JPS63247656A - チオール化合物を検出するのに有用な分析試薬、及びそれを用いた検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 危旦ユ公Ｉ 本発明は１反応工程で一時的に発生するチオール化合物
をはじめとする、液体系中のチオール化合物をＡＩ一定
するための分析試薬及び方法に関する。更に詳しくは、
本発明の分析試薬及び方法は、チオール化合物の比色分
析に関するものであり、チオール化合物の存在に関連し
たり、その原因となる試薬又は酵素の存在の測定に用い
ることができる。

久」Ｊと１月 チオール化合物は天然に存在し、また、化学反応によっ
て製造することもできる。かかる反応としては、次式： ％式％ のようなジスルフィドの還元反応及び生化学的反応を挙
げることができる。

数多くの方法がチオール基を含む化合物の検出に関して
公知である。特に有用であり、しばしば引用される方法
は、Ｇ、　Ｋ、　ＥｌｌｍａｎによってＡｒｃｈ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、、第８２巻７０〜
７７頁（１！４５９年）に記載されているものである。

この方法は、３−メルカプト−６−二トロー安息香酸の
黄色のアニオンを生成する３、３°−ジチオ−ビス−６
−二トロ安息香酸（Ｅｌ１ｍａｎ試薬）とのチオール反
応に基づくものである。

しかしながら、Ｅ　Ｉ　Ｉ　＠ａｎ法の一つの欠点は、
還元されたジスルフィド類によって黄色の色合いのみし
か生じないという事である。赤色又は青色領域の色合い
が出れば、通常、はるかに望ましいと考えられており、
したがって、チオール類の視覚測定に、より適するであ
ろう。

したがって、本発明の目的は、試薬及び方法によって与
えられる色が赤又は青色の領域である、チオール化合物
を比色分析するための、信頼性があり、正確で安価な分
析試薬及び方法を提供することである。

本発明の他の目的は、本明細書及び請求項を読めば当業
者に明らかになろう。

しい−シ　熊　の雪　な譬 本発明の試薬及び方法は、次の反応式に関するものであ
る。

２　Ｒ−９ｌ（＋　２Ｆｅ”　　＋　Ｒ−３−９−Ｒ＋
　２Ｆｅ”この反応において、チオール化合物は＋３の
酸化状態の鉄と相互作用し、該イオンを＋２の状態に還
元せしめ、これによって、該チオール化合物を酸化せし
めてジスルフィドを形成せしめる。得られるＦｅｚ＋イ
オンは好適なリガンドと錯体を形成し、色変化を起こす
ことができる０本方法においてＦｅ３＋のモル減少率（
５ｏｌａｒ　ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ　）、及び発色リガ
ンド：Ｆｅ２＋錯体によって得られる色変化は、系中に
最初に存在しているチオール化合物の量に直接関連する
。

数多くの方法が、発色錯体として好適な錯体リガンドに
よるＦｅ２＋イオンの検出に関して公知である。この目
的のために好適なリガンドの例としては、フェロイン類
、クジロイン類及びテロイン類からなる群より選択され
る化合物が挙げられる。特に好適な錯体リガンドとして
は、ヒドラゾン類及びその互変異性アゾ体、テトラゾイ
ルピリジン類、ピリジルキナゾリン類、ビス−イソキノ
リン類、イミン類、フェナントロリン類、ビピリジン類
、ターピリジン類、ビジアジン類、ピリジルジアジン類
、ピリジルベンズイミダゾール類、ジアジルトリアジン
類、Ｏ−ニトロアニリン類、フェノール類、テトラジン
類、トリアジン類、ピリジン類、フェナジン類、キノキ
サリン類、ベンズイミダゾール類、置換メチル又はフェ
ニル−２−ピリジルケトン類のオキシム類が挙げられる
［　Ｓｍ１ｔｈ、　Ａｎａｌｙｔ、　Ｃｈｅｗ、、　２
Ｅｔ、　１５３４〜１５３８　（１９５４年）Ｈ５ｃｈ
ｉｌｔら、　Ｔａ１ａｎｔａ、　１５．４７５〜４７８
　（１９８８年）Ｈ５ｃｈｉｌｔら、↑ａｌａｎｔａ、
　１５．１０５５〜１０５Ｂ　（１１１８８年）；及び
、　　５ｃｈｉｌｔら、　Ｔａ１ａｎｔａ、　１１３゜
４４８〜４５２　（１！３Ｅ１９年）１．他の錯体リガ
ンドに関する記載は、ＢｌａｎｄａｍｅｒらのＪ、　Ｃ
ｈｅｗ、　Ｓｏｃ、。

Ｄａｌｔｏｎ　１００１〜１００Ｂ　（１９７８年）　
、　Ｃａ５ｅのＪ、　Ｏｒｇ。

Ｃｈｅｗｓ、、　３１．２３９８〜２４００　（１９６
８年）に、また、英国特許出願第７０１，８４３号にお
いて見られる。もちろん、ここに示したちの以外の錯体
リガンドを用いることもできる。

試験片型材中に錯体リガンドを組み込んで本発明の実施
態様を用いる場合は、疎水性基又はイオン交換官能基も
有するようにすることが有利である。これによって錯体
リガンドのマトリクスへの結合が改善され、それによっ
て試験片が「ブリード」するのが防止される。用いるこ
とができる疎水性基の例としては、長鎖のアルキル又は
アラル午ル基が挙げられる。錯体リガンドのポリマー結
合も考えられる。

本発明によれば、該試験用試薬をリポン酸アミド（ｌｉ
ｐｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　ａｓｉｄｅ）、チオコリン、グ
ルタチオン又は補酵素Ａのようなチオール類、あるいは
チオグリコシド類のチオール類を検出するために用いる
ことができる。更に、チオエステル、チオエーテル、ジ
スルフィド又はチオアセタールが試験系において生成す
る場合などにチオール前駆物質を検出することもできる
。

本発明の試験用試薬は、チオエーテルヒドロラーゼ類、
チオエステラーゼ類又はチオグリコシダーゼ類のような
チオ化合物を開裂する酵素を分析するのに好適である。

更に、コリンエステラーゼ（ＣＨＥ）のようなエステラ
ーゼ類も検出する、−）−がでセス−Ｃ口Ｆの通常の几
脣ｌ＋７セ羊Ｊし１リンであるが、この酵素はアセチル
−及びブチリルチオコリンを開裂することもでき、該試
験用試薬は開裂によって生成する＊＊チオール基を検出
することができる０本発明はまた、還元されたニコチン
アミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）の存在下で
の、リポンアミドデヒドロゲナーゼ（ｌｉｐｏｎａｍｉ
ｄｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を触媒として用い
るリポン酸（ｌｉｐｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）　　の還元の
ような酸化還元反応によって遊離チオール基が生成する
生化学的反応と共に用いることもできる。

したがって、本発明の試験用試薬は、ＮＡＤＨによる反
応の分析に用いることができる。ＮＡＤＨによる酵素の
典型例としては、ラクテートデヒドロゲナーゼ、アルコ
ールデヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、
グリセロールアルデヒドデヒドロゲナーゼ、グリセロー
ルホスフェートデヒドロゲナーゼ、マレートデヒドロゲ
ナーゼなどが挙げられる。ＮＡＤＨはまた、グルタメー
トオキサルアセテートトランスアミナーゼ（ＥＣ２，６
，ｌｌ）、グルタメートビルベートトランスアミナーゼ
（ＥＣ２，６，１２）又はクレアチニンキナーゼ（ＥＣ
２，７，３２）の分析の場合のように、多段酵素反応の
最終生成物であってもよい。

ＮＡＤ）（はまた、ラクテート、グルコース、マレート
、尿素などのような基質の分析においては反応生成物で
あってもよい。ＮＡＤＨによる反応の分析において本発
明の試験用試薬を用いることにより、ＮＡＤＨＩモルあ
たり２モルのＦｅ計が生成し、いくつかの場合の発色錯
体が非常に高い吸光係数を有するので感度が実質的に向
上する。

チオール基質に結合しているＦｅ３＋錯体を提供するこ
とが有利であることが証明され、可能な錯体形成用試薬
は、ＥＤＴＡ、ＨＥＤＴＡ、クエン酸、リンゴ酸、乳酸
１例えばアラニン、グリシン、及びグルタミンのような
アミノ酸類、例えば１８−クラウン−６、フェニルアザ
−１５−クラウン−５、ベンゾ−１５−クラウン−５及
びジベンゾビリジノー１５−クラウン−５のようなりラ
ウンエーテル類、又はトリアジノファン類及びクリプテ
ート類である。

チオール：Ｆｅ３＋の濃度比は少なくともｌ：１でなけ
ればならず、好ましくは約ｌ：５である。

反応を最も速くするためには１：１０の比も好ましいが
、１：２０の比が特に好ましい。

本発明に関する試験用試薬又は試験系を用いてセル中の
分析対象物を測定することができる。

Ｆｅ”÷イオン及び錯体リガンドに加えて、該試験用試
薬は、酵素、基質、補酵素、エフェクター、抗原、抗体
などのような、特定の分析に必要なすべての試薬を含有
することもできる。これらの試験用試薬は、緩衝剤、湿
潤剤及び安定化剤のような、反応しない物質を含有する
ことができる。

上記記載のように、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰ）Ｉを補酵素
として用いてチオール基を生成する酵素、例えばリポン
アミドデヒドロゲナーゼ及びグルタチオンレダクターゼ
を測定することができる。試薬配合物を酵素、試薬及び
既に述べた物質から調製することができ、また、溶液又
は粉末として又は錠剤もしくは凍結乾燥物の形態で混合
することができる。試薬配合物は既に溶液状態になって
はいない場合は、水又は他の好適な溶液中に溶解するこ
とができ、試薬溶液はこれによって調製される。試薬配
合物が個々の成分からなる場合は、これらを互いに混合
する。試料（例えば基質溶液、酵素溶液、血清、血漿又
は尿）を試薬混合物の一部と混合した後に、得られた色
を光度計で測定する０次に、特定の濃度、又は基質濃度
を、モル吸光係数及び加えた試薬又は試料の量から計算
する。動的測定及び終点測定のいずれも可能である。

Ｆｅ３＋／リガンド系を、 １、特定のパラメーター検出に必要な１以上の試薬又は
他の酵素； ２、緩衝系； ３、湿潤剤； ４、活性化剤；及び、 ５、他の助剤 と共に吸収性試薬担持体（例えば紙、フリースなど）上
に含浸せしめることもできる。これについては、試薬又
は助剤がどの程度溶解するかによって、水溶液、有機溶
液又は混合溶液の形態で１以上の含浸溶液を調製するこ
とができる。

吸収性又は膨潤性担持体、好ましくは濾紙、又はガラス
もしくはプラスチックの吸収性フリースにこれらの溶液
を含浸又は噴霧し、次に乾燥する。このようにして製造
された試薬担持体を、液体試料、すなわち、血液、尿も
しくは唾液のような体液、又は果汁、牛乳などのような
食品の含有物を直接測定するための迅速診断薬として用
いることもできる。それによって液体を試薬担持体に直
接施すか、又は担持体を液体中に短時間浸漬する。比較
用の色を、このようにして生成した色に対して配置する
ことによって半定量的分析が可能である。定量的分析は
反射光度計によって行なうことができる。

本発明による試験用試薬を、注型成形用溶液から製造さ
れる担体マトリクス中に組み込むことも可能である。こ
こで示しうる例は、セルロース、セルロース誘導体、ゼ
ラチン、ゼラチン誘導体、又はポリウレタン及びアクリ
ルアミドのようなプラスチックである。ここで、試験用
試薬、及び、適当な場合には他の必要な試薬を注型成形
用溶液に直接加えると有利である。それによって、一つ
の操作で担体及び試薬からなる試験具を製造することが
できる。

上記記載の試薬を、水又は緩衝剤又は血清によって吸収
性担体から溶出せしめることによって試薬溶液を得るこ
とができる０次に基質又は酵素を上記記載のように光度
計のセル中で測定することができる。

記載された試験用試薬に好適な緩衝剤は、アルカリ金属
又はアンモニウム対向イオンを有するリン酸塩、クエン
酸塩、ホウ酸塩、及びＧＯＯＤ緩衝剤である。しかしな
がら他の系を用いることもできる。ＰＨ６，５〜７．５
が好ましいが、目的とするＰＨ値は６〜１０である。

湿潤剤は、本発明による化合物とイオン性相互作用を起
こすアニオン及びカチオン湿潤剤が特に好ましい、酵素
を活性化する非イオン湿潤剤を用いることもでき、ラウ
リル硫酸ナトリウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリ
ウム及びアルキルアリールポリエーテルアルコール類が
好ましい。

用いることができるエフェクターは特定の酵素反応に関
して公知のものである。

適当な他の助剤は、他の色原体を用いた対応する試験に
おいて公知のもののような１通常の増粘剤、可溶化剤、
乳化材、光学的増白剤、一定媒体などである。

折 記載された試験系においてＮＡＤＨを検出するために、
次の試薬成分をセル中に入れた。

試験における濃度 ０．１１４／文酢酸ａＸ緩衝剤　　　８７　　ミリモル
／交１７４０ル見、　ｐＨ糟５ リポンアミド１００　ｌＬ立　　　　２．５　ミリモル
／１ＦｅＣＩ３溶液　１００　ｇ　ｌ　　　　　１　　
　ミリモル７文ジピリジル　　ＢＯｇｌ　　　　　３　
　ミリモル７文リポンアミドデヒドロ ゲナーゼ　　　２０ｇ４　　　１２　　ｋＶ／ｊＬ試薬
ブランク値を測定後、ＮＡＤＨ溶液２０ル文を加えるこ
とによって反応を開始させた。５１５ｎｍにおいて最大
吸光度が測定された。動的測定によって、僅か１時間の
反応時間後に安定な終了点（２０分以内の吸光度変化が
１％）が示された。

作用能力及び直線性を試験するために、１〜１０ミリモ
ル／ｌの範囲のＮＡＤＨ濃度を回分試験で測定した。５
１５ｎｍにおいて測定した吸光度の違いを表１に示した
。

友」 ＮＡＤＨＥ５１５ｎＩｎ （ミリモル／交） １　　　　　　　　　　０．１２４ ２　　　　　　　　　　０．２１９ ３　　　　　　　　　　０．３２７ ４　　　　　　　　　　０．４２９ ５　　　　　　　　　　０．５１３ ６　　　　　　　　　　　Ｑ、１３３３７　　　　　　
　　　　０．７３５ ８　　　、　　　　　　　０．８２２ ９　　　　　　　　　　０．８８４ １０　　　　　　　　　　１．０９８ 種々の錯体リガンドを用いて得られる色、及び対応する
最大吸光度を表２に示した。

と−１ Ｌ−λ（続き） 手続補正書 昭和６３年　４月１８０ 特許庁長官　小　川　邦　夫　殿 １、事件の表示 昭和６３年特許願第　２１４２７号 ２、発明の名称 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 名　称　マイルス・インコーホレーテッド４、代理人 ５、補正命令の日付　　自　発 ６、補正の対象　　明細書の特許請求の範囲の欄７、補
正の対象　　別紙のとおり 特許請求の範囲 ・１．＋３の酸化状態であり、少なくとも検出するチオ
ール化合物の量と等量の鉄、及び、＋２の酸化状態の鉄
と選択的に錯体を形成することができ、それによって該
鉄との錯体形成に基づく色変化を示すリガンドからなる
ことを特徴とする、液体試料中のチオール化合物、又は
チオール化合物の存在に関連する物質を比色分析するた
めの分析試験用試薬。

２、＋３の酸化状態の鉄からなり、かつ、＋２の酸化状
態の鉄と選択的に錯体を形成することができ、それによ
って、＋２の酸化状態のかかる鉄イオンとの錯体形成に
より、色変化を起こすリガンドからもなっている液と、
液体試料を一緒にすることを特徴とする、液体試料中の
チオール化合物、又はチオール化合物の存在に関連する
物質の分析方法。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、＋３の酸化状態であり、少なくとも検出するチオー
   ル化合物の量と等量の鉄、及び、 ＋２の酸化状態の鉄と選択的に錯体を形成することがで
   き、それによって該鉄との錯体形成に基づく色変化を示
   すリガンドからなることを特徴とする、液体試料中のチ
   オール化合物、又はチオール化合物の存在に関連する物
   質を比色分析するための分析試験用試薬。 ２、該リガンドがフェロイン類、クプロイン類、及びテ
   ロイン類からなる群の一である請求項１記載の分析試験
   用試薬。 ３、該リガンドが錯体リガンド類、例えば、ヒドラゾン
   類及びその互変異性アゾ体、テトラゾイルピリジン類、
   ピリジルキナゾリン類、ビス−イソキノリン類、イミン
   類、フェンナントロリン類、ビピリジン類、ターピリジ
   ン類、ビジアジン類、ピリジルジアジン類、ピリジルベ
   ンズイミダゾール類、ジアジルトリアジン類、ｏ−ニト
   ロアニリン類、フェノール類、テトラジン類、トリアジ
   ン類、ピリジン類、フェナジン、キノキサリン類、ベン
   ズイミダゾール類、置換メチル又はフェニル−２−ピリ
   ジルケトン類のオキシム類からなる群の一である請求項
   ２記載の分析試験用試薬。 ４、更に疎水性基又はイオン交換官能基からなる請求項
   １記載の分析試験用試薬。 ５、該疎水性基が長鎖アルキル基及びアラルキル基から
   なる群のものである請求項４記載の分析試験用試薬。 ６、更に吸収性担体マトリクスからなる請求項５記載の
   分析試験用試薬。 ７、＋３の酸化状態の鉄からなり、かつ、＋２の酸化状
   態の鉄と選択的に錯体を形成することができ、それによ
   って、＋２の酸化状態のかかる鉄イオンとの錯体形成に
   より、色変化を起こすリガンドからもなっている液と、
   液体試料を一緒にすることを特徴とする、液体試料中の
   チオール化合物、又はチオール化合物の存在に関連する
   物質の分析方法。 ８、検出されるチオが、リポン酸アミド（ｌｉｐｏｎｉ
   ｃ　ａｃｉｄ　ａｍｉｄｅ）、チオコリン、グルタチオ
   ン及びチオグリコシド類からなる群の一である請求項７
   記載の方法。 ９、分析されるチオがチオエステル、チオエーテル、ジ
   スルフィド又はチオアセタールの前駆物質の形態で存在
   する請求項７記載の方法。 １０、チオ化合物を開裂する酵素が間接的に分析される
   請求項７記載の方法。 １１、該酵素がエステラーゼ類、チオグリコシダーゼ類
   又はチオエステラーゼ類からなる群の一である請求項１
   ０記載の方法。 １２、リポアミド類及びリポアミドデヒドロゲナーゼ類
   を補助的に用いて、還元されたピリジンヌクレオチド類
   を分析するために該方法を用いる請求項７記載の方法。 １３、基質の反応によって遊離チオール基が直接又は間
   接的に形成され、これらチオール基を、請求項１記載の
   試験用試薬を補助的に用いて検出する請求項７記載の方
   法。