DE3003490C2 - - Google Patents
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Description
Es sind bereits verschiedene Verfahren zur analytischen Bestimmung
von Wasserstoffperoxid bekannt. Bei einer Gruppe dieser
Verfahren wird das Enzym Peroxidase verwendet, das die
Umsetzung eines Substrates mit Wasserstoffperoxid katalysiert,
wobei das Substrat oxidiert wird und Wasser entsteht. Enzymatische
Bestimmungen dieser Art haben sich als besonders
nützlich bei der Analyse verschiedener Stoffe, wie Cholesterin,
Glukose und Harnsäure, in Körperflüssigkeiten, beispielsweise
im Blut, erwiesen. Bei solchen Verfahren wird die Körperflüssigkeit
mit einem Enzym vermischt, das befähigt ist, die Oxidation
des zu bestimmenden Bestandteiles unter gleichzeitiger
Entstehung des Wasserstoffperoxid zu katalysieren. Die Flüssigkeit
wird ferner mit Peroxidase und einem Substrat für
Peroxidase versetzt, das bei der Oxidation eine Farbänderung
erleidet. Das Ausmaß der Farbänderung ist ein Maß für die
Menge des entstandenen Wasserstoffperoxids, die ihrerseits
wieder ein Maß für die Menge des zu bestimmenden Bestandteils
darstellt.
Beispielsweise beschreiben Hall u. Mitarb. in "Automated
Determination of Glucose Using Glucose Oxidase and Potassium
Ferrocyanide", Analyt. Biochem., 26 (1968), S. 12-17, ein Verfahren
zur quantitativen Bestimmung von Glucose durch Oxidation
mit Glucoseoxidase unter Entstehung von Glukonsäure und
Wasserstoffperoxid und Reduktion des Wasserstoffperoxids mit
Kaliumeisen(III)-cyanid in Gegenwart von Peroxidase unter Bildung
von Eisen(III)-cyanid. Trinder beschreibt in "Determination
of Glucose in Blood Using Glucose Oxidase With an Alternative
Oxygen Acceptor", Ann. Clin. Biochem., 6, (1969), S. 24-27,
die Verwendung von Phenol und 4-Aminophenazon (4-Aminoantipyrin)
als farbbildendes System anstelle von Kaliumeisen(III)-cyanid.
Man nimmt an, daß hierbei das Phenol oxidiert wird und
sich dann mit dem 4-Aminophenazon zu einem Chinoniminfarbstoff
umsetzt. Eines solche Umsetzung wurde bereits früher von
Emerson in "The Condensation of Aminoantipyrine II. A New
Color Test for Phenolic Compounds", J. Org. Chem., 8, (1943),
S. 417-428 und in der US-PS 21 94 201 beschrieben. Die von
Emerson beschriebenen Umsetzungsteilnehmer wurden noch in
jüngster Zeit auf die Trinder-Umsetzung angewendet; vgl.
Meiattini in US-PS 38 66 045.
Diese Art von Verfahren kann auch zur Bestimmung anderer Bestandteile
des Blutes oder von anderen Körperflüssigkeiten
verwendet werden, wenn die Glucoseoxidase durch ein Enzym ersetzt
wird, das die Oxidation dieses anderen Bestandteils
unter gleichzeitiger Entstehung von Wasserstoffoxid katalysieren
kann, beispielsweise Cholesterinoxidase oder Harnsäureoxidase
(Urikase). Beispielsweise wird die Übertragung dieses
Verfahrens auf die Bestimmung von Harnsäure im Serum von
Trivedi und Mitarbeiter in "New Enzymatic Method for Serum Uric
Acid at 500 nm", Clin. Chem., 24, (1978) S. 1908-1911,
beschrieben. Die von Trider beschriebene Art von Farbstoffträgern
ist jedoch nicht so empfindlich, wie es für die Bestimmung
von Stoffwechselprodukten erwünscht ist, die wie
Harnsäure üblicherweise im Blut nur in sehr geringen Konzentrationen
vorhanden sind, beispielsweise in der Größenordnung
von 4 bis 9 mg/100 ml Blut im Vergleich zu Konzentrationen von
80 bis 100 mg/100 ml Glucose und 150 bis 250 mg/100 ml für
Cholesterin.
Eine andere Art von Chromogen-Chromophor-System, das als Wasserstoff
peroxid-Detektor in analytischen Verfahren dieser Art
verwendet wurde, ist das Gemisch aus 3-Methyl-2-benzothia
zolinon-hydrazon-N,N-dimethylanilin, bei dem die beiden Umset
zungsteilnehmer oxidativ zu einem kovalent gebundenen Indamin
farbstoff koppeln. Die Anwendung dieses Verfahrens auf die
analytischen Bestimmung von Harnsäure und Glukose wurde von
Gochman und Mitarbeiter in "Automated Determination of Uric Acid,
With Use of a Uricase-Peroxidase System", Clin. Chem., 17,
(1971), S. 1154 bis 1159 und in "Application of a New
Peroxide Indicator Reaction to the Specific, Automated
Determination of Glucose with Glucose Oxidase", Clin. Chem.,
18, (1972), S. 943-950, beschrieben.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen Farbstoff zur analytischen
Bestimmung von Wasserstoffperoxid zur Verfügung
zu stellen, das die erforderliche Empfindlichkeit zur Bestimmung
von Stoffen aufweist, die, wie Harnsäure, normalerweise
in geringer Konzentration vorliegen. Diese Aufgabe wird durch
ein neues Chromogen-Chromophor-System zur
enzymatischen Bestimmung von Wasserstoffperoxid gelöst, wobei
als Chromogen ein Gemisch aus einer 3-aminoaromatischen Säure
und einem 4-Aminoantipyrin verwendet wird und wobei ein neuer
Farbstoffträger (Chromophor) entsteht, der einen außergewöhnlich
hohen Extinktionskoeffizienten aufweist.
Die Erfindung betrifft somit den in den Patentansprüchen ge
kennzeichneten Gegenstand.
Die erfindungsgemäß verwendete aminoaromatische Säure ist
entweder eine 3-Aminobezoesäure oder eine 3-Aminobenzolsulfonsäure.
Diese Säuren besitzen die allgemeine Formel I
in der X einen Mono- oder Dialkylaminorest bedeutet und ZH
die Carboxyl-(-CO₂H)- oder Sulfonsäure(-SO₃H)-Gruppe darstellt.
Die Art der Alkylreste in der Aminogruppe ist nicht
besonders kritisch, mit der Maßgabe, daß die Entstehung des
gewünschten Farbstoffes möglich ist. Aus Gründen, die nachstehend
erörtert werden, sollen deshalb voluminöse Gruppen,
wie tertiäre Alkyl- oder Cycloalkylreste, nicht verwendet
werden. Bevorzugt sind primäre Alkylreste. Die Länge des Alkylrestes
ist nicht besonders kritisch, solange die aminoaromatische
Säure und der erhaltene Farbstoff in wäßrigem Medium
löslich sind. Bevorzugt sind jedoch niedere Alkylreste, d. h.
Alkylreste mit 1 bis etwa 6 Kohlenstoffatomen, beispielsweise
die Methyl-, Äthyl-, Propyl-, Butyl-, Pentyl- und Hexylgruppe.
Bevorzugt sind ferner Dialkylaminoreste, insbesondere die
Dimethylaminogruppe. Die aminoaromatischen Säuren können am
Benzolkern substituiert sein, wenn der Substituent die Farbstoffbildung
nicht beeinträchtigt. Beispielsweise kann der
Benzolkern mindestens ein Halogenatom, wie Chlor- oder Bromatome,
aufweisen. Nicht labile Substituenten, wie Alkylreste,
sollen sich jedoch nicht in p-Stellung zur Aminogruppe befinden.
Der zweite Bestandteil des erfindungsgemäßen Farbstoffs ist
ein 4-Aminoantipyrin der allgemeinen Formel II
in der R und R¹ unabhängig voneinander Alkylreste, R² einen
aromatischen Rest, R³ und R⁴ unabhängig voneinander Wasserstoffatome
oder Alkylreste und Y ein Sauerstoff- oder Schwefelatom
bedeuten. Ebenso wie bei der aminoaromatischen Säure
sollen die Alkylreste des Aminoantipyrins, d. h. die Reste R,
R¹, R³ und R⁴, keine voluminösen Gruppen, wie tertiäre Alkylreste,
darstellen, und ihre Kettenlänge ist durch die Löslichkeit
des Aminoantipyrins und des entstehenden Farbstoffes
begrenzt. Bevorzugt sind niedere Alkylreste, insbesondere die
Methylgruppe. Günstigerweise ist die 4-Aminogruppe eine primäre
Aminogruppe, d. h. die Reste R³ und R⁴ stellen Wasserstoffatome
dar, da bei Verwendung solcher Verbindungen eine schnellere
Umsetzung und kräftigere Färbung stattfindet. Der aroma
tische Rest R² ist vorzugsweise eine gegebenenfalls substituierte
Phenylgruppe. Günstige Substituenten der Phenylgruppe
sind niedere Alkylreste oder Halogenatome. Bevorzugt ist das
4-Aminoantipyrin.
Der Farbstoff, der entsteht, wenn das Gemisch aus aminoaromatischer
Säure der allgemeinen Formel I und Aminoantipyrin der
allgemeinen Formel II mit Wasserstoffperoxid in Berührung
gebracht wird, ist kein Chinonimin der Art, die bei den von
Trinder, Emerson und Meiattini beschriebenen Verfahren entsteht.
Der bei diesen bekannten Verfahren gebildete Farbstoff
erfordert die Anwesenheit einer nicht-substituierten 4-Aminogruppe
in dem Aminoantipyrin. Dabei entsteht gemäß folgender
Gleichung eine kovalent gebundene Verbindung.
Emerson beschreibt in der US-PS 21 94 201 ebenso wie in seiner
früheren Veröffentlichung (Eisenstaedt) "The Condensation of
Aminoantipyrine With Aromatic Amines in the Presence of Oxidizing
Agents", J. Org. Chem., 3, (1938), S. 153-165, auch die
Umsetzung von Aminobenzolen, wie Anilin und Dimethylanilin,
mit 4-Aminoantipyrin. Auch dabei entsteht jedoch ein kovalent
gebundener Farbstoff, wobei die 4-Aminogruppe des 4-Amino
antipyrins unsubstituiert sein muß.
Im Gegensatz dazu entsteht der Farbstoff gemäß vorliegender Erfindung
auch dann, wenn die 4-Aminogruppe des Aminoantipyrins
substituiert ist. Beispielsweise bildet sich bei der Umsetzung
von 3-Dimethylaminobenzoesäure in Gegenwart von Wasserstoffperoxid
und Peroxidase mit entweder 4-Aminoantipyrin oder 4-Di
methylaminoantipyrin ein blauer Farbstoff mit einem Absorptionsmaximum
bei 550 nm. Wird Phenol oder das Natriumsalz von
p-Hydroxybenzoesäure anstelle von 3-Dimethylaminobenzoesäure
verwendet, dann entsteht mit 4-Aminoantipyrin ein roter Farbstoff
mit einem Absorptionsmaximum bei 500 nm. Mit 4-Dimethyl
aminoantipyrin findet dagegen praktisch keine Umsetzung statt.
Nach Emerson (Eisenstaedt) ergibt die Umsetzung von N,N-Dime
thylanilin mit 4-Aminoantipyrin einen Iminofarbstoff, während
die Verwendung von 4-N,N-Dimethylaminoantipyrin anstelle von
4-Aminoantipyrin nur zur Bildung von blau gefärbtem oxidiertem
4-N,N-Dimethylaminoantipyrin führt.
Der erfindungsgemäß bei Verwendung von 3-Dimethylaminobenzoesäure
erhaltene Farbstoff ist in Wasser stärker löslich als
die kovalent gebundenen Iminfarbstoffe, die aus Phenol, dem
Natriumsalz von p-Hydroxybenzoesäure oder Dimethylanilin entstehen.
Andererseits ist er aber in organischen Lösungsmitteln,
wie Chloroform oder Cyclohexan, weniger löslich als die Iminfarbstoffe.
Aufgrund dieser Befunde ist zu vermuten, daß der erfindungsgemäß
erhaltene Farbstoff ein Charge-Transfer-Komplex aus einem
freien Radikal der aminoaromatischen Säure und einem freien
Radikal des 4-Aminoantipyrins ist, der sich durch die Formeln
Ia und IIa wiedergeben läßt.
In den vorstehenden Formeln stellen X′ einen Alkylimino-
oder einen Dialkyliminorest und Z den nach der Entfernung
des Wasserstoffatoms aus einer Carboxyl- oder Sulfonsäuregruppe
verbleibenden Rest dar. Y, R, R¹, R³ und R⁴ haben die vorstehend
angegebene Bedeutung.
Der genaue Aufbau des Komplexes ist nicht im einzelnen nachgewiesen;
es sind jedoch die nachstehenden Strukturen möglich,
die am Beispiel des Komplexes aus 4-N,N-Dimethylaminoantipyrin
und 3-Dimethylaminobenzoesäure unter den Formeln IIIa,
IIIb und IIIc gezeigt werden:
Die vorstehenden Formelbilder lassen erkennen, daß voluminöse
Substituenten an irgendeinem der Bestandteile die Bildung des
Charge-Transfer-Komplexes beeinflussen oder sogar verhindern
können. Aus diesem Grund sind solche Substituenten demnach
nicht erwünscht. Die Formelbilder zeigen ferner, daß der erfindungsgemäß
gebildete Farbstoff nicht einer der bekannten
Iminfarbstoffe ist.
Möglicherweise entsteht ein Charge-Transfer-Komplex dieser
Art auch als Zwischenstufe in der Umsetzung von N,N-Dimethylanilin
mit 4-Aminoantipyrin, wie sie von Emerson (Eisenstaedt)
beschrieben wird. Er könnte für die von Eisenstaedt berichtete
blaue Färbung bei der Verwendung von 4-N,N-Dimethylaminoantipyrin
verantwortlich sein. N,N-Dimethylanilin ist jedoch
zur Verwendung in einem analytischen Reagenz nicht geeignet.
Erstens ist seine Umsetzungsgeschwindigkeit geringer als die
der erfindungsgemäß verwendeten Aminobezoesäuren. Ferner ist
Dimethylanilin eine ölige Flüssigkeit, die mit Wasser oder
wäßrigen Medien nicht besonders mischbar ist. Infolgedessen
ist die Farbstoffbildung nicht linear, was die Verwendung von
Dimethylanilin in analytischen Reagenzien aus praktischen Gründen
ausschließt.
Die durch die Umsetzung der aminoaromatischen Säuren der allgemeinen
Formel I mit den Aminoantipyrinen der allgemeinen
Formel II entstehenden Farbstoffe weisen im allgemeinen Ab
sorptionsmaxima im Bereich von etwa 450 bis 650 nm auf. Sie
zeichnen sich ferner durch hohen Extinktionskoeffizienten aus.
Beispielsweise hat der aus 3-N,N-Dimethylaminobenzoesäure und
4-Aminoantipyrin erhaltene Farbstoff ein Absorptionsmaxima
bei 550 nm und einen Extinktionskoeffizienten von
1,72×10⁴ l Mol-1 cm-1. Dies ist eine sehr starke Absorption,
die die Verwendung dieser Farbstoffe bei der Analyse zur Bestimmung
sogar sehr geringer Konzentrationen von Wasserstoffperoxid
ermöglicht. Diese Farbstoffe können demnach zur Analyse
von Bestandteilen von Körperflüssigkeiten benutzt werden,
die in geringer Konzentration vorliegen, da sie entweder
normalerweise nur in geringer Menge vorhanden sind, wie z. B.
Harnsäure in Blut, oder da die Körperflüssigkeit vor der Analyse
verdünnt wurde.
Die erfindungsgemäß erhaltenen Farbstoffe sind weniger stabil
als die Iminfarbstoffe, die in den von Trinder, Emerson und
Meiattini beschriebenen Verfahren erhalten werden. Diese bekannten
Farbstoffe sind sehr stabile, kovalent gebundene Ver
bindungen, die sogar als Färbestoffe verwendet werden können.
Im Gegensatz dazu sind die erfindungsgemäß erhaltenen Farbstoffe
zwar ausreichend stabil, um in einem analytischen Verfahren
benutzt zu werden, sie zersetzen sich jedoch innerhalb ver
hältnismäßig kurzer Zeit.
Infolge der verhältnismäßig geringen Beständigkeit des Farbstoffes
verändert sich seine Konzentration im Reaktionsgemisch
im Laufe der Zeit. Anfänglich steigt die Konzentration auf
ein Maximum an, um danach wieder abzufallen. Die Bildungs-
und Zersetzungsgeschwindigkeit des Farbstoffs hängen ebenso
wie die Zeit, in der seine größte Konzentration erreicht wird,
von den Umsetzungsbedingungen ab, insbesondere von den Anteilen
der Säure der allgemeinen Formel I und des Antipyrins
der allgemeinen Formel II, den absoluten Konzentrationen dieser
Umsetzungsteilnehmer und der Umsetzungstemperatur. Deshalb
muß jede dieser Variablen eingestellt werden, um die für die
analytische Bestimmung innerhalb der gewünschten Zeitdauer erwünschte
Farbstoffkonzentration zu erreichen. Ferner kann die
Zeit, zu der sich die Farbstoffkonzentration in der Nähe oder
am Maximum befindet, verändert werden, um eine günstige Zeitspanne
zu erhalten, in der der Farbstoff bestimmt und die gewünschte
Analyse durchgeführt wird.
Der mengenmäßige Anteil an aminoaromatischer Säure der allgemeinen
Formel I und 4-Aminoantipyrin der allgemeinen Formel II
in der Umsetzung zur Herstellung des Farbstoffes ist nicht besonders
kritisch, solange der erwünschte Farbstoff gebildet
wird. Geeignete Mengenverhältnisse liegen im allgemeinen im
Bereich von etwa 0,1 bis etwa 25 Mol der aminoaromatischen Säure
pro Mol Aminoantipyrin. Das günstigste Mengenverhältnis
hängt in starkem Maße von der gewünschten Farbstoffbildungsgeschwindigkeit
ab. Mit zunehmendem Verhältnis von Säure zu
Antipyrin steigt die Farbstoffbildungsgeschwindigkeit an. Infolge
der vermutlich radikalischen Natur der stattfindenden
Umsetzung wird jedoch durch einen erhöhten Anteil der Säure
der allgemeinen Formel I auch die Lebensdauer des erhaltenen
Farbstoffes vermindert. Das Verhältnis der beiden Komponenten
muß deshalb derart eingestellt werden, daß eine möglichst
günstige Umsetzungsgeschwindigkeit erreicht wird und die Bestimmng
in einer vernünftigen Zeit durchgeführt werden kann
und/oder eine möglichst große Farbstoffkonzentration mit günstiger
Lebensdauer erhalten wird. Das beste Verhältnis hängt
davon ab, ob die Aminogruppe des 4-Aminoantipyrins substituiert
ist. Ein Mengenverhältnis von Säure zu Antipyrin von etwa
10 : 1, d. h. von etwa 8 : 1 bis etwa 12 : 1, ist bei einer
primären 4-Aminogruppe bevorzugt. Bei einer tertiären 4-Aminogruppe
liegt das günstigste Verhältnis von Säure zu Antipyrin
unter 1 : 1 und beträgt vorzugsweise etwa 0,25 : 1, d. h. etwa
0,2 : 1 bis etwa 0,3 : 1.
Die Konzentrationen der beiden Chromogene werden derart gewählt,
daß sie zur Bildung einer meßbaren Menge des Farbstoffes
ausreichen. Im allgemeinen kann die Konzentration des
Aminoantipyrins im Bereich von etwa 0,01 bis etwa 1000 mMol/Liter,
insbesondere im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 5 mMol/Liter
liegen. Eine Konzentration des Aminoantipyrins im Bereich
von etwa 0,35 bis etwa 0,5 mMol/Liter ist bevorzugt.
Die Konzentration der Aminosäure wird so bestimmt,
daß ein Farbstoff in der gewünschten Zeit erhalten wird.
Sie kann von geringen Werten, wie 0,1 mMol/Liter bis zur Lös
lichkeitsgrenze oder etwa 50 mMol/Liter reichen.
Die Umsetzung der beiden Chromogene mit Wasserstoffperoxid
wird durch das Enzym Peroxidase katalysiert. Bekanntermaßen
kann dieses Enzym aus einer Vielzahl von Quellen, wie Meerrettich,
Leber, Petersilie und bestimmten Bakterien
gewonnen werden. Obwohl die aus verschiedenen Quellen erhaltene
Peroxidase Unterschiede aufweist, ist die Herkunft der
Peroxidase erfindungsgemäß nicht kritisch. Peroxidase aus Meerrettich
ist jedoch die geläufigste Form von Peroxidase und
aus diesem Grund bevorzugt. Die Menge an eingesetzter Peroxidase
ist kein Merkmal der Erfindung; es können die in den bekannten
Verfahren verwendeten Mengen eingesetzt werden. Im
allgemeinen werden jedoch mindestens 50 Peroxidaseeinheiten
pro Liter der Lösung, vorzugsweise mindestens 500 Einheiten
pro Liter, verwendet. Grundsätzlich besteht keine Obergrenze
für die Menge. Peroxidasemengen über etwa 2500 Einheiten pro
Liter sind jedoch unnötig. Bevorzugt sind Mengen im Bereich
von etwa 1200 bis 1600 Einheiten/Liter.
Umsetzungstemperatur und pH-Wert des Umsetzungsgemisches beeinflussen
beide die Farbstoffbildungsgeschwindigkeit und die
Stabilität des Farbstoffes. Im allgemeinen steigt die Umset
zungsgeschwindigkeit mit der Temperatur an und die Stabilität
des Farbstoffes nimmt gleichzeitig ab. Geeignet ist im allgemeinen
eine Temperatur in der Nähe der Raumtemperatur, d. h.
von etwa 20 bis 45°C, vorzugsweise von etwa 25 bis 30°C. Ferner
ist die Aktivität der Peroxidase bekanntermaßen bei einem pH-Wert
von etwa 6,8, d. h. von etwa 6,5 bis 7,0, am größten.
Beim Einsatz der Erfindung als Teil einer enzymatischen Analyse
eines Bestandteiles einer Körperflüssigkeit müssen Temperatur
und pH-Wert jedoch derart eingestellt werden, daß der gesamte
Reaktionsverlauf möglichst günstig gestaltet wird. Bei
der Analyse von Cholesterin sind beispielsweise eine Temperatur
von etwa 30°C und ein pH-Wert von etwa 7,5 bevorzugt. Bei
der Analyse von Glucose sind eine Temperatur von etwa 25°C
und ein pH-Wert von etwa 7,0 bevorzugt. Bei der Analyse von
Harnsäure sind eine Temperatur von etwa 25°C und ein pH-Wert
von etwa 8,0 bevorzugt.
Infolge der Bedeutung des pH-Wertes für enzymatische Reaktionen
wird günstigerweise ein Puffer verwendet, der in der Lage ist,
den gewünschten pH-Wert für die zur Durchführung der Analyse
erforderliche Zeit aufrechtzuerhalten. Geeignete Puffer sind
Phosphat-, Pyrophosphat-, Borat- oder andere bekannte Puffer,
wie Tris-(hydroxymethyl-)aminomethan ("tris"), N,N,N-tris-(2-
Hydroxyäthyl)-methyl-2-aminomethansulfonsäure ("TES"),
N-(2-Hydroxyäthyl)-piperazin-N′-2-äthan-sulfonsäure ("HEPES"),
N,N-Bis-(2-hydroxyäthyl)-glycin ("Bicine"), N,N,N-tris-(2-
Hydroxyäthyl)-methylglycin ("Tricine"), Piperazin-N,N-bis-(2-
äthansulfonsäure) ("PIPES") und N,N-Bis-(2-hydroxyäthyl)-2-
aminoäthansulfonsäure ("BES").
Bei der Verwendung des erfindungsgemäßen Farbstoffs zur Analyse
eines bestimmten Bestandteiles einer Körperflüssigkeit wird
ferner ein Enzym eingesetzt, das in der Lage ist, die Bildung
von Wasserstoffperoxid durch Oxidation des fraglichen Bestandteiles
zu katalysieren. Solche Enzyme sind im allgemeinen unter
der Bezeichnung "Oxidasen" bekannt. Spezielle Beispiele sind
Glucoseoxidase, Cholesterinoxidase und Harnsäureoxidase. Die
erforderliche Menge solcher Oxidasen ist bekannt und stellt
deshalb kein Merkmal der Erfindung dar.
Der erfindungsgemäße Farbstoff kann in Form eines Analysenkastens
oder -satzes hergerichtet werden, der die erforderlichen Bestandteile
in vorbestimmten Mengenverhältnissen enthält.
Die Bestandteile können getrennt verpackt sein. Es können auch
zwei oder mehr von ihnen als Gemisch vorliegen. Das erfindungsgemäße
Reagenz weist den Vorteil auf, daß sowohl die aminoaromatische
Säure der allgemeinen Formel I als auch das Aminoantipyrin
der allgemeinen Formel II stabile Feststoffe sind.
In derartigen Kästen werden die Enzyme vorzugsweise als
trockene Feststoffe verpackt.
Wenn der Analysenkasten oder -satz zur Analyse von Wasserstoffperoxid
vorgesehen ist, muß er Peroxidase, Aminoantipyrin
und aminoaromatische Säure enthalten. In einem solchen Analysensatz
sind das Aminoantipyrin und die aminoaromatische Säure
günstigerweise getrennt verpackt. Die Peroxidase kann getrennt
abgepackt oder mit einer der beiden vorstehenden Komponenten
vermischt sein. In ähnlicher Weise sind bei der Bestimmung des
Analysensatzes zur Analyse von Blutbestandteilen zusätzliche
Enzyme, günstigerweise in trockener Form, als zusätzliche
Komponenten enthalten, die entweder getrennt oder im Gemisch
mit einer oder mehreren der anderen Komponenten verpackt sein
können. Vorzugsweise enthält der Analysensatz auch einen Puffer,
der getrennt oder im Gemisch mit dem Antipyrin, der
aminoaromatischen Säure und/oder der Peroxidase abgepackt
sein kann. In einer weiteren Ausführungsform können auch alle
festen Komponenten als einzelnes Gemisch abgepackt sein. Ferner
können eine oder mehrere Komponenten auch in Form von wäßrigen
Lösungen, entweder als Konzentrat oder etwa in der Arbeits
konzentration, abgepackt sein, auch wenn dies weniger günstig
ist.
Bei der Verwendung zur Analyse werden die Komponenten des
Analysensatzes miteinander vermischt, in Wasser gelöst oder
mit Wasser nach Bedarf verdünnt und nach üblichen Verfahren
zur Durchführung der Analyse angewendet. Das heißt, daß die
verschiedenen Bestandteile mit der zu analysierenden Lösung
vermischt werden und das erhaltene Gemisch auf einer vorher
festgelegten Temperatur gehalten wird, um die Entstehung des
Farbstoffes zu ermöglichen. Danach wird die Konzentration des
Farbstoffes beispielsweise durch übliche photometrische Analyse
bestimmt. Solche Analysen können manuell oder automatisch
unter Verwendung bekannter Ausrüstungen und Verfahren durchgeführt
werden. Eine weitere Erörterung der Verfahrenstechnik
kann hier demnach unterbleiben.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Es wird eine wäßrige Lösung mit einem Gehalt von 200 Einheiten/Liter
Urikase, 1400 Einheiten/Liter Peroxidase, 0,35 mMol/Liter
4-Aminoantipyrin, 100 mMol/Liter tris-Puffer und 5,0 mMol/Liter
3-N,N-Dimethylaminobenzoesäure hergestellt, die einen pH-Wert
von 8 aufweist. Bei einer Temperatur von 25°C werden sodann
2,0 ml dieses Reagenz mit 50 λ einer Harnsäure enthaltenden Probe
versetzt. Die Absorption bei 550 nm wird unmittelbar nach
der Zugabe der Probe zu dem Reagenz und dann erneut nach 6 Minuten
gemessen. Die Harnsäurekonzentration wird nach folgender
Gleichung berechnet.
In vorstehender Gleichung bedeuten:
C ua: Konzentration der Harnsäure in mg/dl.
Δ A: Änderung der Absorption, oder Unterschied zwischen der Absorption nach 6 Minuten und der anfänglichen Absorption.
MW ua: Molekulargewicht der Harnsäure (168,11 Daltons).
TV: Gesamtes Reaktionsvolumen, ml.
LP: Weg des Lichtes, cm.
ε: Molarer Extinktionskoeffizient des erhaltenen Farbstoffes (1,72×10⁴ l Mol-1 cm-1).
SV: Probenvolumen, ml.
In dem verwendeten System vereinfacht sich die Gleichung zu C ua = 40,0 Δ A.
C ua: Konzentration der Harnsäure in mg/dl.
Δ A: Änderung der Absorption, oder Unterschied zwischen der Absorption nach 6 Minuten und der anfänglichen Absorption.
MW ua: Molekulargewicht der Harnsäure (168,11 Daltons).
TV: Gesamtes Reaktionsvolumen, ml.
LP: Weg des Lichtes, cm.
ε: Molarer Extinktionskoeffizient des erhaltenen Farbstoffes (1,72×10⁴ l Mol-1 cm-1).
SV: Probenvolumen, ml.
In dem verwendeten System vereinfacht sich die Gleichung zu C ua = 40,0 Δ A.
Das Verfahren wird mit 9 verschiedenen Harnsäure-Standardlösungen
wiederholt. Jede dieser Standardlösungen wird ferner
mit Hilfe eines bekannten technischen Reagenzes zur Harnsäureanalyse
(Statzyme Uric Acid) zum Vergleich der Messung der Absorption
bei 293 nm analysiert. Die Ergebnisse der verschiedenen
Analysen sind nachstehend aufgeführt.
Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß die mit dem erfindungsgemäßen
Reagenz erhaltenen Analysenwerte mit denen unter
Verwendung des bekannten Reagenzes erhaltenen vergleichbar
sind.
Die in diesem Beispiel angegebenen Konzentrationen sind die
günstigsten für die in dem besonderen Fall verwendeten Stof
fe. Gute Ergebnisse können jedoch auch mit den folgenden Kon
zentrationen erhalten werden:
Urikase: | |
10 Einheiten/Liter | |
Peroxidase: | 50 Einheiten/Liter |
4-Aminoantipyrin: | 0,01 bis 1000 Millimol/Liter |
Tris-Puffer: | 10 bis 1000 Millimol/Liter |
3-N,N-Dimethylaminobenzoesäure: | 0,1 bis 50 Millimol/Liter |
pH-Wert | 6,2-9,5. |
Die Analyse kann bei einer Temperatur von 20 bis 45°C mit
einer Umsetzungsdauer von etwa 1 bis 30 Minuten, vorzugsweise
etwa 5 bis 10 Minuten und Messung der Absorption in einem
Bereich von 450 bis 650 nm durchgeführt werden. Unter diesen
Bedingungen beträgt die Empfindlichkeit der Analyse 0,01 bis
0,04 Absorptionseinheiten pro mg %; in dem angegebenen Beispiel
beträgt sie 0,025 Absorptionseinheiten pro mg %.
Es wird eine wäßrige Lösung mit einem Gehalt von 14 042 Einheiten/Liter
Glucoseoxidase, 766 Einheiten pro Liter Peroxidase,
0,35 mMol/Liter 4-Aminoantipyrin, 109 mMol/Liter
Phosphatpuffer und 1,0 mMol/Liter 3-N,N-Dimethylaminobenzoesäure
hergestellt, die einen pH-Wert von 7 aufweist. Sodann
werden 3,5 ml dieses Reagenzes mit 10 λ einer Glucose enthaltenden
Probe bei einer Temperatur von 25°C versetzt. Die Absorption
bei 550 nm wird unmittelbar nach der Zugabe der Probe
zu dem Reagenz und danach erneut nach 6 Minuten gemessen.
Die Glucosekonzentration wird nach folgender Gleichung berechnet:
In vorstehender Gleichung bedeuten:
C g: Konzentration der Glucose in mg/dl.
Δ A: Änderung der Absorption, oder Unterschied zwischen der Absorption nach 6 Minuten und der anfänglichen Absorption.
MW g: Molekulargewicht der Glucose (180,16 Daltons).
TV: Gesamtes Reaktionsvolumen, ml.
LP: Lichtweg, cm.
ε: molarer Extinktionskoeffizient des erhaltenen Farbstoffes (1,72×10⁴ l Mol-1 cm-1).
SV: Probenvolumen, ml.
In dem verwendeten System vereinfacht sich die Gleichung zu C g = 367,6 Δ A. Die Empfindlichkeit der Analyse beträgt 0,213 Absorptionseinheiten/mg %.
C g: Konzentration der Glucose in mg/dl.
Δ A: Änderung der Absorption, oder Unterschied zwischen der Absorption nach 6 Minuten und der anfänglichen Absorption.
MW g: Molekulargewicht der Glucose (180,16 Daltons).
TV: Gesamtes Reaktionsvolumen, ml.
LP: Lichtweg, cm.
ε: molarer Extinktionskoeffizient des erhaltenen Farbstoffes (1,72×10⁴ l Mol-1 cm-1).
SV: Probenvolumen, ml.
In dem verwendeten System vereinfacht sich die Gleichung zu C g = 367,6 Δ A. Die Empfindlichkeit der Analyse beträgt 0,213 Absorptionseinheiten/mg %.
Das Verfahren wird mit neun verschiedenen Glucose-Standard-Lösungen
wiederholt. Jede Standardlösung wird ferner unter
Verwendung eines bekannten technischen Reagenzes mit einem
Gehalt an Natriumsalz von p-Hydroxybenzoesäure und 4-Aminoantipyrin
(Statzyme Glucose 500) zu Vergleichszwecken durch
Messung der Absorption bei 500 nm ein zweites Mal analysiert.
Die Ergebnisse der verschiedenen Analysen sind nachstehend
aufgeführt.
Die vorstehenden Werte zeigen, daß die bei Verwendung des
erfindungsgemäßen Reagenzes erhaltenen Werte mit denen vergleichbar
sind, die mit dem bekannten Reagenz erhalten werden.
Die in diesem Beispiel verwendeten Konzentrationen sind die
günstigsten für die bestimmten Stoffe. Gute Ergebnisse können
jedoch auch mit folgenden Konzentrationen erhalten werden:
Glukoseoxidase: | |
100 Einheiten/Liter | |
Peroxidase: | 50 Einheiten/Liter |
4-Aminoantipyrin: | 0,01 bis 1000 Millimol/Liter |
Phosphat-Puffer: | 10 bis 1000 Millimol/Liter |
3-N,N-Dimethylaminobenzoesäure: | 0,1 bis 50 Millimol/Liter |
pH-Wert | 4,0-9,5. |
Die Analysen können bei einer Temperatur von 20 bis 45°C in
einer Zeit von etwa 1 bis 30 Minuten, vorzugsweise von etwa
5 bis 10 Minuten durch Messung der Absorption bei 450 bis
650 nm durchgeführt werden.
Es wird eine wäßrige Lösung mit einem Gehalt von 600 Einheiten/Liter
Cholesterinesterase, 110 Einheiten/Liter Cholesterinoxidase,
1400 Einheiten/Liter Peroxidase, 0,5 mMol/Liter
4-Aminoantipyrin, 100 mMol/Liter Tris-Puffer, 5,0 mMol/Liter
3-N,N-Dimethylaminobenzoesäure und 0,2% Triton X-100 hergestellt,
die einen pH-Wert von 7,5 aufweist. Sodann werden
3,0 ml dieses Reagenzes mit 10 λ einer Cholesterin enthaltenden
Probe bei 30°C versetzt. Die Absorption bei 550 nm wird
unmittelbar nach Zugabe der Probe zu dem Reagenz und sodann
erneut nach 15 Minuten gemessen. Die Cholesterinkonzentration
wird nach folgender Gleichung berechnet:
In vorstehender Gleichung bedeuten:
C c: Konzentration des Cholesterins in mg/dl.
Δ A: Änderung der Absorption, oder Unterschied zwischen der Absorption nach 15 Minuten und der anfänglichen Absorption.
MW c: Molekulargewicht von Cholesterin (386,6 Daltons).
TV: Gesamtes Reaktionsvolumen, ml.
LP: Lichtweg, cm.
ε: molarer Extinktionskoeffizient des erhaltenen Farbstoffes (1,72×10⁴ l Mol-1 cm-1).
SV: Probenvolumen, ml.
In dem verwendeten System vereinfacht sich die Gleichung zu C c = 674,3 Δ A.
C c: Konzentration des Cholesterins in mg/dl.
Δ A: Änderung der Absorption, oder Unterschied zwischen der Absorption nach 15 Minuten und der anfänglichen Absorption.
MW c: Molekulargewicht von Cholesterin (386,6 Daltons).
TV: Gesamtes Reaktionsvolumen, ml.
LP: Lichtweg, cm.
ε: molarer Extinktionskoeffizient des erhaltenen Farbstoffes (1,72×10⁴ l Mol-1 cm-1).
SV: Probenvolumen, ml.
In dem verwendeten System vereinfacht sich die Gleichung zu C c = 674,3 Δ A.
Das Verfahren wird mit 7 verschiedenen Cholesterin-Standardlösungen
wiederholt. Für jede Standardlösung wird außerdem
unter Verwendung eines technischen Reagenzes, das Phenol und
4-Aminoantipyrin enthält (Statzyme Cholesterol), zu Vergleichs
zwecken durch Messung der Absorption bei 500 nm eine zweite
Bestimmung durchgeführt. Die Ergebnisse der verschiedenen Analysen
sind nachstehend aufgeführt.
Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß die mit den erfindungsgemäßen
Reagenz erhaltenen Analysenwerte im allgemeinen
mit denen vergleichbar sind, die mit dem bekannten Reagenz erhalten
werden. Es besteht keine so gute Übereinstimmung wie
in den vorhergehenden Bestimmungen. Es kann jedoch angenommen
werden, daß eine weitere Verbesserung der Bedingungen zu besseren
Ergebnissen führen würde. Insbesondere wird vermutlich
eine günstigere Cholesterinesterasekonzentration zu Ergebnissen
führen, die mit dem bekannten Reagenz erhaltenen
viel besser übereinstimmen würden. Es muß jedoch bemerkt werden,
daß im Fall der ersten drei Proben mit dem erfindungsgemäßen
Reagenz im allgemeinen Ergebnisse erhalten würden, die
näher an der bekannten Cholesterinkonzentration liegen als
die mit dem bekannten Reagenz erhaltenen Werte.
Die in diesem Beispiel eingesetzten Konzentrationen sind die
günstigsten für die bestimmten verwendeten chemischen Stoffe.
Es können jedoch mit folgenden Konzentrationen gute Ergebnisse
erhalten werden:
Cholesterinesterase: | |
20 Einheiten/Liter | |
Cholesterinoxidase: | 1 Einheit/Liter |
Peroxidase: | 50 Einheiten/Liter |
4-Aminoantipyrin: | 0,01 bis 1000 Millimol/Liter |
Tris-Puffer: | 10 bis 1000 Millimol/Liter |
3-N,N-Dimethylaminobenzoesäure: | 0,1 bis 50 Millimol/Liter |
Triton X-100: | 0,001-10% |
pH-Wert | 3-9. |
Die Analysen können bei einer Temperatur von 20 bis 45°C mit
einer Umsetzungsdauer von etwa 1 bis 45 Minuten, vorzugsweise
von etwa 10 bis 20 Minuten durch Messung der Adsorption im
Bereich von 450 bis 650 nm durchgeführt werden. Unter diesen
Bedingungen beträgt die Empfindlichkeit der Analyse 0,1 bis
0,4 Absorptionseinheiten pro mg %. In dem speziellen Beispiel
beträgt sie 0,150 Absorptionseinheiten pro mg %.
Es werden drei wäßrige Lösungen hergestellt:
- (1) Eine Enzym-Reagenzlösung mit einem Gehalt von 200 Einheiten pro Liter Urikase, 1400 Einheiten/Liter Peroxidase, 0,35 mMol/Liter 4-Aminoantipyrin und 100 mMol/Liter Tris-Puffer;
- (2) eine Farbstoffträger-Puffer-Lösung mit einem Gehalt von 5,0 mMol/Liter 3-N,N-Dimethylaminobenzoesäure und 100 mMol/Liter Tris-Puffer; und
- (3) eine Proben-Puffer-Lösung mit einem Gehalt von 100 mMol/Liter Tris-Puffer. Der pH-Wert jeder Lösung beträgt 8,0.
Die vorstehenden Lösungen werden zur Bestimmung der Harnsäure
konzentrationen in den in Beispiel 1 verwendeten neun Proben
benutzt, wobei jedoch ein automatisiertes Verfahren unter Verwendung
eines Technicon Type II Auto-Analysengerätes angewendet
wurde, das mit einer 12 inch Dialyseeinrichtung ausgerüstet
ist, die eine Membrane vom Typ C enthält. Die Probengeschwindigkeit
beträgt 60 Proben/Stunde und das Proben-/Waschverhältnis 9 : 1
(Waschdauer: 6 Sekunden). Ein Strom des Proben-Puffers, der
1 ml/Liter eines Netzmittels (Brÿ 35) enthält, wird nach dem
Vermischen mit der zu analysierenden Probe, die mit einer Geschwindigkeit
von 0,32 cm³/Minute zugeführt wird, und mit Luft
in einer Menge von 0,32 cm³/Minute mit einer Geschwindigkeit
von 1 cm³/Minute gegen eine Oberfläche der Membran des Analysegerätes
geführt. Ein Gemisch aus der Enzym-Reagenzlösung mit
einem Gehalt von 1 ml/Liter Brÿ 35 (0,23 cm³/Minute) und der
Chromophor-Pufferlösung (1,00 cm³/Minute) wird nach dem Vermischen
mit Luft, die in einer Menge von 0,32 cm³/Minute zugeführt
wird, auf die andere Seite der Membran des Dialysegerätes
geführt.
Die Absorption der Proben wird in einer 1,5 cm Fließzelle
unter Verwendung eines 550-nm-Filters nach 5,5 Minuten Inkubation
bestimmt, wobei der Durchzug 1,0 cm³/Minute beträgt.
Die Empfindlichkeit des Verfahrens liegt bei etwa 0,017 Ab
sorptionseinheiten/mg % Harnsäure. Die Ergebnisse werden automatisch
mit Hilfe eines Schreibgerätes und eines Konzentrationsrechners
aufgenommen, wobei eine Standardlösung mit bekannter
Harnsäurekonzentration zur Kalibrierung verwendet
wird.
Nachstehend sind die Ergebnisse zusammen mit den in Beispiel 1
nach dem manuellen Verfahren erhaltenen angegeben.
Im allgemeinen stimmen die mit dem erfindungsgemäßen Reagenz
nach dem automatisierten Verfahren erhaltenen Ergebnisse mit
denen, die im manuellen Betrieb erhalten werden, in vernünftigen
Grenzen überein.
Gute Ergebnisse können nach dem automatisierten Verfahren
auch mit Reagenzien folgender Zusammensetzung erhalten werden:
Enzym-Reagenz | |
Urikase | |
10 Einheiten/Liter | |
Peroxidase | 50 Einheiten/Liter |
4-Aminoantipyrin | 0,01 bis 1000 Millimol/Liter |
Tris-Puffer | 10 bis 1000 Millimol/Liter |
Farbstoffträger-Puffer | |
3-N,N-Dimethylaminobenzoesäure | |
0,1 bis 50 Millimol/Liter | |
Tris-Puffer | 10 bis 1000 Millimol/Liter |
Probe-Puffer |
Tris-Puffer |
10 bis 1000 Millimol/Liter |
Das Verfahren kann bei einer Temperatur von 20 bis 45°C,
einem pH-Wert von 6,2 bis 9,5 und einer Umsetzungsdauer von
1 bis 30 Minuten durch Messung der Absorption bei 450 bis
650 nm mit einer Empfindlichkeit von 0,01 bis 0,4 Absorptions
einheiten/mg % durchgeführt werden.
Aus den vorstehenden Beispielen ist ersichtlich, daß eine geringe
Menge eines Netzmittels verwendet werden kann. Ein Netzmittel
ist besonders bei der Durchführung der automatisierten
Analyse gemäß Beispiel 4 günstig.
Claims (19)
1. Farbstoff, erhältlich durch Umsetzung von
- (1) Peroxidase,
- (2) einer aminoaromatischen Säure der allgemeinen Formel I in der X einen Mono- oder Dialkylaminorest und ZH eine Carboxyl- oder Sulfonsäuregruppe bedeuten, und
- (3) einem 4-Aminoantipyrin der allgemeinen Formel (II)
in der R und R¹ unabhängig voneinander Alkylreste, R²
einen aromatischen Rest, R³ und R⁴ unabhängig
voneinander Wasserstoffatome oder Alkylreste und Y ein
Sauerstoff- oder Schwefelatom darstellen,
mit der Maßgabe, daß X, R, R¹, R³ und R⁴ keine tertiären Alkyl- oder Cycloalkylreste bedeuten,
mit Wasserstoffperoxid in einem wäßrigen Medium.
2. Farbstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß Y in der allgemeinen Formel II ein Sauerstoffatom und Z
in der allgemeinen Formel I den Rest einer Carboxylgruppe
darstellen.
3. Farbstoff nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,
daß X in der allgemeinen Formel I einen Dialkylaminorest
und R und R¹ in der allgemeinen Formel II Methylgruppen
darstellen.
4. Farbstoff nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet,
daß X in der allgemeinen Formel I eine Dimethylaminogruppe
und R³ und R⁴ in der allgemeinen Formel II Wasserstoffatome
darstellen.
5. Farbstoff nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet,
daß X in der allgemeinen Formel I eine Dimethylaminogruppe
und R³ und R⁴ in der allgemeinen Formel II Methylgruppen
darstellen.
6. Verfahren zur Herstellung eines Farbstoffes nach
Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in einem
Wasserstoffperoxid enthaltenden wäßrigen Medium (1)
Peroxidase mit (2) einer aminoaromatischen Säure der
allgemeinen Formel I und (3) mit einem 4-Aminoantipyrin der
allgemeinen Formel II in Berührung bringt.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet,
daß man es bei einer Temperatur von etwa 20 bis 45°C und
einem pH-Wert von etwa 3 bis 9,5 durchführt.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet,
daß man als aminoaromatische Säure eine Aminobenzoesäure
verwendet und ein Aminoantipyrin der allgemeinen Formel II
einsetzt, in der R² eine Phenylgruppe und Y ein
Sauerstoffatom bedeuten.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet,
daß man ein Aminoantipyrin der allgemeinen Formel II
einsetzt, in der R und R¹ Methylgruppen bedeuten.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet,
daß man als Aminobenzoesäure 3-N,N-Dimethylaminobenzoesäure
verwendet.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet,
daß man ein Aminoantipyrin der allgemeinen Formel II
einsetzt, in der R³ und R⁴ Wasserstoffatome bedeuten.
12. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet,
daß man ein Aminoantipyrin der allgemeinen Formel II
einsetzt, in der R³ und R⁴ Methylgruppen bedeuten.
13. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet,
daß man die aminoaromatische Säure und das Aminoantipyrin in
einem Molverhältnis von etwa 0,1 : 1 bis etwa 25 : 1
verwendet.
14. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet,
daß man die aminoaromatische Säure und das Aminoantipyrin in
einem Molverhältnis von etwa 8 : 1 bis etwa 12 : 1 verwendet.
15. Verwendung eines Farbstoffs nach einem der Ansprüche
1 bis 5 zum Nachweis der Anwesenheit von Wasserstoffperoxid
in einem wäßrigen Medium, durch photometrische Bestimmung
der auftretenden Farbänderung.
16. Verwendung eines Farbstoffs nach einem der Ansprüche
1 bis 5 in einem Reagenz zur analytischen Bestimmung von
Wasserstoffperoxid in einem wäßrigen Medium.
17. Verwendung nach Anspruch 16, wobei das wäßrige Medium
eine Körperflüssigkeit ist.
18. Verwendung eines Farbstoffs nach einem der Ansprüche
1 bis 5 zur enzymatischen Bestimmung der Menge eines Bestandteiles
in einer Körperflüssigkeit, wobei die Körperflüssigkeit
mit
- (a) einem Enzym, das zur Oxidation des Bestandteiles unter Bildung von Wasserstoffperoxid befähigt ist,
- (b) Peroxidase und
- (c) einem farbgebenden Stoff, der durch mit Peroxidase katalysierte Umsetzung mit Wasserstoffperoxid zu einem Farbstoffträger oxidiert werden kann, und Messen der auftretenden Farbänderung, wobei als farbgebender Stoff ein Gemisch aus einer aminoaromatischen Säure der allgemein nen Formel I und einem 4-Aminoantipyrin der allgemeinen Formel II verwendet wird.
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