DE3703081A1

DE3703081A1 - Verfahren und mittel zum nachweis von thiolen

Info

Publication number: DE3703081A1
Application number: DE19873703081
Authority: DE
Inventors: Holger Dipl Chem D Heidenreich; Herbert Dipl Chem Dr Hugl; Klaus Dipl Chem Dr Wehling
Original assignee: Miles Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1987-02-03
Filing date: 1987-02-03
Publication date: 1988-08-11
Also published as: JPH0635966B2; GB8801876D0; FR2610409A1; CA1339797C; FR2610409B1; GB2200989A; GB2200989B; JPS63247656A

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren und Mittel zum Nachweis von Thiolgruppen, die in einem System vorhanden sind oder in einem der Nachweisreaktion vorgelagerten Schritt gebildet werden. Diese Bildung kann durch chemische Reaktionen, wie z. B. Reduktion von Disulfiden, oder biochemische Reaktionen erfolgen. Die bevorzugten bio chemischen Reaktionen werden durch das folgende Formel schema verdeutlicht:

Es sind zahlreiche Methoden zum Nachweis von Thiolgrup pen enthaltenden Verbindungen bekannt. Eine besonders wertvolle und häufig zitierte Methode ist die von G. K. Ellman in "Arch. Biochem. Biophys. 1959, 82, 70-77" beschriebene, die auf der Bildung des gelben Anions der 3-Mercapto-6-nitro-benzoesäure beruht, das durch Reak tion zwischen einem Thiol und der 3,3′-Dithio-bis-6- nitro-benzoesäure (Ellmans Reagenz) entsteht.

Ein gravierender Nachteil des Ellman Reagenzes besteht darin, daß man durch die reduzierten Disulfide nur zu gelben Farbtönen gelangt. Wünschenswert für die visuelle Bestimmung von Thiolen wären aber Farbtöne aus dem Rot- bzw. Blaubereich.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren können gerade diese Farbtöne entwickelt werden.

Der Erfindung liegt folgende grundsätzliche Reaktion zugrunde:

2 R-SH + 2 Fe³⁺ → R-S-S-R + 2 Fe²⁺

Eisen in der Oxidationsstufe 3 wird durch Thiole zu Eisen in der Oxidationsstufe 2 reduziert, wobei die Thiole selbst zu Disulfiden oxidiert werden. Das gebil dete Fe²⁺-Ion wird nun durch geeignete Liganden in Kom plexe übergeführt, deren molare Extinktion ein Viel faches der molaren Extinktion der Fe³⁺-Komplexe auf weist. Zudem erfahren die Fe²⁺-Komplexe gegenüber den Fe³⁺-Komplexen einen Shift, so daß man einen deutlichen Farbumschlag erkennen kann.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Testmittel zum Nachweis von Thiolgruppen, enthaltend Fe³⁺-Ionen, welche durch die Thiolgruppen zu Fe²⁺-Ionen reduziert werden können, und einen Komplexliganden, der in der Lage ist mit den gebildeten Fe²⁺-Ionen einen farbigen Komplex zu bilden.

Der Nachweis von Fe²⁺-Ionen mit Hilfe von geeigneten Komplexliganden als gefärbte Komplexe ist bekannt. Ge eignete Liganden dafür sind z. B. Verbindungen aus der Gruppe Ferroine, Cuproine und Terroine.

Besonders geeignet sind Komplexliganden wie Hydrazone und deren tautomiere Azoformen, Tetrazolylpyridine, Pyridylquinazoline, Bis-Isoquinoline, Imine, Phenan throline, Bipyridine, Terpyridine, Bidiazine, Pyridyl diazine, Pyridylbenzimidazole, Diazyltriazine, o-Nitro aniline, Phenole, Tetrazine, Triazine, Pyridine, Phenazin, Chinoxaline, Benzimidazole, Oxime von substi tuierten Methyl- oder Phenyl 2-Pyridylketonen (Smith, Analyt. Chem., 26 [1954] 1534-1538; Schilt et. al., Talanta 15 [1968] 475-478; Schilt et. al., Talanta 15 [1968] 1055-1058; Schilt et. al., Talanta 16 [1969] 448-452).

Eine Beschreibung von weiteren Komplexliganden findet sich in Blandamer et. al. J. Org. Chem. Soc. Dalton (1978) 1001-1008, Case, J. Org. Chem., 31 (1966) 2398-2400 und auch in der Englischen Patentanmeldung 701, 843. Es können aber auch andere Komplexliganden als die hier genannten eingesetzt werden.

Für den Einsatz des Testmittels und damit auch der Komplexliganden in Teststreifen kann es vorteilhaft sein, daß die Komplexliganden noch hydrophobe Reste oder Ionenaustauscher-Funktionen tragen. Die Bindung der Komplexliganden an die Matrix wird dadurch verbessert und damit ein "Ausbluten" des Teststreifens verhindert. Als hydrophobe Reste sind langkettige Alkyl- oder Aral kylreste einsetzbar. Eine Polymerbindung der Komplex liganden ist ebenfalls denkbar.

Das erfindungsgemäße Testmittel kann zum Nachweis von Thiolen wie Liponsäureamid, Thiocholin, Glutathion, Coenzym A oder auch von Thioglykosiden eingesetzt werden. Im Testmittel kann das Thiol auch als Vorläufer in Form eines Thioesters, Thioethers, Disulfids oder Thioacetals vorliegen.

So eignet sich das erfindungsgemäße Testmittel z. B. auch, um Enzyme nachzuweisen, die Thioverbindungen spalten. Zu nennen wären hier Thioetherhydrolasen, Thioesterasen oder auch Thioglykosidasen. Aber auch Esterasen wie die Cholinesterase (CHE) können nachge wiesen werden. Natürliches Substrat der CHE ist das Acetylcholin. Dieses Enzym ist aber auch in der Lage, Acetyl- bzw. Buturylthiocholin zu spalten. Die durch die Spaltung gebildete freie Thiolgruppe wird dann mit dem Testmittel nachgewiesen.

Weiterhin sind biochemische Reaktionen bekannt, bei denen auf Grund von Redoxreaktionen freie Thiolgruppen gebildet werden.

Zu nennen ist hier die durch die Liponamiddehydrogenase katalysierte Reduktion der Liponsäure in Anwesenheit von reduziertem Nicotinsäureamidadenindinucleotid (NADH).

Damit ergibt sich die Möglichkeit das erfindungsgemäße Testmittel auch in der Analytik von NADH abhängigen Reaktionen einzusetzen. Als typische Vertreter für NADH abhängige Enzyme sind zu nennen: Laktatdehydrogenase, Alkoholdehydrogenase, Glukosedehydrogenase, Glycerin aldehyddehydrogenase, Glycerinphosphatdehydrogenase, Malatdehydrogenase usw. Das NADH kann auch das Endpro dukt von mehrstufigen enzymatischen Reaktionen sein wie bei der Analytik der Glutamat-Oxalacetat-Transaminase (EC 2.6.11), Glutamat-Pyruvat-Transaminase (EC 2.6.12) oder auch der Creatin-Kinase (EC 2.7.32).

Auch bei der Analytik von Substraten wie Laktat, Glu kose, Malat, Harnstoff usw. kann NADH Reaktionsprodukt sein. Durch die Verwendung von dem erfindungsgemäßen Testmittel in der Analytik von NADH abhängigen Reak tionen wird eine wesentliche Verbesserung der Empfind lichkeit erreicht, und zwar, weil pro Mol NADH zwei Mol Fe²⁺ gebildet werden und die gefärbten Komplexe teil weise sehr hohe Extinktionskoeffizienten besitzen.

Es hat sich als günstig erwiesen das Fe³⁺ komplex ge bunden dem Thiol-Substrat anzubieten. Als Komplexbildner kommen EDTA, HEDTA, Zitronensäure, Äpfelsäure, Milch säure, Aminosäuren, wie z. B. Alanin, Glycin, Glutamin, Kronenether, wie z. B. 18-Krone-6, Phenylaza-15-krone-5, Benzo-15-krone-5, Dibenzopyridino-15-krone-5 oder Tria zinophane und Kryptate in Frage.

Das Konzentrationsverhältnis Thiol : Fe³⁺ sollte min destens 1 : 1, besser 1 : 5 sein. Besonders bevorzugt für eine möglichst schnelle Reaktion ist das Verhältnis 1 : 20, wobei das Verhältnis 1 : 10 ganz besonders günstig ist.

Unter Testmittel oder Testsystem im Rahmen der vorlie genden Erfindung sind z. B. solche zu verstehen, die in einer Küvette vermessen werden können. Die Testmittel enthalten neben den Fe³⁺-Ionen und den Komplexliganden alle für den der jeweiligen Analysensubstanz notwendigen Reagenzien wie Enzyme, Substrate, Coenzyme, Effektoren, Antigene, Antikörper usw. Weiterhin können diese Test mittel noch nicht reagierende Substanzen, wie z. B. Puffer, Netzmittel und Stabilisatoren, enthalten. Wie oben ausgeführt, sind Enzyme, die mit Hilfe von NADH und NADPH als Coenzym Thiolgruppen bilden, die Liponamid dehydrogenase und auch die Glutathionreduktase. Aus den genannten Enzymen, Reagenzien und Substanzen können Reagenzkombinationen hergestellt werden, die als Lösung, als Pulver vermischt, als Tabletten oder als Lyophylisat vorliegen. Die Reagenzkombination (falls sie nicht schon als Lösung vorliegt) wird mit Wasser oder einem anderen geeigneten Lösungsmittel aufgenommen und zu einer Rea genzlösung bereitet. Besteht die Reagenzkombination aus einzelnen Komponenten, so sind diese miteinander zu mischen. Nach Vermischen der Probe (z. B. Substratlösung, Enzymlösung, Blut, Serum, Plasma oder Urin) mit einem aliquoten Teil der Reagenzmischung wird die entstehende Farbe am Photometer vermessen und über den molaren Ex tinktionskoeffizienten und die zugesetzten Reagenz- bzw. Probevolumina die jeweilige Konzentration bzw. Substrat konzentration berechnet. Es sind sowohl kinetische als auch Endpunktmessungen möglich.

Ebenso kann das Fe³⁺-System-/Ligand zusammen mit dem/den für den jeweiligen Parameternachweis notwendi gen Reagenzien bzw. anderen Enzymen, dem Puffersystem, gegebenenfalls Netzmitteln und Aktivatoren sowie anderen Hilfsstoffen auf saugfähigen Reagenzträgern wie Pa pieren, Vliesen etc. imprägniert werden. Dazu kann man eine oder mehrere Imprägnierlösungen in Form von wäß rigen oder organischen bzw. gemischten Lösungen her stellen, je nach dem wie sich die Reagenzien oder Hilfs stoffe lösen. Mit diesen Lösungen werden saugfähige oder quellfähige Träger, vorzugsweise Filterpapier oder saug fähige Glas- oder Kunststoffvliese imprägniert oder besprüht. Anschließend wird getrocknet. Die so herge stellten Reagenzträger können entweder als Schnell diagnostica zur direkten Bestimmung von Inhaltsstoffen von Flüssigkeiten (z. B. in Körperflüssigkeiten wie Blut, Urin oder Speichel, oder in Lebensmitteln z. B. Frucht säften, Milch o. a.) eingesetzt werden. Die Flüssigkeit wird dabei direkt auf den Reagenzträger gebracht oder dieser kurz in die Flüssigkeit eingetaucht. Eine semi quantitative Bestimmung ist möglich, indem man die so entstandene Farbe einer Vergleichsfarbe zuordnet. Eine quantitative Auswertung läßt sich remis sionsphotometrisch durchführen.

Ebenso ist es möglich das erfindungsgemäße Testmittel in Trägermatrices einzubringen, die aus Gießlösungen hergestellt wurden. Beispielhaft sind hier Cellulose, Cellulosederivate, Gelatine, Gelatinederivate oder auch Kunststoffe wie Polyurethane und Acrylamid zu nennen. Dabei ist es vorteilhaft, wenn die Testmittel und ge gebenenfalls die anderen notwendigen Reagenzien der Gießlösung direkt zugesetzt werden, wodurch es möglich wird, die Testvorrichtung, bestehend aus Träger und Reagenzien, in einem Arbeitsgang herzustellen.

Durch Eluieren der vorweggenannten Reagenzien mit Wasser bzw. Puffer oder Serum aus dem saugfähigen Träger läßt sich eine Reagenzlösung herstellen, mit der man, wie oben, beschrieben Substrate oder Enzyme in der Küvette am Photometer bestimmen kann.

Geeignete Puffer für die genannten Testmittel sind Phos phat-, Citrat-, Borat-, GOOD-Puffer mit Alkali- oder Am moniumgegenionen. Andere Systeme sind jedoch ebenfalls brauchbar. Als pH-Werte sind 6 bis 10, insbesondere 6,5 bis 7,5 anzustreben.

Netzmittel sind insbesondere anionische und kationische Netzmittel, die mit den erfindungsgemäßen Verbindungen ionische Wechselwirkungen eingehen. Nichtionogene Netz mittel, die die Enzyme aktivieren, sind jedoch ebenfalls brauchbar. Natriumlaurylsulfat, Dioctylnatriumsulfosuc cinat und Alkylarylpolyetheralkohle werden bevorzugt.

Als Effektoren sind die für die jeweilige enzymatische Reaktion bekannten einzusetzen.

Als sonstige Hilfsstoffe können übliche Verdicker, Lö sungsvermittler, Emulgatoren, optische Aufheller, Kon trastmittel etc. sinnvoll sein, wie sie in entsprechen den Testen mit anderen Chromogenen bekannt sind.

Beispiel Thiol-Nachweis mit FeCl₃ und Komplexliganden

Zum Nachweis von NADH in dem beschriebenen Testsystem wurden in einer Küvette folgende Reagenzbestandteile vorgelegt:

Konzentration im Test

1740 µl 0,1 M/l Acetatpuffer, pH = 587 mmol/l 100 µl Liponamid 2,5 mmol/l 100 µl FeCl₃-Lösung 1 mmol/l 60 µl Dipyridyl 3 mmol/l 20 µl Liponamid-Dehydrogenase12 kV/l

Nach Messung der Reagenzien-Leerwerte wurde die Reaktion durch Zugabe von 20 µl NADH-Lösung gestartet. Das ge messene Extintionsmaximum liegt bei 515 nm. Kinetische Untersuchungen ergaben einen stabilen Endpunkt (Ex tinktionsveränderung innerhalb von 20 Minuten = 1%) bereits nach einer Reaktionszeit von 1 Minute.

Zur Prüfung der Funktionsfähigkeit und Linearität wurden im Testansatz NADH-Konzentrationen im Bereich 1-10 mmol/l gemessen. Die gemessenen Extinktionsdiffe renzen bei 515 nm sind in Tabelle 1 zusammengestellt.
NADH (mmol/l)E_{515 nm}

10,124 20,219 30,327 40,429 50,513 60,633 70,735 80,822 90,964 101,098

In der Tabelle 2 sind die mit den verschiedenen Komplex liganden erhältlichen Färbungen und die entsprechenden Extinktionsmaxima zusammengestellt.

Tabelle 2

Claims

1. Testmittel zum Nachweis von Thiolgruppen, ent haltend Fe³⁺-Ionen, welche durch die Thiolgruppen zu Fe²⁺-Ionen reduziert werden können, und einen Komplexliganden, der in der Lage ist, mit den gebildeten Fe²⁺-Ionen einen farbigen Komplex zu bilden.

2. Testmittel gemäß Anspruch 1 zum Nachweis von Thiolen aus der Gruppe Liponsäureamid, Thiocholin, Gluthathion und Thioglykoside.

3. Testmittel gemäß den Ansprüchen 1 und 2, enthaltend das Thiol als Vorläufer in Form eines Thioesters, Thioethers, Disulfids oder Thioacetals.

4. Testmittel gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, worin der Komplexligand für die Fe²⁺-Ionen aus der Gruppe enthaltend Ferroine, Cuproine oder Terroine stammt.

5. Testmittel gemäß den Ansprüchen 1 bis 4, worin der Komplexligand für die Fe²⁺-Ionen aus der Gruppe enthaltend Hydrazone, Terazolylpyridine, Pyridyl quinazoline, Bis-Isoquinoline, Imine, Phenan troline, Bipyridine, Terpyridine, Bidiazine, Pyri dyldiazine, Pyridylbenzimidazole, Diazyltriazine, o-Nitroaniline, Phenole, Tetrazine, Chinoxaline, Benzimidazole, Oxime von substituierten Methyl- oder Phenyl 2-Pyridylketonen stammt.

6. Testmittel gemäß den Ansprüchen 1 bis 5 worin der Komplexligand zusätzlich einen hydrophoben Rest enthält.

7. Verwendung des Testmittels gemäß den Ansprüchen 1 bis 6 zum Nachweis von Enzymen die Thioverbindungen spalten.

8. Verwendung nach Anspruch 7 wobei die Enzyme, Ester asen, Thioglykosidasen oder Thioesterasen sind.

9. Verwendung des Testmittels gemäß den Ansprüchen 1 bis 6 zum Nachweis von reduziertem Liponsäureamid.

10. Verwendung des Testmittels gemäß den Ansprüchen 1 bis 6 zum Nachweis von reduzierten Pyridin nucleotiden mit Hilfe des Liponamids und der Liponamiddehydrogenase.

11. Verfahren zum Nachweis von Enzymen, wobei durch die enzymatische Reaktion direkt oder indirekt freie Thiolgruppen gebildet werden und diese mit Hilfe des Testmittels gemäß den Ansprüchen 1 bis 6 nach gewiesen werden.

12. Verfahren zum Nachweis von Substraten, wobei durch die Reaktion der Substrate direkt oder indirekt freie Thiolgruppen gebildet werden und diese mit Hilfe des Testmittels gemäß den Ansprüchen 1 bis 6 nachgewiesen werden.