DE3003490C2

DE3003490C2 -

Info

Publication number: DE3003490C2
Application number: DE3003490A
Authority: DE
Inventors: Paul T. Jackson N.J. Us Nix; Spencer M. Freehold N.J. Us Fields
Original assignee: Millipore Corp
Current assignee: EMD Millipore Corp
Priority date: 1979-01-31
Filing date: 1980-01-31
Publication date: 1990-08-30
Also published as: JPS55131400A; CA1125770A; FR2476129A1; US4247631A; FR2476129B1; GB2043891B; GB2043891A; JPS6258718B2; DE3003490A1

Description

Es sind bereits verschiedene Verfahren zur analytischen Bestimmung von Wasserstoffperoxid bekannt. Bei einer Gruppe dieser Verfahren wird das Enzym Peroxidase verwendet, das die Umsetzung eines Substrates mit Wasserstoffperoxid katalysiert, wobei das Substrat oxidiert wird und Wasser entsteht. Enzymatische Bestimmungen dieser Art haben sich als besonders nützlich bei der Analyse verschiedener Stoffe, wie Cholesterin, Glukose und Harnsäure, in Körperflüssigkeiten, beispielsweise im Blut, erwiesen. Bei solchen Verfahren wird die Körperflüssigkeit mit einem Enzym vermischt, das befähigt ist, die Oxidation des zu bestimmenden Bestandteiles unter gleichzeitiger Entstehung des Wasserstoffperoxid zu katalysieren. Die Flüssigkeit wird ferner mit Peroxidase und einem Substrat für Peroxidase versetzt, das bei der Oxidation eine Farbänderung erleidet. Das Ausmaß der Farbänderung ist ein Maß für die Menge des entstandenen Wasserstoffperoxids, die ihrerseits wieder ein Maß für die Menge des zu bestimmenden Bestandteils darstellt.

Beispielsweise beschreiben Hall u. Mitarb. in "Automated Determination of Glucose Using Glucose Oxidase and Potassium Ferrocyanide", Analyt. Biochem., 26 (1968), S. 12-17, ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Glucose durch Oxidation mit Glucoseoxidase unter Entstehung von Glukonsäure und Wasserstoffperoxid und Reduktion des Wasserstoffperoxids mit Kaliumeisen(III)-cyanid in Gegenwart von Peroxidase unter Bildung von Eisen(III)-cyanid. Trinder beschreibt in "Determination of Glucose in Blood Using Glucose Oxidase With an Alternative Oxygen Acceptor", Ann. Clin. Biochem., 6, (1969), S. 24-27, die Verwendung von Phenol und 4-Aminophenazon (4-Aminoantipyrin) als farbbildendes System anstelle von Kaliumeisen(III)-cyanid. Man nimmt an, daß hierbei das Phenol oxidiert wird und sich dann mit dem 4-Aminophenazon zu einem Chinoniminfarbstoff umsetzt. Eines solche Umsetzung wurde bereits früher von Emerson in "The Condensation of Aminoantipyrine II. A New Color Test for Phenolic Compounds", J. Org. Chem., 8, (1943), S. 417-428 und in der US-PS 21 94 201 beschrieben. Die von Emerson beschriebenen Umsetzungsteilnehmer wurden noch in jüngster Zeit auf die Trinder-Umsetzung angewendet; vgl. Meiattini in US-PS 38 66 045.

Diese Art von Verfahren kann auch zur Bestimmung anderer Bestandteile des Blutes oder von anderen Körperflüssigkeiten verwendet werden, wenn die Glucoseoxidase durch ein Enzym ersetzt wird, das die Oxidation dieses anderen Bestandteils unter gleichzeitiger Entstehung von Wasserstoffoxid katalysieren kann, beispielsweise Cholesterinoxidase oder Harnsäureoxidase (Urikase). Beispielsweise wird die Übertragung dieses Verfahrens auf die Bestimmung von Harnsäure im Serum von Trivedi und Mitarbeiter in "New Enzymatic Method for Serum Uric Acid at 500 nm", Clin. Chem., 24, (1978) S. 1908-1911, beschrieben. Die von Trider beschriebene Art von Farbstoffträgern ist jedoch nicht so empfindlich, wie es für die Bestimmung von Stoffwechselprodukten erwünscht ist, die wie Harnsäure üblicherweise im Blut nur in sehr geringen Konzentrationen vorhanden sind, beispielsweise in der Größenordnung von 4 bis 9 mg/100 ml Blut im Vergleich zu Konzentrationen von 80 bis 100 mg/100 ml Glucose und 150 bis 250 mg/100 ml für Cholesterin.

Eine andere Art von Chromogen-Chromophor-System, das als Wasserstoff peroxid-Detektor in analytischen Verfahren dieser Art verwendet wurde, ist das Gemisch aus 3-Methyl-2-benzothia zolinon-hydrazon-N,N-dimethylanilin, bei dem die beiden Umset zungsteilnehmer oxidativ zu einem kovalent gebundenen Indamin farbstoff koppeln. Die Anwendung dieses Verfahrens auf die analytischen Bestimmung von Harnsäure und Glukose wurde von Gochman und Mitarbeiter in "Automated Determination of Uric Acid, With Use of a Uricase-Peroxidase System", Clin. Chem., 17, (1971), S. 1154 bis 1159 und in "Application of a New Peroxide Indicator Reaction to the Specific, Automated Determination of Glucose with Glucose Oxidase", Clin. Chem., 18, (1972), S. 943-950, beschrieben.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen Farbstoff zur analytischen Bestimmung von Wasserstoffperoxid zur Verfügung zu stellen, das die erforderliche Empfindlichkeit zur Bestimmung von Stoffen aufweist, die, wie Harnsäure, normalerweise in geringer Konzentration vorliegen. Diese Aufgabe wird durch ein neues Chromogen-Chromophor-System zur enzymatischen Bestimmung von Wasserstoffperoxid gelöst, wobei als Chromogen ein Gemisch aus einer 3-aminoaromatischen Säure und einem 4-Aminoantipyrin verwendet wird und wobei ein neuer Farbstoffträger (Chromophor) entsteht, der einen außergewöhnlich hohen Extinktionskoeffizienten aufweist.

Die Erfindung betrifft somit den in den Patentansprüchen ge kennzeichneten Gegenstand.

Die erfindungsgemäß verwendete aminoaromatische Säure ist entweder eine 3-Aminobezoesäure oder eine 3-Aminobenzolsulfonsäure. Diese Säuren besitzen die allgemeine Formel I

in der X einen Mono- oder Dialkylaminorest bedeutet und ZH die Carboxyl-(-CO₂H)- oder Sulfonsäure(-SO₃H)-Gruppe darstellt. Die Art der Alkylreste in der Aminogruppe ist nicht besonders kritisch, mit der Maßgabe, daß die Entstehung des gewünschten Farbstoffes möglich ist. Aus Gründen, die nachstehend erörtert werden, sollen deshalb voluminöse Gruppen, wie tertiäre Alkyl- oder Cycloalkylreste, nicht verwendet werden. Bevorzugt sind primäre Alkylreste. Die Länge des Alkylrestes ist nicht besonders kritisch, solange die aminoaromatische Säure und der erhaltene Farbstoff in wäßrigem Medium löslich sind. Bevorzugt sind jedoch niedere Alkylreste, d. h. Alkylreste mit 1 bis etwa 6 Kohlenstoffatomen, beispielsweise die Methyl-, Äthyl-, Propyl-, Butyl-, Pentyl- und Hexylgruppe. Bevorzugt sind ferner Dialkylaminoreste, insbesondere die Dimethylaminogruppe. Die aminoaromatischen Säuren können am Benzolkern substituiert sein, wenn der Substituent die Farbstoffbildung nicht beeinträchtigt. Beispielsweise kann der Benzolkern mindestens ein Halogenatom, wie Chlor- oder Bromatome, aufweisen. Nicht labile Substituenten, wie Alkylreste, sollen sich jedoch nicht in p-Stellung zur Aminogruppe befinden.

Der zweite Bestandteil des erfindungsgemäßen Farbstoffs ist ein 4-Aminoantipyrin der allgemeinen Formel II

in der R und R¹ unabhängig voneinander Alkylreste, R² einen aromatischen Rest, R³ und R⁴ unabhängig voneinander Wasserstoffatome oder Alkylreste und Y ein Sauerstoff- oder Schwefelatom bedeuten. Ebenso wie bei der aminoaromatischen Säure sollen die Alkylreste des Aminoantipyrins, d. h. die Reste R, R¹, R³ und R⁴, keine voluminösen Gruppen, wie tertiäre Alkylreste, darstellen, und ihre Kettenlänge ist durch die Löslichkeit des Aminoantipyrins und des entstehenden Farbstoffes begrenzt. Bevorzugt sind niedere Alkylreste, insbesondere die Methylgruppe. Günstigerweise ist die 4-Aminogruppe eine primäre Aminogruppe, d. h. die Reste R³ und R⁴ stellen Wasserstoffatome dar, da bei Verwendung solcher Verbindungen eine schnellere Umsetzung und kräftigere Färbung stattfindet. Der aroma tische Rest R² ist vorzugsweise eine gegebenenfalls substituierte Phenylgruppe. Günstige Substituenten der Phenylgruppe sind niedere Alkylreste oder Halogenatome. Bevorzugt ist das 4-Aminoantipyrin.

Der Farbstoff, der entsteht, wenn das Gemisch aus aminoaromatischer Säure der allgemeinen Formel I und Aminoantipyrin der allgemeinen Formel II mit Wasserstoffperoxid in Berührung gebracht wird, ist kein Chinonimin der Art, die bei den von Trinder, Emerson und Meiattini beschriebenen Verfahren entsteht. Der bei diesen bekannten Verfahren gebildete Farbstoff erfordert die Anwesenheit einer nicht-substituierten 4-Aminogruppe in dem Aminoantipyrin. Dabei entsteht gemäß folgender Gleichung eine kovalent gebundene Verbindung.

Emerson beschreibt in der US-PS 21 94 201 ebenso wie in seiner früheren Veröffentlichung (Eisenstaedt) "The Condensation of Aminoantipyrine With Aromatic Amines in the Presence of Oxidizing Agents", J. Org. Chem., 3, (1938), S. 153-165, auch die Umsetzung von Aminobenzolen, wie Anilin und Dimethylanilin, mit 4-Aminoantipyrin. Auch dabei entsteht jedoch ein kovalent gebundener Farbstoff, wobei die 4-Aminogruppe des 4-Amino antipyrins unsubstituiert sein muß.

Im Gegensatz dazu entsteht der Farbstoff gemäß vorliegender Erfindung auch dann, wenn die 4-Aminogruppe des Aminoantipyrins substituiert ist. Beispielsweise bildet sich bei der Umsetzung von 3-Dimethylaminobenzoesäure in Gegenwart von Wasserstoffperoxid und Peroxidase mit entweder 4-Aminoantipyrin oder 4-Di methylaminoantipyrin ein blauer Farbstoff mit einem Absorptionsmaximum bei 550 nm. Wird Phenol oder das Natriumsalz von p-Hydroxybenzoesäure anstelle von 3-Dimethylaminobenzoesäure verwendet, dann entsteht mit 4-Aminoantipyrin ein roter Farbstoff mit einem Absorptionsmaximum bei 500 nm. Mit 4-Dimethyl aminoantipyrin findet dagegen praktisch keine Umsetzung statt. Nach Emerson (Eisenstaedt) ergibt die Umsetzung von N,N-Dime thylanilin mit 4-Aminoantipyrin einen Iminofarbstoff, während die Verwendung von 4-N,N-Dimethylaminoantipyrin anstelle von 4-Aminoantipyrin nur zur Bildung von blau gefärbtem oxidiertem 4-N,N-Dimethylaminoantipyrin führt.

Der erfindungsgemäß bei Verwendung von 3-Dimethylaminobenzoesäure erhaltene Farbstoff ist in Wasser stärker löslich als die kovalent gebundenen Iminfarbstoffe, die aus Phenol, dem Natriumsalz von p-Hydroxybenzoesäure oder Dimethylanilin entstehen. Andererseits ist er aber in organischen Lösungsmitteln, wie Chloroform oder Cyclohexan, weniger löslich als die Iminfarbstoffe.

Aufgrund dieser Befunde ist zu vermuten, daß der erfindungsgemäß erhaltene Farbstoff ein Charge-Transfer-Komplex aus einem freien Radikal der aminoaromatischen Säure und einem freien Radikal des 4-Aminoantipyrins ist, der sich durch die Formeln Ia und IIa wiedergeben läßt.

In den vorstehenden Formeln stellen X′ einen Alkylimino- oder einen Dialkyliminorest und Z den nach der Entfernung des Wasserstoffatoms aus einer Carboxyl- oder Sulfonsäuregruppe verbleibenden Rest dar. Y, R, R¹, R³ und R⁴ haben die vorstehend angegebene Bedeutung.

Der genaue Aufbau des Komplexes ist nicht im einzelnen nachgewiesen; es sind jedoch die nachstehenden Strukturen möglich, die am Beispiel des Komplexes aus 4-N,N-Dimethylaminoantipyrin und 3-Dimethylaminobenzoesäure unter den Formeln IIIa, IIIb und IIIc gezeigt werden:

Die vorstehenden Formelbilder lassen erkennen, daß voluminöse Substituenten an irgendeinem der Bestandteile die Bildung des Charge-Transfer-Komplexes beeinflussen oder sogar verhindern können. Aus diesem Grund sind solche Substituenten demnach nicht erwünscht. Die Formelbilder zeigen ferner, daß der erfindungsgemäß gebildete Farbstoff nicht einer der bekannten Iminfarbstoffe ist.

Möglicherweise entsteht ein Charge-Transfer-Komplex dieser Art auch als Zwischenstufe in der Umsetzung von N,N-Dimethylanilin mit 4-Aminoantipyrin, wie sie von Emerson (Eisenstaedt) beschrieben wird. Er könnte für die von Eisenstaedt berichtete blaue Färbung bei der Verwendung von 4-N,N-Dimethylaminoantipyrin verantwortlich sein. N,N-Dimethylanilin ist jedoch zur Verwendung in einem analytischen Reagenz nicht geeignet. Erstens ist seine Umsetzungsgeschwindigkeit geringer als die der erfindungsgemäß verwendeten Aminobezoesäuren. Ferner ist Dimethylanilin eine ölige Flüssigkeit, die mit Wasser oder wäßrigen Medien nicht besonders mischbar ist. Infolgedessen ist die Farbstoffbildung nicht linear, was die Verwendung von Dimethylanilin in analytischen Reagenzien aus praktischen Gründen ausschließt.

Die durch die Umsetzung der aminoaromatischen Säuren der allgemeinen Formel I mit den Aminoantipyrinen der allgemeinen Formel II entstehenden Farbstoffe weisen im allgemeinen Ab sorptionsmaxima im Bereich von etwa 450 bis 650 nm auf. Sie zeichnen sich ferner durch hohen Extinktionskoeffizienten aus. Beispielsweise hat der aus 3-N,N-Dimethylaminobenzoesäure und 4-Aminoantipyrin erhaltene Farbstoff ein Absorptionsmaxima bei 550 nm und einen Extinktionskoeffizienten von 1,72×10⁴ l Mol^-1 cm^-1. Dies ist eine sehr starke Absorption, die die Verwendung dieser Farbstoffe bei der Analyse zur Bestimmung sogar sehr geringer Konzentrationen von Wasserstoffperoxid ermöglicht. Diese Farbstoffe können demnach zur Analyse von Bestandteilen von Körperflüssigkeiten benutzt werden, die in geringer Konzentration vorliegen, da sie entweder normalerweise nur in geringer Menge vorhanden sind, wie z. B. Harnsäure in Blut, oder da die Körperflüssigkeit vor der Analyse verdünnt wurde.

Die erfindungsgemäß erhaltenen Farbstoffe sind weniger stabil als die Iminfarbstoffe, die in den von Trinder, Emerson und Meiattini beschriebenen Verfahren erhalten werden. Diese bekannten Farbstoffe sind sehr stabile, kovalent gebundene Ver bindungen, die sogar als Färbestoffe verwendet werden können. Im Gegensatz dazu sind die erfindungsgemäß erhaltenen Farbstoffe zwar ausreichend stabil, um in einem analytischen Verfahren benutzt zu werden, sie zersetzen sich jedoch innerhalb ver hältnismäßig kurzer Zeit.

Infolge der verhältnismäßig geringen Beständigkeit des Farbstoffes verändert sich seine Konzentration im Reaktionsgemisch im Laufe der Zeit. Anfänglich steigt die Konzentration auf ein Maximum an, um danach wieder abzufallen. Die Bildungs- und Zersetzungsgeschwindigkeit des Farbstoffs hängen ebenso wie die Zeit, in der seine größte Konzentration erreicht wird, von den Umsetzungsbedingungen ab, insbesondere von den Anteilen der Säure der allgemeinen Formel I und des Antipyrins der allgemeinen Formel II, den absoluten Konzentrationen dieser Umsetzungsteilnehmer und der Umsetzungstemperatur. Deshalb muß jede dieser Variablen eingestellt werden, um die für die analytische Bestimmung innerhalb der gewünschten Zeitdauer erwünschte Farbstoffkonzentration zu erreichen. Ferner kann die Zeit, zu der sich die Farbstoffkonzentration in der Nähe oder am Maximum befindet, verändert werden, um eine günstige Zeitspanne zu erhalten, in der der Farbstoff bestimmt und die gewünschte Analyse durchgeführt wird.

Der mengenmäßige Anteil an aminoaromatischer Säure der allgemeinen Formel I und 4-Aminoantipyrin der allgemeinen Formel II in der Umsetzung zur Herstellung des Farbstoffes ist nicht besonders kritisch, solange der erwünschte Farbstoff gebildet wird. Geeignete Mengenverhältnisse liegen im allgemeinen im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 25 Mol der aminoaromatischen Säure pro Mol Aminoantipyrin. Das günstigste Mengenverhältnis hängt in starkem Maße von der gewünschten Farbstoffbildungsgeschwindigkeit ab. Mit zunehmendem Verhältnis von Säure zu Antipyrin steigt die Farbstoffbildungsgeschwindigkeit an. Infolge der vermutlich radikalischen Natur der stattfindenden Umsetzung wird jedoch durch einen erhöhten Anteil der Säure der allgemeinen Formel I auch die Lebensdauer des erhaltenen Farbstoffes vermindert. Das Verhältnis der beiden Komponenten muß deshalb derart eingestellt werden, daß eine möglichst günstige Umsetzungsgeschwindigkeit erreicht wird und die Bestimmng in einer vernünftigen Zeit durchgeführt werden kann und/oder eine möglichst große Farbstoffkonzentration mit günstiger Lebensdauer erhalten wird. Das beste Verhältnis hängt davon ab, ob die Aminogruppe des 4-Aminoantipyrins substituiert ist. Ein Mengenverhältnis von Säure zu Antipyrin von etwa 10 : 1, d. h. von etwa 8 : 1 bis etwa 12 : 1, ist bei einer primären 4-Aminogruppe bevorzugt. Bei einer tertiären 4-Aminogruppe liegt das günstigste Verhältnis von Säure zu Antipyrin unter 1 : 1 und beträgt vorzugsweise etwa 0,25 : 1, d. h. etwa 0,2 : 1 bis etwa 0,3 : 1.

Die Konzentrationen der beiden Chromogene werden derart gewählt, daß sie zur Bildung einer meßbaren Menge des Farbstoffes ausreichen. Im allgemeinen kann die Konzentration des Aminoantipyrins im Bereich von etwa 0,01 bis etwa 1000 mMol/Liter, insbesondere im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 5 mMol/Liter liegen. Eine Konzentration des Aminoantipyrins im Bereich von etwa 0,35 bis etwa 0,5 mMol/Liter ist bevorzugt. Die Konzentration der Aminosäure wird so bestimmt, daß ein Farbstoff in der gewünschten Zeit erhalten wird. Sie kann von geringen Werten, wie 0,1 mMol/Liter bis zur Lös lichkeitsgrenze oder etwa 50 mMol/Liter reichen.

Die Umsetzung der beiden Chromogene mit Wasserstoffperoxid wird durch das Enzym Peroxidase katalysiert. Bekanntermaßen kann dieses Enzym aus einer Vielzahl von Quellen, wie Meerrettich, Leber, Petersilie und bestimmten Bakterien gewonnen werden. Obwohl die aus verschiedenen Quellen erhaltene Peroxidase Unterschiede aufweist, ist die Herkunft der Peroxidase erfindungsgemäß nicht kritisch. Peroxidase aus Meerrettich ist jedoch die geläufigste Form von Peroxidase und aus diesem Grund bevorzugt. Die Menge an eingesetzter Peroxidase ist kein Merkmal der Erfindung; es können die in den bekannten Verfahren verwendeten Mengen eingesetzt werden. Im allgemeinen werden jedoch mindestens 50 Peroxidaseeinheiten pro Liter der Lösung, vorzugsweise mindestens 500 Einheiten pro Liter, verwendet. Grundsätzlich besteht keine Obergrenze für die Menge. Peroxidasemengen über etwa 2500 Einheiten pro Liter sind jedoch unnötig. Bevorzugt sind Mengen im Bereich von etwa 1200 bis 1600 Einheiten/Liter.

Umsetzungstemperatur und pH-Wert des Umsetzungsgemisches beeinflussen beide die Farbstoffbildungsgeschwindigkeit und die Stabilität des Farbstoffes. Im allgemeinen steigt die Umset zungsgeschwindigkeit mit der Temperatur an und die Stabilität des Farbstoffes nimmt gleichzeitig ab. Geeignet ist im allgemeinen eine Temperatur in der Nähe der Raumtemperatur, d. h. von etwa 20 bis 45°C, vorzugsweise von etwa 25 bis 30°C. Ferner ist die Aktivität der Peroxidase bekanntermaßen bei einem pH-Wert von etwa 6,8, d. h. von etwa 6,5 bis 7,0, am größten.

Beim Einsatz der Erfindung als Teil einer enzymatischen Analyse eines Bestandteiles einer Körperflüssigkeit müssen Temperatur und pH-Wert jedoch derart eingestellt werden, daß der gesamte Reaktionsverlauf möglichst günstig gestaltet wird. Bei der Analyse von Cholesterin sind beispielsweise eine Temperatur von etwa 30°C und ein pH-Wert von etwa 7,5 bevorzugt. Bei der Analyse von Glucose sind eine Temperatur von etwa 25°C und ein pH-Wert von etwa 7,0 bevorzugt. Bei der Analyse von Harnsäure sind eine Temperatur von etwa 25°C und ein pH-Wert von etwa 8,0 bevorzugt.

Infolge der Bedeutung des pH-Wertes für enzymatische Reaktionen wird günstigerweise ein Puffer verwendet, der in der Lage ist, den gewünschten pH-Wert für die zur Durchführung der Analyse erforderliche Zeit aufrechtzuerhalten. Geeignete Puffer sind Phosphat-, Pyrophosphat-, Borat- oder andere bekannte Puffer, wie Tris-(hydroxymethyl-)aminomethan ("tris"), N,N,N-tris-(2- Hydroxyäthyl)-methyl-2-aminomethansulfonsäure ("TES"), N-(2-Hydroxyäthyl)-piperazin-N′-2-äthan-sulfonsäure ("HEPES"), N,N-Bis-(2-hydroxyäthyl)-glycin ("Bicine"), N,N,N-tris-(2- Hydroxyäthyl)-methylglycin ("Tricine"), Piperazin-N,N-bis-(2- äthansulfonsäure) ("PIPES") und N,N-Bis-(2-hydroxyäthyl)-2- aminoäthansulfonsäure ("BES").

Bei der Verwendung des erfindungsgemäßen Farbstoffs zur Analyse eines bestimmten Bestandteiles einer Körperflüssigkeit wird ferner ein Enzym eingesetzt, das in der Lage ist, die Bildung von Wasserstoffperoxid durch Oxidation des fraglichen Bestandteiles zu katalysieren. Solche Enzyme sind im allgemeinen unter der Bezeichnung "Oxidasen" bekannt. Spezielle Beispiele sind Glucoseoxidase, Cholesterinoxidase und Harnsäureoxidase. Die erforderliche Menge solcher Oxidasen ist bekannt und stellt deshalb kein Merkmal der Erfindung dar.

Der erfindungsgemäße Farbstoff kann in Form eines Analysenkastens oder -satzes hergerichtet werden, der die erforderlichen Bestandteile in vorbestimmten Mengenverhältnissen enthält. Die Bestandteile können getrennt verpackt sein. Es können auch zwei oder mehr von ihnen als Gemisch vorliegen. Das erfindungsgemäße Reagenz weist den Vorteil auf, daß sowohl die aminoaromatische Säure der allgemeinen Formel I als auch das Aminoantipyrin der allgemeinen Formel II stabile Feststoffe sind. In derartigen Kästen werden die Enzyme vorzugsweise als trockene Feststoffe verpackt.

Wenn der Analysenkasten oder -satz zur Analyse von Wasserstoffperoxid vorgesehen ist, muß er Peroxidase, Aminoantipyrin und aminoaromatische Säure enthalten. In einem solchen Analysensatz sind das Aminoantipyrin und die aminoaromatische Säure günstigerweise getrennt verpackt. Die Peroxidase kann getrennt abgepackt oder mit einer der beiden vorstehenden Komponenten vermischt sein. In ähnlicher Weise sind bei der Bestimmung des Analysensatzes zur Analyse von Blutbestandteilen zusätzliche Enzyme, günstigerweise in trockener Form, als zusätzliche Komponenten enthalten, die entweder getrennt oder im Gemisch mit einer oder mehreren der anderen Komponenten verpackt sein können. Vorzugsweise enthält der Analysensatz auch einen Puffer, der getrennt oder im Gemisch mit dem Antipyrin, der aminoaromatischen Säure und/oder der Peroxidase abgepackt sein kann. In einer weiteren Ausführungsform können auch alle festen Komponenten als einzelnes Gemisch abgepackt sein. Ferner können eine oder mehrere Komponenten auch in Form von wäßrigen Lösungen, entweder als Konzentrat oder etwa in der Arbeits konzentration, abgepackt sein, auch wenn dies weniger günstig ist.

Bei der Verwendung zur Analyse werden die Komponenten des Analysensatzes miteinander vermischt, in Wasser gelöst oder mit Wasser nach Bedarf verdünnt und nach üblichen Verfahren zur Durchführung der Analyse angewendet. Das heißt, daß die verschiedenen Bestandteile mit der zu analysierenden Lösung vermischt werden und das erhaltene Gemisch auf einer vorher festgelegten Temperatur gehalten wird, um die Entstehung des Farbstoffes zu ermöglichen. Danach wird die Konzentration des Farbstoffes beispielsweise durch übliche photometrische Analyse bestimmt. Solche Analysen können manuell oder automatisch unter Verwendung bekannter Ausrüstungen und Verfahren durchgeführt werden. Eine weitere Erörterung der Verfahrenstechnik kann hier demnach unterbleiben.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Harnsäureanalyse (manuell)

Es wird eine wäßrige Lösung mit einem Gehalt von 200 Einheiten/Liter Urikase, 1400 Einheiten/Liter Peroxidase, 0,35 mMol/Liter 4-Aminoantipyrin, 100 mMol/Liter tris-Puffer und 5,0 mMol/Liter 3-N,N-Dimethylaminobenzoesäure hergestellt, die einen pH-Wert von 8 aufweist. Bei einer Temperatur von 25°C werden sodann 2,0 ml dieses Reagenz mit 50 λ einer Harnsäure enthaltenden Probe versetzt. Die Absorption bei 550 nm wird unmittelbar nach der Zugabe der Probe zu dem Reagenz und dann erneut nach 6 Minuten gemessen. Die Harnsäurekonzentration wird nach folgender Gleichung berechnet.

In vorstehender Gleichung bedeuten:
C _ua: Konzentration der Harnsäure in mg/dl.
Δ A: Änderung der Absorption, oder Unterschied zwischen der Absorption nach 6 Minuten und der anfänglichen Absorption.
MW _ua: Molekulargewicht der Harnsäure (168,11 Daltons).
TV: Gesamtes Reaktionsvolumen, ml.
LP: Weg des Lichtes, cm.
ε: Molarer Extinktionskoeffizient des erhaltenen Farbstoffes (1,72×10⁴ l Mol^-1 cm^-1).
SV: Probenvolumen, ml.
In dem verwendeten System vereinfacht sich die Gleichung zu C _ua = 40,0 Δ A.

Das Verfahren wird mit 9 verschiedenen Harnsäure-Standardlösungen wiederholt. Jede dieser Standardlösungen wird ferner mit Hilfe eines bekannten technischen Reagenzes zur Harnsäureanalyse (Statzyme Uric Acid) zum Vergleich der Messung der Absorption bei 293 nm analysiert. Die Ergebnisse der verschiedenen Analysen sind nachstehend aufgeführt.

Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß die mit dem erfindungsgemäßen Reagenz erhaltenen Analysenwerte mit denen unter Verwendung des bekannten Reagenzes erhaltenen vergleichbar sind.

Die in diesem Beispiel angegebenen Konzentrationen sind die günstigsten für die in dem besonderen Fall verwendeten Stof fe. Gute Ergebnisse können jedoch auch mit den folgenden Kon zentrationen erhalten werden:

Urikase:
10 Einheiten/Liter
Peroxidase:	50 Einheiten/Liter
4-Aminoantipyrin:	0,01 bis 1000 Millimol/Liter
Tris-Puffer:	10 bis 1000 Millimol/Liter
3-N,N-Dimethylaminobenzoesäure:	0,1 bis 50 Millimol/Liter
pH-Wert	6,2-9,5.

Die Analyse kann bei einer Temperatur von 20 bis 45°C mit einer Umsetzungsdauer von etwa 1 bis 30 Minuten, vorzugsweise etwa 5 bis 10 Minuten und Messung der Absorption in einem Bereich von 450 bis 650 nm durchgeführt werden. Unter diesen Bedingungen beträgt die Empfindlichkeit der Analyse 0,01 bis 0,04 Absorptionseinheiten pro mg %; in dem angegebenen Beispiel beträgt sie 0,025 Absorptionseinheiten pro mg %.

Beispiel 2 Glucoseanalyse (manuell)

Es wird eine wäßrige Lösung mit einem Gehalt von 14 042 Einheiten/Liter Glucoseoxidase, 766 Einheiten pro Liter Peroxidase, 0,35 mMol/Liter 4-Aminoantipyrin, 109 mMol/Liter Phosphatpuffer und 1,0 mMol/Liter 3-N,N-Dimethylaminobenzoesäure hergestellt, die einen pH-Wert von 7 aufweist. Sodann werden 3,5 ml dieses Reagenzes mit 10 λ einer Glucose enthaltenden Probe bei einer Temperatur von 25°C versetzt. Die Absorption bei 550 nm wird unmittelbar nach der Zugabe der Probe zu dem Reagenz und danach erneut nach 6 Minuten gemessen. Die Glucosekonzentration wird nach folgender Gleichung berechnet:

In vorstehender Gleichung bedeuten:
C _g: Konzentration der Glucose in mg/dl.
Δ A: Änderung der Absorption, oder Unterschied zwischen der Absorption nach 6 Minuten und der anfänglichen Absorption.
MW _g: Molekulargewicht der Glucose (180,16 Daltons).
TV: Gesamtes Reaktionsvolumen, ml.
LP: Lichtweg, cm.
ε: molarer Extinktionskoeffizient des erhaltenen Farbstoffes (1,72×10⁴ l Mol^-1 cm^-1).
SV: Probenvolumen, ml.
In dem verwendeten System vereinfacht sich die Gleichung zu C _g = 367,6 Δ A. Die Empfindlichkeit der Analyse beträgt 0,213 Absorptionseinheiten/mg %.

Das Verfahren wird mit neun verschiedenen Glucose-Standard-Lösungen wiederholt. Jede Standardlösung wird ferner unter Verwendung eines bekannten technischen Reagenzes mit einem Gehalt an Natriumsalz von p-Hydroxybenzoesäure und 4-Aminoantipyrin (Statzyme Glucose 500) zu Vergleichszwecken durch Messung der Absorption bei 500 nm ein zweites Mal analysiert. Die Ergebnisse der verschiedenen Analysen sind nachstehend aufgeführt.

Die vorstehenden Werte zeigen, daß die bei Verwendung des erfindungsgemäßen Reagenzes erhaltenen Werte mit denen vergleichbar sind, die mit dem bekannten Reagenz erhalten werden.

Die in diesem Beispiel verwendeten Konzentrationen sind die günstigsten für die bestimmten Stoffe. Gute Ergebnisse können jedoch auch mit folgenden Konzentrationen erhalten werden:

Glukoseoxidase:
100 Einheiten/Liter
Peroxidase:	50 Einheiten/Liter
4-Aminoantipyrin:	0,01 bis 1000 Millimol/Liter
Phosphat-Puffer:	10 bis 1000 Millimol/Liter
3-N,N-Dimethylaminobenzoesäure:	0,1 bis 50 Millimol/Liter
pH-Wert	4,0-9,5.

Die Analysen können bei einer Temperatur von 20 bis 45°C in einer Zeit von etwa 1 bis 30 Minuten, vorzugsweise von etwa 5 bis 10 Minuten durch Messung der Absorption bei 450 bis 650 nm durchgeführt werden.

Beispiel 3 Cholesterinanalyse (manuell)

Es wird eine wäßrige Lösung mit einem Gehalt von 600 Einheiten/Liter Cholesterinesterase, 110 Einheiten/Liter Cholesterinoxidase, 1400 Einheiten/Liter Peroxidase, 0,5 mMol/Liter 4-Aminoantipyrin, 100 mMol/Liter Tris-Puffer, 5,0 mMol/Liter 3-N,N-Dimethylaminobenzoesäure und 0,2% Triton X-100 hergestellt, die einen pH-Wert von 7,5 aufweist. Sodann werden 3,0 ml dieses Reagenzes mit 10 λ einer Cholesterin enthaltenden Probe bei 30°C versetzt. Die Absorption bei 550 nm wird unmittelbar nach Zugabe der Probe zu dem Reagenz und sodann erneut nach 15 Minuten gemessen. Die Cholesterinkonzentration wird nach folgender Gleichung berechnet:

In vorstehender Gleichung bedeuten:
C _c: Konzentration des Cholesterins in mg/dl.
Δ A: Änderung der Absorption, oder Unterschied zwischen der Absorption nach 15 Minuten und der anfänglichen Absorption.
MW _c: Molekulargewicht von Cholesterin (386,6 Daltons).
TV: Gesamtes Reaktionsvolumen, ml.
LP: Lichtweg, cm.
ε: molarer Extinktionskoeffizient des erhaltenen Farbstoffes (1,72×10⁴ l Mol^-1 cm^-1).
SV: Probenvolumen, ml.
In dem verwendeten System vereinfacht sich die Gleichung zu C _c = 674,3 Δ A.

Das Verfahren wird mit 7 verschiedenen Cholesterin-Standardlösungen wiederholt. Für jede Standardlösung wird außerdem unter Verwendung eines technischen Reagenzes, das Phenol und 4-Aminoantipyrin enthält (Statzyme Cholesterol), zu Vergleichs zwecken durch Messung der Absorption bei 500 nm eine zweite Bestimmung durchgeführt. Die Ergebnisse der verschiedenen Analysen sind nachstehend aufgeführt.

Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß die mit den erfindungsgemäßen Reagenz erhaltenen Analysenwerte im allgemeinen mit denen vergleichbar sind, die mit dem bekannten Reagenz erhalten werden. Es besteht keine so gute Übereinstimmung wie in den vorhergehenden Bestimmungen. Es kann jedoch angenommen werden, daß eine weitere Verbesserung der Bedingungen zu besseren Ergebnissen führen würde. Insbesondere wird vermutlich eine günstigere Cholesterinesterasekonzentration zu Ergebnissen führen, die mit dem bekannten Reagenz erhaltenen viel besser übereinstimmen würden. Es muß jedoch bemerkt werden, daß im Fall der ersten drei Proben mit dem erfindungsgemäßen Reagenz im allgemeinen Ergebnisse erhalten würden, die näher an der bekannten Cholesterinkonzentration liegen als die mit dem bekannten Reagenz erhaltenen Werte.

Die in diesem Beispiel eingesetzten Konzentrationen sind die günstigsten für die bestimmten verwendeten chemischen Stoffe. Es können jedoch mit folgenden Konzentrationen gute Ergebnisse erhalten werden:

Cholesterinesterase:
20 Einheiten/Liter
Cholesterinoxidase:	1 Einheit/Liter
Peroxidase:	50 Einheiten/Liter
4-Aminoantipyrin:	0,01 bis 1000 Millimol/Liter
Tris-Puffer:	10 bis 1000 Millimol/Liter
3-N,N-Dimethylaminobenzoesäure:	0,1 bis 50 Millimol/Liter
Triton X-100:	0,001-10%
pH-Wert	3-9.

Die Analysen können bei einer Temperatur von 20 bis 45°C mit einer Umsetzungsdauer von etwa 1 bis 45 Minuten, vorzugsweise von etwa 10 bis 20 Minuten durch Messung der Adsorption im Bereich von 450 bis 650 nm durchgeführt werden. Unter diesen Bedingungen beträgt die Empfindlichkeit der Analyse 0,1 bis 0,4 Absorptionseinheiten pro mg %. In dem speziellen Beispiel beträgt sie 0,150 Absorptionseinheiten pro mg %.

Beispiel 4 Harnsäureanalyse (automatisiert)

Es werden drei wäßrige Lösungen hergestellt:

(1) Eine Enzym-Reagenzlösung mit einem Gehalt von 200 Einheiten pro Liter Urikase, 1400 Einheiten/Liter Peroxidase, 0,35 mMol/Liter 4-Aminoantipyrin und 100 mMol/Liter Tris-Puffer;
(2) eine Farbstoffträger-Puffer-Lösung mit einem Gehalt von 5,0 mMol/Liter 3-N,N-Dimethylaminobenzoesäure und 100 mMol/Liter Tris-Puffer; und
(3) eine Proben-Puffer-Lösung mit einem Gehalt von 100 mMol/Liter Tris-Puffer. Der pH-Wert jeder Lösung beträgt 8,0.

Die vorstehenden Lösungen werden zur Bestimmung der Harnsäure konzentrationen in den in Beispiel 1 verwendeten neun Proben benutzt, wobei jedoch ein automatisiertes Verfahren unter Verwendung eines Technicon Type II Auto-Analysengerätes angewendet wurde, das mit einer 12 inch Dialyseeinrichtung ausgerüstet ist, die eine Membrane vom Typ C enthält. Die Probengeschwindigkeit beträgt 60 Proben/Stunde und das Proben-/Waschverhältnis 9 : 1 (Waschdauer: 6 Sekunden). Ein Strom des Proben-Puffers, der 1 ml/Liter eines Netzmittels (Brÿ 35) enthält, wird nach dem Vermischen mit der zu analysierenden Probe, die mit einer Geschwindigkeit von 0,32 cm³/Minute zugeführt wird, und mit Luft in einer Menge von 0,32 cm³/Minute mit einer Geschwindigkeit von 1 cm³/Minute gegen eine Oberfläche der Membran des Analysegerätes geführt. Ein Gemisch aus der Enzym-Reagenzlösung mit einem Gehalt von 1 ml/Liter Brÿ 35 (0,23 cm³/Minute) und der Chromophor-Pufferlösung (1,00 cm³/Minute) wird nach dem Vermischen mit Luft, die in einer Menge von 0,32 cm³/Minute zugeführt wird, auf die andere Seite der Membran des Dialysegerätes geführt.

Die Absorption der Proben wird in einer 1,5 cm Fließzelle unter Verwendung eines 550-nm-Filters nach 5,5 Minuten Inkubation bestimmt, wobei der Durchzug 1,0 cm³/Minute beträgt.

Die Empfindlichkeit des Verfahrens liegt bei etwa 0,017 Ab sorptionseinheiten/mg % Harnsäure. Die Ergebnisse werden automatisch mit Hilfe eines Schreibgerätes und eines Konzentrationsrechners aufgenommen, wobei eine Standardlösung mit bekannter Harnsäurekonzentration zur Kalibrierung verwendet wird.

Nachstehend sind die Ergebnisse zusammen mit den in Beispiel 1 nach dem manuellen Verfahren erhaltenen angegeben.

Im allgemeinen stimmen die mit dem erfindungsgemäßen Reagenz nach dem automatisierten Verfahren erhaltenen Ergebnisse mit denen, die im manuellen Betrieb erhalten werden, in vernünftigen Grenzen überein.

Gute Ergebnisse können nach dem automatisierten Verfahren auch mit Reagenzien folgender Zusammensetzung erhalten werden:

Enzym-Reagenz
Urikase
10 Einheiten/Liter
Peroxidase	50 Einheiten/Liter
4-Aminoantipyrin	0,01 bis 1000 Millimol/Liter
Tris-Puffer	10 bis 1000 Millimol/Liter

Farbstoffträger-Puffer
3-N,N-Dimethylaminobenzoesäure
0,1 bis 50 Millimol/Liter
Tris-Puffer	10 bis 1000 Millimol/Liter

Probe-Puffer

Tris-Puffer

10 bis 1000 Millimol/Liter

Das Verfahren kann bei einer Temperatur von 20 bis 45°C, einem pH-Wert von 6,2 bis 9,5 und einer Umsetzungsdauer von 1 bis 30 Minuten durch Messung der Absorption bei 450 bis 650 nm mit einer Empfindlichkeit von 0,01 bis 0,4 Absorptions einheiten/mg % durchgeführt werden.

Aus den vorstehenden Beispielen ist ersichtlich, daß eine geringe Menge eines Netzmittels verwendet werden kann. Ein Netzmittel ist besonders bei der Durchführung der automatisierten Analyse gemäß Beispiel 4 günstig.

Claims

1. Farbstoff, erhältlich durch Umsetzung von

(1) Peroxidase,
(2) einer aminoaromatischen Säure der allgemeinen Formel I in der X einen Mono- oder Dialkylaminorest und ZH eine Carboxyl- oder Sulfonsäuregruppe bedeuten, und
(3) einem 4-Aminoantipyrin der allgemeinen Formel (II) in der R und R¹ unabhängig voneinander Alkylreste, R² einen aromatischen Rest, R³ und R⁴ unabhängig voneinander Wasserstoffatome oder Alkylreste und Y ein Sauerstoff- oder Schwefelatom darstellen,
mit der Maßgabe, daß X, R, R¹, R³ und R⁴ keine tertiären Alkyl- oder Cycloalkylreste bedeuten,

mit Wasserstoffperoxid in einem wäßrigen Medium.

2. Farbstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Y in der allgemeinen Formel II ein Sauerstoffatom und Z in der allgemeinen Formel I den Rest einer Carboxylgruppe darstellen.

3. Farbstoff nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß X in der allgemeinen Formel I einen Dialkylaminorest und R und R¹ in der allgemeinen Formel II Methylgruppen darstellen.

4. Farbstoff nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß X in der allgemeinen Formel I eine Dimethylaminogruppe und R³ und R⁴ in der allgemeinen Formel II Wasserstoffatome darstellen.

5. Farbstoff nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß X in der allgemeinen Formel I eine Dimethylaminogruppe und R³ und R⁴ in der allgemeinen Formel II Methylgruppen darstellen.

6. Verfahren zur Herstellung eines Farbstoffes nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in einem Wasserstoffperoxid enthaltenden wäßrigen Medium (1) Peroxidase mit (2) einer aminoaromatischen Säure der allgemeinen Formel I und (3) mit einem 4-Aminoantipyrin der allgemeinen Formel II in Berührung bringt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man es bei einer Temperatur von etwa 20 bis 45°C und einem pH-Wert von etwa 3 bis 9,5 durchführt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als aminoaromatische Säure eine Aminobenzoesäure verwendet und ein Aminoantipyrin der allgemeinen Formel II einsetzt, in der R² eine Phenylgruppe und Y ein Sauerstoffatom bedeuten.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Aminoantipyrin der allgemeinen Formel II einsetzt, in der R und R¹ Methylgruppen bedeuten.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man als Aminobenzoesäure 3-N,N-Dimethylaminobenzoesäure verwendet.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Aminoantipyrin der allgemeinen Formel II einsetzt, in der R³ und R⁴ Wasserstoffatome bedeuten.

12. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Aminoantipyrin der allgemeinen Formel II einsetzt, in der R³ und R⁴ Methylgruppen bedeuten.

13. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die aminoaromatische Säure und das Aminoantipyrin in einem Molverhältnis von etwa 0,1 : 1 bis etwa 25 : 1 verwendet.

14. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man die aminoaromatische Säure und das Aminoantipyrin in einem Molverhältnis von etwa 8 : 1 bis etwa 12 : 1 verwendet.

15. Verwendung eines Farbstoffs nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zum Nachweis der Anwesenheit von Wasserstoffperoxid in einem wäßrigen Medium, durch photometrische Bestimmung der auftretenden Farbänderung.

16. Verwendung eines Farbstoffs nach einem der Ansprüche 1 bis 5 in einem Reagenz zur analytischen Bestimmung von Wasserstoffperoxid in einem wäßrigen Medium.

17. Verwendung nach Anspruch 16, wobei das wäßrige Medium eine Körperflüssigkeit ist.

18. Verwendung eines Farbstoffs nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur enzymatischen Bestimmung der Menge eines Bestandteiles in einer Körperflüssigkeit, wobei die Körperflüssigkeit mit

(a) einem Enzym, das zur Oxidation des Bestandteiles unter Bildung von Wasserstoffperoxid befähigt ist,
(b) Peroxidase und
(c) einem farbgebenden Stoff, der durch mit Peroxidase katalysierte Umsetzung mit Wasserstoffperoxid zu einem Farbstoffträger oxidiert werden kann, und Messen der auftretenden Farbänderung, wobei als farbgebender Stoff ein Gemisch aus einer aminoaromatischen Säure der allgemein nen Formel I und einem 4-Aminoantipyrin der allgemeinen Formel II verwendet wird.