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Allgemeiner
Stand der Technik
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein genaues und bequemes Verfahren
zur quantitativen Bestimmung von Mannose mittels eines enzymatischen
Verfahrens sowie ein Reagenz zur quantitativen Bestimmung.
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Mannose,
eine Hexose, liegt im menschlichen Blut in niedrigen Mengen vor.
In Bezug auf seine Bereitstellung ist bekannt, dass Mannose in erster
Linie durch ein Glucosestoffwechselsystem, nicht durch die Aufnahme
von Nahrungsmitteln, bereitgestellt wird. Die Mannosekonzentration
im Blut beträgt üblicherweise nur
ungefähr
0,5 mg/dl. Es ist jedoch bekannt, dass ihre Konzentration bei Diabetikern,
denen die Fähigkeit, den
Blutzucker zu regulieren, fehlt (Clinica. Chimica Acta 251; 1996
S. 91–103)
oder bei Patienten, die an Pilzinfektionen leiden (J. Clin. Microbiol.
21(6); 1985 S. 972–979)
tendenzmäßig hoch
ist, und es wurde vorgeschlagen, dass sich die Mannosekonzentration
für eine
Diagnose dieser Erkrankungen eignet.
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Bekannte
Verfahren für
die Bestimmung von Mannose sind das Verfahren der Gaschromatographie (Clin.
Chem 25; 1979; S. 1384–1387),
das Verfahren der Flüssigkeitschromatographie
(Bulletin of Japan Urology Association, 80; 1989; S. 1816–1823),
das enzymatische Verfahren (Clin. Chem 30(2); 1984 S. 293–294) und
dergleichen.
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Bei
dem enzymatischen Verfahren ist es zum Beispiel erforderlich, Glucose
zu eliminieren, da es schwierig ist, eine genaue quantitative Bestimmung
in einer Probe oder einem Material, die/das Glucose enthält, durchzuführen. Bei
dem Verfahren von Soyama et al. (Clin. Chem 30; 1084 S. 293–294) wird
die Glucose in der Probe zuerst mittels Glucoseoxidase und Katalyse
eliminiert. Anschließend
wird die Mannose in Gegenwart von Adenosintriphosphat (im Folgenden
ATP genannt) mit Hexokinase zur Reaktion gebracht, wodurch sie in
Mannose-6-phosphat
umgewandelt wird, und anschließend
mit Mannose-6- phosphatisomerase
zur Reaktion gebracht, wodurch man Fruktose-6-phosphat enthält, das
weiter mit Glucose-6-phosphatisomerase zur Reaktion gebracht wird,
wodurch man Glucose-6-phosphat enthält, und schließlich wird
in Gegenwart von oxidierendem Nicotinamidadenindinucleotid als Coenzym
(im Folgenden NAD genannt) mit Glucose-6-phosphatdehydrogenase zur
Reaktion gebracht, und anschließend
wird die Extinktion (340 nm) des gebildeten reduzierten Nicotinamidadenindinucleotids
(im Folgenden NADH genannt) mit einem Spektrophotometer gemessen,
um die Mannose quantitativ zu bestimmen.
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Als
Verbesserung des genannten enzymatischen Verfahrens wird weiterhin
ein Verfahren für
die quantitative Bestimmung von Mannose von Pitkanen et al. (Eur.
J. Clin. Chem. Clin. Biochem 35(10); 1997 S. 761–766) beschrieben, bei dem
Hexokinase und Glucose-6-phosphatisomerase mit einer Probe, in der
gleichzeitig Glucose und Fruktose vorliegen, in Gegenwart von ATP
und einem oxidierenden Nicotinamidadenindinucleotidphosphat (im
Folgenden NADP genannt) zur Reaktion gebracht werden, wodurch die
Glucose und Fruktose in Glucose-6-phosphat umgewandelt werden; anschließend wird
mit Glucose-6-phosphatdehydrogenase
versetzt, um das Glucose-6-phosphat in Gluconolakton-6-phosphat umzuwandeln;
das gebildete reduzierte Nicotinamidadenindinucleotidphosphat (im
Folgenden NADPH genannt) wird unter sauren Bedingungen mit Salzsäure abgebaut,
um den Einfluss der Glucose usw. zu eliminieren; anschließend wird
auf gleiche Weise wie oben Mannose in Gegenwart von ATP und NADP
mit Hexokinase, Mannose-6-phosphatisomerase, Glucose-6-phosphatisomerase
und Glucose-6-phosphatdehydrogenase zur Reaktion gebracht, und die
Extinktion (340 nm) des gebildeten NADPH wird gemessen.
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Bei
dem oben genannten enzymatischen Verfahren ist es jedoch schwierig,
die Bedingungen für
alle Enzyme zu optimieren, da es erforderlich ist, ein komplexes
enzymkonjugiertes System durchzuführen, bei dem unterschiedliche
Enzymreaktionen kombiniert werden. Da für die Verwendung verschiedene
teure Enzyme kombiniert werden, besteht weiterhin ein Kostenproblem.
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Außerdem ist
die Tatsache, daß diese
Verfahren gegenüber
dem Einfluss von Bestandteilen aus biologischen Proben oder Verunreinigungen
empfindlich sind, von Nachteil.
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Bei
dem Gaschromatographieverfahren und dem Flüssigkeitschromatographieverfahren
wiederum ist es erforderlich, komplizierte Abwärtsschritte wie Derivatisierung
oder Markierung, z.B. Fluoreszenzmarkierung, durchzuführen und
Spezialgerätschaft
zu verwenden, und diese Verfahren sind daher für die Behandlung von vielen
Proben ungeeignet.
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Kurze Darstellung
der Erfindung
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Die
Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung
eines Verfahrens zur quantitativen Bestimmung von Mannose und eines
Reagenzes für
die quantitative Bestimmung, das es ermöglicht, die Behandlung von
vielen Proben auf genaue und bequeme Weise durchzuführen.
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Um
die oben genannte Aufgabe zu lösen
stellt die vorliegende Erfindung in einem Aspekt ein Verfahren zur
quantitativen Bestimmung von Mannose bereit, umfassend das zur Reaktion
bringen einer Probe mit einem Glucose-Eliminator, das zur Reaktion
bringen von Mannose in der Probe mit einem Enzym, das in der Lage
ist, Mannose durch Dehydrierung in Gegenwart eines Elektronenakzeptors
zu oxidieren und quantitative Bestimmung einer reduzierten Form
des Elektronenakzeptors, wobei der Glucose-Eliminator in der Lage
ist, gegebenenfalls in der Probe vorhandene Glucose in eine Struktur
umzuwandeln, die nicht mit dem Enzym reaktionsfähig ist.
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Bei
dem oben genannten Verfahren wird, wenn die Probe zusätzlich zu
Mannose auch Glucose enthält,
die Glucose in der Probe vor der Reaktion mit dem Enzym durch den
Glucose-Eliminator in eine Struktur, die nicht mit dem Enzym reaktionsfähig ist,
umgewandelt.
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Bei
dem oben genannten Verfahren ist das Enzym vorzugsweise eine Glucosedehydrogenase,
die der Enzymnummer EC 1.1.1.119 zugeordnet ist, stärker bevorzugt
eine Aldohexosedehydrogenase, die aus einem Mikroorganismus stammt,
der zur Gattung Gluconobacter gehört. Bezüglich der Probe wird bevorzugt,
dass die Probe zumindest eine biologische Probe ausgewählt aus
der Gruppe Blut, Serum, Plasma, Zerebrospinalflüssigkeit und Urin ist oder
eine Probe, die aus dieser biologischen Probe hergestellt wird.
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In
einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Reagenz
zur quantitativen Bestimmung von Mannose bereit, das ein Enzym,
das in der Lage ist Mannose durch Dehydrieren in Gegenwart eines
Elektronenakzeptors zu oxidieren, einen Elektronenakzeptor, der
für das
Enzym geeignet ist, und einen Glucose-Eliminator umfasst.
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Das
Enzym ist vorzugsweise eine Glucosedehydrogenase, die der Enzymnummer
EC 1.1.1.119 zugeordnet ist, stärker
bevorzugt eine Aldohexosedehydrogenase, die aus einem Mikroorganismus
stammt, der zur Gattung Gluconobacter gehört. Weiterhin enthält der Glucose-Eliminator
vorzugsweise ein Glucose in 6-Position
phosphorylierendes Enzym, und Adenosintriphosphat. Weiterhin ist
der Elektronenakzeptor vorzugsweise NADP als Coenzym.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung ist es, da ein Enzym verwendet wird, das direkt mit Mannose
reagiert und in der Lage ist, Mannose durch Dehydrieren zu oxidieren,
und ohne dass die Messung über
ein aufwendiges enzymkonjugiertes System durchgeführt wird,
möglich,
Mannose bequem quantitativ zu bestimmen und die Behandlung von vielen
Proben durchzuführen.
Weiterhin ist es, da ein Glucose-Eliminator verwendet wird, da die
Messung kaum durch die Glucose in der Probe beeinflusst wird, möglich, Mannose
genau quantitativ zu bestimmen.
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Kurze Erklärung der
Zeichnungen
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1 ist
ein Graph, der die Ergebnisse der Messung von Mannoselösungen mit
unterschiedlichen Konzentrationen durch Verwendung eines ersten
Reagenzes, das einen Elektronenakzeptor enthält und eines zweiten Reagenzes,
das Aldohexosedehydrogenase enthält,
zeigt.
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2 ist
ein Graph, der die Ergebnisse der Messung von Mannoselösungen mit
unterschiedlichen Konzentrationen durch Verwendung eines ersten
Reagenzes, das einen Elektronenakzeptor und einen Glucose-Eliminator
enthält
und eines zweiten Reagenzes, das Aldohexosedehydrogenase enthält, zeigt.
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3 ist
ein Graph, der die Ergebnisse der Messung von Mannoselösungen mit
einer konstanten Konzentration sowie Glucose in unterschiedlichen
Konzentrati onen durch Verwendung eines ersten Reagenzes, das einen
Elektronenakzeptor und einen Glucose-Eliminator enthält und eines
zweiten Reagenzes, das Aldohexosedehydrogenase enthält, zeigt.
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Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
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Bei
der vorliegenden Erfindung unterliegt die (Prüf)-Probe, so lange die Mannosekonzentration
gemessen werden soll, keinen bestimmten Einschränkungen. Es wird jedoch bevorzugt,
eine biologische Probe, wie Blut, Serum, Plasma, Zerebrospinalflüssigkeit
und Urin oder eine Probe, die aus diesen biologischen Proben hergestellt
wird, zu verwenden, zum Beispiel eine Probe, die mit verschiedenen
Verfahren vorbehandelt worden ist, so dass die Mannose leicht bestimmt
werden kann, usw. Als solche Vorbehandlung zum Beispiel eine Behandlung,
bei der die Glucose zuerst aus einer Probe, in der gleichzeitig
Glucose vorliegt, zuerst entfernt oder eliminiert wird.
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Bezüglich des
bei der vorliegenden Erfindung verwendeten Enzyms unterliegt dieses,
insofern als es sich um ein Enzym handelt, das in der Lage ist,
Mannose durch Dehydrieren in Gegenwart eines Elektronenakzeptors
zu oxidieren, keiner bestimmten Einschränkung (im Folgenden „Mannosedehydrogenase" genannt). Vorzugsweise
zu erwähnen
ist jedoch ein Enzym, dem die Enzymnummer EC 1.1.1.119 zugeordnet
ist. So können
zum Beispiel im Einzelnen die von Acetobacter suboxydans erhältliche
NADP-abhängige
Glucosedehydrogenase, wie sie in OKAMOTOs Schrift (J. Biochem. 53(5)
1963 S. 348–353)
beschrieben ist, die von Gluconobacter cerinus erhältliche
NADP-abhängige
Aldohexosedehydrogenase, wie sie in der Schrift AVIGAD et al. (J.
Biol. Chem. 243(8) 1968 S. 1936–1941)
beschrieben ist, die in der Schrift von DAHMS et al. (J. Biol. Chem.
247(7) 1972 S. 2222–2227)
beschriebene NAD-abhängige
Aldohexosedehydrogenase und ähnliche erwähnt werden.
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Das
oben genannte Enzym ist insbesondere Aldohexosedehydrogenase, die
aus einem Mikroorganismus stammt, der zur Gattung Gluconobacter
gehört.
Als Mikroorganismus, der zur Gattung Gluconobacter gehört, sind
zum Beispiel Gluconobacter asaii (G. assai) IFO 3276, Gluconobacter
cerinus (G. cerinus) IFO 3267, Gluconobacter frateurii (G. frateurii)
IFO 3264, Gluconobacter oxydans (G. oxy dans) IFO 14819 und dergleichen
zu erwähnen.
Das Enzym kann dadurch erhalten werden, dass man solch einen Mikroorganismus
züchtet
und die Zellen gewinnt und anschließend die Zellen durch Behandlung
mit Ultraschallwellen oder dergleichen zerstört und die gebildete zerstörte Lösung wird,
falls erforderlich, dadurch aufgereinigt, dass man Säulenchromatographie
wie Ammoniumsulfatfraktionierung, Ionenaustauschchromatographie,
hydrophobe Chromatographie, Hydroxyapatitgel- und Gelfiltration
kombiniert.
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Die
verwendete Mannosedehydrogenasekonzentration ist auf keine bestimmten
Grenzen beschränkt, beträgt jedoch
vorzugsweise 0,1 bis 100 Einheiten/Liter, stärker bevorzugt 1 bis 10 Einheiten/Liter.
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Bei
der vorliegenden Erfindung können
zweckmäßigerweise
als Elektronenakzeptor ein oder zwei oder mehr Coenzyme wie NAD
und NADP, Sauerstoff, Phenazinmethosulfat, Dichlorphenol-Indophenol,
Cyanoferrat(III)-Verbindungen, Tetrazoliumsalze und dergleichen
gewählt
werden. Besonders bevorzugt als Coenzym ist NADP. Die verwendete
Elektronenakzeptorkonzentration liegt vorzugsweise im Bereich von
0,1 bis 10 mmol/Liter, besonders bevorzugt 0,5 bis 2 mmol/Liter.
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Um
die reduzierte Form des Elektronenakzeptors quantitativ zu bestimmen
kann weiterhin ein farbgebendes Reagenz, das durch Reduktion des
Elektronenakzeptors eine Farbe entwickelt, verwendet werden. Das
Farbe entwickelnde Reagenz kann je nach dem zu verwendenden Elektronenakzeptor
entsprechend ausgewählt
werden. Um zum Beispiel NADPH als reduzierte Form des Coenzyms NADP
quantitativ zu bestimmen, kann ein Verfahren erwähnt werden, bei dem ein Tetrazoliumsalz
gemeinsam mit Phenazinmethosulfat oder Diaphorase vorliegen gelassen
wird, und der gebildete Formazanfarbstoff wird quantitativ colorimetrisch bestimmt.
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Da
die bei der vorliegenden Erfindung verwendete Mannosedehydrogenase
nicht nur gegenüber
Mannose, sondern auch gegenüber
Glucose eine Aktivität
zeigt, wird sie weiterhin vermutlich auch durch Glucose beeinflusst,
insbesondere dann, wenn die Mannose in den biologischen Proben wie
Serum oder Plasma zu bestimmen ist. Um die Messgenauigkeit bei der
biologischen Probe zu erhöhen, wird
daher auch ein Glucose-Eliminator verwendet. Als Glucose-Eliminator
verwendet man vorzugsweise denjenigen, der ATP und ein Glucose in
6-Position phosphorylierendes Enzym enthält.
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Als
Glucose in 6-Position phosphorylierendes Enzym sind Glucokinase,
Hexokinase und dergleichen zu erwähnen. Es besteht keine bestimmte
Einschränkung,
so lange es EC 2.7.1.2 oder EC 2.7.1.1 zugeordnet ist, und es können kommerziell
verfügbare
Enzyme verwendet werden. Glucokinase mit einer hohen Spezifität für Glucose
kann jedoch vorzugsweise verwendet werden. Ihre Menge hängt von
der Glucosemenge in der Probe ab, beträgt jedoch üblicherweise im Bereich von
0,1 bis 50 u/ml. Weiterhin hängt
die für
die Phosphorylierung der Glucose erforderliche ATP-Menge von der
Glucosemenge in der Probe ab, liegt jedoch im Allgemeinen im Bereich
von 1 bis 20 mM. Weiterhin sind als das die Phosphorylierung von
Glucose beschleunigende Mittel im Allgemeinen Magnesiumionen von
z.B. einem anorganischen oder organischen Salz in einer Menge von
ungefähr
5 bis 50 mM enthalten. Die Glucosephosphorylierung zwecks Elimination
der Glucose wird bei 20 bis 50°C,
vorzugsweise 25 bis 37°C,
ungefähr
10 min. lang unmittelbar nach der Zugabe in einer Pufferlösung mit
einem pH von 6 bis 10 durchgeführt.
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Als
Pufferlösung,
die sich für
die vorliegende Erfindung eignet, können allgemein verwendbare
Pufferlösungen
mit einem pH von 6 bis 10, wie eine Phosphatpufferlösung, Glycinpufferlösung, Tris-Salzsäure-Pufferlösung, Pufferlösung nach
Good sowie Borsäurepufferlösung verwendet
werden.
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Als
Reagenz für
die quantitative Bestimmung von Mannose gemäß der vorliegenden Erfindung
können
der Glucose-Eliminator und das Reagenz für die quantitative Bestimmung
getrennt hergestellt und für
die Verwendung zusammengegeben werden. Genauer gesagt kann es aus
zwei Reagenzien zusammengesetzt sein, also einem ersten Reagenz,
das den Elektronenakzeptor und den Glucose-Eliminator enthält und einem zweiten Reagenz,
das die Mannosedehydrogenase enthält.
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Das
Reagenz für
die quantitative Bestimmung von Mannose wird einer biologischen
Probe zwecks Reaktion zugesetzt, und die Menge an reduziertem Elektro nenakzeptor
in der Reaktionslösung
wird dann z.B. durch Messen der Extinktion bei der für die reduzierte
Form des Elektronenakzeptors spezifischen Extinktionswellenlänge oder
durch Messen der Farbentwicklungsintensität eines eine Farbe entwickelnden
Reagenzes, das durch Reduktion des Elektronenakzeptors eine Farbe
entwickelt, gemessen.
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Die
vorliegende Erfindung wird im Folgenden unter spezifischer Bezugnahme
auf Beispiele beschrieben. Es ist jedoch zu erwähnen, dass die vorliegende
Erfindung keinesfalls hierauf beschränkt ist.
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Herstellungsbeispiel
für das
Enzym (Herstellung von Aldohexosedehydrogenase aus Gluconobacter asaii.
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Gluconobacter
asaii (IFO 3276) wurde auf ein Medium, das 0,5% Hefeextrakt und
1% Fruktose enthielt, inokuliert und 24 Stunden bei 28°C am Schüttler gezüchtet, wonach
man Zellen mittels Zentrifuge abtrennte. Die Zeilen wurden in einer
20 mM Phosphatpufferlösung
(pH 7) suspendiert und unter Eiskühlung mit einem Ultraschallgerät behandelt,
und die aufgebrochene Lösung
wurde anschließend
zentrifugiert, wodurch man die Zellreste abtrennte und zu einer
Rohenzymlösung
gelangte.
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Diese
Rohenzymlösung
wurde mit Ammoniumsulfatpulver versetzt, das darin gelöst wurde,
so dass die Ammoniumsulfatmenge 30% der Sättigungsmenge entsprach. Die
gefällten
Proteine wurden durch Zentrifugieren entfernt. Der erhaltene Überstand
wurde durch eine Butyl-Toyopearl-Säule durchlaufen gelassen, um die
Enzyme daran zu absorbieren, und diese wurden anschließend mit
einer 20 mM Phosphatpufferlösung
(pH 7), die Ammoniumsulfat in einer Menge von 30% bis 0% Sättigung
enthielt, in Form eines linearen Gradienten eluiert.
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Die
Enzymaktivität
der entsprechenden Eluatfraktionen wurden gemessen und die Fraktionen
mit Aktivität
wurden aufbewahrt. Die Fraktionen mit Aktivität wurden zum Entsalzen mit
einer 20 mM Phosphatpufferlösung
(pH 7) dialysiert, und das Dialysat wurde anschließend durch
eine DEAE-Toyopearl-Säule
durchlaufen gelassen, um die Enzyme daran absorbieren zu lassen,
und die Enzyme wurden mit einer 20 mM Phosphatpufferlösung (pH
7), die 0 bis 0,25 M NaCl enthielt, in Form eines linearen Gradienten
eluiert.
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Die
Enzymaktivität
der entsprechenden Eluatfraktionen wurde bestimmt und Fraktionen
mit Aktivität wurden
aufbewahrt. Die Fraktionen mit Aktivität wurden zum Entsalzen mit
einer 20 mM Phosphatpufferlösung (pH
7) dialysiert und das Dialysat wurde anschließend durch eine Hydroxyapatitsäule durchlaufen
gelassen, um Enzyme daran zu adsorbieren, und die Enzyme wurden
mit einer 20 bis 150 mM Phosphatpufferlösung (pH 7) in Form eines linearen
Gradienten eluiert. Die Enzymaktivität der entsprechenden Eluatfraktionen
wurden gemessen und Fraktionen mit Aktivität wurden aufbewahrt, und dieses
Produkt wurde als aufgereinigte Enzymlösung bezeichnet.
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Beispiel 1 (Vergleichsbeispiel)
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Unter
Verwendung der in dem obigen Herstellungsbeispiel für das Enzym
erhaltenen Aldohexosedehydrogenase und einem Coenzym NADP als Elektronenakzeptor
wurde ein Reagenz für
die quantitative Bestimmung umfassend ein erstes Reagenz und ein
zweites Reagenz wie unten angegeben hergestellt.
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Erstes Reagenz (pH 8,5):
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- 125 mM Tris-Salzsäure-Pufferlösung
- 1,25 mM NADP
- 0,75 mM WST-1 (Handelsname, Hersteller: K.K. Dojin Kagaku Kenkyusho)
- 1,25% Tween 20 (Polyoxyethylen(20)sorbitanmonolaurat)
- 6,25 U/ml Diaphorase
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Zweites Reagenz (pH 7,0):
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- 20 mM Phosphatpufferlösung
- 23 U/ml Aldohexosedehydrogenase
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Mit
diesem Reagenz wurden Mannoselösungen
mit unterschiedlichen Konzentrationen (0 bis 50 μg/ml) wie unten angegeben gemessen.
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8
ml von jeder der Mannoselösungen
mit unterschiedlichen Konzentrationen wurden mit 256 μl des ersten
Reagenzes versetzt und es wurde 5 min. lang bei 37°C reagieren
gelassen, wonach mit 56 μl
des zweiten Reagenzes versetzt wurde und ebenfalls 5 min. bei 37°C reagieren
gelassen wurde. Anschließend
wurde die Extinktion mit einem zweipunkt-Assay bei einer Hauptwellenlänge von
450 nm und einer Nebenwellenlänge
von 700 nm gemessen. Diese Schritte wurden mit einem Analyseautomaten
von Hitachi, Modell 7150, durchgeführt. Die Ergebnisse sind in 1 dargestellt.
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Aus 1 war
ersichtlich, dass bei der Mannosekonzentration von 0 bis 50 μg/ml eine
lineare Lichtextinktion erhalten wurden, und dass es möglich ist,
eine genaue quantitative Mannosebestimmung in einem niedrigen Konzentrationsbereich
durchzuführen.
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Beispiel
2 (quantitative Bestimmung von Mannose mit einem Reagenzsystem,
das eine Kombination mit einem Glucose-Eliminator enthält).
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Unter
Verwendung der in dem obigen Herstellungsbeispiel für das Enzym
erhaltenen Aldohexosedehydrogenase und einem Coenzym NADP als Elektronenakzeptor
sowie Glucokinase und ATP als Glucose-Eliminatoren wurde ein Reagenz
für die
quantitative Bestimmung umfassend ein erstes Reagenz und ein zweites Reagenz
wie unten angegeben hergestellt.
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Erstes Reagenz (pH 8,5):
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- 125 mM Tris-Salzsäure-Pufferlösung
- 1,25 mM NADP
- 0,75 mM WST-1 (Handelsname, Hersteller: K.K. Dojin Kagaku Kenkyusho)
- 1,25% Tween 20 (Polyoxyethylen(20)sorbitanmonolaurat)
- 6,25 U/ml Diaphorase
- 12,5 U/ml Glucokinase
- 10 mM ATP
- 2 mM Magnesiumacetat
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Zweites Reagenz (pH 7,0):
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- 20 mM Phosphatpufferlösung
- 23 U/ml Aldohexosedehydrogenase
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Zuerst
wurde wie in Beispiel 1 das Reagenz mit jeder der Mannoselösungen in
den unterschiedlichen Konzentrationen (0 bis 50 μg/ml) reagieren gelassen und die
Extinktion der Reaktionslösungen
wurden gemessen. Die Ergebnisse sind in 2 dargestellt.
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Dann
wurde das oben genannte Reagenz mit jeder der Lösungen, die Mannose in einer
konstanten Konzentration (ungefähr
10 μg/ml)
sowie Glucose in unterschiedlichen Konzentrationen (0 bis 1000 mg/dl)
enthielten, umgesetzt, und die Extinktion der Reaktionslösungen wurde
gemessen. Die Ergebnisse sind in 3 dargestellt.
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Aus 2 ging
hervor, dass bei einer Mannosekonzentration von 0 bis 50 μg/ml eine
lineare Lichtextinktion erhalten wurde und dass es möglich ist,
eine genaue quantitative Mannosebestimmung auch in einem Reagenzsystem,
bei dem eine Kombination mit einem Glucose-Eliminator verwendet
wird, durchzuführen.
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Aus 3 ging
weiterhin hervor, dass auch dann, wenn die Glucosekonzentration
in der Probe von 0 bis 1000 mg/dl schwankt, eine konstante Extinktion
in Abhängigkeit
von der Mannosekonzentration erzielt werden kann. Aus diesem Ergebnis
wird klar, dass auch bei einer Probe, die Glucose in hoher Konzentration enthält, die
Mannose in der Probe genau quantitativ bestimmt werden kann.
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Beispiel 3
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Mannose
wurde mit dem Reagenz von Beispiel 2 bezüglich Proben, die dadurch hergestellt
wurden, dass man jeweils fünf
Arten von Serum (Serum Nr. 1 bis 5) im Verhältnis Volumenteil zu 9 Volumenteile
mit einer wässrigen
Mannose-Lösung in
einer Konzentration von 100 μg/ml
versetzt sowie als Kontrolle Proben, die statt mit der wässrigen
Mannoselösung
mit Wasser versetzt wurden, bestimmt. Mit Hilfe der Messwerte und einer
in Beispiel 2 erhaltenen Eichkurve (2) wurden
die Mannosemengen quantitativ bestimmt und die Wiederfindungsraten
der stöchiometrischen
Mengen der zugesetzten Mannose wurden erhalten. Die Ergebnisse sind
in Tabelle 1 angegeben.
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Aus
den Ergebnissen der Tabelle I geht hervor, dass in Bezug auf die
stöchiometrische
Menge zugesetzter Mannose (10 μg/ml)
die Wiederfindungsrate ausgezeichnet ist und dass es möglich ist,
Mannose in dem Serum genau quantitativ zu bestimmen.
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Wie
oben erwähnt
wird erfindungsgemäß die Probe,
die Mannose enthält,
mit einem Elektronenakzepor versetzt, und damit wird eine Mannosedehydrogenase
umgesetzt, wodurch die Mannosedehydrogenase mit der Mannose direkt
unter Oxidation der Mannose reagiert und gleichzeitig direkt den
Elektronenakzeptor reduziert und dementsprechend kann dadurch, dass
man den so gebildeten reduzierten Elektronenakzeptor misst, Mannose
mit hoher Empfindlichkeit genau quantitativ bestimmt werden. Außerdem kann
dadurch, dass das Reaktionssystem einfach ist, die vorliegende Erfindung
leicht auf verschiedene Analyseautomaten angewandt werden und eignet
sich für
die Behandlung von vielen Proben.
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Weiterhin
wird dadurch, dass man eine Kombination mit einem Glucose-Eliminator dazu verwendet, um
die gleichzeitig in der Probe vorhandene Glucose zu reduzieren,
die Probe derart, dass der Einfluss der Glucose im Wesentlichen
vernachlässigt
werden kann, wodurch eine hohe Messgenauigkeit auch in biologischen
Proben in Serum oder Plasma mittels einer einfachen Vorgehensweise
erzielt werden kann.
