.
  • Die in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendete Thiolverbindung ist nicht besonders eingeschränkt und schließt zum Beispiel Dithiothreitol, Mercaptoethanol, N-Acetylcystein, Dithioerythritol und Thioglycolsäure ein. Jede Konzentration kann als die Konzentration der Thiolverbindung verwendet werden, solange sie ermöglicht, dass oxidiertes Homocystein in reduziertes Homocystein umgewandelt wird. Bevorzugt beträgt die Konzentration 0,1 mM oder mehr, bezogen auf eine Thiolgruppe, und stärker bevorzugt 1 mM oder mehr.
  • Die Grundlagen der Bestimmung, wenn eine Methyltransferase und D-Methioninmethylsulfonium verwendet werden (Methyltransferaseverfahren (hier nachstehend als MTase-Verfahren bezeichnet))
  • Die Grundlagen der Bestimmung des Falls, wobei eine Methyltransferase unter Verwendung von Homocystein als ein Methylakzeptor und D-Methioninmethylsulfonium, welches ein Methyldonor ist, verwendet werden, werden mit Bezug auf 1 beschrieben. Mit anderen Worten, in diesem Falle wird das Homocystein in einer Probe mit einer Methyltransferase und D-Methioninmethylsulfonium umgesetzt und dann wird das hergestellte D-Methionin bestimmt.
  • (1) MTase-Verfahren I
  • Jede Methyltransferase kann verwendet werden, solange sie sich mit D-Methioninmethylsulfonium und L-Homocystein umsetzt und die Herstellung von D-Methionin und L-Methionin katalysiert. Beispiele der Methyltransferase schließen Homocysteinmethyltransferase [EC 2.1.1.10], 5-Methyltetrahydrofolsäure-Homocystein-S-Methyltransferase [EC 2.1.1.13], 5-Methyltetrahydropteroyltriglutaminsäure-Homocystein-S-Methyltransferase [EC 2.1.1.14] ein. Bevorzugt kann Homocysteinmethyltransferase [EC 2.1.1.10] verwendet werden. Der phylogenetische Name von Homocysteinmethyltransferase ist S-Adenosyl-L-methionin:L-Homocystein-S-Methyltransferase und dieses Enzym stellt L-Methionin und S-Adenosyl-L-homocystein unter Verwendung von L-Homocystein, welches ein Methylakzeptor ist, und S-Adenosyl-L-methionin, welches ein Methyldonor ist, als die Substrate her (Enzyme handbook, Asakura Syoten, 1982). Darüber hinaus hat S. K. Shapiro berichtet, dass dieses Enzym auch S-Methyl-L-methionin (L-Methioninmethylsulfonium) oder S-Adenosyl-D-methionin als den Methyldonor verwendet (Biochim. Biophys. Acta, 29, 405–409, 1958).
  • Dieser Bericht bestätigt auch die Ergebnisse von Markierungsexperimenten mit einem Radioisotop, dass Methionin durch die Methylgruppe von S-Adenosylmethionin, welche auf Homocystein übertragen wird, hergestellt wird und nicht durch die Bindung zwischen einer Ribose und einem Schwefelatom des S-Adenosylmethionins, welche geöffnet wird. Deshalb werden, wenn S-Adenosyl-L-methionin als der Methyldonor verwendet wird, L-Methionin und S-Adenosyl-L-homocystein hergestellt. Wenn L-Methioninmethylsulfonium als der Methyldonor verwendet wird, werden zwei L-Methioninmoleküle hergestellt. Wenn S-Adenosyl-D-methionin als der Methyldonor verwendet wird, werden L-Methionin und S-Adenosyl-D-homocystein hergestellt. In allen Fällen wird L-Methionin hergestellt, so dass die Menge des Homocysteins quantitativ durch die Bestimmung des L-Methionins bestimmt werden kann.
  • Jedoch ist L-Methionin im Allgemeinen in einer biologischen Probe in einer größeren Menge als Homocystein (3 bis 5 Mal mehr im Plasma) enthalten, so dass es notwendig ist, vorher L-Methionin in einer Weise zu entfernen, welche Homocystein nicht beeinflusst, und spezifisch das L-Methionin zu bestimmen, welches durch eine Homocysteinmethyltransferase-Reaktion hergestellt wird, was ein komplizierter Vorgang ist, und deshalb ist dieses Verfahren nicht bevorzugt. Auf der anderen Seite haben G. Grue-Sorensen et al. berichtet, dass Homocysteinmethyltransferase D-Methionin unter Verwendung von D-Methioninmethylsulfonium als der Methyldonor herstellt (J. Chem. Soc. Perkin Trans. I 1091–7 (1984)), obwohl die Spezifität niedrig ist. Aus diesem Grund wird im Verfahren der vorliegenden Erfindung, welche diese Umsetzung verwendet, D-Methionin, welches im Wesentlichen nicht in einer biologischen Probe vorhanden ist, hergestellt und dann wird das D-Methionin bestimmt, um so spezifisch Homocystein quantitativ zu bestimmen.
  • Von jedweden Quellen abgeleitete Homocysteinmethyltransferase kann als die Homocysteinmethyltransferase für die vorliegende Erfindung verwendet werden, solange sie D-Methioninmethylsulfonium als den Methyldonor verwendet. Zum Beispiel können Enzyme, welche von Bakterien, Hefen, Ratten oder dergleichen abgeleitet sind, verwendet werden.
  • Es gibt in Bezug auf das Verfahren zur quantitativen Bestimmung von D-Methionin keine besondere Einschränkung, aber es ist bevorzugt, es enzymatisch mit einem D-Aminosäureumwandelnnden Enzym zu bestimmen. Stärker bevorzugt wird D-Aminosäureoxidase [EC 1.4.3.3] verwendet. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben unerwarteterweise gezeigt, dass D-Methioninmethylsulfonium, welches eine D-Aminosäure ist, im Wesentlichen nicht als ein Substrat für D-Aminosäureoxidase dienen kann. Folglich, wenn sich das D-Aminosäure-umwandelnde Enzym nicht mit dem D-Methioninmethylsulfonium umsetzt, oder obwohl sich dieses Enzym sogar damit umsetzt, wenn das Enzym eine ausreichend niedrigere Reaktivität als die in Bezug auf D-Methionin aufweist, kann das hergestellte D-Methionin bestimmt werden, ohne das D-Methioninmethylsulfonium, welches nach der Umsetzung mit Homocysteinmethyltransferase bleibt, von dem Reaktionssystem zu entfernen. Zusätzlich zu D-Aminosäureoxidase können D-Aminosäureacetyltransferase [EC 2.3.1.36], D-Aminosäuredehydrogenase [EC 1.4.99.1] und dergleichen, welche ähnliche Eigenschaften aufweisen, verwendet werden (1).
  • Wie in 1 gezeigt, wenn D-Methionin mit D-Aminosäureoxidase umgesetzt wird, wird Wasserstoffperoxid hergestellt. Dieses Wasserstoffperoxid führt zu einem oxidativen Farbentwicklungsmittel, welches allgemein in der Gegenwart eines SH-Reagenzes verwendet wird, um es so kolorimetrisch zu bestimmen. Darüber hinaus, wenn D-Methionin mit D-Aminosäureacetyltransferase umgesetzt wird, führt das hergestellte Coenzym A zu Wasserstoffperoxid durch Acyl-Coenzym A-Synthetase [EC 6.2.1.3] und eine Acyl-Coenzym A-Oxidase [EC 1.3.3.6] und dieses Wasserstoffperoxid kann in der gleichen Weise quantitativ bestimmt werden.
  • (2) MTase-Verfahren II
  • Wenn D-Methionin mit D-Aminosäureoxidase oder D-Aminosäuredehydrogenase umgesetzt wird, werden Ammoniak und 4-Methylthio-2-oxobuttersäure hergestellt. Homocystein kann durch Bestimmen dieser Produkte quantitativ bestimmt werden.
  • Ammoniak kann quantitativ bestimmt werden durch das Umsetzen des Ammoniaks mit reduziertem Nikotinamidadenindinukleotid (NADH), reduziertem Nikotinamidadenindinukleotidphosphat (NADPH) oder Derivaten davon (hier nachstehend in dieser Beschreibung als NAD(P)H bezeichnet), 2-Oxoglutarsäure und Glutamatdehydrogenase ([EC 1.4.1.2], [EC 1.4.1.3] oder [EC 1.4.1.4]) und das Bestimmen einer Abnahme von NAD(P)H durch Messen der Extinktionsveränderung bei 340 nm. Alternativ kann eine Zunahme von NAD oder NADP oder Derivaten davon (hier nachstehend in dieser Beschreibung als NAD(P) bezeichnet) bestimmt werden. Beispiele der Derivate von NAD(P)H schließen Thio-NAD(P)H und 3-Acetylpyridinadenindinukleotid (oder 3-Acetylpyridindinukleotidphosphat) ein. Für die Bestimmung von Ammoniak kann zusätzlich zu Glutamatdehydrogenase, wie vorstehend beschrieben, jedwede Dehydrogenase verwendet werden, solange sie eine reduktive Aminierungsreaktion unter Verwendung von Ammoniak mit NAD(P)H als ein Coenzym katalysieren kann. Zum Beispiel können Leucindehydrogenase ([EC 1.4.1.9]), Alanindehydrogenase ([EC 1.4.1.1]), Serindehydrogenase ([EC 1.4.1.7]), Valindehydrogenase ([EC 1.4.1.8]) und Glycindehydrogenase ([EC 1.4.1.10]) verwendet werden. Als ein Cosubstrat für diese Dehydrogenasen können ein Ammoniumsalz, eine 2-Oxosäure oder dergleichen verwendet werden. Beispiele der 2-Oxosäure schließen Brenztraubensäure, 2-Oxobuttersäure, 2-Oxoisocapronsäure, 2-Oxoisovaleriansäure, 2-Oxovaleriansäure, 2-Oxocapronsäure, Glyoxylsäure und Hydroxybrenztraubensäure, zusätzlich zu 2-Oxoglutarsäure wie vorstehend beschrieben, ein.
  • Ammoniak kann quantitativ unter Verwendung eines Nessler-Reagenz, eines pH-Wert-Indikators, eines Elektrodenverfahrens oder eines anderen Verfahrens bestimmt werden.
  • 4-Methylthio-2-oxobuttersäure kann quantitativ durch Umsetzen der 4-Methylthio-2-oxobuttersäure mit NADH, Ammoniak und Leucindehydrogenase [EC 1.4.1.9] und Bestimmen von zum Beispiel einer Abnahme von NADH durch Messen der Extinktionsveränderung bei 340 nm wie im Falle von Ammoniak bestimmt werden. Es ist bekannt, dass 4-Methylthio-2-oxobuttersäure als ein Substrat von Leucindehydrogenase dient (G. Livesey et al. Methods in Enzymology, 166, 282–288, 1988). Für die Bestimmung von 4-Methylthio-2-oxobuttersäure kann, zusätzlich zur Leucindehydrogenase wie vorstehend beschrieben, jedwede Dehydrogenase verwendet werden, solange sie 4-Methylthio-2-oxobuttersäure reduzieren kann. Zum Beispiel kann Lactatdehydrogenase ([EC 1.1.1.27]) verwendet werden.
  • Es ist bekannt, dass es unwahrscheinlich ist, dass das Verfahren zum Führen von 4-Methylthio-2-oxobuttersäure oder Ammoniak zu einem System, welches zur quantitativen Bestimmung durch die Extinktionsveränderung bei 340 nm von NAD(P)H verwendet wird, von einem Reduktionsmittel beeinflusst wird. Deshalb besteht kein Bedarf für die Verwendung eines SH-Reagenzes (Ikeda et al. Rinshokensa (Clinical test), 41, 989–993, 1997). Ein Beispiel für das Führen von ihnen zu einem quantitativen NAD(P)H-Bestimmungssystem in der Gegenwart eines Reduktionsmittels ist ein Bestimmungsverfahren von Kreatinkinase in Blut (Rinshokagaku (Clinical Chemistry), 19, 189–208, 1990).
  • In dem Bestimmungssystem, in welchem Ammoniak oder 4-Methylthio-2-oxobuttersäure durch D-Aminosäureoxidase hergestellt werden, ist es möglich, Wasserstoffperoxid zu entfernen, welches eines der Produkte ist, durch die Verwendung von Katalase, um die Wirkung davon zu vermeiden.
  • Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann manuell oder durch automatische Analyse verwendet werden. Wenn zum Beispiel ein herkömmliches automatisches Analysegerät für ein Zwei-Reagenz-System verwendet wird, wird das Verfahren in das erste Verfahren von Durchführen der Homocysteinmethyltransferase-Reaktion und das zweite Verfahren von Bestimmen des D-Methionins aufgeteilt, um so in einfacher Weise Homocystein in einer biologischen Probe zu bestimmen.
  • Bei der quantitativen Bestimmung von Homocystein durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung hängt die Genauigkeit von der D-Aminosäure in der Probe ab, aber die Menge der D-Aminosäure in einer biologischen Probe ist sehr klein. Jedoch wurde berichtet, dass die Menge einer D-Aminosäure bei einer bestimmen Art von Erkrankung erhöht sein kann. Um die Wirkung der D-Aminosäuren zu vermeiden, wird deshalb die Bestimmung mit einem Reagenz durchgeführt, welches in der gleichen Weise hergestellt wird, außer dass es keine Homocysteinmethyltransferase enthält, und das Ergebnis wird von dem Wert subtrahiert, der durch die Bestimmung in einer Probe erhalten wurde, welche dieses Enzym enthielt, so dass die Menge an Homocystein genau bestimmt werden kann.
  • Wenn die Extinktion von NADH nachgewiesen wird, wird zuerst ein Reagenz für eine Reduktionsreaktion und das zweite Verfahren zu einer Probe gegeben, um eine Umsetzung hervorzurufen, und dann wird ein Reagenz, welches Homocysteinmethyltransferase für das erste Verfahren enthält, dazu gegeben, um eine Umsetzung hervorzurufen. Dann wird der Unterschied in der Extinktion am Ende von jeder Umsetzung erhalten, was es möglich macht, quantitativ Homocystein ohne jedwede Wirkung von endogenen Substanzen wie D-Aminosäure zu bestimmen.
  • Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung einen Kit zur Bestimmung von Homocystein in einer Probe bereit, umfassend (a) eine Thiolverbindung zur Reduktion von Homocystein, (b) eine Methyltransferase, welche Homocystein als einen Methylakzeptor verwendet, und einen Methyldonor zur Umsetzung mit dem reduzierten Homocystein (erstes Verfahren), und (c) (i) ein SH-Reagenz und ein oxidatives Farbentwicklungsmittel oder (ii) eine Dehydrogenase unter Verwendung von NAD(P)H als ein Coenzym und ein Cosubstrat oder ein Farbentwicklungsmittel gemäß den Eigenschaften der Dehydrogenase zur Bestimmung des verbleibenden Methyldonors oder des hergestellten methylierten Homocysteins (zweites Verfahren). Um das Reduktionsverfahren und das erste Verfahren zur selben Zeit durchzuführen, können (a) und (b) zusammen enthalten sein. Insbesondere wenn (c) (ii) verwendet wird, können (a), (b) und (c) zusammen enthalten sein.
  • Beispiele
  • Beispiel 1 Herstellung von Homocysteinmethyltransferase
  • Das Verfahren von S. K. Shapiro (Methods Enzymol., 17 Pt. B, 400–405, 1971) wurde teilweise modifiziert, um eine Homocysteinmethyltransferase-Enzymlösung in der folgenden Weise herzustellen.
  • Zuerst wurden 250 g Bäckerhefe (hergestellt von Oriental Yeast Co., Ltd.) in 125 ml destilliertem Wasser suspendiert und auf 37°C erwärmt und dann wurden dazu 16,3 g Natriumhydrogencarbonat und 44 ml Toluol mit Rühren gegeben. Das Gemisch wurde für 90 Minuten mit Rühren bei 37°C inkubiert und dann wurde dazu ein gleiches Volumen an eisgekühltem destilliertem Wasser gegeben und das Gemisch wurde schnell abgekühlt. Diese Lösung wurde bei 7000 UpM für 30 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde durch ein Papiertuch filtriert und das Filtrat wurde ferner bei 9000 UpM für 90 Minuten zentrifugiert und der Überstand wurde gesammelt.
  • Dann wurde L-Methionin mit Rühren unter Eiskühlen zugegeben, so dass die Endkonzentration 0,5% betrug, und es wurde über etwa 60 Minuten gelöst. Die Temperatur der Lösung wurde bei 3°C oder niedriger gehalten und auf etwa –20°C gekühltes Ethanol wurde mit einer Rate von 20 ml/min mit Rühren zugegeben. An dem Punkt, an dem die Konzentration von Ethanol etwa 25% erreicht hatte, wurde das Abkühlen durch Erniedrigen der Temperatur des Kühlbades auf –10°C oder niedriger unter Verwendung von Salz-Eis gestartet. Dann wurde Ethanol in der gleichen Weise zugegeben, bis die Endkonzentration 53% erreichte, und dann ließ man die Lösung bei –20°C für 16 Stunden stehen. Dann wurde die Lösung bei 9000 UpM und –10°C für 60 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt und Ethanol wurde unter den gleichen Bedingungen zugegeben, bis die Endkonzentration 70% erreichte, während auf –10°C oder niedriger unter Verwendung von Salz-Eis gekühlt wurde. Nach der Zugabe ließ man die Lösung für eine Stunde stehen und zentrifugierte bei 9000 UpM und –10°C für 90 Minuten.
  • Der resultierende Niederschlag wurde in etwa 7 ml 10 mM Kaliumphosphat-Puffer (pH-Wert 6,8) gelöst. Die gelöste Lösung wurde zweimal gegen den gleichen Puffer dialysiert und dann auf etwa 1,5 ml mit einer Zentrifugenaufkonzentriervorrichtung (Centriprep-10, hergestellt von Amicon) aufkonzentriert. So wurde eine Enzymlösung erhalten.
  • Dann wurde die Homocysteinmethyltransferase-Aktivität der erhaltenen Enzymlösung in der folgenden Weise bestimmt. Zuerst wurden 60 mM Phosphat-Puffer (pH-Wert 7,4), 10% der Enzymlösung, 1 mM Dithiothreitol, 0,2 mM Homocystin (H-6010, hergestellt von Sigma-Aldrich Corp.) und 0,4 mM iodiertes L-Methioninmethylsulfonium (27794-0250, hergestellt von Across) oder bromiertes D-Methioninmethylsulfonium (29939-0010, hergestellt von Across) gemischt und man ließ bei 37°C für 2 Stunden umsetzen. Das Gemisch wurde auf eine Dünnschichtplatte (Platte für Dünnschichtchromatographie) in einer Menge von etwa 8 μl für jeden Punkt aufgetüpfelt und wurde mit 95%iges Ethanol/28%iger wässriger Ammoniak (77:23, v/v) entwickelt und dann wurde eine Farbentwicklung mit Ninhydrin durchgeführt. Als ein Ergebnis wurde bestätigt, dass in jedem Fall, wobei L-Methioninmethylsulfonium oder D-Methioninmethylsulfonium als das Substrat verwendet wurden, Methionin in dem Reaktionsprodukt enthalten war. Auf der anderen Seite wurde bestätigt, dass, wenn Homocystein, welches ein Methylakzeptor ist, von dem Reaktionssystem entfernt worden war, Methionin nicht hergestellt wurde.
  • Durch das Vorstehende wurde bestätigt, dass die erhaltene Enzymlösung Homocysteinmethyltransferase-Aktivität aufweist und dass diese Enzymlösung nicht nur L-Methionin methylsulfonium sondern auch D-Methioninmethylsulfonium als den Methyldonor verwenden kann.
  • Beispiel 2 Reaktivität der D-Aminosäureoxidase, welche von Schweinenieren abgeleitet wurde, in Bezug auf D-Methionin und D-Methioninmethylsulfonium
  • Die Reaktivität der D-Aminosäureoxidase, welche von Schweinenieren abgeleitet wurde, in Bezug auf D-Methionin und D-Methioninmethylsulfonium wurde unter Verwendung eines automatischen Analysegerätes, Hitachi 7170, in der folgenden Weise bestimmt. Zuerst wurden 200 μl eines Reagenzes 1, welches 92 mM Phosphat-Puffer (pH-Wert 7,4), 1,3 mM 4-Aminoantipyrin und 3,3 U/ml Peroxidase enthielt, zu 10 μl einer Probe, welche 1,3 mM D-Methionin enthielt, gegeben und man ließ bei 37°C für etwa 5 Minuten umsetzen. Dann wurden 50 μl eines Reagenzes 2, welches 69 mM Phosphat-Puffer (pH-Wert 7,4), 5,2 mM TOOS, 2,6 U/ml D-Aminosäureoxidase, welche von Schweinenieren abgeleitet wurde (hergestellt von Sigma-Aldrich Corp.), und 2,6 mM Flavinadenindinukleotid (FAD) enthielt, dazu gegeben und man ließ weiter für etwa 5 Minuten bei 37°C umsetzen. Die Extinktionsveränderung wurde bei einer Primärwellenlänge von 546 nm und einer Sekundärwellenlänge von 700 nm nachgewiesen. Darüber hinaus wurden eine Probe, welche 1,3 mM bromiertes D-Methioninmethyisuifonium enthielt, und eine Probe, welche 1,3 mM D-Methionin und 1,3 mM bromiertes D-Methioninmethylsulfonium enthielt, genau in dieser Weise bestimmt. 2 zeigt den zeitlichen Verlauf der Umsetzung. Die D-Aminosäureoxidase, welche von Schweinenieren abgeleitet wurde, setzte sich verglichen mit D-Methionin (•) kaum mit D-Methioninmethylsulfonium (Δ) um. Es wurde auch gefunden, dass die Reaktivität mit D-Methionin nicht verändert war, sogar in der Gegenwart von D-Methioninmethylsulfonium
    Figure 00170001
  • Beispiel 3 Reaktivität der D-Aminosäureoxidase, welche von Pilzen abgeleitet wurde, in Bezug auf D-Methionin und D-Methioninmethylsulfonium
  • Die Reaktivität wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 bestimmt, außer dass die D-Aminosäureoxidase, welche von Schweinenieren abgeleitet wurde, mit der D-Aminosäureoxidase, welche von Pilzen abgeleitet wurde (Fusarium, hergestellt von Ikedatohka Kogyo), ersetzt wurde. 3 zeigt den zeitlichen Verlauf der Umsetzung. Es war ersichtlich, dass sich die D-Aminosäureoxidase, welche von Pilzen abgeleitet wurde, verglichen mit D-Methionin (•) auch kaum mit D-Methioninmethylsulfonium (Δ) umsetzte. Darüber hinaus wurde auch gefunden, dass die Reaktivität mit D-Methionin nicht verändert war, sogar in der Gegenwart von D-Methioninmethylsulfonium
    Figure 00180001
  • Beispiel 4 Wirkung von N-Ethylmaleimid auf ein D-Methionin-Bestimmungssystem unter Verwendung eines oxidativen Farbentwicklungsmittels in der Gegenwart eines Reduktionsmittels
  • Als nächstes wurde D-Methionin unter Verwendung eines automatischen Analysegerätes, Hitachi 7170, in der folgenden Weise bestimmt. Zuerst wurden 200 μl eines Reagenzes 1, welches 100 mM Phosphat-Puffer (pH-Wert 7,4), 1 mM TOOS und 0,05% Triton X-100 enthielt, zu 20 μl von 0, 0,0625, 0,125, 0,25, 0,5 oder 1 mM D-Methionin, welches 5 mM Dithiothreitol (DTT) enthielt, gegeben und man ließ bei 37°C für etwa 5 Minuten umsetzen. Dann wurden 50 μl eines Reagenzes 2, welches 100 mM Phosphat-Puffer (pH-Wert 7,4), 4 mM 4-Aminoantipyrin, 1 U/ml D-Aminosäureoxidase, 17,6 U/ml Peroxidase, 1 mM FAD und 0,05% Triton X-100 enthielt, dazu gegeben und man ließ weiter für etwa 5 Minuten bei 37°C umsetzen. Die Extinktionsveränderung (bei einer Primärwellenlänge von 546 nm und einer Sekundärwellenlänge von 700 nm) vom Nachweispunkt 16 bis 34 wurde gemessen. Dann wurde ein Reagenz in der gleichen Weise hergestellt, außer dass 2,8 mM N-Ethylmaleimid (NEM) zu dem Reagenz 1 gegeben wurden, und die Bestimmung wurde für den Fall der NEM-Zugabe in der gleichen Weise durchgeführt.
  • Wie in 4 gezeigt, wurde, als die Bestimmung unter Verwendung des Reagenzes ohne NEM durchgeführt wurde (o), D-Methionin überhaupt nicht nachgewiesen wegen dem Dithiothreitol, welches in der Probe enthalten war. Auf der anderen Seite wurde eine lineare Dosisabhängigkeit erkannt, als die Bestimmung unter Verwendung des Reagenzes mit NEM durchgeführt wurde (•), und es wurde gefunden, dass das D-Methionin bestimmt werden kann.
  • Beispiel 5 Untersuchung der Dosisabhängigkeit unter Verwendung einer Homocystein-Prüfprobe im Verfahren der vorliegenden Erfindung (MTase-Verfahren I)
  • Zuerst wurden 0, 100 oder 200 μM Homocystin (0, 200 beziehungsweise 400 μM, ausgedrückt als Homocystein), 86 mM Phosphat-Puffer (pH-Wert 7,4), 10% der Enzymlösung, 4 mM Dithiothreitol und 1,5 mM bromiertes D-Methioninmethylsulfonium bei 37°C für 90 Minuten umgesetzt.
  • Die Menge des D-Methionins in dem Reaktionsgemisch wurde unter Verwendung eines automatischen Analysegerätes, Hitachi 7170, in der folgenden Weise bestimmt. Zuerst wurden 200 μl eines Reagenzes 1, welches 100 mM Phosphat-Puffer (pH-Wert 7,4), 1 mM TOOS und 1,7 mM N-Ethylmaleimid (NEM) enthielt, zu 30 μl der Probe (Reaktionsgemisch) gegeben und man ließ bei 37°C für etwa 5 Minuten umsetzen. Dann wurden 50 μl eines Reagenzes 2, welches 100 mM Phosphat-Puffer (pH-Wert 7,4), 4 mM 4-Aminoantipyrin, 1 U/ml D-Aminosäureoxidase, 17,6 U/ml Peroxidase und 0,2 mM FAD enthielt, dazu gegeben und man ließ weiter für etwa 5 Minuten bei 37°C umsetzen. Die Extinktionsveränderung (bei einer Primärwellenlänge von 546 nm und einer Sekundärwellenlänge von 700 nm) vom Nachweispunkt 16 bis 34 wurde gemessen. Die Ergebnisse sind in 5 mit der Homocystin-Konzentration auf der horizontalen Achse und der Extinktionsveränderung (× 10000) auf der vertikalen Achse gezeigt.
  • Wie in 5 gesehen wird, steigt die Extinktionsveränderung abhängig von der Homocystin-Dosis (•). Auf der anderen Seite wurde die Dosisabhängigkeit nicht gesehen, als D-Methioninmethylsulfonium nicht zugegeben wurde (Δ) und als das Enzym nicht zugegeben wurde (☐).
  • 6 Untersuchung der Dosisabhängigkeit von Serum-Homocystein im Verfahren der vorliegenden Erfindung (MTase-Verfahren I)
  • Zuerst wurden 50 μl einer Behandlungslösung, welche 50 mM Phosphat-Puffer (pH-Wert 7,4), 30% der Enzymlösung, 15 mM Dithiothreitol und 3 mM bromiertes D-Methioninmethylsulfonium enthielt, zu 100 μl einer Probe gegeben, in welcher 0, 10, 20, 30, 40 oder 50 μM Homocystin (0 bis 100 μM, ausgedrückt als Homocystein) zu normalem Kontrollserum SERACLEAR HE (AZWELL Inc.) gegeben worden waren, damit gemischt und man ließ bei 37°C für 90 Minuten umsetzen.
  • Die Menge des D-Methionins in dem Reaktionsgemisch wurde unter Verwendung eines automatischen Analysegerätes, Hitachi 7170, in der folgenden Weise bestimmt. Zuerst wurden 200 μl eines Reagenzes 1, welches 100 mM Phosphat-Puffer (pH-Wert 7,4), 1 mM TOOS, 2,8 mM NEM und 0,05% Triton X-100 enthielt, zu 20 μl der Probe (Reaktionsgemisch) gegeben und man ließ bei 37°C für etwa 5 Minuten umsetzen. Dann wurden 50 μl eines Reagenzes 2, welches 100 mM Phosphat-Puffer (pH-Wert 7,4), 4 mM 4-Aminoantipyrin, 1 U/ml D-Aminosäureoxidase, 17,6 U/ml Peroxidase, 1 mM FAD und 0,05% Triton X-100 enthielt, dazu gegeben und man ließ weiter für etwa 5 Minuten bei 37°C umsetzen. Die Extinktionsveränderung (bei einer Primärwellenlänge von 546 nm und einer Sekundärwellenlänge von 700 nm) vom Nachweispunkt 16 bis 34 wurde gemessen. Die Ergebnisse sind in 6 mit der zugegebenen Homocystin-Konzentration auf der horizontalen Achse und den Unterschieden bei der Extinktion aus der vertikalen Achse gezeigt, wobei die Unterschiede durch Subtrahieren der Extinktionsveränderung (× 10000) in der Probe ohne Homocystin von der Extinktionsveränderung (× 10000) in jeder Probe erhalten wurden.
  • Wie in 6 gesehen wird, wurde die Dosisabhängigkeit von der Menge des zugegebenen Homocystins auch in der Serumprobe gefunden (•). Auf der anderen Seite wurde eine solche Abhängigkeit nicht gefunden, als D-Methioninmethylsulfonium nicht zugegeben wurde (o). Die vorstehend beschriebenen Ergebnisse zeigen, dass die Menge des Homocysteins in der Probe quantitativ bestimmt werden kann.
  • Beispiel 7 Bestimmung unter Verwendung eines hoch-empfindlichen Farbentwicklungsmittels
  • Die Bestimmung wurde genau in der gleichen Weise wie in Beispiel 6 durchgeführt, außer dass ein TOOS- und 4-Aminoantipyrin-System als das Farbentwicklungsmittel für die quantitative Bestimmung von D-Methionin mit TPM-PS, welches ein hoch-empfindliches Farbentwicklungsmittel ist, ersetzt wurde. Genauer wurden ein Reagenz, welches durch Entfernen von TOOS von dem Reagenz 1 für die quantitative Bestimmung von D-Methionin erhalten wurde, und ein Reagenz, welches durch Entfernen von 4-Aminoantipyrin von dem Reagenz 2 und anstelle dessen Zugeben von 2 mM TMP-PS erhalten wurde, für die Bestimmung verwendet. Wie in 7 gezeigt, kann die Bestimmung unter Verwendung von TMP-PS mit einer höheren Empfindlichkeit als die Bestimmung unter Verwendung des TOOS- und 4-Aminoantipyrin-Systems durchgeführt werden.
  • Beispiel 8 Korrelation zwischen der vorliegenden Erfindung (MTase-Verfahren I) und dem herkömmlichen HPLC-Verfahren
  • Für 35 Serumproben wurde Homocystein durch das MTase-Verfahren I bestimmt. Eine Salzlösung wurde als ein Reagenzblindwert verwendet und eine Salzlösung, welche 50 μM Homocystein enthielt, wurde als ein Standard verwendet. Zuerst wurden 50 μl von 35 mM Phosphat-Puffer (pH-Wert 7,0), der 9,6 U/l Homocysteinmethyltransferase, 15 mM DTT, 1,5 mM bromiertes D-Methioninmethylsulfonium und 0,5 mM Zinkbromid enthielt, zu 100 μl einer Probe gegeben und man ließ bei 37°C für 90 Minuten umsetzen. Es sollte angemerkt werden, dass 1 U Homocysteinmethyltransferase die Menge an Enzym ist, welche die D-Methionin-Synthese in einer Menge von 1 μMol pro Minute katalysiert, wenn D-Methioninmethylsulfonium als der Methyldonor verwendet wird und Homocystein als ein Methylakzeptor verwendet wird. Die gleiche Probe wurde in der gleichen Weise mit einem Reagenz umgesetzt, welches keine Homocysteinmethyltransferase enthielt. Dann wurden 150 μl einer Lösung, welche 18 mM NEM enthielt, dazu gegeben, um die Umsetzung abzustoppen. Die Menge des D-Methionins in dem Reaktionsgemisch wurde unter Verwendung eines automatischen Analysegerätes, Hitachi 7170, in der folgenden Weise bestimmt. Zuerst wurden 150 μl von 96 mM Phosphat-Puffer (pH-Wert 7,0), welcher 0,48 mM TOOS enthielt, zu 30 μl des Reaktionsgemisches gegeben und man ließ bei 37°C für etwa 5 Minuten umsetzen. Dann wurden 100 μl von 90 mM Phosphat-Puffer (pH-Wert 7,0), welcher 0,7 mM 4-Aminoantipyrin, 1,4 U/ml D-Aminosäureoxidase, 4,4 U/ml Peroxidase und 1 mM FAD enthielt, dazu gegeben und man ließ weiter für etwa 5 Minuten bei 37°C umsetzen. Die Extinktionsveränderung (bei einer Primärwellenlänge von 546 nm und einer Sekundärwellenlänge von 700 nm) wurde vom Nachweispunkt 16 bis 34 gemessen. Die Menge des Homocysteins in der Probe wurde unter Verwendung eines Wertes berechnet, der durch Substrahieren der Extinktionsveränderung bei dem Reagenz ohne Homocysteinmethyltransferase (Blindwertprobe) von der Extinktionsveränderung bei dem Reagenz mit diesem Enzym erhalten wurde.
  • Auf der anderen Seite wurde das Homocystein in der gleichen Probe durch das HPLC-Verfahren (erhalten von SRL Inc.) bestimmt.
  • Die Ergebnisse sind in 8 mit dem Wert, der durch das HPLC-Verfahren erhalten wurde, auf der horizontalen Achse und dem Wert, der durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung (MTase-Verfahren I) erhalten wurde, auf der vertikalen Achse gezeigt. Wie in 8 gesehen wird, wird eine sehr zufriedenstellende Korrelation erhalten und das Homocystin in den Proben kann durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung genau bestimmt werden.
  • 9 Dosisabhängigkeit bei dem D-Methionin-Bestimmungssystem unter Verwendung von D-Aminosäureoxidase und Leucindehydrogenase und die Wirkung eines Reduktionsmittels DTT
  • Das D-Methionin wurde unter Verwendung eines automatischen Analysegerätes, Hitachi 7170, in der folgenden Weise bestimmt. Zuerst wurden 180 μl eines Reagenzes 1, welches 50 mM TAPS (N-Tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropansulfonsäure; hergestellt von Dojin Kagaku Kenkyusho) (pH-Wert 8,5), 990 mM Ammoniumchlorid (hergestellt von Nakarai), 3,4 U/ml Leucindehydrogenase (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 32 U/ml Katalase (hergestellt von Roche) und 0,16 mM NADH (hergestellt von Oriental Yeast Co., Ltd.) enthielt, zu 30 μl einer Probe, welche 0, 25, 50, 100, 200 oder 400 μM D-Methionin in einer Salzlösung (0,9% NaCl) enthielt, gegeben und man ließ bei 37°C für etwa 5 Minuten umsetzen. Dann wurden 40 μl eines Reagenzes 2, welches 50 mM TAPS (pH-Wert 8,5), 990 mM Ammoniumchlorid, 5 U/ml D-Aminosäureoxidase (abgeleitet von Schweinenieren, hergestellt von Kikkoman) und 0,1 mg/ml FAD enthielt, dazu gegeben und man ließ weiter für etwa 5 Minuten bei 37°C umsetzen. Die Extinktionsveränderung (bei einer Primärwellenlänge von 340 nm und einer Sekundärwellenlänge von 405 nm) von NADH vom Nachweispunkt 16 bis 34 wurde gemessen. Als nächstes wurde ein Reagenz genau in der gleichen Weise hergestellt, außer dass 10 mM DTT zu dem Reagenz 1 gegeben wurden und die Bestimmung unter Verwendung von DTT in der gleichen Weise durchgeführt wurde.
  • Die Ergebnisse sind in 9 mit der D-Methionin-Konzentration auf der horizontalen Achse und der Extinktionsveränderung bei 340 nm (Sekundärwellenlänge 405 nm) auf der vertikalen Achse gezeigt.
  • Wie in 9 gesehen wird, wurde die von D-Methionin dosisabhängige lineare Extinktionsveränderung bei diesem Bestimmungssystem beobachtet, als DTT nicht zugegeben wurde (Δ), so dass D-Methionin quantitativ bestimmt werden kann. Als DTT zugegeben wurde (o), wurde die Bestimmung von Methionin durch DTT nicht beeinflusst.
  • Beispiel 10 Dosisabhängigkeit beim Homocystein-Bestimmungssystem (MTase-Verfahren II) unter Verwendung von Homocysteinmethyltransferase, D-Aminosäureoxidase und Leucindehydrogenase
  • Homocystein wurde unter Verwendung eines automatischen Analysegerätes, Hitachi 7170, in der folgenden Weise bestimmt. Zuerst wurden 180 μl eines Reagenzes 1, welches 50 mM TAPS (pH-Wert 8,5), 990 mM Ammoniumchlorid, 10 mM DTT, 0,5 U/ml Homocysteinmethyltransferase (abgeleitet von Hefe, erhalten von Ozeki), 0,6 mM bromiertes D-Methioninmethylsulfonium, 5 U/ml Leucindehydrogenase (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 32 U/ml Katalase und 0,16 mM NADH enthielt, zu 30 μl einer Probe, welche 0, 12,5, 25, 50 oder 100 μM Homocystin (0, 25, 50, 100 oder 200 μM, ausgedrückt als Homocystein) in einer Salzlösung (0,9% NaCl) enthielt, gegeben und man ließ bei 37°C für etwa 5 Minuten umsetzen. Dann wurden 40 μl eines Reagenzes 2, welches 50 mM TAPS (pH-Wert 8,5), 990 mM Ammoniumchlorid, 7,5 U/ml D-Aminosäureoxidase (hergestellt von Kikkoman) und 0,1 mg/ml FAD enthielt, dazu gegeben und man ließ weiter für etwa 5 Minuten bei 37°C umsetzen. Die Extinktionsveränderung (bei einer Primärwellenlänge von 340 nm und einer Sekundärwellenlänge von 405 nm) von NADH vom Nachweispunkt 16 bis 34 wurde gemessen. Als nächstes wurde eine Bestimmung genau in der gleichen Weise wie vorstehend durchgeführt, außer dass eine Probe, in welcher 0, 12,5, 25, 50 oder 100 μM Homocystin zu einem normalen Kontrollserum SERACLEAR HE gegeben worden waren, als die Probe verwendet wurde.
  • Die Ergebnisse sind in 10 mit der Konzentration des zugegebenen Homocysteins auf der horizontalen Achse und der Extinktionsveränderung bei 340 nm (Sekundärwellenlänge 405 nm) auf der vertikalen Achse gezeigt.
  • Wie in 10 gesehen wird, kann in beiden Fällen der Homocystein-Prüfprobe (•) und der Serumprobe
    Figure 00240001
    gesehen werden, dass die Extinktionsveränderung von der Dosis des zugegebenen Homocysteins abhängt, so dass es ersichtlich ist, dass auch bei diesem Bestimmungssystem Homocystein quantitativ bestimmt werden kann.
  • Beispiel 11 Dosisabhängigkeit beim Homocystein-Bestimmungssystem (MTase-Verfahren II) unter Verwendung von Homocysteinmethyltransferase, D-Aminosäureoxidase und Glutamatdehydrogenase
  • Homocystein wurde unter Verwendung eines automatischen Analysegerätes, Hitachi 7170, in der folgenden Weise bestimmt. Zuerst wurden 180 μl eines Reagenzes 1, welches 100 mM Tris-Puffer (pH-Wert 8,0), 10 mM DTT, 0,6 mM bromiertes D-Methioninmethylsulfonium, 2 U/ml D-Aminosäureoxidase (hergestellt von Kikkoman), 0,03 mg/ml FAD, 32 U/ml Katalase, 8 U/ml Glutamatdehydrogenase (hergestellt von Toyobo Co., Ltd.), 8 mM 2-Oxoglutarsäure (hergestellt von Nakarai) und 0,16 mM NADH enthielt, zu 30 μl einer Probe, welche 0, 12,5, 25, 50 oder 100 μM Homocystin (0, 25, 50, 100 oder 200 μM, ausgedrückt als Homocystein) in einer Salzlösung (0,9% NaCl) enthielt, gegeben und man ließ bei 37°C für etwa 5 Minuten umsetzen. Dann wurden 40 μl eines Reagenzes 2, welches 100 mM Tris-Puffer (pH-Wert 8,0) und 2,1 U/ml Homocysteinmethyltransferase (abgeleitet von Hefe, erhalten von Ozeki) enthielt, dazu gegeben und man ließ weiter für etwa 5 Minuten bei 37°C umsetzen. Die Extinktionsveränderung (bei einer Primärwellenlänge von 340 nm und einer Sekundärwellenlänge von 405 nm) von NADH vom Nachweispunkt 16 bis 34 wurde gemessen. Als nächstes wurde eine Bestimmung in der gleichen Weise wie vorstehend durchgeführt, außer dass eine Probe, in welcher 0, 12,5, 25, 50 oder 100 μM Homocystin zu einem normalen Kontrollserum SERACLEAR HE gegeben worden waren, verwendet wurde.
  • Die Ergebnisse sind in 11 mit der Konzentration des zugegebenen Homocysteins auf der horizontalen Achse und der Extinktionsveränderung bei 340 nm (Sekundärwellenlänge 405 nm) auf der vertikalen Achse gezeigt.
  • Wie in 11 gesehen wird, kann in beiden Fällen der Homocystein-Prüfprobe (•) und der Serumprobe
    Figure 00250001
    gesehen werden, dass die Extinktionsveränderung von der Dosis des zugegebenen Homocysteins abhängt. Es ist ersichtlich, dass auch bei diesem Bestimmungssystem Homocystein quantitativ bestimmt werden kann.
  • Beispiel 12 Quantitativität von 4-Methylthio-2-oxobuttersäure durch Lactatdehydrogenase
  • 4-Methylthio-2-oxobuttersäure wurde unter Verwendung eines automatischen Analysegerätes, Hitachi 7170, in der folgenden Weise bestimmt. Zuerst wurden 180 μl eines Reagenzes 1, welches 200 mM Phosphat-Puffer (pH-Wert 7,0) und 0,16 mM NADH enthielt, zu 30 μl einer Probe, welche 0, 50, 100, 200 oder 400 μM 4-Methylthio-2-oxobuttersäure in einer Salzlösung (0,9% NaCl) enthielt, gegeben und man ließ bei 37°C für etwa 5 Minuten umsetzen. Dann wurden 40 μl eines Reagenzes 2, welches 200 mM Phosphat-Puffer (pH-Wert 7,0) und 65 U/ml Lactatdehydrogenase (abgeleitet von Schweineherzen, hergestellt von Oriental Yeast) enthielt, dazu gegeben und man ließ weiter für etwa 5 Minuten bei 37°C umsetzen. Die Extinktionsveränderung (bei einer Primärwellenlänge von 340 nm und einer Sekundärwellenlänge von 405 nm) von NADH vom Nachweispunkt 16 bis 34 wurde gemessen.
  • Die Ergebnisse sind in 12 mit der 4-Methylthio-2-oxobuttersäure-Konzentration auf der horizontalen Achse und der Extinktionsveränderung bei 340 nm (Sekundärwellenlänge 405 nm) auf der vertikalen Achse gezeigt.
  • Wie in 12 gesehen wird, kann gesehen werden, dass die Extinktionsveränderung von der Dosis der 4-Methylthio-2-oxobuttersäure abhängt, so dass es ersichtlich ist, dass die Lactatdehydrogenase 4-Methylthio-2-oxobuttersäure als das Substrat verwendet, und auch bei diesem Bestimmungssystem, wobei die Lactatdehydrogenase anstelle der Leucindehydrogenase und der Glutamatdehydrogenase in den Beispielen 10 und 11 verwendet wird, kann Homocystein quantitativ bestimmt werden.
  • Industrielle Verwendbarkeit
  • Die vorliegende Erfindung ermöglicht, dass Homocystein in einer biologischen Probe, insbesondere in Körperfluiden wie Blut und Urin, schnell und einfach und mit hoher Empfindlichkeit nachgewiesen und quantitativ bestimmt wird.

Claims (9)

  1. Verfahren zum Nachweisen oder Bestimmen von Homocystein in einer Probe, umfassend: (d) das Reduzieren des Homocysteins in der Probe durch eine Thiolverbindung, (e) das Umsetzen des reduzierten Homocysteins mit einer Methyltransferase und einem Methyldonor, wobei methyliertes Homocystein hergestellt wird, und (f) das Nachweisen oder Bestimmen des verbleibenden Methyldonors, des hergestellten methylierten Homocysteins oder eines Enzymreaktionsprodukts davon durch Umsetzen des verbleibenden Methyldonors, des hergestellten methylierten Homocysteins oder eines Enzymreaktionsprodukts davon mit einem D-Aminosäure-umwandelndem Enzym, wobei eine Oxosäure und/oder Ammoniak hergestellt werden, und Nachweisen oder Bestimmen der hergestellten Oxosäure und/oder Ammoniak.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Methyltransferase Homocysteinmethyltransferase ist und der Methyldonor D-Methioninmethylsulfonium ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das D-Aminosäure-umwandelnde Enzym D-Aminosäureoxidase ist.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei im Schritt (c) das hergestellte Wasserstoffperoxid durch Farbentwicklung unter Verwendung von Peroxidase und einem oxidativen Farbentwicklungsmittel nachgewiesen oder bestimmt wird.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei im Schritt (c) eine Abnahme von NAD(P)H oder eine Zunahme von NAD(P) durch Umsetzen der hergestellten Oxosäu re und/oder Ammoniak mit Dehydrogenase unter Verwendung von NAD(P)H als ein Coenzym nachgewiesen oder bestimmt werden.
  6. Reagenzkit zur Homocysteinbestimmung, umfassend eine Thiolverbindung, eine Methyltransferase, welche Homocystein als einen Methylakzeptor verwendet, einen Methyldonor und ein D-Aminosäure-umwandelndes Enzym.
  7. Kit nach Anspruch 6, ferner umfassend NAD(P)H, Dehydrogenase unter Verwendung von NAD(P)H als ein Coenzym und ein Ammoniumsalz oder eine 2-Oxosäure als ihr Cosubstrat.
  8. Kit nach Anspruch 6, wobei die Methyltransferase Homocysteinmethyltransferase ist und der Methyldonor D-Methioninmethylsulfonium ist.
  9. Kit nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei das D-Aminosäure-umwandelnde Enzym D-Aminosäureoxidase ist.
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