DE69924017T2 - Verfahren zur bestimmung von schwefelwasserstoff oder von sulfidionen und verfahren zur bestimmung gewisser substanzen mit hilfe dieses verfahrens - Google Patents

Verfahren zur bestimmung von schwefelwasserstoff oder von sulfidionen und verfahren zur bestimmung gewisser substanzen mit hilfe dieses verfahrens Download PDF

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Description

  • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Schwefelwasserstoff oder Sulfid-Ionen in einer Probe auf bequeme Weise mit hoher Empfindlichkeit, durch Nutzung einer Beschleunigungs- oder Hemmungsreaktion durch Schwefelwasserstoff oder Sulfid-Ionen gegen die Bildung von Komplexen zwischen Metall-Ionen und einem Metall-Indikator; und ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung einer Substanz in einer Probe auf bequeme Weise mit hoher Empfindlichkeit, wobei Schwefelwasserstoff aus der spezifischen Substanz gebildet wird und der Schwefelwasserstoff oder die daraus abgeleiteten Sulfid-Ionen durch Nutzung der obigen quantitativen Bestimmungsmethode gemessen werden.
  • Stand der Technik
  • Schwefel ist eines der Elemente, die wichtige Rollen in der Natur einnehmen. Insbesondere nimmt es eine wesentliche Rolle als ein konstituierendes Element für Cystein und Methionin als schwefelhaltige Aminosäuren ein. Außerdem ist bekannt, daß ein großer Schwefelzyklus zwischen Pflanzen und Tieren abläuft. In den Pflanzen wird Schwefel in der Form von Sulfat-Ionen aufgenommen und zu Sulfid-Ionen reduziert und dann einer Cystein-Synthese und weiter Methionin-Synthese unterworfen. In den Tieren wird Methionin aus Nahrungsmitteln durch die Nahrungskette aufgenommen und in vivo zu Cystein verstoffwechselt. In diesem Verstoffwechslungsstadium wird Homocystein als ein Zwischenprodukt gebildet.
  • Homocystein ist ein Zwischenmetabolit, der im normalen Zustand kaum vorhanden ist. Es ist jedoch berichtet worden, daß, wenn seine Konzentration im Blut auf einem hohen Spiegel ist, die Auftretensrate von Herzerkrankungen und zerebraler Apoplexie hoch ist. Demgemäß ist die Homocystein-Menge im Blut als ein Risikofaktor erkannt worden, der nützlich ist für die Vorhersage des Auftretens von Thromboembolie, wie etwa Myokardinfarkt oder Zerebralinfarkt, oder Arteriosklerose.
  • Außerdem kann, da Cystein eine Aminosäure ist, die durch den Stoffwechsel von Methionin gebildet wird, es ein Hilfsanzeichen für das Greifen der Gründe für Stoffwechselfehler von Homocystein sein.
  • Überdies sind Enzyme bekannt, die die Funktion haben auf Homocystein oder Cystein zu wirken und Zersetzung oder Substitution durchzuführen, wodurch Schwefelwasserstoff gebildet wird. Selbst wenn man versucht, Homocystein oder Cystein durch Nutzung solch eines Enzyms quantitativ zu bestimmen, ist, da es keine Methode zum Messen des gebildeten Schwefelwasserstoffs auf bequeme Weise mit hoher Empfindlichkeit gibt, jedoch keine praktische Methode gebunden worden, bei der dieses Enzym zur quantitativen Bestimmung von Homocystein oder Cystein verwendet wird.
  • Andererseits sind Schwefelwasserstoff oder daraus abgeleitete Sulfid-Ionen wichtig als ein Anzeichen für Umweltverschmutzung, wie etwa Luftverschmutzung oder Wasserverschmutzung von Flüssen. Der Verschmutzungszustand kann bestätigt werden durch Messen des Schwefelwasserstoffs oder der daraus abgeleiteten Sulfid-Ionen in Proben.
  • Als herkömmliche Verfahren zur Messung von Schwefelwasserstoff oder daraus abgeleiteten Sulfid-Ionen sind die folgenden Verfahren bekannt. Zum Beispiel sind, als ein Verfahren mit Nutzung eines Farbentwicklers, ein Verfahren, bei dem 2,2'-Dipyridyldisulfid (Svenson, Anal. Biochem., 107; 51–55 (1980)) oder Natriumnitroprussid verwendet wird, ein Verfahren, bei dem N,N-Dimethyl-p-phenylendiamin und Eisen(II)-chlorid unter stark sauren Bedingungen umgesetzt werden, um Methylenblau zu bilden, und blaue Farbentwicklung nachgewiesen wird (Methylenblau-Verfahren), ein Verfahren, bei dem eine sich abschwächende Menge und Rate eines Farbstoffes (Toluidinblau oder Methylenblau) durch Verwendung von Cer als einem Katalysator gemessen wird (Mousavi et al., Bull. Chem. Soc. Jpn, 65; 2770–2772 (1992), Gokmen et al., Analyst, 119; 703–708 (1994)), und dergleichen bekannt. Diese Verfahren sind unter den Gesichtspunkten der Bequemlichkeit und Empfindlichkeit kaum angemessen.
  • GB-A 2,200,989 offenbart ein Verfahren zum Nachweis von Thiolgruppen. Fe3+-Ionen werden zu Fe2+-Ionen durch die Thiolgruppen reduziert und die Fe2+-Ionen werden dann mit geeigneten Komplexliganden nachgewiesen.
  • Offenbarung der Erfindung
  • Demgemäß ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein bequemeres und hoch empfindliches Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Schwefelwasserstoff oder Sulfid-Ionen bereitzustellen. Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung einer spezifischen Substanz in einer Probe auf bequeme Weise mit hoher Empfindlichkeit bereitzustellen, bei der Schwefelwasserstoff aus der spezifischen Substanz gebildet wird und der Schwefelwasserstoff oder die daraus abgeleiteten Sulfid-Ionen durch Nutzung des obigen quantitativen Nachweisverfahrens gemessen werden.
  • Die gegenwärtigen Erfindung haben intensive Studien durchgeführt, um die obigen Aufgaben zu lösen, und festgestellt, daß Schwefelwasserstoff oder Sulfid-Ionen in einer Probe auf bequeme Weise mit hoher Empfindlichkeit quantitativ bestimmt werden können, indem eine Hemmungs- oder Beschleunigungswirkung durch den Schwefelwasserstoff oder die Sulfid-Ionen gegen die Farbentwicklung zwischen Metall-Ionen und einem Metall-Indikator genutzt wird.
  • Die vorliegende Erfindung stellt nämlich ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Schwefelwasserstoff oder Sulfid-Ionen bereit, welches umfaßt, daß zu einer Probe, die Schwefelwasserstoff oder Sulfid-Ionen enthält, Metall-Ionen oder eine Verbindung, die besagte Metall-Ionen freisetzt, und ein Metall-Indikator, der mit den Metall-Ionen reagiert und daraus folgend eine Farbentwicklung durchläuft, zugegeben werden, wobei die Farbentwicklung durch den Schwefelwasserstoff oder die Sulfid-Ionen beschleunigt oder gehemmt wird; und daß der Grad der Farbentwicklung des Metall-Indikators gemessen wird.
  • Die vorliegende Erfindung stellt weiter ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung einer spezifischen Substanz bereit, welches umfaßt, daß zu einer Probe, die die spezifische Substanz umfaßt, eine Komponente, die auf die spezifische Substanz so wirkt, daß die spezifische Substanz Schwefelwasserstoff oder Sulfid-Ionen bildet, Metall-Ionen oder ein Verbindung, die besagte Metall-Ionen freisetzt, und ein Metall-Indikator, der mit den Metall-Ionen reagiert und daraus folgend eine Farbentwicklung durchläuft, zugegeben werden, wobei die Farbentwicklung durch den Schwefelwasserstoff oder die Sulfid-Ionen beschleunigt oder gehemmt wird; und daß der Grad der Farbentwicklung des Metall-Indikators gemessen wird.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es möglich, Schwefelwasserstoff oder Sulfid-Ionen auf bequeme Weise mit hoher Empfindlichkeit quantitativ zu bestimmen, indem eine Beschleunigungs- oder Hemmungsreaktion durch die Sulfid-Ionen gegen die Bildung von Komplexen zwischen Metall-Ionen oder einem Metall-Indikator genutzt wird. Es ist weiter möglich, eine spezifische Substanz in einer Probe auf bequeme Weise mit hoher Empfindlichkeit quantitativ zu bestimmen, indem eine Komponente, die auf die spezifische Substanz so wirkt, daß die spezifische Substanz Schwefelwasserstoff oder Sulfid-Ionen bildet, zur Probe zugegeben und der gebildete Schwefelwasserstoff unter Nutzung der obigen Reaktion gemessen wird.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse der quantitativen Bestimmung von Sulfid-Ionen durch ein die Farbentwicklung hemmendes Verfahren darstellt.
  • 2 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse einer quantitativen Bestimmung von Sulfid-Ionen mit einem die Farbentwicklung beschleunigenden Verfahren darstellt.
  • 3 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse der quantitativen Bestimmung von Homocystein mit einem die Farbentwicklung beschleunigenden Verfahren darstellt.
  • 4 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse der quantitativen Bestimmung von Cystein durch ein die Farbentwicklung beschleunigendes Verfahren darstellt.
  • Beste Art und Weise zur Durchführung der Erfindung
  • Im Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Schwefelwasserstoff oder Sulfid-Ionen der vorliegenden Erfindung wird der Fall der Ausnutzung der Wirkung von Schwefelwasserstoff oder Sulfid-Ionen, die die Farbentwicklungsreaktion zwischen Metall-Ionen und einem Metall-Indikator hemmen, im weiteren beschrieben werden. Das heißt, man läßt den Schwefelwasserstoff oder die Sulfid-Ionen, der (die) in einer Probe vorhanden ist (sind), mit Metall-Ionen in Kontakt kommen, um ein Metallsulfid zu bilden, und gleichzeitig werden die Metall-Ionen mit dem Metall-Indikator umgesetzt, und dann wird der Grad der Farbstoffentwicklung gemessen und dadurch die Menge der durch die Reaktion zwischen den Metall-Ionen und dem Metall-Indikator gebildeten Komplexe. Dann wird die obige Menge der gebildeten Komplexe von der Menge der gebildeten Komplexe, wenn die Metall-Ionen mit dem Metall-Indikator unter denselben Bedingungen wie oben umgesetzt werden, vorausgesetzt, daß kein Schwefelwasserstoff oder keine Sulfid-Ionen vorhanden sind, subtrahiert, wodurch die verringerte Menge der gebildeten Komplexe durch Nutzung der Eigenschaft erhalten wird, daß das Metallsulfid keine Komplexe bildet. Die verringerte Menge der gebildeten Komplexe entspricht der Menge des Schwefelwasserstoffs oder der Sulfid-Ionen, die in der Probe vorhanden ist. Demgemäß kann die Menge des Schwefelwasserstoffs oder der Sulfid-Ionen in der Probe auf der Grundlage der verringerten Menge der gebildeten Komplexe berechnet werden.
  • Der Fall der Ausnutzung der Wirkung von Schwefelwasserstoff oder Sulfid-Ionen, die die Farbentwicklungsreaktion zwischen den Metall-Ionen und dem Metall-Indikator beschleunigt, wird im weiteren beschrieben werden. Das heißt, zu der Probe, die den Schwefelwasserstoff oder die Sulfid-Ionen enthält, werden die Metall-Ionen und der Metall-Indikator zugegeben, und die Reaktion wird durchgeführt, und dann wird der Grad der Farbentwicklung gemessen, um die Menge der durch die Reaktion zwischen den Metall-Ionen und dem Metall-Indikator gebildeten Komplexe zu bestimmen. Dann wird von dieser Menge der gebildeten Komplexe die Menge der Komplexe subtrahiert, die gebildet wird, wenn die Metall-Ionen mit dem Metall-Indikator unter denselben Bedingungen wie oben umgesetzt werden, vorausgesetzt, daß kein Schwefelwasserstoff oder keine Sulfid-Ionen vorhanden ist (sind), wodurch die erhöhte Menge der gebildeten Komplexe bestimmt wird. Da die erhöhte Menge der gebildeten Komplexe der Beschleunigung der Reaktion zwischen den Metall-Ionen und dem Metall-Indikator durch den Schwefelwasserstoff oder die Sulfid-Ionen zuschreibbar ist, entspricht sie der Menge des Schwefelwasserstoffs oder der Sulfid-Ionen. Demgemäß kann die Menge des Schwefelwasserstoffs oder der Sulfid-Ionen in der Probe auf der Grundlage der erhöhten Menge der gebildeten Komplexe berechnet werden.
  • In der vorliegenden Erfindung sind die Metall-Ionen so lange nicht besonders beschränkt, wie die Farbentwicklung zwischen den Metall-Ionen und dem Metall-Indikator durch den Schwefelwasserstoff oder die Sulfid-Ionen gehemmt oder beschleunigt wird. Als diejenigen, die die Farbentwicklungsreaktion der Metall-Ionen und des Metall-Indikators hemmen, werden Zink-Ionen bevorzugt verwendet. Als diejenigen, die obige Farbentwicklungsreaktion beschleunigen, werden vorzugsweise Eisen(II)- und Eisen(III)-Ionen verwendet. Spezifisch werden Hydrochloride, Sulfate, Acetate oder dergleichen der obigen Metalle verwendet. Es gibt jedoch solange keine besondere Beschränkung, wie es sich in einer wäßrigen Lösung auflöst und freigesetzte Metall-Ionen bildet.
  • Als der in der vorliegenden Erfindung verwendete Metall-Indikator gibt es solange keine besondere Beschränkung, wie es eine Substanz ist, deren Farbentwicklungsreaktion mit den Metall-Ionen durch den Schwefelwasserstoff oder die Sulfid-Ionen gehemmt wird. Bevorzugt ist diejenige mit einer hohen Empfindlichkeit der Farbentwicklung zum Zeitpunkt der Bildung der Komplexe. Pyridylazoverbindungen und Nitrosoaminophenolverbindungen werden zum Beispiel bevorzugt verwendet. Spezifischer werden, als die Pyridylazoverbindungen, 2-(5-Brom-2-pyridylazo)-5-[N-n-propyl-N-(3-sulfopropyl)amino]-phenol-Natriumsalz (Markenname: 5-Br-PAPS; im weiteren einfach als 5-Br-PAPS bezeichnet) und 2-(5-Nitro-2-pyridylazo)-5-[N-n-propyl-N-(3-sulfopropyl)-amino]phenol-Natriumsalz (Markenname: Nitro-PAPS) bevorzugt verwendet. Weiter werden, als die Nitrosoaminophenolverbindungen, bevorzugt 2-Nitroso-5-[N-n-propyl-N-(3-sulfopropyl)-amino]phenol (Markenname: Nitroso-PSAP) und 2-Nitroso-5-[N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)amino]phenol (Markenname: Nitroso-ESAP) verwendet. Diese Verbindungen sind wasserlöslich und haben die Eigenschaft, daß sie mit Zink-Ionen, Kupfer-Ionen, Cobalt-Ionen oder Eisen-Ionen Komplexe bilden und Farbentwicklung mit einer hohen Empfindlichkeit durchlaufen. Als diese Metall-Indikatoren werden solche mit verschiedenen Eigenschaften von zum Beispiel Dojindo Laboratories kommerziell vertrieben und verfügbar gemacht.
  • Die spezifische Substanz in der vorliegenden Erfindung kann jede Substanz sein, solange sie Schwefelwasserstoff oder Sulfid-Ionen durch z.B. enzymatische Reaktion bildet. Homocystein und Cystein sind zum Beispiel bevorzugt erwähnt.
  • Wenn die spezifische Substanz Homocystein ist, wird als die Komponente zur Bildung von Schwefelwasserstoff oder Sulfid-Ionen aus der spezifischen Substanz ein Enzym (E1) verwendet, das die Funktion hat, auf Homocystein so zu wirken, daß das Homocystein Schwefelwasserstoff oder Sulfid-Ionen bilden würde. Als solch ein Enzym können zum Beispiel L-Methionin-γ-Lyase (Enzym Nr. EC-Klasse 4.4.1.11) und O-Acetylhomoserin-Lyase (Enzym Nr. EC-Klasse 4.2.99) erwähnt werden. Insbesondere kann O-Acetylhomoserin-Lyase vorzugsweise verwendet werden.
  • L-Methionin-γ-Lyase ist als ein Enzym bekannt, das eine Zersetzungs(Freisetzungs-)-Wirkung gegenüber Homocystein zeigt und Schwefelwasserstoff in Abwesenheit einer Thiolverbindung bildet, aber die Wirkung der Katalyse der γ-Substitution in Gegenwart einer Thiolverbindung zeigt. Dieses Enzym ist erhältlich aus Mikroorganismen, die in der Lage sind, es zu produzieren, zum Beispiel Bakterien der Gattung Pseudomonas, aber einige Arten davon werden kommerziell von zum Beispiel Wako Pure Chemicals Industries, Ltd. vertrieben und verfügbar gemacht.
  • Weiter ist O-Acetylhomoserin-Lyase als ein Enzym bekannt, das eine Aminosäuresynthese-Wirkung besitzt (zum Beispiel die Wirkung der Bildung von Homocystein aus O-Acetylhomoserin und Schwefelwasserstoff und Methionin aus Methanthiol) (Bezug genommen werden kann auf „Handbook of Enzyme", zusammengestellt von Maruo et al., Asakura Shoten, 1982). Die gegenwärtigen Erfinder haben nunmehr die enzymatische Wirkung festgestellt, daß, wenn man O-Acetylhomoserin-Lyase auf Homocystein in Gegenwart einer Thiolverbindung einwirken läßt, Schwefelwasserstoff durch γ-Substitution gebildet wird (japanische Patentanmeldung Nr. 10-347003).
  • Im Hinblick auf O-Acetylhomoserin-Lyase sind verschiedene Mikroorganismen bekannt, die in der Lage sind, sie zu produzieren (Bezug genommen werden kann zum Beispiel auf Ozaki et al., J. Biochem. 91; 1163–1171 (1982), Yamagata, J. Biochem. 96; 1511–1523 (1984), Brzywczy et al., Acta. Biochimica. Polonica 40(3); 421–428 (1993)). O-Acetylhomoserin-Lyase kann durch Kultivieren dieser Mikroorganismen erhalten werden, aber einige Typen davon können von zum Beispiel Unitika Ltd. kommerziell vertrieben werden und verfügbar sein. Diese Enzyme (E1) haben die Funktion, stark auf Homocystein zu wirken und ein wenig auf Cystein zu wirken, wodurch Schwefelwasserstoff gebildet wird.
  • Physikochemische Eigenschaften von O-Acetylhomoserin-Lyase (Markenname: „GCS"), die aus dem Stamm Bacillus gewonnen ist, hergestellt von Unitika Ltd., sind wie folgt. Unter den folgenden physikochemischen Eigenschaften wurden alles andere als das Molekulargewicht von den gegenwärtigen Erfindern bestimmt.
  • Physikochemische Eigenschaften
    • 1) Wirkung: sie katalysiert die γ-Substitution von L-Homocystein und einer Thiolverbindung, wodurch Schwefelwasserstoff und ein mit der Thiolverbindung substituiertes Homocystein gebildet werden. Weiter katalysiert sie Substitution von L-Methionin und einer Thiolverbindung, wodurch Methanthiol und ein mit der Thiolverbindung substitutiertes Homocystein gebildet werden.
    • 2) Substratspezifität: sie wirkt auf L-Homocystein und L-Methionin. Weiter wirkt sie durch β-Substitution ein weinig auf L-Cystein.
    • 3) Molekulargewicht: 180.000 (Gelfiltrationsmethode)
    • 4) Optimaler pH: 8,5–9,0
    • 5) Km: 0,9 mM (L-Homocystein)
  • Weiter wird, wenn die spezifische Substanz Cystein ist, als die Komponente zur Bildung von Schwefelwasserstoff oder Sulfid-Ionen aus der spezifischen Substanz ein Enzym (E2) verwendet, das die Funktion hat, auf Cystein so zu wirken, daß das Cystein Schwefelwasserstoff und Sulfid-Ionen bildet. Als solch ein Enzym können zum Beispiel O-Acetylserin-Lyase, β-Cyanoalanin-Synthase und Cystein-Lyase erwähnt werden. Insbesondere wird vorzugsweise O-Acetylserin-Lyase verwendet.
  • O-Acetylserin-Lyase ist als ein Enzym bekannt, das eine Cysteinsynthesewirkung besitzt (die Wirkung der Bildung von Cystein aus O-Acetylserin und Schwefelwasserstoff). Die gegenwärtigen Erfinder haben die enzymatische Wirkung festgestellt, daß, wenn man O-Acetylserin-Lyase auf Cystein in Gegenwart einer Thiolverbindung wirken läßt, Schwefelwasserstoff durch β-Substitution gebildet wird (Japanische Patentanmeldung Nr. 11-84035). Diese Wirkung ist spezifisch für Cystein. O-Acetylserin-Lyase kann aus Mikroorganismen erhalten werden, die in der Lage sind, sie zu produzieren (zum Beispiel Burnell et al., Biochim. Biophys. Acta 481; 246-265 (1977), Nagasaw et al., Methods Enzymol 143; 474–478 (1987), aus Pflanzen (zum Beispiel Droux et al., Arch. Biochem. Biophys. 295(2); 379–390 (1992), Yamaguchi et al., Biochim. Biophys. Acta 1251; 91–98 (1995)), etc..
  • Zum Beispiel sind die Folgenden physikochemische Eigenschaften von O-Acetylserin-Lyase, erhalten aus Spinat, mit dem Verfahren, das beschrieben ist in Yamaguchi et al., Biochim. Biophys. Acta 1251; 91–98 (1995). Unter den folgenden physikochemischen Eigenschaften wurden alles andere als das Molekulargewicht von den gegenwärtigen Erfindern bestimmt.
  • Physikochemische Eigenschaften von O-Acetylserin-Lyase
    • 1) Wirkung: sie katalysiert β-Substitution von L-Cystein und einer Thiolverbindung, wodurch Wasserstoff und ein mit der Thiolverbindung substituiertes Cystein gebildet werden.
    • 2) Substratspezifität: sie wirkt spezifisch auf L-Cystein.
    • 3) Molekulargewicht: 63.000 (Gelfiltrationsmethode)
    • 4) Optimaler pH: 9,0-11,0
    • 5) Km: 0,27 mM (L-Cystein)
  • Andererseits ist bekannt, daß, wenn man β-Cyanoalanin-Synthase auf Cystein in Gegenwart von Cyan wirken läßt, sie eine katalytische Reaktion der Bildung von Schwefelwasserstoff durch β-Substitution zeigt, und wenn man Cystein-Lyase auf Cystein in Gegenwart von Sulfid-Ionen wirken läßt, sie eine katalytische Reaktion der Bildung von Schwefelwasserstoff durch β-Substitution zeigt.
  • Als die in der vorliegenden Erfindung verwendete Thiolverbindung gibt es solange keine besondere Beschränkung, wie sie für eine Substitutionsreaktion verwendet werden kann, und Methanthiol, 2-Mercaptoethanol, Dithiothreitol, Thioglycerol und Cysteamin können zum Beispiel erwähnt werden. Als die bevorzugten können 2-Mercaptoethanol und Cysteamin erwähnt werden.
  • Die Reaktion im Verfahren zur Messung des Schwefelwasserstoffs oder der Sulfid-Ionen der vorliegenden Erfindung sind dargestellt durch die folgenden chemischen Formeln 1 und 2.
  • Chemische Formel 1
  • Reaktion A:
    • Metall-Ionen + Metall-Indikator → Bildung von Komplexen (Zink) (Pyridylazoverbindung) (Farbentwicklung
  • Reaktion B:
    • Metall-Ionen + Sulfid-Ionen (Zink) (Schwefelwasserstoff) → Metallsulfid + Metall-Indikator – (Hemmung) (Zinksulfid) (Pyridylazoverbindung) → Bildung von Komplexen (x)
  • Chemische Formel 2
  • Reaktion C:
    • Metall-Ionen + Metall-Indikator (Eisen) (Pyridylazoverbindung oder Nitrosoaminophenolverbindung) (keine Reaktion) → Bildung von Komplexen (x)
  • Reaktion D:
    • Metall-Ionen + Sulfid-Ionen + Metall-Indikator (Eisen) (Schwefelwasserstoff) (Pyridylazoverbindung oder Nitrosoaminophenolverbindung) –(Beschleunigung der Reaktion) → Bildung von Komplexen (Farbentwicklung)
  • In der obigen chemischen Formel 1 zeigt Reaktion A, daß in Abwesenheit von Sulfid-Ionen die Metall-Ionen (zum Beispiel Zink-Ionen) und der Metall-Indikator (zum Beispiel eine Pyridylazoverbindung) schnell Komplexe bilden und Farbentwicklung durchlaufen.
  • Reaktion B zeigt, daß, indem man zunächst die Metall-Ionen (zum Beispiel Zink-Ionen) mit Sulfid-Ionen in Kontakt kommen läßt, um ein Metallsulfid (zum Beispiel Zinksulfid) zu bilden, die gebildete Verbindung (Zinksulfid) keine Komplexe mit dem Metall-Indikator bilden kann, und der numerische Wert der Farbentwicklung nimmt entsprechend ab. Demgemäß können Schwefelwasserstoff oder Sulfid-Ionen gemessen werden, indem die verringerte Menge des numerischen Wertes der Farbentwicklung berechnet wird.
  • In der obigen chemischen Formel 1 ist es nämlich wichtig, die Kombination aus Metall-Ionen, die ein stabiles Metallsulfid durch Reaktion mit Sulfid-Ionen bilden, und einem Metall-Indikator, der mit den Metall-Ionen schnell Komplexe bildet, auszuwählen. Als solch eine Kombination der Metall-Ionen und des Metall-Indikators kann zum Beispiel die Kombination aus Zink-Ionen und einer Pyridylazoverbindung erwähnt werden. In der folgenden Erläuterung wird die Meßmethode, die das Prinzip der obigen chemischen Formel 1 nutzt, eine die Farbentwicklung hemmende Methode genannt.
  • Weiter zeigt, in der obigen chemischen Formel 2, Reaktion C, daß zum Beispiel, indem man zunächst Metall-Ionen (z.B. Eisen-Ionen) und einen Metall-Indikator (z.B. eine Pyridylazoverbindung oder eine Nitrosoaminophenolverbindung) gleichzeitig in einer geeigneten Pufferlösung von neutral bis schwach alkalisch (pH 7,0 – 9,0) vorkommen läßt, die Bildung von Komplexen zwischen den Metall-Ionen und dem Metall-Indikator gehemmt wird, und daher tritt keine Farbentwicklung auf.
  • Reaktion D zeigt, daß in solch einem Zustand, wenn Sulfid-Ionen hinzugegeben werden, die Bildung von Komplexen derselben in Übereinstimmung mit der Konzentration an Sulfid-Ionen beschleunigt wird, wodurch der mumerische Wert der Farbentwicklung entsprechend ansteigt. Demgemäß kann (können) der Schwefelwasserstoff oder die Sulfid-Ionen durch Berechnung der erhöhten Menge des numerischen Wertes der Farbentwicklung gemessen werden.
  • In der obigen chemischen Formel 2 ist es nämlich wichtig, die Bedingungen so zu steuern, daß die Metall-Ionen und der Metall-Indikator kaum Komplexe bilden. Als die Kombination aus den Metall-Ionen und dem Metall-Indikator kann eine Kombination aus zum Beispiel Eisen-Ionen und einer Pyridylazoverbindung oder einer Nitrosoaminophenolverbindung erwähnt werden. In der folgenden Erläuterung wird die Meßmethode, die das Prinzip der obigen chemischen Formel 2 nutzt, eine die Farbentwicklung beschleunigende Methode genannt.
  • Der Reaktionsmechanismus der obigen die Farbentwicklung beschleunigende Methode kann im Hinblick auf die Kombination aus den Eisen-Ionen und der Pyridylazoverbindung wie folgt betrachtet werden.
  • Es ist bekannt, daß Eisen-Ionen in verschiedenen Formen, wie etwa als ein Aqua-Komplex oder ein Hydroxo-Komplex, in einer wäßrigen Lösung vorhanden sind und wesentlich durch solche Faktoren wie den pH-Wert beeinflußt werden. Weiter kann, unter hoch alkalischen Bedingungen, die Bildung von Niederschlägen als Hydroxide eintreten. Das folgende kann bedacht werden. In der Kombination aus Eisen-Ionen und einer Pyridylazoverbindung in diesem Meßsystem bilden, indem man zunächst Eisen(II)- und Eisen(III)-Ionen in einer geeigneten Pufferlösung von neutral bis schwach alkalisch (pH 7,0–9,0) gemeinsam vorkommen läßt, die Eisen-Ionen selbst Komplexe in der Lösung, wodurch die Reaktion mit dem Metall-Indikator (Pyridylazoverbindung) gehemmt wird. Demgemäß sind, im Falle von Eisen(II)-Ionen, unter den obigen Bedingungen, Eisen(II)-Ionen empfindlich gegenüber der Oxidation durch Sauerstoff, zusätzlich zur Bildung von Komplexen, wodurch die Eisen-Ionen in der Form von Eisen(III)-Ionen vorliegen. Wenn Sulfid-Ionen zu den Eisen-Ionen in solch einem Zustand zugegeben werden und man sie gemeinsam vorkommen läßt, werden Eisen(III)-Ionen zu Eisen(II)-Ionen durch die Reduktionskraft der Sulfid-Ionen reduziert und werden mit der Pyridylazoverbindung reaktiv, wodurch eine Farbentwicklung durchlaufen wird. Weiter bildet ein bestimmter Typ von Metall-Indikator kaum Komplexe mit Eisen(III)-Ionen, und in solch einem Fall kann dieses Prinzip der Beschleunigungsmethode sogar angewendet werden, wenn der pH außerhalb des obengenannten pH-Bereiches liegt.
  • Gemäß der die Farbentwicklung beschleunigende Methode der vorliegenden Erfindung werden nämlich zunächst Metall-Ionen, die mit einem Metall-Indikator durch die Reduktion mit Sulfid-Ionen reaktiv werden, in einen Zustand gebracht, daß sie mit dem Metall-Indikator nicht reaktiv sind, durch zum Beispiel Einstellen der Bedingungen der Lösung der Metall-Ionen in geeigneter Weise. Dann werden, durch Hinzugeben von Sulfid-Ionen dazu, die Metall-Ionen im nicht-reaktiven Zustand dahingehend verändert, daß sie reaktiv sind, und man läßt sie mit dem Metall-Indikator reagieren.
  • Demgemäß wird die die Farbentwicklung beschleunigende Methode der vorliegenden Erfindung durchgeführt, indem man die obengenannten Metall-Ionen mit einem geeigneten Metall-Indikator kombiniert.
  • Weiter wird die Reaktion in der Meßmethode, wenn die spezifische Substanz der vorliegenden Erfindung Homocystein ist, durch die folgende chemische Formel 3 dargestellt.
  • Chemische Formel 3
  • Reaktion E:
    • Homocystein – (Enzym (E1)) → Schwefelwasserstoff
  • Reaktion F:
    • Cystein – (Enzym (E2)) → Schwefelwasserstoff
  • In der obigen chemischen Formel 3 zeigt Reaktion E, daß Schwefelwasserstoff durch die Wirkung eines Enzyms (E1) (zum Beispiel O-Acetylhomoserin-Lyase) gebildet wird, das die katalytische Funktion hat, auf Homocystein so zu wirken, daß das Homocystein Schwefelwasserstoff bildet. Weiter zeigt Reaktion F, daß Schwefelwasserstoff durch die Wirkung eines Enzyms (E2) (zum Beispiel O-Acetylserin-Lyase) gebildet wird, das die katalytische Funktion hat, auf Cystein so zu wirken, daß das Cystein Schwefelwasserstoff bildet. Der gebildete Schwefelwasserstoff wird durch Nutzung der Reaktion, wie dargestellt in chemischer Formel 1 oder 2, um das Homocystein oder Cystein quantitativ zu bestimmen, gemessen.
  • Im weiteren wird die vorliegende Erfindung detaillierter unter Bezugnahme auf Beispiele beschrieben werden. Es sollte jedoch erwähnt werden, daß die vorliegende Erfindung auf keinen Fall darauf beschränkt ist.
  • Beispiel 1 (Quantitative Bestimmung von Sulfid-Ionen durch die die Farbentwicklung hemmende Methode)
  • Als die Probe und die Reagentien wurden die folgenden verwendet.
    Probe: eine wäßrige Lösung, die 0 bis 100 μM Natriumsulfid (hergestellt von Wako Pure Chemicals Industries, Ltd.) als Sulfid-Ionen enthält.
  • Erstes Reagens:
    • Tris-Puffer (pH 8,5) 100 mM
    • Zinkchlorid 10 μM
  • Zweites Reagens:
    • 5Br·PAPS (hergestellt von Dojindo Laboratories) 1 mM.
  • Zu 50 μl der Probe wurden 900 μl des ersten Reagens zugegeben, und dies wurde bei Raumtemperatur für 5 Minuten stehengelassen, und dann wurden 50 μl des zweiten Reagens hinzugegeben, und dies wurde bei Raumtemperatur für 5 Minuten stehengelassen. Dann wurde die Extinktion der Reaktionslösung mit einer Wellenlänge von 550 nm gemessen. Die Ergebnisse sind in 1 dargestellt.
  • Aus den Ergebnissen von 1 wurde eine Abnahme der Extinktion in Übereinstimmung mit der Konzentration der Sulfid-Ionen bestätigt, und es wurde festgestellt, daß diese Korrelation quantitativ war. Aus den Ergebnissen wurde auch festgestellt, daß Sulfid-Ionen durch Nutzung der Hemmungsreaktion gegenüber der Bildung von Komplexen zwischen den Metall-Ionen und dem Metall-Indikator gemessen werden können.
  • Beispiel 2 (Quantitative Bestimmung von Sulfid-Ionen durch die die Farbentwicklung beschleunigende Methode)
  • Als die Probe und die Reagentien wurden die folgenden verwendet.
    Probe: eine wäßrige Lösung, die 0 bis 100 μm Natriumsulfid (hergestellt von Wako Pure Chemicals Industries Ltd.) als Sulfid-Ionen enthält.
  • Erstes Reagens:
    • Tris-Puffer (pH 8,0) 100 mM
    • Eisen(II)-chlorid 33,3 μM
    • 2-Mercaptoethanol 4 mM
  • Zweites Reagens:
    • 5 Br·PAPS (hergestellt von Dojindo Laboratories) 0,25 mM
  • Drittes Reagens:
    • EDTA (pH 7,0) 200 mM
  • Zu 20 μl der Probe wurden 600 μl des ersten Reagens zugegeben, und dies wurde bei 37°C für 10 Minuten stehengelassen, und dann wurden 160 μl des zweiten Reagens zugegeben, und dies wurde bei 37°C für 5 Minuten stehengelassen. Weiter wurden 20 μl des dritten Reagens zugegeben, und dies wurde bei Raumtemperatur für 5 Minuten stehengelassen, und dann wurde die Extinktion der Reaktionslösung mit einer Wellenlänge von 550 nm gemessen. Die Ergebnisse sind in 2 dargestellt.
  • Aus den Ergebnissen von 2 wurde der Anstieg der Extiaktion in Übereinstimmung mit der Konzentration der Sulfid-Ionen bestätigt, und es wurde festgestellt, daß diese Korrelation quantitativ war. Aus den Ergebnissen wurde auch festgestellt, daß Sulfid-Ionen durch Nutzung der Beschleunigungsreaktion für die Bildung von Komplexen zwischen den Metall-Ionen und dem Metall-Indikator gemessen werden können.
  • In den folgenden Beispielen wurde als ein Enzym (E1), das für die quantitative Bestimmung von Homocystein verwendet werden soll, O-Acetylhomoserin-Lyase verwendet, gewonnen aus der Gattung Bacillus (Markenname: „GCS", hergestellt von Unitika Ltd., die unten angegebene Aktivität ist ein nomineller Wert des Herstellers), und als ein Enzym (E2), das für die quantitative Bestimmung von Cystein verwendet werden soll, wurde O-Acetylserin-Lyase (gewonnen aus Spinat) verwendet.
  • Die O-Acetylserin-Lyase wurde gemäß dem Verfahren von Yamaguchi et al. (Biochim. Biophys. Acta 1251; 91–98 (1995)) hergestellt.
  • Spezifisch wurde das Enzym mit etwa 4.000 Einheiten durch die Extraktion von 2 kg Spinatblättern und die Schritte der Ionenaustauschchromatographie, der hydrophoben Chromatographie und der Gelfiltrationschromatographie hergestellt und für die Beispiele verwendet. Die Aktivität wurde mit dem im obigen Dokument beschriebenen Verfahren gemessen.
  • Beispiel 3 (Quantitative Bestimmung von Homocystein durch die die Farbentwicklung beschleunigende Methode)
  • Als die Probe und die Reagentien wurden die folgenden verwendet.
    Probe: eine wäßrige Lösung, die 0 bis 50 μM L-Homocystin (hergestellt von Sigma) enthält (als das L-Homocystein, von 0 bis 100 μM).
  • Erstes Reagens:
    • Tris-Puffer (pH 8,0) 100 mM
    • Eisen(III)-chlorid 33,3 μM
    • 2-Mercaptoethanol 4 mM
    • O-Acetylhomoserin-Lyase (hergestellt von Unitika Ltd.) 3 u/ml
  • Zweites Reagens:
    • 5 Br·PAPS (hergestellt von Dojindo Laboratories) 0,25 mM
  • Drittes Reagens:
    • EDTA (pH 7,0) 200 mM
  • Zu 20 μl der Probe wurden 600 μl des ersten Reagens zugegeben und dies wurde bei 37°C für 10 Minuten stehengelassen, und dann wurden 160 μl des zweiten Reagens zugegeben, und dies wurde bei 37°C für 5 Minuten stehengelassen. Weiter wurden 20 μl des dritten Reagens zugegeben, und dies wurde bei Raumtemperatur für 5 Minuten stehengelassen, und dann wurde die Extinktion der Reaktionslösung mit einer Wellenlänge von 550 nm gemessen. Die Ergebnisse sind in 3 dargestellt.
  • Aus den Ergebnissen von 3 wurde der Anstieg der Extinktion in Übereinstimmung mit der Konzentration des Homocysteins bestätigt, und es wurde festgestellt, daß die Korrelation quantitativ war. Aus den Ergebnissen wurde auch festgestellt, daß Homocystein durch Nutzung der Beschleunigungsreaktion für die Bildung von Komplexen zwischen den Metall-Ionen und dem Metall-Indikator gemessen werden kann.
  • Beispiel 4 (Quantitative Bestimmung von Cystein durch die die Farbentwicklung beschleunigende Methode)
  • Als die Probe und die Reagentien wurden die folgenden verwendet.
    Probe: eine wäßrige Lösung, die 0 bis 500 μM L-Cystein (hergestellt von Sigma) enthält.
  • Erstes Reagens:
    • Tris-Puffer (pH 8,0) 100 mM
    • Eisen(III)-chlorid 33,3 μM
    • 2-Mercaptoethanol 4 mM
    • O-Acetylserin-Lyase (gewonnen aus Spinat) 6 u/ml
  • Zweites Reagens:
    • 5 Br·PAPS (hergestellt von Dojindo Laboratories) 0,25 mM
  • Drittes Reagens:
    • EDTA (pH 7,0) 200 mM
  • Zu 20 μl der Probe wurden 600 μl des ersten Reagens zugegeben, und dies wurde bei 37°C für 10 Minuten stehengelassen, und dann wurden 160 μl des zweiten Reagens zugegeben, und dies wurde bei 37°C für 5 Minuten stehengelassen. Weiter wurden 20 μl des dritten Reagens zugegeben, und dies wurde bei Raumtemperatur für 5 Minuten stehengelassen, und dann wurde die Extinktion der Reaktionslösung mit einer Wellenlänge von 550 nm gemessen. Die Ergebnisse sind in 4 dargestellt.
  • Aus den Ergebnissen von 4 wurde der Anstieg der Extinktion in Übereinstimmung mit der Konzentration des Cysteins bestätigt, und es wurde festgestellt, daß diese Korrelation quantitativ war. Aus den Ergebnissen wurde auch festgestellt, daß Cystein durch Nutzung der Beschleunigungsreaktion für die Bildung von Komplexen zwischen den Metall-Ionen und dem Metall-Indikator gemessen werden kann.
  • Industrielle Anwendbarkeit
  • Wie oben beschrieben, ist es gemäß der vorliegenden Erfindung möglich, Schwefelwasserstoff oder Sulfid-Ionen in einer Probe auf bequeme Weise mit hoher Empfindlichkeit quantitativ zu bestimmen. Weiter ist es auch möglich, eine spezifische Substanz in einer Probe auf bequeme Weise mit hoher Empfindlichkeit quantitativ zu bestimmen, indem zu der Probe, die die spezifische Substanz enthält, eine Komponente zugegeben wird, die auf die spezifische Substanz so wirkt, daß die spezifische Substanz Schwefelwasserstoff oder Sulfid-Ionen bildet, und der Schwefelwasserstoff oder die Sulfid-Ionen durch das obige quantitative Bestimmungsverfahren gemessen wird (werden). Demgemäß kann die vorliegende Erfindung für zum Beispiel ein quantitatives Bestimmungsverfahren von Homocystein, Cystein, etc. in einer Probe eines lebenden Körpers eingesetzt werden.

Claims (14)

  1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Schwefelwasserstoff oder Sulfid-Ionen, welches umfaßt, daß zu einer Probe, die Schwefelwasserstoff oder Sulfid-Ionen enthält, Metall-Ionen oder eine Verbindung, die besagte Metall-Ionen freisetzt, und ein Metall-Indikator, der mit den Metall-Ionen reagiert und daraus folgend eine Farbentwicklung durchläuft, zugegeben werden, wobei die Farbentwicklung durch den Schwefelwasserstoff oder die Sulfid-Ionen beschleunigt oder gehemmt wird; und daß der Grad der Farbentwicklung des Metall-Indikators gemessen wird.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Metall-Ionen Zink-Ionen oder Eisen-Ionen sind.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Metall-Indikator eine Pyridylazo-Verbindung oder eine Nitrosoaminophenol-Verbindung ist.
  4. Verfahren zur quantitativen Bestimmung einer spezifischen Substanz, welches umfaßt, daß zu einer Probe, die eine spezifische Substanz umfaßt, eine Komponente, die auf die spezifische Substanz so wirkt, daß die spezifische Substanz Schwefelwasserstoff oder Sulfid-Ionen bildet, Metall-Ionen oder eine Verbindung, die besagte Metall-Ionen freisetzt, und ein Metall-Indikator, der mit den Metall-Ionen reagiert und daraus folgend eine Farbentwicklung durchläuft, zugegeben werden, wobei die Farbentwicklung durch den Schwefelwasserstoff oder die Sulfid-Ionen beschleunigt oder gehemmt wird; und daß der Grad der Farbentwicklung des Metall-Indikators gemessen wird.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Metall-Ionen Zink-Ionen oder Eisen-Ionen sind.
  6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Metall-Indikator eine Pyridylazo-Verbindung oder eine Nitrosoaminophenol-Verbindung ist.
  7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die spezifische Substanz Homocystein ist und die Komponente, die auf die spezifische Substanz so wirkt, daß die spezifische Substanz Schwefelwasserstoff oder Sulfid-Ionen bildet, ein Enzym (E1) ist, das auf das Homocystein so wirkt, daß das Homocystein Schwefelwasserstoff bildet.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym (E1) eine Substanz ist, die eine Substitutionsreaktion an das Homocystein in Gegenwart einer Thiol-Verbindung katalysiert.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym (E1) O-Acetylhomoserin-Lyase ist.
  10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Thiol-Verbindung wenigstens eine ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Methanthiol, 2-Mercaptoethanol, Dithiothreitol, Thioglycerol und Cysteamin besteht.
  11. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die spezifische Substanz Cystein ist und die Komponente, die auf die spezifische Substanz so wirkt, daß die spezifische Substanz Schwefelwasserstoff oder Sulfid-Ionen bildet, ein Enzym (E2) ist, das auf das Cystein so wirkt, daß das Cystein Schwefelwasserstoff bildet.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym (E2) eine Substanz ist, die eine Substitutionsreaktion an das Cystein in Gegenwart einer Thiol-Verbindung katalysiert.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym (E2) O-Acetylserin-Lyase ist.
  14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Thiol-Verbindung wenigstens eine ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Methanthiol, 2-Mercaptoethanol, Dithiothreitol, Thioglycerol und Cysteamin besteht.
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