DE3003490A1

DE3003490A1 - Reagenz zur analytischen bestimmung von wasserstoffperoxid

Info

Publication number: DE3003490A1
Application number: DE19803003490
Authority: DE
Inventors: Spencer M Fields; Paul T Nix
Original assignee: Millipore Corp
Current assignee: EMD Millipore Corp
Priority date: 1979-01-31
Filing date: 1980-01-31
Publication date: 1980-08-14
Also published as: GB2043891A; GB2043891B; FR2476129B1; US4247631A; CA1125770A; FR2476129A1; DE3003490C2; JPS6258718B2; JPS55131400A

Description

Es sind bereits verschiedene Verfahren zur analytischen Bestimmung von Wasserstoffperoxid bekannt. Bei einer Gruppe dieser Verfahren wird das Enzym Peroxidase verwendet, das die Umsetzung eines Substrates mit Wasserstoffperoxid katalysiert, wobei das Substrat oxidiert wird und Wasser entsteht. Enzymatische Bestimmungen dieser Art haben sich als besonders

. nützlich bei der Analyse verschiedener Stoffe, wie Cholesterin, Glukose und Harnsäure, in Körperflüssigkeiten, beispielsweise im Blut, erwiesen. Bei solchen Verfahren wird die Körperflüssigkeit mit einem Enzym vermischt, das befähigt ist, die Oxidation des zu bestimmenden Bestandteiles unter gleichzeitiger Entstehung von Wasserstoffperoxid zu katalysieren. Die Flüssigkeit wird ferner mit Peroxidase und einem Substrat für Peroxidase versetzt, das bei der Oxidation eine Farbänderung erleidet. Das Ausmaß der Farbänderung ist ein Maß für die Menge des entstandenen Wasserstoffperoxids, die ihrerseits wieder ein Maß für die Menge des zu bestimmenden Bestandteils darstellt.

Beispielsweise beschreiben Hall u» Mitarb, in "Automated Determination of Glucose Using Glucose Oxidase and Potassium Ferrocyanide", Analyt. Biochem., 26 (1968), S. 12-17, ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Glucose durch Oxidation mit Glucoseoxidase unter Entstehung von Glukonsäure und Wasserstoffperoxid und Reduktion des Wasserstoffperoxids mit Kaliumeisen(II)-cyanid in Gegenwart von Peroxidase unter Bildung von Eisen (III)-cyanid. Trinder beschreibt in "Determination of Glucose in Blood Using Glucose Oxidase With an Alternative Oxygen Acceptor", Ann. Clin Biochem., 6, (1969), S. 24 - 27, die Verwendung von Phenol und 4-Aminophenazon (4-Aminoantipyrin) als farbbildendes System anstelle von Kaliumeisen(III)-cyanid. Man nimmt an, daß hierbei das Phenol oxidiert .wird und

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Γ ~l

sich dann mit dem 4-Aminophenazon zu einem Chinoniminfarbstoff umsetzt. Eine solche Umsetzung wurde bereits früher von Emerson in "The Condensation of Aminoantip'yrine II. A New Color Test for Phenolic Compounds", J. Org. Chem., 8, (1943),

S. 417.- 428 und in der US.-PS 2 194 201 beschrieben. Die von Emerson beschriebenen Umsetzungsteilnehmer wurden noch in jüngster Zeit auf die Trinder-Umsetzung angewendet; vgl. Meiattini in US-PS 3 866 045.

•jO Diese Art von Verfahren kann auch zur Bestimmung anderer Bestandteile des Blutes oder von anderen Körperflüssigkeiten verwendet werden, wenn die Glucoseoxidase durch ein Enzym ersetzt wird, das die Oxidation dieses anderen Bestandteils unter gleichzeitiger Entstehung von Wasserstoffoxid katalysieren kann, beispielsweise Cholesterinoxidase oder Harnsäureoxidase (Urikase). Beispielsweise wird die Übertragung dieses Verfahrens auf die Bestimmung von Harnsäure im Serum von Trivedi u. Mitarb, in "New Enzymatic Method for Serum Uric Acid at 500 nm", Clin. Chem., 24, (1978) S. 1908 - 1911, beschrieben. Die von Trinder beschriebene Art von Farbstoffträgern ist jedoch nicht so empfindlich, wie es für die Bestimmung von StoffWechselprodukten erwünscht ist, die wie Harnsäure üblicherweise im Blut nur in sehr geringen Konzentrationen . vorhanden sind, beispielsweise in der Größenordnung von 4 bis 9 mg/100 ml Blut im Vergleich zu Konzentrationen von 80 bis 100 mg/100 ml Glucose und 150 bis 250 mg/100 ml für Cholesterin.

Eine andere Art von Chromogen-Chromophor-Systern, das als Wasserstoffperoxid-Detektor in analytischen Verfahren dieser Art verwendet wurde, ist das Gemisch aus '3-Methyl-2-benzothiazolinon-hydrazon-NfN-dimethylanilin, bei dem die beiden Umsetzungsteilnehmer oxidativ zu einem kovalent gebundenen Indaminfarbstoff koppeln. Die Anwendung dieses Verfahrens auf die analytische Bestimmung von Harnsäure und Glukose wurde von Gochman und Mitarb, in "Automated Determination of Uric Acid, With Use of a Uricase-Peroxidase System", Clin. Chem., 17,

L . J

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_V^Vt?i-> JA* BAD ORIGINAL

Γ . "I

(1971), S. 1154 bis 1159 und in "Application of a New ■ Peroxide Indicator Reaction to the Specific, Automated Determination of Glucose with Glucose Oxidase", elin- ehem., •18, (1972), S. 943-950, beschrieben.
■

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Reagenz zur ana lytischen Bestimmung von Wasserstoffperoxid zur Verfügung zu stellen, das die erforderliche Empfindlichkeit zur Bestimmung von Stoffen aufweist, die, wie Harnsäure, normalerweise in geringer Konzentration vorliegen. Diese Aufgabe wird durch die Verwendung eines neuen Chromogen-Chromophor-Systems zur enzymatischen Bestimmung von Wasserstoffperoxid gelöst, wobei als Chromogen ein Gemisch aus einer 3-aminoaromatischen Säure und einem 4-Aminoantipyrin verwendet wird und wobei ein neuer Farbstoffträger (Chromophor) entsteht, der einen außergewöhnlich hohen Extinktionskoeffizienten aufweist.

Die Erfindung betrifft somit den in den Patentansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.
20

Die erfindungsgemäß verwendete aminoaromatische Säure ist entweder eine 3-Aminobenzoesäure oder eine 3-Aminobenzolsulfonsäure. Diese Säuren besitzen die allgemeine Formel I

in der X einen Mono- oder Dialkylaminorest bedeutet und ZH die Carboxyl-(-CO~H) oder Sulfonsäure (-SO-H)-Gruppe darstellt. Die Art der Alkylreste in der Aminogruppe ist nicht besonders kritisch, mit der Maßgabe , daß die Entstehung des gewünschten Farbstoffes möglich ist. Aus Gründen, die nachstehend erörtert werden, sollen deshalb voluminöse Gruppen, wie tertiäre Alkyl- oder Cyclpalkylreste, nicht verwendet

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werden. Bevorzugt sind primäre Alkylreste. Die Länge des Alkylrestes ist nicht besonders kritisch, solange die aminoaromatische Säure und der erhaltene Farbstoff in wäßrigem Medium löslich sind. Bevorzugt sind jedoch niedere Alkylreste, d.h.

Alkylreste mit 1 bis etwa 6 Kohlenstoffatomen, beispielsweise die Methyl-, Äthyl-, Propyl-, Butyl-, Pentyl- und Hexylgruppe. Bevorzugt sind ferner Dialkylaminoreste, insbesondere die Dimethylaminogruppe. Die aminoaromatischen Säuren können am Benzolkern substituiert sein, wenn der Substituent die Farb-Stoffbildung nicht beeinträchtigt. Beispielsweise kann der Benzolkern mindestens ein Halogenatom, wie Chlor- oder Bromatome, aufweisen. Nicht labile Substituenten, wie Alkylreste, sollen sich jedoch nicht in p-Stellung zur Aminogruppe befinden.

.

Der zweite Bestandteil des erfindungsgemäßen Reagenzes ist ein 4-Aminoantipyrin der allgemeinen Formel II

R²

^^V

R³R⁴N—C=:z.C R (jjj

1 2

in der R und R unabhängig voneinander Alkylreste, R einen

3 4

aromatischen Rest, R und R unabhängig voneinander Wasserstoffatome oder Alkylreste und Y ein Sauerstoff- oder Schwefelatom bedeuten. Ebenso wie bei der aminoaromatischen Säure sollen die Alkylreste des Aminoantipyrins, d.h. die Reste R,

13 4
R , R und R , keine voluminösen Gruppen, wie tertiäre Alkylreste, darstellen, und ihre Kettenlänge ist durch die Löslichkeit des Aminoantipyrins und des entstehenden Farbstoffes begrenzt. Bevorzugt sind niedere Alkylreste, insbesondere die Methylgruppe. Günstigerweise ist die 4-Aminogruppe eine primä-

3 4 re Aminogruppe, d.h. die Reste R und R stellen Wasserstoffatome dar, da bei Verwendung solcher Verbindungen eine schnellere Umsetzung und kräftigere Färbung stattfindet. Der aroma-

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Γ

tische Reste R ist vorzugsweise eine gegebenenfalls substituierte Phenylgruppe. Günstige Substituenten der Phenylgruppe sind niedere Alkylreste oder Halogenatome. Bevorzugt ist das 4-Aminoantipyrin.

Der Farbstoff, der entsteht , wenn das Gemisch aus aminoaromatischer Säure der allgemeinen Formel I 'und Aminoantipyrin der allgemeinen Formel II mit Wasserstoffperoxid in Berührung gebracht wird, ist kein Chinonimin der Art _s die bei den von Trinder, Emerson und Meiattini beschriebenen Verfahren entsteht. Der bei diesen bekannten Verfahren gebildete Farbstoff erfordert die Anwesenheit einer nicht-substituierten 4-Aminogruppe in dem Aminoantipyrin. Dabei entsteht gemäß folgender Gleichung eine kovalent gebundene Verbindung.

• ' <r6^H5

OH ·■ C,Hc ν

ι Vb => Q y ^

Os=X""^—-CH,

H₂N-

Emerson beschreibt in der US-PS 2 194 201 ebenso'wie in seiner früheren Veröffentlichung (Eisenstaedt) "The Condensation of Aminoantipyrine With Aromatic Amines in the Presence of Oxidizing Agents", J. Org. Chem., 3, (1938), S. 153-165, auch die Umsetzung von Aminobenzolen, wie Anilin und Dimethylanilin/ mit 4-Aminoantipyrin. Auch dabei entsteht jedoch ein kovalent gebundener Farbstoff, wobei die 4-Aminogruppe des 4-Aminoantipyrins unsubstituiert sein muß.

Im Gegensatz dazu entsteht der Farbstoff gemäß vorliegender Erfindung auch dann, wenn die 4-Aminogruppe des Aminoantipyrins

Λ fßs:.^-"-'

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substituiert ist. Beispielsweise bildet sich bei der Umsetzung von 3-Dimethylaminobenzoesäure in Gegenwart von Wasserstoffperoxid und Peroxidase mit entweder 4-Aminoantipyrin oder 4-Dime thy laminoantipyr in ein blauer Farbstoff mit einem Absorptionsmaximum bei 550 nm. Wird Phenol oder das Natriumsalz von p-Hydroxybenzoesäure anstelle von 3-Dimethylaminobenzoesäure verwendet, dann entsteht mit 4-Aminoantipyrin ein roter Farbstoff mit einem Absorptionsmaximum bei 500 nm. Mit 4-Dimethylaminoantipyrin findet dagegen praktisch keine Umsetzung statt. Nach Emerson (Eisenstaedt) ergibt die Umsetzung von N,N-Dimethylanilin mit 4-Aminoantipyrin einen 'iminofarbstof f , während die Verwendung von 4-N,N-Dimethylaminoantipyrin anstelle von 4-Aminoantipyrin nur zur Bildung von blau gefärbtem oxidiertem 4-N,N-Dimethylaminoantipyrin führt.
· .

Der erfindungsgemäß bei Verwendung von 3-Dimethylaminobenzoesäure erhaltene Farbstoff ist in Wasser stärker löslich als die kovalent gebundenen Iminfarbstoffe, die aus Phenol, dem Natriumsalz von p-Hydroxybenzoesäure oder Dimethylanilin entstehen. Andererseits ist er aber in organischen Lösungsmitteln, wie Chloroform oder Cyclohexan, weniger löslich als die Iminfarbstof fe.

Aufgrund dieser Befunde ist zu vermuten, daß der erfindungsge-' maß erhaltene Farbstoff ein Charge-Transfer-Komplex aus einem freien Radikal der aminoaromatischen Säure und einem freien Radikal des 4-Aminoantipyrins ist, der sich durch die Formeln Ia' und Ha wiedergeben läßt.

(la) (Ha)

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In den vorstehenden Formeln stellen X" einen Alkylimino- oder einen Dialkyliminorest und Z den nach der Entfernung des Wasserstoffatoms aus einer Carboxyl- oder Sulfonsäuregrup

13 4 pe verbleibenden Rest dar, Y, R, R , R und R haben die vorstehend angegebene Bedeutung»

Der genaue Aufbau des Komplexes ist nicht im einzelnen nachge wiesen; es sind jedoch die nachstehenden Strukturen möglich, die am Beispiel des. Komplexes aus 4-N,N-Dimethylaminoantipyrin und 3-Dimethylaminobenzoesäure unter den Formeln lila, TIIb und IHc gezeigt werden:

H₃C

(HIa)

• (nib)

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- 16 -

Die vorstehenden Formelbilder lassen erkennen, daß voluminöse Substituenten an irgendeinem der Bestandteile die Bildung des Charge-Transfer-Komplexes beeinflussen oder sogar verhindern können. Aus diesem Grund sind solche Substituenten demnach nicht erwünscht. Die Formelbilder zeigen ferner, daß der erfindungsgemäß gebildete Farbstoff nicht einer der bekannten Iminfarbstoffe ist.

Möglicherweise entsteht ein Charge-Transfer-Komplex dieser Art auch als Zwischenstufe in der Umsetzung von N,N-Dimethylanilin mit 4-Aminoantipyrin, wie sie von Emerson (Eisenstaedt) beschrieben wird. Er könnte für die von Eisenstaedt berichtete blaue Färbung bei der Verwendung von 4-N,N-Dimethylaminoantipyrin verantwortlich sein. N,N-Dimethy!anilin ist jedoch zur Verwendung in einem analytischen Reagenz nicht geeignet. Erstens ist seine Umsetzungsgeschwindigkeit geringer als die der erfindungsgemäß verwendeten Aminobenzoesäuren. Ferner ist Dimethylanilin eine ölige Flüssigkeit, die mit Wasser oder wäßrigen Medien.nicht besonders mischbar ist. Infolgedessen ist die Farbstoffbildung nicht linear, was die Verwendung von Dimethylanilin in analytischen Reagenzien aus praktischen Gründen ausschließt.

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Die durch die Umsetzung der aminoaromatischen Säuren der allgemeinen. Formel I mit den Aminoantipyrinen der allgemeinen Formel II entstehenden Farbstoffe weisen im allgemeinen Absorptionsmaxima im Bereich von etwa 450 bis 650 nm auf. Sie ■ 5 zeichnen sich ferner durch hohe Extinktionskoeffizienten aus. Beispielsweise hat der aus 3-N,N-Dimethylaminobenzoesäure und 4-Aminoantipyrin erhaltene Farbstoff ein Absorptionsmaximum bei 550 nm und einen Extjnkfcionskoeffizienten von

4 -1-1
. 1,72x TO 1 Mol cm . Dies ist eine sehr starke Absorption, ■ die die Verwendung dieser Farbstoffe bei der Analyse zur Bestimmung sogar sehr geringer Konzentrationen von Wasserstoffperoxid ermöglicht ο Diese Farbstoffe können demnach zur Analyse von Bestandteilen von Körperflüssigkeiten benutzt werden, die in geringer Konzentration vorliegen, da sie entweder normalerweise nur in geringer Menge vorhanden sind, wie z.B. Harnsäure in Blut, oder da die Körperflüssigkeit vor der Analyse verdünnt wurde.

Die erfindungsgemäß erhaltenen Farbstoffe sind weniger stabil als die Iminfarbstof fe., die in den von Trinder, Emerson und Meiattini beschriebenen Verfahren erhalten werden. Diese bekannten Farbstoffe sind sehr stabile, kovalent gebundene Verbindungen, die sogar als Färbestoffe verwendet werden können. Im Gegensatz dazu sind die erfindungsgemäß erhaltenen Farbstof-²^ fe zwar ausreichend stabil,um in einem analytischen Verfahren benutzt zu werden, sie zersetzen sich jedoch innerhalb verhältnismäßig kurzer Zeit.

Infolge der verhältnismäßig geringen Beständigkeit des Farb- ^O stoffes verändert sich seine Konzentration im Reaktionsgemisch im Laufe der Zeit. Anfänglich steigt die Konzentration auf ein Maximum an, um danach wieder abzufallen. Die Bildungsund Zersetzungsgeschwindigkeit des Farbstoffs hängen ebenso wie die Zeit., in der seine größte Konzentration erreicht wird,

von den Umsetzungsbedingungen ab, insbesondere von den Anteilen der Säure der allgemeinen Formel I und des Antipyrins

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Γ Ι

der allgemeinen Formel II, den absoluten Konzentrationen dieser Umsetzungsteilnehmer und der Umsetzungstemperatur. Deshalb muß jede dieser Variablen eingestellt werden, um die für die analytische Bestimmung innerhalb der gewünschten Zeitdauer erwünschte Farbstoffkonzentration zu erreichen. Ferner kann die Zeit, zu der sich die Farbstoffkonzentration in der Nähe oder am Maximum befindet, verändert werden, um eine günstige Zeitspanne zu erhalten, in der der Farbstoff bestimmt und die gewünschte Analyse durchgeführt wird.

.

Der mengenmäßige Anteil an aminoaromatischer Säure der allgemeinen Formel I und 4-Aminoantipyrin der allgemeinen Formel II in der Umsetzung zur Herstellung des Farbstoffes ist nicht besonders kritisch, solange der erwünschte Farbstoff gebildet wird- Geeignete Mengenverhältnisse liegen im allgemeinen im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 25 Mol der aminoaromatischen Säure pro Mol Aminoantipyrin. Das günstigste Mengenverhältnis hängt in starkem Maße von der gewünschten Farbstoffbildungsgeschwindigkeit ab. Mit zunehmendem Verhältnis von Säure zu Antipyrin steigt die Farbstoffbildungsgeschwindigkeit an. Infolge der vermutlich radikalischen Natur der stattfindenden Umsetzung wird jedoch durch einen erhöhten Anteil der Säure der allgemeinen Formel I auch die Lebensdauer des erhaltenen Farbstoffes vermindert. Das Verhältnis der beiden Komponenten muß deshalb derart eingestellt werden, daß eine möglichst günstige Umsetzungsgeschwindigkeit erreicht wird und die Bestimmung in einer vernünftigen Zeit durchgeführt werden kann und/oder eine möglichst große Farbstoffkonzentration mit günstiger Lebensdauer erhalten wird. Das beste Verhältnis hängt davon ab, ob die Aminogruppe des 4-Aminoantipyrins substituiert ist. Ein Mengenverhältnis von Säure zu Antipyrin von etwa 10 : 1, d.h. von etwa 8 : 1 bis etwa 12 : 1, ist bei einer primären 4-Aminogruppe bevorzugt. Bei einer tertiären 4-Aminogruppe liegt das günstigste Verhältnis von Säure zu Antipyrin unter 1 : 1 und beträgt vorzugsweise etwa 0,25 .: 1, d.h. etwa 0,2 : 1 bis etwa 0,3 : 1.

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Γ -1

Die Konzentrationen der beiden Chromogene werden derart gewählt, daß sie zur Bildung einer meßbaren Menge des Farbstoffes ausreichen. Im allgemeinen kann die Konzentration des Aminoantipyrins im Bereich von etwa 0,01 bis etwa 1000 mMol/ Liter, insbesondere im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 5 mMol/ Liter liegen. Eine Konzentration des Aminoantipyrins im Bereich von etwa 0,35 bis etwa 0,5 mMol/Liter ist bevorzugt. Die Konzentration der Aminosäure .wird so bestimmt,

daß ein Farbstoff in der gewünschten Zeit erhalten wird. ^O Sie kann von geringen Werten, wie 0,1 mMol/Liter bis zur Löslichkeitsgrenze oder etwa 50 mMol/Liter reichen.

Die Umsetzung der beiden Chromogene mit Wasserstoffperoxid wird durch das Enzym Peroxidase katalysiert. Bekanntermaßen kann dieses Enzym aus einer Vielzahl von Quellen, wie Meerrettich, Leber, Petersilie und bestimmten Bakterien gewonnen werden. Obwohl die aus verschiedenen Quellen erhaltene Peroxidase Unterschiede aufweist, ist die Herkunft der Peroxidase erfindungsgemäß nicht kritisch. Peroxidase aus Meer-

²^ rettich ist jedoch die geläufigste Form von Peroxidase und aus diesem Grund bevorzugt. Die Menge an eingesetzter Peroxidase ist kein Merkmal der Erfindung; es können die in den bekannten Verfahren verwendeten Mengen eingesetzt werden. Im allgemeinen werden jedoch mindestens 50 Peroxidaseeinheiten pro Liter der Lösung, vorzugsweise mindestens 500 Einheiten pro Liter, verwendet. Grundsätzlich besteht keine Obergrenze für die Menge. Peroxidasemengen über etwa 2500 Einheiten pro Liter sind jedoch unnötig. Bevorzugt sind Mengen im Bereich

von etwa 1200 bis 1600 Einheiten/Liter. 30

Ümsetzungstemperatur und pH-Wert des Umsetzungsgemisches beeinflussen beide die Farbstoffbildungsgeschwindigkeit und die Stabilität des Farbstoffes. Im allgemeinen steigt die Umsetzungsgeschwindigkeit mit der Temperatur an und die Stabilität

des Farbstoffes nimmt gleichzeitig ab. Geeignet ist im allgemeinen eine Temperatur in der Nähe der Raumtemperatur, d.h.

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von etwa 20 bis 45⁰C, vorzugsweise von etwa 25 bis 3O°C. Ferner ist die Aktivität der Peroxidase bekanntermaßen bei einem pH-Wert von etwa 6,8, d.h.. von etwa 6,5 bis 7,0, am größten.

Beim Einsatz der Erfindung als Teil einer enzymatischen Analyse eines Bestandteiles einer Körperflüssigkeit müssen Temperatur und pH-Wert jedoch derart- eingestellt werden, daß der 'gesamte Reaktionsverlauf möglichst günstig gestaltet wird. Bei der Analyse von Cholesterin sind beispielsweise eine Temperatür von etwa 3O°C und ein pH-Wert von etwa 7,5 bevorzugt. Bei der Analyse von Glucose sind eine Temperatur von etwa 25°C und ein pH-Wert von etwa 7,0 bevorzugt. Bei der Analyse von Harnsäure sind eine Temperatur von etwa 25⁰C und ein pH-Wert von etwa 8,0 bevorzugt.

Infolge der Bedeutung des pH-Wertes für enzymatische Reaktionen wird günstigerweise ein Puffer verwendet, der in der Lage ist, . den gewünschten pH-Wert für die zur Durchführung der Analyse erforderliche Zeit aufrechtzuerhalten. Geeignete Puffer sind phosphat-, Pyrophosphat-, Borat-.oder andere bekannte Puffer, wie Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan ("tris"), Ν,Ν,Ν-tris-(2-Hydroxyäthyl)-methyl-2-aminomethansulfonsäure ("TES"), N-(2-Hydroxyäthyl)-piperazin-N'-2-äthan-sulfonsäure ("HEPES"), N,N-Bis-(2-hydroxyäthyl)-glycin ("Bicine"), Ν,Ν,Ν-tris-(2-Hydroxyäthyl)-methylglycin ("Tricine"), Piperazin-N,N-bis-(2-äthansulfonsäure) X¹¹PIPEs") und N,N-Bis-(2-hydroxyäthyl)-2-aminoäthansulfonsäure ("BES").

Bei der Verwendung des erfindungsgemäßen Reagenzes zur Analyse eines bestimmten Bestandteiles einer Körperflüssigkeit,wird ferner ein Enzym eingesetzt, das in der Lage ist, die Bildung von Wasserstoffperoxid durch Oxidation des fraglichen Bestandteiles zu katalysieren. Solche Enzyme sind im allgemeinen unter der Bezeichnung "Oxidasen" bekannt. Spezielle Beispiele sind Glucoseoxidase, Cholesterinoxidase und Harnsäureoxidase. Die erforderliche Menge solcher Oxidasen ist bekannt und stellt

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^ deshalb kein Merkmal der Erfindung dar.

Das erfindungsgeinäße Reagenz kann in Form eines Analysenkastens oder -. Satzes... hergerichtet werden, der die erforderlichen Bestandteile in vorbestimmten Mengenverhältnissen enthält= Die Bestandteile können getrennt verpackt sein. Es können auch zwei oder, mehr von ihnen als Gemisch vorliegen. Das erfindungsgemäße Reagenz weist den Vorteil auf, daß sowohl die aminoaromatische Säure der allgemeinen Forme] I als auch das AminojO antipyrin der allgemeinen Formel II stabile Feststoffe sind. In derartigen Kästen werden die Enzyme vorzugsweise als trockene Feststoffe verpackt,

Wenn der Analysenkasten oder -satz zur Analyse von Wasserstoffperoxid vorgesehen ist, muß er Peroxidase, Aminoantipyrin und aminoaromatische Säure enthalten. In einem solchen Analysensatz sind das Aminoantipyrin und die aminoaromatische Säure günstigerweise -getrennt verpackt. Die Peroxidase kann getrennt abgepackt oder mit einer der beiden vorstehenden Komponenten vermischt sein. In ähnlicher Weise sind bei der Bestimmung des Analysensatzes zur Analyse von Blutbestandteilen zusätzliche Enzyme, günstigerweise in trockener Form, als zusätzliche Komponenten enthalten, die entweder getrennt oder im Gemisch mit einer oder mehreren der anderen Komponenten verpackt sein können. Vorzugsweise enthält der Analysensatz auch einen Puffer, der getrennt oder im Gemisch mit dem Antipyrin, der aminoaromatischen Säure und/oder der Peroxidase abgepackt sein kann. In einer weiteren Ausführungsform können auch alle festen Komponenten als einzelnes Gemisch abgepackt sein. Ferner können eine oder mehrere Komponenten auch in Form von wäßrigen Lösungen, entweder als Konzentrat oder etwa in der Arbeitskonzentration, abgepackt sein, auch wenn dies weniger günstig ist.

Bei der Verwendung zur Analyse werden die Komponenten des Analysensatzes miteinander vermischt, in Wasser gelöst oder mit Wasser nach Bedarf verdünnt und nach"üblichen Verfahren

zur Durchführung der Analyse angewendet. Das heißt, daß die verschiedenen Bestandteile mit der zu analysierenden Lösung vermischt werden und das erhaltene Gemisch auf einer vorher festgelegten Temperatur gehalten wird, um die Entstehung des Farbstoffes zu ermöglichen. Danach wird die Konzentration des Farbstoffes beispielsweise durch übliche photometrische Analyse bestimmt. Solche Analysen können manuell oder automatisch unter Verwendung bekannter Ausrüstungen und Verfahren durchgeführt werden. Eine weitere Erörterung der Verfahrenstechnik kann hier demnach unterbleiben.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Harnsäureanalyse (manuell)

Es wird eine wäßrige Lösung mit einem Gehalt von 200 Einheiten/ Liter Urikase, 1400 Einheiten/Liter Peroxidase, 0,35 mMol/Liter 4-Aminoantipyrin, 100 mMol/Liter tris-Puffer und 5,0 mMol/Liter 3-N,N-Dimethylaminobenzoesäure hergestellt, die einen pH-Wert von 8 aufweist. Bei einer Temperatur von 25°C werden sodann 2,0 ml dieses Reagenz mit 50 /Leiner Harnsäure enthaltenden Probe versetzt. Die Absorption bei 550 nm wird unmittelbar nach der Zugabe der Probe zu dem Reagenz und dann erneut nach 6 Minuten gemessen. Die Harnsäurekonzentration wird nach folgender Gleichung berechnet.

(tv)

^Ua (£) (LP) (10) (SV)

In vorstehender Gleichung bedeuten:

C : Konzentration der Harnsäure in mg/dl.

ΔA: Änderung der Absorption, oder unterschied zwischen der

Absorption nach 6 Minuten und der anfänglichen Ab-35

sorption.

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MW : Molekulargewicht der Harnsäure (168,11 Daltons).
ua

TV : Gesamtes Reaktionsvolumen, ml.

LP : Weg des Lichtes, cm.

S - Molarer Extinktionskoeffizient des erhaltenen Farbstof-

fes (1,72 χ 1O⁴ 1 Mol"¹ cm"¹).

SV : Probenvolumen, ml.

In dem verwendeten System vereinfacht sich die Gleichung zu

C_ua = 40,0 Δα.
10

Das Verfahren wird mit 9 verschiedenen Harnsäure-Standardlösungen wiederholt. Jede dieser Standardlösungen wird ferner mit Hilfe eines bekannten technischen Reagenzes zur Harnsäureanalyse (Statzyme Uric Acid)¹ zum Vergleich der Messung der Ab-¹^ sorption bei 293 nm analysiert. Die Ergebnisse der verschiedenen Analysen sind nachstehend aufgeführt.

Gemessene Konzentration, mg/dl

Probe bekanntes Reagenz erfindungsgemäßes

Aq. Standard, 2 mg/dl 1,9 ■ 2,0

Aq. Standard, 6 mg/dl 5,9 6,2

Aq. standard, 12 mg/dl 11,8 11,7

Monitrol I 4,7 4,0

Validate . 5,0 4,1

SMA Reference 3 6,7 6,6

Stattroi reference serum 6,5 7,3

Monitrol II . 8,4 9,2

Validate A 8,1 8,9

Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß die mit dem erfindungsgemäßen Reagenz erhaltenen Analysenwerte mit denen unter Verwendung des bekannten Reagenzes erhaltenen vergleichbar sind.

Die in diesem Beispiel angegebenen Konzentrationen sind die günstigsten für die in dem besonderen Fall verwendeten Stof-

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j fe. Gute Ergebnisse können jedoch auch mit den folgenden Konzentrationen erhalten werden:

ürikase; ^1O Einheiten/Liter

Peroxidase: ]^5O Einheiten/Liter

4 -Aminoantipyrin: 0,.Ol bis 1OOO Millimol/Liter Tris-Puffer: 10 bis 1000 Millimol/Liter

3-N,N-Dimethylaminobenzoe- 0/1 bis 50 Millimol/Liter säure

pH-Wert: 6,2-9,5.

Die Analyse kann bei einer Temperatur von 20 bis 45⁰C mit einer Umsetzungsdauer von etwa 1 bis 30 Minuten, vorzugsweise etwa 5 bis 10 Minuten und Messung der Absorption in einem

Bereich von 450 bis 650 nm durchgeführt werden. Unter diesen 15

Bedingungen beträgt die Empfindlichkeit der Analyse 0,01 bis 0,04 Absorptionseinheiten pro mg %; in dem angegebenen Beispiel beträgt sie 0,025 Absorptionseinheiten pro mg %.

Beispiel 2 20

Glucoseanalyse (manuell)

Es wird eine wäßrige Lösung mit einem Gehalt von 14 042 Einheiten/Liter Glucoseoxidase, 766 Einheiten pro Liter Peroxidase, 0,35 mMol/Liter 4-Aminoantipyrin,. 109 mMol/Liter Phosphatpuffer und 1,0 mMol/Liter 3-N,N-Dimethylaminobenzoesäure hergestellt, die einen pH-Wert von 7 aufweist. Sodann werden 3,5 ml dieses Reagenzes mit i0/\einer Glucose enthaltenden Probe bei einer Temperatur von 25 C versetzt. Die Absorption bei 550 nm wird unmittelbar nach der Zugabe der Probe zu dem Reagenz und danach erneut nach 6 Minuten gemessen. Die Glucosekonzentration wird nach folgender Gleichung berechnet:

£a(mw_q) (ίο³) (tv)

C = 2

^y (£) (LP) (10) (SV)

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In vorstehender Gleichung bedeuten:

C : Konzentration der Glucose in mg/dl=

ΔΑ : Änderung der Absorption, oder Unterschied zwischen der Absorption nach 6 Minuten und der anfänglichen Absorption -

MW : Molekulargewicht der Glucose (180,16 Daltons). TV : Gesamtes Reaktionsvolumen, ml. LP : Lichtweg, cm.

£' : molarer Extinktionskoeffizient des erhaltenen Farbstoffes (1 ,72 χ 1O'
SV. : Probenvolumen, ml.

stoffes (1,72 χ 1O⁴ 1 Mol ¹ cm"¹)

In dem verwendeten System vereinfacht sich die Gleichung zu C = 367,6 Δα. Die Empfindlichkeit der Analyse beträgt 0,213 Absorptionseinheiten/mg %. ·

Das Verfahren wird mit neun verschiedenen Glucose-Standard-Lösungen wiederholt.· Jede Standardlösung wird ferner unter Verwendung eines bekannten technischen Reagenzes mit einem Gehalt an Natriumsalz von p-Hydroxybenzoesäure und 4-Aminoantipyrin (Statzyme Glucose 500) zu Vergleichszwecken durch Messung der Absorption bei 500 nm ein zweites Mal analysiert. Die Ergebnisse der verschiedenen Analysen sind nachstehend aufgeführt.

■ ' .Gemessene Konzentration, mg/dl

Probe: ' ■

Ag. standard, 100 mg/dl

Ag. standard, 200 mg/dl 30 Aq. Standard, 400 mg/dl Monitrol I

Validate

SMA reference 5

Hyland II
35 Monitrol II

Validate A

L ' . _J

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bekanntes	Reagenz	erfindungs gemäßes
101		101
201		205
395		413
85		88
85		87
215		193
189		190
203		207
237		238

Die vorstehenden Werte zeigen, daß die bei Verwendung des erfindungsgemäßen Reagenzes erhaltenen Werte mit denen vergleichbar sind, die mit dem bekannten Reagenz erhalten werden.

Die in diesem Beispiel verwendeten Konzentrationen sind die günstigsten für die bestimmten Stoffe. Gute Ergebnisse können jedoch auch mit folgenden Konzentrationen erhalten werden :

Glukoseoxidase: >1OO Einheiten/Liter Peroxidase: ^ 50 Einheiten/Liter

4-Aminoantipyrin: 0,01 bis 1000 Millimol/Liter Phosphat-Puffer: 10 bis 1000 Millimol/Liter

3-N,N-Dimethylamino-

benzoesäure: 0,1 bis 50 Millimol/Liter

pH-Wert: 4,0 - 9,5

Die Analysen können bei einer Temperatur von 2O bis 45⁰C in einer Zeit von etwa 1 bis 30 Minuten, vorzugsweise von etwa

5 bis 10 Minuten durch Messung der Absorption bei 450 bis 20

650 nm durchgeführt werden.

Beispiel 3

Cholesterinanalyse (manuell) .

Es wird eine wäßrige Lösung mit einem Gehalt von 600 Einheiten/ Liter Cholesterinesterase, 110 Einheiten/Liter Cholesterinoxidase, 1400 Einheiten/Liter Peroxidase, 0,5 mMol/Liter 4-Aminoanitpyrin, 100 mMol/Liter Tris-Puffer, 5,0 mMol/Liter 3-N,N-Dimethylaminobenzoesäure und 0,2 % Triton X-100 hergestellt, die einen pH-Wert von 7,5 aufweist. Sodann werden 30

3,0 ml dieses Reagenzes mit 10^-/einer Cholesterin enthaltenden Probe bei 30⁰C versetzt.- Die Absorption bei 550 nm wird unmittelbar nach Zugabe der Probe zu dem Reagenz und sodann erneut nach 15 Minuten gemessen. Die Cholesterinkonzentration wird nach folgender Gleichung berechnet:

030033/0668

) (ΙΟ³) (TV)

(LP) (10) (SV)

5 In vorstehender Gleichung bedeuten:

C : Konzentration des Cholesterinsin mg/dl.

^A : Änderung der Absorption, oder Unterschied zwischen der Absorption nach 15 Minuten und der anfänglichen Absorption

MW : Molekulargewicht von Cholesterin (386,6 Daltons). TV : Gesamtes Reaktionsvolumen, ml. LP : Lichtweg, cm.

£ : molarer Extinktionskoeffizient des erhaltenen Farbstoffes (1,72 χ 10⁴ 1 Mol"¹ cm"¹). SV ': Probenvolumen, ml.

In dem verwendeten System vereinfacht sich die Gleichung zu C = 674,3 ΔΑ.

Das Verfahren wird mit 7 verschiedenen Cholesterin-Standardlösungen wiederholt. Für jede Standardlösung wird außerdem unter Verwendung eines technischen Reagenzes, das Phenol und 4-Aminoantipyrin enthält (Statzyme Cholesterol), zu Vergleichszwecken durch Messung der Absorption bei 500 nm eine zweite Bestimmung durchgeführt. Die Ergebnisse der verschiedenen Analysen sind nachstehend aufgeführt.

Probe:

Gemessene Konzentration, mg/dl

bekanntes Reagenz erfindungsgemäßes

Aq. standard,.	100	Ortho abnormal	iag/dl	93
Aq. standard,-	300	Stattrol reference	mg/dl	250
Aq. Standard,	500	mg/dl	437
Scale 1			101
Scale 2			194
	135
serum	126

81 302 553

94 148

73 121

03003370668

Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß die mit dem erfindungsgemäßen Reagenz erhaltenen Analysenwerte im allgemeinen mit denen vergleichbar sind, die mit dem bekannten Reagenz erhalten werden. Es besteht keine so gute Übereinstimmung wie in den vorhergehenden Bestimmung3i.Es kann jedoch angenommen werden, daß eine weitere Verbesserung der Bedingungen zu besseren Ergebnissen führen würde. Insbesondere wird vermutlich eine günstigere Cholesterinesterasekonzentration zu Ergebnissen führen, die mit dem mit dem bekannten Reagenz erhaltenen viel besser übereinstimmen würden. Es muß jedoch bemerkt werden, daß im Fall der ersten drei Proben mit dem erfindungsgemäßen Reagenz im. allgemeinen Ergebnisse erhalten würden, die näher an der bekannten Cholesterinkonzentration liegen als die mit dem bekannten Reagenz erhaltenen Werte.

Die in diesem Beispiel eingesetzten Konzentrationen sind die günstigsten für die bestimmten verwendeten chemischen Stoffe. Es können jedoch mit folgenden Konzentrationen gute Ergebnisse erhalten werden:

Cholesterinesterase: >2O Einheiten/Liter Cholesterinoxidase: ^ 1 Einheit /Liter

Peroxidase: ^5O Einheiten/Liter

4-Aminoantipyrin: 0,01 bis 1000 Millimol/Liter

Tris-Puffer; 10 bis 1000 Millimol/Liter

3-N,N-Dimethylamino-

benzoesäure 0,1 bis 50 Millimol/Liter

Triton X-100 O,001 - 10 %

pH-Wert ' 3-9.

Die Analysen können bei einer Temperatur von 20 bis 45°C mit einer Umsetzungsdauer von etwa 1 bis 45 Minuten, vorzugsweise von etwa 10 bis 20 Minuten durch Messung der Absorption im Bereich von 450 bis 650 nm durchgeführt werden. Unter diesen Bedingungen beträgt die Empfindlichkeit der Analyse 0,1 bis 0,4 Absorptionseinhexten pro mg %. In dem speziellen Beispiel beträgt sie 0,150 Absorptionseinheiten pro mg %.

L . -J

03G033/0S68

Beispiel4

Harnsäureanalyse (automatisiert)
Es werden drei wäßrige Lösungen hergestellt:

(1) Eine Enzym-Reagenzlösung mit einem Gehalt von 200 Einheiten pro Liter Urikase, 1400 Einheiten/Liter Peroxidase, 0,35 mMol/Liter 4-Aminoantipyrin und 100 mMol/Liter Tris-Puffer;

(2) eine Farbstoffträger-Puffer-Lösung mit einem Gehalt von

5,0 mMol/Liter 3-N,N-Dimethylaminobenzoesäure und 100 iriMol/ j Liter Tris-Puffer; und j

(3) eine Proben-Puffer-Lösung mit einem Gehalt von 100 mMol/ , Liter Tris-Puffer. Der pH-Wert jeder Lösung beträgt 8,0. j

Die vorstehenden Lösungen werden zur Bestimmung der Harnsäurekonzentration in den in Beispiel 1 verwendeten neun Proben benutzt, wobei jedoch ein automatisiertes Verfahren unter Verwendung eines Technicon Type II Auto-Analysengerätes angewendet wurde, das mit einer 12 inch Dialyseeinrichtung ausgerüstet ist, die eine Membrane vom Typ C enthält. Die Probengeschwin-

oC Proben/Stunde
digkeit beträgt und das Proben/Waschverhältnis 9 : 1

(Waschdauer: 6 Sekunden). Ein Strom des Proben-Puffers, der 1 ml/Liter eines Netzmittels (Brij 35) enthält, wird nach dem Vermischen mit der zu analysierenden Probe, die mit einer Geschwindigkeit von 0,32 cm³/Minute zugeführt wird, und mit Luft in einer Menge von 0,32 cm³/Minute mit einer Geschwindigkeit von 1 cm³/Minute gegen eine Oberfläche der Membran des Analysegerätes geführt .'·Ein Gemisch aus der Enzym-Reagenzlösung mit einem Gehalt von 1 ml/Liter Brij 35 (0,23 cm³/Minute) und der Chromophor-Pufferlösung (1,00 cm³/Minute) wird nach dem Vermischen mit Luft, die in einer Menge von 0,32 cm³/Minute zugeführt wird, auf die andere Seite der Membran des Dialysegerätes geführt.

Die Absorption der Proben wird in einer 1,5 cm Fließzelle .35 unter Verwendung eines 550 nm-Filters nach 5,5 Minuten Inkubation bestimmt, wobei der Durchzug 1,0 cm³/Minute beträgt.

830033/0668

Die Empfindlichkeit des Verfahrens liegt bei etwa 0,017 Absorptionseinheiten/mg % Harnsäure. Die Ergebnisse werden automatisch mit Hilfe eines Schreibgerätes und eines Konzentrationsrechners aufgenommen, wobei eine Standardlösung mit bekannter Harnsäurekonzentration zur Kalibrierung verwendet wird.

Nächstehend sind die Ergebnisse zusammen mit den in Beispiel 1 nach dem manuellen Verfahren erhaltenen angegeben.

Harnsäurekonzentration

Probe	Manuell Beispiel 1	automatisiert
Aq. Standard, 2 mg/dl	2,0	2,2
Aq. Standard, 6 mg/dl	6,2	7,0
Aq. standard, 12 mg/dl '	11,7'	13,2
Monitrol I	4,0	4,5
Validate	4,1	4,2
SMA reference 3	6,6	6,7
Stattroi reference serum	7,3	7,4
Monitrol II .	9,2	8,9
Validate A '	. 8,9	7,5

Im allgemeinen stimmen die mit dem erfindungsgemäßen Reagenz nach dem automatisierten Verfahren erhaltenen Ergebnisse mit denen, die im manuellen Betrieb erhalten werden, in vernünftigen Grenzen überein.'

Gute Ergebnisse können nach dem automatisierten Verfahren auch mit Reagenzien folgender Zusammensetzung erhalten werden :

030033/Q668

En zym-Reagen z ürikase Peroxidase 4-Aminoantipyrin Tris-Puffer

- 31

•^10 Einheiten/Liter

^.50 Einheiten/Liter 0,01 bis 1000 Millimol/Liter 10 bis 1000 Millimol/Liter

Farbstoffträger-Puffer

3-N,N-Dimethylaminobenzoesäure

Tris-Puffer

0,1 bis 50 Millimol/Liter 10 bis 1000 Millimol/Liter

Probe-Puffer Tris-Puffer

10 bis 1000 Millimol/Liter

Das Verfahren kann bei einer Temperatur von 20 bis 45°C, ■einem pH-Wert von 6,2 bis 9,5 und einer Umsetzungsdauer von 1 bis 30 Minuten durch Messung der Absorption bei 450 bis 6.50 nm mit einer Empfindlichkeit von 0,01 bis 0,4 Absorptionseinheiten/mg % durchgeführt werden.

Aus den vorstehenden Beispielen ist ersichtlich, daß eine geringe Menge eines Netzmittels verwendet werden kann. Ein Netzmittel ist besonders bei der Durchführung der automatisierten Analyse gemäß Beispiel 4 günstig.

.8 3QQ3-3/0-6 6.8

Claims

VOSSIUS VOSSIUS- TA UCHNER · HEUNEMANN · RAUH PATENTANWÄLTE SIEBERTSTRASSE 4 · 8OOO MÜNCHEN 86 · PHONE: (O89) 47 4O75 CABLE: BENZOLP ATE NT MÜNCHEN · TELEX 5-29 4-53 VOPAT D u.Z.: P 502 (Ra/kä) ^ Januar Case: 3796 MILLIPORE CORPORATION Bedford, Massachusetts, V.St.A. 10 " Reagenz zur analytischen Bestimmung von Wasserstoffperoxid " Priorität: 31. Januar 1979, V.St.A., Nr. 8 154 ■ ; : : Patentansprüche

1. Reagenz zur analytischen Bestimmung von Wasserstoffperoxid in einem wäßrigen Medium, dadurch gekennzeichnet, daß es

(1) Peroxidase,

(2) eine aminoaromatische Säure der allgemeinen Formel I

• X :

i/ w

(D

in der X einen Mono- oder Dialkylaminorest und ZH eine Carboxyl- oder SuIfonsäuregruppe bedeuten, und (3) ein 4-toirrantipyrin der allgemeinen Formel (II)

(II) · p^ _ «' R I V

_J

1 2

in der R und R unabhängig voneinander Alkylreste, R einen

aromatischen Rest, R und R unabhängig voneinander Wasserstoffatome oder Alkylreste und Y ein Sauerstoff- oder Schwefelatom darstellen,
enthält.

2. Reagenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es die aminoaromatische Säure und das Aminoantipyrin in einem Molverhältnis von etwa 0,1 : 1 bis etwa 25 : 1 enthält.

3. Reagenz nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich einen Puffer zur Einstellung des pH-Wertes einer wäßrigen Lösung der Peroxidase, der aminoaromatischen Säure und des Aminoantipyrens auf einen pH-Bereidivon etwa 3 bis etwa 9,5 enthält.

4. Reagenz nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich ein Enzym enthält, das in der Lage ist, einen Bestandteil einer Körperflüssigkeit unter Bildung von Wasserstoffperoxid zu oxidieren.

5. Reagenz nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym zur Oxidation von Harnsäure, Cholesterin oder Glucose

unter Bildung von Wasserstoffperoxid befähigt ist. 25

6. Reagenz nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die aminoaromatische Säure der allgemeinen Formel I eine Aminobenzoesäure ist und daß in dem Aminoantipyrin der allgemeinen

2
Formel II R eine Phenylgruppe und Y ein Sauerstoffatom darstellen.

7. Reagenz nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß in der aminoaromatischen Säure der allgemeinen Formel I X einen Aminoalkylrest bedeutet und in dem Aminoantipyrin der allgemeinen Formel II R und R Methylgruppen darstellen.

.Jl

030033/0668

Γ "1

8. Reagenz nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß in der aminoaromatisehen Säure der allgemeinen Formel I X eine Dimethylaminogruppe bedeutet und in dem Aminoantipyrin der

3 4
allgemeinen Formel II R und R Wasserstoffatome darstellen.

9* Reagenz nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß in der aminoaromatischen Säure der allgemeinen Formel I X eine Dimethylaminogruppe bedeutet und in dem Aminoantipyrin der all-

3 4
gemeinen Formel II R und R Methylgruppen darstellen.

10. Reagenz nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es die aminoaromatische Säure und das Aminoantipyrin in einem Molverhältnis von etwa 8 : 1 bis etwa 12s 1 enthält.

11. Reagenz nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es als Enzym Urikase enthält.

12. Reagenz nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es als Enzym Glukoseoxidase enthält.

13. Reagenz nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es

als Enzym Cholesterinoxidase enthält.

14. Verwendung des Reagenz nach Anspruch 1 bis 13 zur analytischen Bestimmung von Wasserstoffperoxid in einem wäßrigen Medium, insbesondere in einer Körperflüssigkeit.

15. Verfahren zur enzymatischen Bestimmung der Menge eines Bestandteiles in einer Körperflüssigkeit durch Vermischen der Körperflüssigkeit mit

(a) einem Enzym, das zur Oxidation des Bestandteiles unter Bildung von Wasserstoffperoxid befähigt ist,

(b) Peroxidase und.

(c) einem farbgebenden Stoff, der durch Peroxidase katalysierte Umsetzung mit Wasserstoffperoxid zu einem Farbstoffträger oxidiert werden kann, und Messen der auftretenden

BAD ORIGINAL

Farbänderung, dadurch gekennzeichnet, daß man als farbgebenden Stoff ein Gemisch aus einer aminoaromatisehen Säure der allgemeinen Formel I und einem 4-Aminoantipyrin der allgemeinen Formel II verwendet. 5

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man es bei einer Temperatur von etwa 20 bis 45⁰C und bei einem pH-Wert von etwa 3 bis 9,5 durchführt.

17. Verfahren nach Anspruch 16,.dadurch gekennzeichnet, daß man als.aminoaromatische Säure eine Aminobenzoesäure verwendet und ein Aminoantipyrin der allgemeinen Formel II einsetzt, in der R„· eine Phenylgruppe und Y ein Sauerstoffatom bedeuten.

18·. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Aminoantipyrin der allgemeinen Formel II einsetzt, in der R und R Methylgruppen bedeuten.

19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß man als Aminobenzoesäure 3-N,N-Dimethylaminobenzoesäure einsetzt.

20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß . man ein Aminoantipyrin der allgemeinen Formel II einsetzt, in der R und R Wasserstoffatome bedeuten.

21. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Aminoantipyrin der allgemeinen Formel II einsetzt,

3 4
in der R und R Methylgruppen bedeuten.

22. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man die aminoaromatische Säure und das Aminoantipyrin in einem Molverhältnis von etwa 0,1 : 1 bis etwa 25 : 1 verwendet.

23. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß man die aminoaromatische Säure und das Aminoantipyrin in einem Molverhältnis von etwa 8 : 1 bis etwa 12 : 1 verwendet.

L- -J

030033/0668

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24. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man als Enzym Urikase verwendet.

25. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man als' Enzym Glucoseoxidase verwendet.

26. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man als Enzym Cholesterinoxidase verwendet-

27. Verfahren zur Herstellung eines Farbstoffes, dadurch gekennzeichnet, daß man in einem Wasserstoffperoxid enthaltenden wäßrigen Medium (1) Peroxidase mit (2) einer aminoaromatischen

und mit Säure der allgemeinen Formel I und III/einem 4-Aminoantipyrin

der allgemeinen Formel II in Berührung bringt. 15

28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß man es bei einer Temperatur von etwa 20 bis 45⁰C und einem pH-Wert von etwa 3 bis 9,5 durchführt.

29. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß man als aminoaromatische Säure eine Aminobenzoesäure verwendet und ein Aminoantipyrin der allgemeinen Formel II einsetzt, in

2
der. R eine Phenylgruppe und Y ein Sauerstoffatom bedeuten.

30. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Aminoantipyrin der allgemeinen Formel II einsetzt, in der R und R Methylgruppen bedeuten.

31. Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß man als Aminobenzoesäure 3-N,.N-Dimethylaminobenzoesäure verwendet ·

32. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß

man ein Aminoantipyrin der allgemeinen Formel II einsetzt, in

3 4
der R und R Wasserstoffatome bedeuten.

33. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Aminoantipyrin der allgemeinen Formel II einsetzt,

3 4
in der R und R Methylgruppen bedeuten.

34. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß man die aminoaromatische Säure und das Aminoantipyrin in einem Molverhältnis von etwa 0,1 : 1 bis etwa 25 : 1 verwendet.

35. Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß

roan die aminoaromatische Säure und das Aminoantipyrin in einem Molverhältnis von etwa 8 : 1 bis etwa 12:1 verwendet.

36. Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit von Wasserstoffperoxid in einem wäßrigen Medium, dadurch gekennzeichnet, daß man

. (a) das wäßrige Medium mit (1) Peroxidase, (2) einer aminoaromatischen Säure der allgemeinen Formel I und (3) einem 4-Aminoantipyrin der allgemeinen Formel II versetzt und (b) danach die auftretende Farbänderung photometrisch bestimmt.

37. Verfahren nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß man es bei einer Temperatur von etwa 20 bis 45⁰C und einem pH-Wert von etwa 3 bis 9,5 durchführt.

38. Verfahren nach Anspruch-37, dadurch gekennzeichnet, daß man als aminoaromatische Säure eine Aminobenzoesäure verwendet und ein Aminoantipyrin der allgemeinen Formel II einsetzt, in der R eine Phenylgruppe und Y ein Sauerstoffatom bedeuten. · .

39. Verfahren nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Aminoantipyrin der allgemeinen Formel II einsetzt,

in der R und R Methylgruppen bedeuten.

L _J

030033/066 8"

BAD ORIGINAL

Γ

40. Verfahren nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, daß man als Aminobenzoesäure 3-N,N-Dimethylaminobenzoesäure verwendet..

41. Verfahren nach Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Amlnoantipyrin der allgemeinen Formel II einsetzt, in

3 4

der R und R Wasserstoffatome bedeuten.

42. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß

man ein Aminoantipyrin der allgemeinen Formel II einsetzt, in

3 4 ' ·

der R und R Methylgruppen bedeuten.

43. Verfahren nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß man die aminoaromatische Säure und das Aminoantipyrin in einem Molverhältnis von etwa 0,1 : 1 bis etwa 25 : 1 verwendet.

44. Verfahren nach Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet, daß man die aminoaromatische Säure· und das Aminoantipyrin in einem Molverhältnis von etwa 8 t I.bis etwa 12; 1 verwendet.

κ 45y Charge-Transfer-Komplex aus

(1)· einem freien Radikal einer aromatischen Säure der allgemeinen Formel Ia

· % ■· i

⁷^ (la) ι

3" in der X' einen Mono- oder Dialkyliminorest bedeutet und Z den nach der Entfernung des Wasserstoffatoms aus einer Carboxyl- oder Sulfonsäuregruppe verbleibenden Rest darstellt, und

(2) einem freien Radikal eines 4-Aminoantipyrins der allgemeinen Formel Ha

■ "^mnJ:!' ' 030033/0668 BAD ORIGINAL

(Ha)

R⁴

13 4

in· der R, R , R , R und Y die vorstehend angegebene Bedeutung haben.

46. Komplex nach Anspruch 45, dadurch gekennzeichnet, daß

Y in der allgemeinen Formel Ha ein Sauerstoffatom und Z in der allgemeinen Formel Ia den Rest einer Carboxylgruppe darstellen.

47. Komplex nach Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, daß X^f in der allgemeinen Formel Ia einen Dialkyliminorest und R und R in der allgemeinen Formel Ha Methylgruppen darstellen.

48. Komplex nach Anspruch 47, dadurch gekennzeichnet, daß X¹ in der allgemeinen Formel Ia eine Dxmethyliminogruppe und R

und R in der allgemeinen Formel Ha Wasser stoff atome darstellen.

49. Komplex nach Anspruch 47, dadurch gekennzeichnet, daß x' in der allgemeinen Formel Ia eine Dxmethyliminogruppe und R

und R in der allgemeinen Formel Ha Methylgruppen darstellen.

030033/066 8

BAD ORIGINAL