KR100639059B1 - 황화수소 또는 황화물 이온의 정량법 및 그것을 이용한특정물질의 정량법 - Google Patents

황화수소 또는 황화물 이온의 정량법 및 그것을 이용한특정물질의 정량법 Download PDF

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Abstract

황화수소 또는 황화물이온을 함유하는 시료에 금속이온 또는 그 금속이온을 유리하는 화합물과, 그 금속이온과 반응하여 발색함과 동시에 그 발색반응이 상기 황화수소 또는 황화물이온에 의하여 저해되거나 그렇지 않으면 촉진되는 금속지시약을 첨가하고, 그 금속지시약에 의한 발색강도를 측정함으로써, 상기 시료중의 황화수소 또는 황화물이온을 간편 또한 감도좋게 정량하는 방법을 제공한다. 또, 특정물질을 포함하는 시료중에 그 특정물질에 작용하여 황화수소 또는 황화물 이온을 발생시키는 성분과, 금속이온 또는 그 금속이온을 유리하는 화합물과, 그 금속이온과 반응하여 발색함과 함께 그 발색반응이 상기 황화수소 또는 황화물이온에 의하여 저해되거나 그렇지 않으면 촉진되는 금속지시약을 첨가하고, 그 금속지시약에 의한 발색강도를 측정함으로써 상기 특정물질을 정량하는 방법을 제공한다.
황화수소, 황화물, 금속이온, 발색, 정량, 지시약

Description

황화수소 또는 황화물 이온의 정량법 및 그것을 이용한 특정물질의 정량법{METHOD FOR DETERMINATION OF HYDROGEN SULFIDE OR SULFIDE ION AND METHOD FOR DETERMINATION OF SPECIFIC SUBSTANCE UTILIZING SAID METHOD}
본 발명의 황화수소 또는 황화물 이온에 의한 금속이온과 금속지시약과의 착체형성의 촉진 또는 저해반응을 이용함으로써, 시료중의 황화수소 또는 황화물 이온을 간편 또한 감도좋게 정량하는 방법, 및 시료중의 특정물질로부터 황화수소를 발생시켜, 그 황화수소 또는 그로부터 유래하는 황화물 이온을 상기 정량법에 의하여 측정하여, 그 특정물질을 간편 또한 고감도로 정량하는 방법에 관한다.
유황은 자연계에서 중요한 역할을 담당하는 원소의 하나이다. 특히 함황아미노산인 시스테인이나 메티오닌의 구성성분으로서의 역할은 크다. 또, 식물과 동물과의 사이에서 큰 유황순환이 이루어지고 있는 것도 알려져 있다. 식물에서는 유황을 황산이온의 꼴로 거두어 들이고, 황화물이온까지 환원한 후, 시스테인 합성이 행해지고, 다시 메티오닌합성에로 계속한다. 동물에서는 식물연쇄에 의하여 메티오닌을 음식물로 부터 섭취하고, 생체내에서 시스테인으로 대사된다. 이 대사과정에서 중간체로서 호모시스테인이 생성된다.
호모시스테인은 정상시에는 거의 존재하지 않는 중간대사물이지만, 그의 혈 액중농도가 높은 값으로되면, 관상동맥질환이나 뇌졸중의 발생율이 높아진다라는 보고가 되고 있다. 이때문에, 혈액중의 호모시스테인량이, 심근경색이나 뇌경색 등의 혈전색전증, 혹은 동맥경화증의 발생을 예지하는데 도움이 되는 리스크팩터로서 인정되어가는 형편이다.
또, 시스테인은 메티오닌의 대사에 의하여 생성하는 아미노산인 까닭에 호모시스테인대사 이상의 원인파악의 보조적인 지표로도 될 수 있다.
더욱더, 호모시스테인 또는 시스테인에 작용하여 분해 또는 치환을 행하고, 황화수소를 생성하는 작용을 갖는 효소로 알려져 있다. 그러나, 이와같은 효소를 이용하여 효모시스테인 또는 시스테인을 정량하려고 하더라도, 발생한 황화수소를 간편 또한 감도좋게 측정하는 방법이 없기 때문에, 상기 효소를 호모시스테인 또는 시스테인의 정량에 사용하는 실용적인 방법은 아직 발견되어 있지 않다.
한편, 황화수소 또는 그에 유래하는 황화물 이온은 대기오염이나 하천의 수질오염등 환경오염의 지표로서도 중요한 것이고, 그들의 시료중의 황화수소 또는 그에 유래하는 황화물 이온을 측정하는 것으로 오염상황을 확인할 수 있다.
황화수소 또는 그로부터 유래하는 황화물 이온의 종래의 측정방법은 예를들면, 발색화합물을 이용한 방법으로서 2,2'-디피리딜디술파이드(Svenson. Anal. Biochem., 107; 51-55(1980))이나, 니트로프루시드나트륨을 사용하는 방법, 강산성하에, N,N-디메틸-P-페닐렌디아민과 염화제2철을 작용시켜서, 메틸렌블루를 생성시켜, 청색발색을 검출하는 방법(메틸렌블루법), 셀렌을 촉매로서 색소(톨루이딘블루나 메틸렌블루)의 퇴색량 및 속도를 측정하는 방법(Mousavi등, Bull. Chem. Soc. Jpn. 65; 2770-2772(1992), Gokmen등, Analyst, 119; 703-708(1994)등이 알려져 있다. 그러나, 어느 경우든지 간편성이나 감도면에서 충분한 방법이라 말하기 어렵다.
따라서, 본 발명의 하나의 목적은 보다 간편하고, 고감도의 황화수소 또는 황화물 이온의 정량법을 제공하는 것에 있다. 본 발명의 또 하나의 목적은 시료중의 특정물질로부터 황화수소를 발생시켜, 그 황화수소 또는 그로부터 유래하는 황화물이온을 상기 정량법에 의하여 측정하여 그 특정물질을 간편하고 고감도로 정량하는 방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명자 등은 상기 목적을 달성하기 위하여, 예의 연구한 결과, 황화수소 또는 황화물이온이, 금속이온과 금속지시약의 발색반응을 저해하거나 그렇지 않으면 촉진하는 작용을 이용함으로써 시료중의 황화수소 또는 황화물이온을 간편하고 고감도로 정량할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명의 하나는 황화수소 또는 황화물 이온을 함유하는 시료에 금속이온 또는 그 금속이온을 유리하는 화합물과, 그 금속이온과 반응하여 발색함과 동시에 그 발색반응이 상기 황화수소 또는 황화물이온에 의하여 저해되거나 그렇지 않으면 촉진되는 금속지시약을 첨가하고, 그 금속지시약에 의한 발색강도를 측정하는 것을 특징으로 하는 황화수소 또는 황화물 이온의 정량법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나는 특정물질을 포함하는 시료중에 그 특정물질에 작용하여 황화수소 또는 황화물 이온을 발생시키는 성분과 금속이온 또는 그 금속이온을 유 리하는 화합물과 그 금속이온과 반응하여 발색함과 동시에, 그 발색반응이 상기 황화수소 또는 황화물이온에 의하여 저해되거나 그렇지 않으면 촉진되는 금속지시약을 첨가하고, 그 금속지시약에 의한 발색강도를 측정하는 것을 특징으로 하는 특정물질의 정량법을 제공하는 것이다.
본 발명에 의하면, 황화물이온에 의한 금속이온과 금속지시약과의 착체형성의 촉진 또는 저해반응을 이용함으로써 간편하고 또한 감도좋게 황화수소 또는 황화물이온을 정량할 수가 있다. 또, 특정물질을 포함하는 시료중에 그 특정물질에 작용하여 황화수소 또는 황화물이온을 발생시키는 성분을 작용시켜 생성한 황화수소를 상기 반응을 이용하여 측정함으로써, 시료중의 특정물질을 간편하고 또한 감도좋게 정량할 수가 있다.
도 1은 발색저해법에 의한 황화물이온의 정량결과를 나타내는 도면,
도 2는 발색촉진법에 의한 황화물이온의 정량결과를 나타내는 도면,
도 3은 발색촉진법에 의한 호모시스테인의 정량결과를 나타내는 도면,
도 4는 발색촉진법에 의한 시스테인의 정량결과를 나타내는 도면이다.
발명을 실시하기 위한 최량의 형태
본 발명의 황화수소 또는 황화물 이온의 정량법에 있어서, 황화수소 또는 황화물이온이, 금속이온과 금속지시약과의 발색반응을 저해하는 작용을 이용하는 경우에 대하여 설명하면 다음과 같다. 즉, 시료중에 존재하는 황화수소 또는 황화물이온과 금속이온을 접촉시켜 황화금속을 생성시킴과 동시에, 금속이온과 금속지시 약을 반응시켜 그 발색강도를 측정함으로써, 금속이온과 금속지시약과의 반응에 의한 착체생성량을 구한다. 그리고, 황화수소 또는 황화물이온이 존재하지 않는 이외는 상기와 같은 조건하에, 금속이온과 금속지시약을 반응시킨 경우의 착체생성량에서 상기 착체생성량을 공제함으로써, 상기 황화금속이 착체생성을 일으키지 않는 성질에 의하여 착체생성량이 감소한 양을 구한다. 이 착체생성량이 감소한 양은 시료중에 존재하는 황화수소 또는 황화물이온에 상응한 양으로 된다. 따라서, 상기 착체생성량의 감소량에 의거하여 시료중의 황화수소 또는 황화물이온의 함량을 산출할 수가 있다.
또, 황화수소 또는 황화물이온이, 금속이온과 금속지시약과의 발색반응을 촉진하는 작용을 이용하는 경우에 대하여 설명하면, 다음과 같다. 즉, 황화수소 또는 황화물이온을 함유하는 시료중에 금속이온과 금속지시약을 첨가하여 반응시켜서, 그 발색강도를 측정함으로써 금속이온과 금속지시약과의 반응에 의한 착체생성량을 구한다. 그리고, 이 착체생성량으로부터 황화수소 또는 황화물이온이 존재하지 않는 이외는 상기와 같은 조건하에 금속이온과 금속지시약을 반응시킨 경우의 착체생성량을 공제함으로써 착체생성량의 증가량을 구한다. 이 착체생성량의 증가량은 황화수소 또는 황화물이온이 금속이온과 금속지시약과의 반응을 촉진하는 것으로 인하여 초래된 것이므로 황화수소 또는 황화물이온에 상응한 양으로 된다. 따라서, 이 착체생성량의 증가량에 의거하여, 시료중의 황화수소 또는 황화물 이온의 함량을 산출할 수가 있다.
본 발명에 있어서, 금속이온은 황화수소 또는 황화물 이온에 의하여 금속이 온과 금속지시약의 발색반응을 저해하거나 그렇지 않으면 촉진하는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 금속이온과 금속지시약과의 발색반응을 저해하는 것으로서는 아연이온이 바람직하게 사용되고, 상기 발색반응을 촉진하는 것으로서는 2가 또는 3가의 철이온이 바람직하게 사용된다. 구체적으로는 상기 금속의 염산염, 황산염, 아세트산염 등이 사용되지만, 수용액에 용해하여 유리의 금속이온을 생성하는 것이면 특별히 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 금속지시약으로서는 황화수소 또는 황화물이온에 의하여 상기 금속이온과의 발색반응을 저해하거나 그렇지 않으면 촉진하는 물질이면 특별히 한정되지 않지만 그 착체형성시의 발색강도가 높은 것이 바람직하고, 예를들면 피리딜아조화합물이나 니트로소아미노페놀화합물 등이 바람직하게 이용된다. 더욱더 구체적으로는 피리딜아조화합물로서는 2-(5-브로모-2-피리딜아조)-5-[N-N-프로필-N-(3-술포프로필)아미노]페놀·나트륨염(상품명: 5Br·PAPS, 이하, 5Br·PAPS로 약기한다)이나, 2-(5-니트로-2-피리딜아조)-5-[N-N-프로필-N-(3-술포프로필)아미노]페놀·나트륨염(상품명: Nitro·PAPS)가 바람직하게 사용된다. 또 니트로소아미노페놀 화합물로서는 2-니트로소-5-[N-N-프로필-N-(3-술포프로필)아미노]페놀(상품명: Nitroso·PSAP)나, 2-니트로소-5-[N-에틸-N-(3-술포프로필)아미노]페놀(상품명: Nitroso·ESAP)가 바람직하게 사용된다. 이들은 수용성이고, 아연이온, 구리이온, 코발트이온, 철이온등과 착체를 형성하여, 고감도로 발색하는 성질을 갖는다. 이들의 금속지시약으로서는 여러가지 특징을 갖는 것이 시판되어 있고, 예를들면 가부시키가이샤 도오진 카가꾸 겐큐쇼로 부터 입수할 수 있다.
본 발명에 있어서 특정물질이란, 효소반응 등에 의하여 황화수소 또는 황화물 이온이 생성되는 것이면 어느것도 좋고, 바람직하게는 호모시스테인이나 시스테인 등을 들 수 있다.
특정물질을 호모시스테인으로 한 경우, 특정물질로 부터 황화수소 또는 황화물이온을 발생시키는 성분으로서는 호모시스테인에 작용하여 황화수소 또는 황화물이온을 생성하는 작용을 갖는 효소(E1)가 사용된다. 이와같은 효소로서는 예를들면 L-메티오닌 γ-리아제(효소번호 EC 클라스 4.4.1.11)이나, ο-아세틸호모세린-리아제(효소번호 EC 클라스 4.2.99)등을 들 수 있지만 특히 ο-아세틸호모세린리아제가 바람직하게 사용된다.
L-메티오닌 γ-리아제는, 티올화합물 비존재하에서는 호모시스테인에 대하여 분해(탈리)작용을 나타내어 황화수소를 발생하지만, 티올화합물 존재하에서는 γ-치환반응을 촉매하는 작용을 갖는 효소로서 알려져 있다. 이 효소는 그것을 생산하는 미생물, 예를들면 슈도모나스속의 세균으로부터 얻을 수 있지만, 시판되어 있는 것도 있고, 예를들면 와꼬쥰야꾸가부시키가이샤 등에서 입수할 수가 있다.
또, ο-아세틸호모세린-리아제는, 아미노산 합성작용(예를들면, ο-아세틸호모세린과 황화수소로부터는 호모시스테인이, 메탄티올로부터는 메티오닌이 생성하는 작용)을 갖는 효소로서 알려져 있다(「효소핸드북」, 마루오등 감수, 아사쿠라 서점, 1982년 참조). 본 발명자들은 ο-아세틸호모세린-리아제를 티올화합물 존재하에 호모시스테인에 작용시키면, γ-치환반응에 의하여 황화수소를 생성하는 촉매작용을 새로이 발견하였다(일본특원평 10-347003호).
ο-아세틸호모세린-리아제는, 그것을 생산하는 여러가지 미생물이 알려져 있고(예를들면 Ozaki등, J. Biochem 91:1163-1171(1982), Yamagata, J. Biochem 96: 1511-1523(1984), Brzywczy등, Acta. Biochimica, Polonica 40(3); 421-428(1993)참조), 이들의 미생물을 배양함으로써 얻을 수 있지만, 시판되어 있는 것도 있고, 예를들면, 유니티카 가부시키카이샤 등에서 입수할 수 있다. 이들 효소(E1)는 호모시스테인에 강하게 반응함과 동시에 시스테인에게도 약간 작용하여 황화수소를 생성하는 작용을 갖는다.
유니티카 가부시키카이샤 제의 바실루스속 유래의 ο-아세틸호모세린-리아제(상품명「GCS」)의 이화학적 성질은 다음과 같다. 더욱이, 하기 이화학적 성질중, 분자량 이외의 항목은 본 발명자등에 의하여 구한 것이다.
(이화학적 성질)
1)작용: L-호모시스테인과 티올화합물의 γ치환반응을 촉매하고, 황화수소 및 티올화합물 치환호모시스테인을 생성한다. 또, L-메티오닌과 티올화합물의 치환반응을 촉매하고, 메탄티올 및 티올화합물 치환호모시스테인을 생성한다.
2)기질특이성: L-호모시스테인, L-메티오닌에 작용한다. 또 L-시스테인에는 β치환반응으로서 약간 반응한다.
3)분자량: 180,000(겔여과법)
4)적당한 pH: 8.5 내지 9.0
5)Km: 0.9mM(L-호모시스테인)
또, 특정물질을 시스테인으로 한 경우, 특정물질로 부터 황화수소 또는 황화물 이온을 발생시키는 성분으로서는 시스테인에 작용하여 황화수소 또는 황화물이온을 생성하는 작용을 갖는 효소(E2)가 사용된다. 이와같은 효소로서는 예를들면 ο-아세틸세린-리아제나 β-시아노알라닌신타아제나 시스테인-리아제등을 들 수 있지만, 특히 ο-아세틸세린-리아제가 바람직하게 사용된다.
ο-아세틸세린-리아제는 시스테인 합성작용(ο-아세틸세린과 황화수소로부터 시스테인을 생성하는 작용)을 갖는 효소로서 알려져 있다.
본 발명자들은 ο-아세틸세린-리아제를 티올화합물 존재하에 시스테인에 작용시키면, β-치환반응에 의하여 황화수소를 생성하는 촉매작용을 새로이 발견하였다(일본특원평 11-84035호공보). 이 작용은 시스테인에 특이적이다. ο-아세틸세린-리아제는 그것을 생산하는 미생물(예를들면, Burnell 등, Biochim. Biophys. Acta 481; 246-265(1977), Nagasaw 등, Methods Enzymol 143; 474-478(1987)이나, 식물(예를들면, Droux등, Arch. Biochem. Biophys. 295(2); 379-390(1992), Yamaguchi 등, Biochim. Biophys. Acta 1251; 91-98(1995))등으로 부터 얻을 수가 있다.
예를들면, Yamaguchi 등, Biochim. Biophys. Acta 1251; 91-98(1995)에 기재된 방법에 의하여 시금치로부터 얻은 ο-아세틸세린-리아제의 이화학적성질은 다음과 같다. 더욱이, 하기 이화학적 성질중, 분자량이외의 항목은 본 발명자들에 의하여 구한 것이다.
(ο-아세틴세린-리아제의 이화학적 성질)
1)작용: L-시스테인과 티올화합물의 β치환반응을 촉매하고, 황화수소 및 티올화합물 치환시스테인을 생성한다.
2)기질특이성: L-시스테인에 특이적으로 작용한다.
3)분자량: 63,000(겔여과법)
4)적당한 pH: 9.0 내지 11.0
5)Km: 0.27mM(L-시스테인)
한편, β-시아노알라닌신타아제는 시안존재하에 시스테인에 작용시키면 β-치환반응에 의하여 황화수소를 생성하는 촉매작용을 나타내고, 또, 시스테인리아제는 아황산이온존재하에, 시스테인에 작용하면 β-치환반응에 의하여 황화수소를 생성하는 촉매작용을 갖는 것이 알려져 있다.
더욱이, 본 발명에서 사용되는 티올화합물은 메탄티올, 2-메르캅토에탄올, 디티오트레이톨, 티오글리세롤, 시스테아민등, 치환반응이 행해지는 것이면 특별히 제한은 없고, 알맞는 것으로서는 2-메르캅토에탄올이나 시스테아민을 들 수 있다.
본 발명의 황화수소나 그렇지 않으면 황화물이온의 측정방법에 있어서 반응을 식으로 나타내면 하기 화학식 1 및 화학식 2와 같이 나타낼 수가 있다.
Figure 112001013383700-pct00001
Figure 112001013383700-pct00002
상기 화학식(1)에 있어서, 반응 A는 황화물이온 비존재하에 있어서, 금속이온(예를들면, 아연이온)과 금속지시약(예를들면, 피리딜아조화합물)은 신속히 착체를 형성하여 발색하는 것을 나타내다.
그리고, 반응 B는 금속이온(예를들면, 아연이온)과 황화물이온을 미리 접촉시켜 황화금속(예를들면, 황화아연)을 생성시킴으로써, 생성한 화합물(황화아연)이 금속지시약과 착체를 형성할 수 없게되고, 그 몫의 발색값이 감소하는 것을 나타내다. 따라서 그 발색값의 감소분을 산출함으로써 황화수소나 그렇지 않으면 황화물이온을 측정할 수가 있다.
즉, 상기 화학식 1에 있어서는 황화물 이온과 반응하여 안정한 황화금속을 형성하는 금속이온과, 그 금속이온과 신속히 착체를 형성하는 금속지시약의 조합을 선택하는 것이 중요하다. 이와같은 금속이온과 금속지시약과의 조합으로서는 예를들면 아연이온과 피리딜아조화합물과의 조합을 들 수 있다. 이하의 설명에서 상기 화학식 1의 원리를 사용한 측정방법을 발색저해법이라 한다.
또, 상기 화학식(2)에 있어서, 반응 C는 예를들면 미리 중성 내지 약 알칼리 성(pH 7.0 내지 9.0)의 적당한 완충액중에, 금속이온(예를들면, 철이온)과 금속지시약(예를들면, 피리딜아조화합물 또는 니트로소아미노페놀화합물)을 공존시키는 것등에 의하여, 그 금속이온과 금속지시약과의 착체작용이 저해되어 발색이 일어나지 않는 상태를 나타낸다.
그리고 반응 D는 이와같은 조건하에 황화물 이온을 첨가하면, 그 착체형성이 황화물이온 농도에 따라 촉진되고, 그 몫의 발색값이 증가하는 것을 나타낸다. 따라서, 그 발색값의 증가량분을 산출함으로써, 황화수소 그렇지 않으면 황화물이온을 측정할 수가 있다.
즉, 상기 화학식(2)에 있어서는 금속이온과 금속지시약이 착체를 형성하기어려운 조건으로 하는 것이 중요하다. 이와같은 금속이온과 금속지시약과의 조합으로서는 예를들면 철이온과 피리딜아조화합물 또는 니트로소아미노페놀 화합물와의 조합을 들 수 있다. 이하의 설명에 있어서, 상기 화학식(2)의 원리를 사용한 측정방법을 발색촉진법이라 한다.
상기 발색촉진법의 반응메카니즘을 철이온과 피리딜아조화합물의 조합으로 미루어 살펴보면 다음과 같이 생각할 수가 있다.
철이온은 수용액중에서 아쿠아착체와 히드록소착체 등 여러가지 형으로 존재하고, 그것은 pH조건등의 요인에 의하여 크게 영향받는 것이 알려져 있다. 또, 고알칼리 조건하에서는 수산화물로서 침전형성도 행해진다. 본 측정계에 있어서 철이온과 피리딜아조화합물의 조합에서는 2가 및 3가의 철이온을 미리 중성에서 약 알칼리성(pH 7.0 내지 9.0)의 적당한 완충액중에 공존시키는 것으로 용액중에서 철이 온 자체가 착체를 형성함으로써 금속지시약(피리딜아조화합물)와의 반응이 저해된다고 고려된다. 특히 2가의 철이온의 경우, 상기 조건하에서는 착체형성외에 산소에 의한 산화를 받기쉽고, 그결과 3가의 철이온으로서 존재하고 있는 것으로 고려된다. 그리고, 이 상태의 철이온에 황화물이온이 첨가공존되면, 황화물이온의 환원력에 의하여 3가의 철이온이 2가의 철이온으로 환원되어 피리딜아조화합물과 반응가능한 상태로 되고, 발색이 인정되는 것으로 고려된다. 또, 금속지시약에 따라서는 3가의 철이온과 착체를 형성하기 어려운것도 있고, 이경우에는 상술한 pH범위외에도 이 촉진반응원리를 적용할 수 있다고 고려된다.
즉, 본 발명의 발색촉진법은 우선, 황화물이온에 의하여 환원을 받아 금속지시약과 반응가능하게되는 금속이온을 예를들면 금속이온의 용액을 적당한 조건으로 함으로써 금속지시약과 반응하지 않는 상태로 한다. 그리고, 황화물이온을 첨가함으로써, 그 반응하지 않는 상태로부터 반응가능한 상태로하여, 금속지시약과 반응시키는 방법이다.
따라서, 본 발명의 발색촉진법은 상술한 바와같은 금속이온과 적당한 금속지시약을 조합함으로써 달성된다.
또, 본 발명의 특정물질을 호모시스테인 및 시스테인으로 한 경우의 측정방법에 있어서 반응을 식으로 표시하면 하기화학식(3)과 같이 표시할 수가 있다.
Figure 112001013383700-pct00003
상기 화학식 3에 있어서, 반응 E는 호모시스테인에 작용하여 황화수소를 생성하는 작용을 촉매하는 효소(E1)(예를들면 ο-아세틸호모세린-리아제)을 작용시켜 황화수소를 생성시키는 것을 나타낸다. 또, 반응 F는 시스테인에 작용하여 황화수소를 생성하는 작용을 촉매하는 효소(E2), (ο-아세틸세린-리아제)를 작용시켜 황화수소를 생성시키는 것을 나타낸다. 그리고, 생성한 황화수소를 상기 화학식 1 또는 화학식 2에 나타내는 반응을 이용하여 측정함으로써 호모시스테인 및 시스테인을 정량할 수가 있다.
이하 실시예를 들어서 본 발명을 다시 상세히 설명하지만, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1(발색저해법에 의한 황화물이온의 정량)
시료 및 시약으로서 이하의 것을 사용하였다.
시료:
황화물이온으로서 황화나트륨(와꼬준야쿠샤제)를 0 내지 100μM포함하는 수용액.
제 1 시약:
트리스완충액(pH 8.5) 100mM
염화아연 10μM
제 2 시약:
5Br·PAPS(도오진카가꾸겐큐쇼샤제) 1mM
시료 50㎕에 제 1시약 900㎕를 가하여 실온에서 5분간 방치후, 제 2시약 50㎕를 가하여 실온에서 5분간 방치하였다. 그후, 550mm의 파장으로 반응용액의 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 1에 나타낸다.
도 1의 결과로부터, 황화물이온의 농도에 따라, 흡광도의 감소가 인정되고, 그 관계는 정량적인 것을 알게되었다. 이결과로부터, 금속이온과 금속지시약과의 착체형성의 저해반응을 이용함으로써, 황화물이온을 측정할 수 있음을 알게되었다.
실시예 2(발색촉진법에 의한 황화물이온의 정량)
시료 및 시약으로서 이하의 것을 사용하였다.
시료:
황화물이온으로서 황화나트륨(와꼬준야쿠샤제)를 0 내지 100μM포함하는 수용액.
제 1 시약:
트리스완충액(pH 8.0) 100mM
염화 제 1철 33.3μM
2-메르캅토에탄올 4mM
제 2 시약:
5Br·PAPS(도오진카가꾸겐큐쇼샤제) 0.25mM
제 3 시약:
EDTA(pH 7.0) 200mM
시료 20㎕에 제 1시약 600㎕를 가하여, 37℃에서 10분간 방지후, 제 2시약 160㎕를 가하여 37℃에서 5분간 방치하였다.
더욱더, 제 3시약 20㎕를 가하여 실온에서 5분간 방치후, 550nm의 파장으로 반응용액의 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 2에 나타낸다.
도 2의 결과로부터, 황화물이온의 농도에 따라 흡광도의 증가가 인정되고, 그 관계는 정량적인 것을 알게되었다. 이 결과로부터 금속이온과 금속지시약과의 착체형성의 촉진반응을 이용함으로써 황화물이온을 측정할 수 있음을 알게 되었다.
이하의 실시예에서는 호모시스테인의 정량에 사용하는 효소(E1)로서, 바실루스속 유래의 ο-아세틸호모세린-리아제(상품명「GCS」, 유니티카 가부시키가이샤제, 이하에 기재한 역가는 메이커 표시값에 의한)를 사용하여, 시스테인 정량에 사용하는 효소(E2)로서, ο-아세틸세린-리아제(시금치유래)를 사용하였다.
더욱이, ο-아세틸세린-리아제는 야마구찌등의 방법(Biochim. Biophys. Acta 1251; 91-98(1995))에 의거하여 조제하였다.
구체적으로는 시금치잎 2kg로부터 추출, 이온교환크로마토그라피, 소수크로마토그라피 및 겔여과크로마토그라피의 공정을 경유하여 약 4,000단위의 효소를 조제하여 사용하였다. 더우기, 역가는 동문헌에 기재의 방법에 의하여 측정하였다.
실시예 3(발색촉진법에 의한 호모시스테인의 정량)
시료 및 시약으로서 이하의 것을 사용하였다.
시료:
L-호모시스테인(시그마샤제)를 0 내지 50μM 포함하는 수용액(L-호모시스테인으로서는 0 내지 100μM).
제 1 시약:
트리스완충액(pH 8.0) 100mM
염화 제 1철 33.3μM
2-메르캅토에탄올 4mM
ο-아세틸호모세린-리아제(위니티카샤제) 3μ/ml
제 2 시약:
5Br·PAPS(도오진카가꾸겐큐쇼샤제) 0.25mM
제 3 시약:
EDTA(pH 7.0) 200mM
시료 20㎕에 제 1시약 600㎕를 가하여, 37℃에서 10분간 방치후, 제 2시약 160㎕를 가하여 37℃에서 5분간 방치하였다. 더욱더, 제 3시약 20㎕를 가하여, 실온에서 5분간 방치후, 550nm의 파장으로 반응용액의 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 3에 나타낸다.
도 3의 결과로부터 호모시스테인 농도에 따라 흡광도의 증가가 인정되고, 그 관계는 정량적인 것을 알게되었다. 그 결과로부터 금속이온과 금속지시약과의 착체형성의 촉진반응을 이용함으로써 호모시스테인을 측정할 수 있음을 알게되었다.
실시예 4(발색촉진법에 의한 시스테인의 정량)
시료 및 시약으로서 이하의 것을 사용하였다.
시료:
L-시스테인(시그마샤)를 0 내지 500μM 포함하는 수용액.
제 1 시약:
트리스완충액(pH 8.0) 100mM
염화 제 1철 33.3μM
2-메르캅토에탄올 4mM
ο-아세틸세린-리아제(시금치유래) 6μ/ml
제 2 시약:
5Br·PAPS(도오진카가꾸겐큐쇼샤제) 0.25mM
제 3 시약:
EDTA(pH 7.0) 200mM
시료 20㎕에 제 1시약 600㎕를 가하여, 37℃에서 10분간 방치후, 제 2시약 160㎕를 가하여 37℃에서 5분간 방치하였다. 더욱더 제 3시약 20㎕를 가하여 실온에서 5분간 방치후 550nm의 파장으로 반응용액의 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 4에 나타낸다.
도 4의 결과로부터 시스테인 농도에 따라 흡광도의 증가가 인정되고, 그 관계는 정량적인 것을 알게되었다. 이 결과로부터, 금속이온과 금속지시약과의 착체형성의 촉진반응을 이용함으로써 시스테인을 측정할 수 있음을 알게되었다.
이상과 같이 본 발명에 의하면, 시료중의 황화수소 또는 황화물이온을 간편하고 또한 감도좋게 정량할수가 있고, 또, 특정물질을 포함하는 시료중에 그 특정물질에 작용하여 황화수소 또는 황화물 이온을 발생시키는 성분을 작용시켜서 생성 한 황화수소를 상기 정량법으로 측정함으로써 시료중의 특정물질을 간편하고 또한 감도좋게 정량할 수가 있다. 따라서, 예를들면 생체시료중의 호모시스테인, 시스테인 등의 정량법에 이용할 수가 있다.

Claims (14)

  1. 황화수소 또는 황화물 이온을 함유하는 시료에,
    금속이온 또는 그 금속이온을 유리하는 화합물과, 그 금속이온과 반응하여 발색함과 동시에, 그 발색반응이 상기 황화수소 또는 황화물이온에 의하여 저해되거나 그렇지 않으면 촉진되는 금속지시약을 첨가하고, 그 금속지시약에 의한 발색강도를 측정하는 것을 특징으로 하는 황화수소 또는 황화물 이온의 정량법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 금속이온이, 아연이온 또는 철이온인 것을 특징으로 하는 황화수소 또는 황화물 이온의 정량법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 금속지시약이 피리딜아조화합물 또는 니트로소아미노페놀화합물인 것을 특징으로 하는 황화수소 또는 황화물이온의 정량법.
  4. 특정물질을 포함하는 시료중에, 그 특정물질에 작용하여 황화수소 또는 황화물이온을 발생시키는 성분과 금속이온 또는 그 금속이온을 유리하는 화합물과, 그 금속이온과 반응하여 발색함과 동시에 그 발색반응이 상기 황화수소 또는 황화물이온에 의하여 저해되거나 그렇지 않으면 촉진되는 금속지시약을 첨가하고, 그 금속지시약에 의한 발색강도를 측정하는 것을 특징으로 하는 특정물질의 정량법.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 금속이온이, 아연이온 또는 철이온인 것을 특징으로 하는 특정물질의 정량법.
  6. 제 4 항에 있어서, 상기 금속지시약이, 피리딜아조화합물 또는 니트로소아미노페놀 화합물인 것을 특징으로 하는 특정물질의 정량법.
  7. 제 4 항에 있어서, 상기 특정물질이 호모시스테인이고, 상기 특정물질에 작용하여 황화수소 또는 황화물 이온을 발생시키는 성분이, 호모시스테인에 작용하여 황화수소를 생성하는 작용을 갖는 효소(E1)인 것을 특징으로 하는 특정물질의 정량법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 효소(E1)가 티올화합물의 존재하에, 호모시스테인에 대하여 치환반응을 촉매하는 것을 특징으로 하는 특정물질의 정량법.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 효소(E1)가 ο-아세틸호모세린-리아제인 것을 특징으로 하는 특정물질의 정량법.
  10. 제 8 항에 있어서, 상기 티올화합물이 메탄티올, 2-메르캅토에탄올, 디티오트레이톨, 티오글리세롤, 시스테아민으로 이루어지는 군에서 선택된 하나인 것을 특징으로 하는 특정물질의 정량법.
  11. 제 4 항에 있어서, 상기 특정물질이 시스테인이고, 상기 특정물질에 작용하여 황화수소 또는 황화물이온을 발생시키는 성분이 시스테인에 작용하여 황화수소를 생성하는 작용을 갖는 효소(E2)인 것을 특징으로 하는 특정물질의 정량법.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 효소(E2)가 티올화합물의 존재하, 시스테인에 대하여 치환반응을 촉매하는 것임을 특징으로 하는 특정물질의 정량법.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 효소(E2)가 ο-아세틸세린-리아제인 것을 특징으로 하는 특정물질의 정량법.
  14. 제 12 항에 있어서, 상기 티올화합물인, 메탄티올, 2-메르캅토에탄올, 디티오트레이톨, 티오글리세롤, 시스테아민으로 이루어지는 군에서 선택된 하나인 것을 특징으로 하는 특정물질의 정량법.
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