ES2382397T3 - Procedimiento para medir 1,5-anhidroglucitol en sangre completa - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para medir electroquímicamente 1,5-anhidroglucitol en una muestra de sangre completa, que comprende las etapas de: eliminación o conversión de la glucosa y/o un derivado de la misma en la muestra de sangre completa que interfiere con la medición, sin separar las células sanguíneas en la muestra de sangre completa, permitir que actúe una enzima para medir 1,5-anhidroglucitol sobre el 1,5-anhidroglucitol de la muestra de sangre completa, sin separar las células sanguíneas; y medición electroquímica del 1,5-anhidroglucitol.

Description

Procedimiento para medir 1,5-anhidroglucitol en sangre completa.

5 Campo tecnico La presente invenci6n se refiere a un procedimiento para medir 1,5-anhidroglucitol en sangre que esta sujeto a interferencia por glucosa y/o un derivado de la misma, concretamente, un procedimiento para medir electroqufmicamente 1,5-anhidroglucitol en sangre, caracterizado por que como muestra se utiliza sangre completa, y no es necesario separar las celulas sangufneas, se describe adicionalmente una microplaca detectora utilizado para la medici6n, y un kit para medir 1,5-anhidroglucitol que incluye la microplaca detectora .

Tecnica anterior

15 En los ultimos anos, el numero de pacientes diabeticos ha ido en aumento a medida que la dieta se ha vuelto mas rica. Para evitar complicaciones en los pacientes diabeticos, los niveles de azucar en sangre deben mantenerse en niveles cercanos a los de los individuos sanos, y se utilizan ampliamente dispositivos para la automedici6n de los niveles de azucar en sangre de manera que los propios pacientes puedan monitorizar los niveles de azucar en sangre en sus hogares. Sin embargo, puesto que los niveles de azucar en sangre varfan dependiendo de la comida, y la medici6n tiene que hacerse con frecuencia, los pacientes sufren una pesada carga. Tambien es diffcil para los pacientes interpretar correctamente los valores medidos debido a la falta de conocimiento, y no resulta facil controlar rigurosamente los niveles de azucar en sangre. Mientras, puesto que el 1,5-anhidroglucitol no se ve afectado por la comida y refleja el control de azucar en sangre

25 en pacientes diabeticos durante la ultima semana, los pacientes diabeticos pueden entender correctamente su control de azucar en sangre mediante una medici6n "una vez por semana" solos en casa. Un kit de automedici6n de 1,5-anhidroglucitol proporcionarfa una gran ventaja a los pacientes, pero los procedimientos convencionales para medir 1,5-anhidroglucitol utilizando suero o plasma como muestra requieren la separaci6n de las celulas sangufneas y no son adecuados para la automedici6n porque la medici6n requiere una gran cantidad de muestra. Por lo tanto, no se han creado kits de automedici6n de 1,5-anhidroglucitol, que incluyen aquellos que utilizan como muestra una cantidad traza de sangre completa tal cual. Los procedimientos de medici6n de 1,5-anhidroglucitol descritos en los documentos de patente 1 a 9 utilizan suero o plasma como muestra, no sangre completa, y no implican la medici6n electroqufmica.

35 Ademas, cuando se utiliza una muestra de sangre completa para el kit de 1,5AG para animales (Nippon Kayaku Co., Ltd.) distribuido por Wako Pure Chemical Industries, Ltd., la sangre se hemoliza anadiendo agua purificada o una soluci6n acuosa de acido etilendiaminotetraacetico (EDTA) 10 mM y se centrifuga adicionalmente, el sobrenadante se trata con una columna, y el 1,5-anhidroglucitol se mide mediante un procedimiento colorimetrico que utiliza un pigmento. En otras palabras, este procedimiento no es un procedimiento para medir electroqufmicamente 1,5-anhidroglucitol utilizando como muestra sangre completa tal cual, sin separar las celulas sangufneas. La raz6n para utilizar convencionalmente suero o plasma como muestra, no sangre completa, es que la glucosa tambien esta contenida en las celulas sangufneas. Incluso cuando se anade un reactivo a la sangre completa para

45 eliminar o convertir la glucosa, la glucosa permanece en las celulas sangufneas sin ser eliminada o convertida. Puesto que la glucosa se libera a traves de la membrana celular en la etapa de medici6n de 1,5-anhidroglucitol en sangre, no puede eliminarse completamente la interferencia producida por la glucosa. En una reacci6n para detectar 1,5-anhidroglucitol en sangre, se espera una interferencia producida por la hemoglobina en los eritrocitos con capacidad de oxidaci6n-reducci6n. Hasta ahora, no se conoce un procedimiento para medir 1,5-anhidroglucitol en sangre que utilice sangre completa convirtiendo o eliminando enzimaticamente la glucosa con antelaci6n, sin separar las celulas sangufneas. Ademas, los procedimientos para medir electroqufmicamente 1,5-anhidroglucitol se describen en el DOCUMENTO NO PATENTE 1 y en los DOCUMENTOS DE PATENTE 10 y 11. Sin embargo, el DOCUMENTO NO PATENTE 1

55 describe un procedimiento para medir 1,5-anhidroglucitol en orina utilizando un detector enzimatico compuesto de un electrodo de per6xido de hidr6geno y una membrana con enzimas inmovilizadas. Sin embargo, no se menciona la medici6n de 1,5-anhidroglucitol en sangre completa, en la que coexisten glucosa y similares. En el DOCUMENTO DE PATENTE 10, el 1,5-anhidroglucitol se mide por amperometrfa utilizando una deshidrogenasa y metosulfato de fenacina como aceptor de electrones. Sin embargo, s6lo se mencionan ejemplos para el estandar de referencia del 1,5-anhidroglucitol, y no existe ninguna descripci6n acerca de la medici6n en sangre completa. En el DOCUMENTO DE PATENTE 11, se deja actuar a una enzima con la capacidad de oxidar el 1,5-anhidroglucitol, y se mide electroqufmicamente el per6xido de hidr6geno producido utilizando un electrodo de per6xido de hidr6geno. Sin embargo, en esta medici6n tambien se utiliza suero, y este no es un procedimiento de medici6n que utilice sangre completa.

65 Mientras, el 1,5-anhidroglucitol es un compuesto que es una glucosa reducida en la posici6n de 1 y tiene una estructura qufmica muy similar a la de la glucosa. Por lo tanto, muchas de las enzimas utilizadas para medir 1,5-anhidroglucitol tambien reaccionan con la glucosa. La glucosa en sangre es 20 veces mas abundante (o mas) que el 1,5-anhidroglucitol. Por lo tanto, para medir 1,5-anhidroglucitol, la glucosa debe eliminarse o convertirse de alguna manera para que la glucosa no reaccione con las enzimas para medir 1,5-anhidroglucitol. Ademas, cuando

5 los derivados de la glucosa producidos por esta conversi6n reaccionan con las enzimas para medir 1,5-anhidroglucitol, estos derivados tambien deben eliminarse o convertirse.

En el DOCUMENTO DE PATENTE 1, la glucosa se elimina o se convierte por oxidaci6n de la glucosa con glucosa oxidasa o por fosforilaci6n de la glucosa con hexoquinasa, en el DOCUMENTO DE PATENTE 2 por oxidaci6n de la glucosa con glucosa oxidasa y gluconolactonasa o glucosa deshidrogenasa y gluconolactonasa, en los DOCUMENTOS DE PATENTE 3 y 4 por conversi6n de la glucosa en fructosa-1,6-difosfato con hexoquinasa, fosfohexosa isomerasa, y 6-fosfofructoquinasa o glucosa isomerasa, fructoquinasa, y 6-fosfofructoquinasa, en el DOCUMENTO DE PATENTE 5 por fosforilaci6n de la glucosa con glucoquinasa o hexoquinasa, y en el DOCUMENTO DE PATENTE 6 por fosforilaci6n de la glucosa con una enzima que fosforila la glucosa a

15 glucosa-6-fosfato y, a continuaci6n se mide el 1,5-anhidroglucitol. En estos documentos, la glucosa se convierte en glucono-1,5-lactona, glucosa-6-fosfato, acido gluc6nico, fructosa-6-fosfato, fructosa-1,6-difosfato, o similares. Hasta ahora, sin embargo, no se conoce la medici6n eliminando o convirtiendo la glucosa en sangre completa con una enzima y a continuaci6n cuantificando electroqufmicamente el 1,5-anhidroglucitol en sangre completa con una enzima.

DOCUMENTO DE PATENTE 1: Patente japonesa nO 2983015 DOCUMENTO DE PATENTE 2: JP-A-2001-78797 DOCUMENTO DE PATENTE 3: Patente japonesa nO 3170320 DOCUMENTO DE PATENTE 4: Patente Japonesa nO 3217180

25 DOCUMENTO DE PATENTE 5: JP-A-2001-116756 DOCUMENTO DE PATENTE 6: Patente japonesa nO 2872983 DOCUMENTO DE PATENTE 7: JP-A-63-185397 DOCUMENTO DE PATENTE 8: JP-A-10-191998 DOCUMENTO DE PATENTE9: JP-A-8-70893 DOCUMENTO DE PATENTE 10: JP-A-7-67697 DOCUMENTO DE PATENTE 11: JP-A-62-79780 DOCUMENTO DE PATENTE 12: JP-A-5-304997 DOCUMENTO DE PATENTE 13: JP-A-63-22185 DOCUMENTO DE PATENTE 14: JP-A-2-268679

35 DOCUMENTO DE PATENTE 15: JP-A-2000-135079 DOCUMENTO DE PATENTE 16: JP-A-11-18760 DOCUMENTO DE PATENTE 17: JP-A-2000-175698 DOCUMENTO DE PATENTE 18: JP-A-10-179140 DOCUMENTO NO PATENTE 1: Biomed. Chromatogr., Vol.7, p.41 (1993)

Divulgacian de la invencian

Problemas a ser resueltos por la invenci6n

45 Para las pruebas de laboratorio clfnico, recientemente se han implementado de manera creciente la medici6n rapida de diversos objetos de ensayo a pie de cama o en un centro de atenci6n al paciente denominado Point of Care Testing y la medici6n de los niveles de azucar en sangre por los propios pacientes en el hogar. Puesto que en tales casos el uso de una centrffuga o similar para la obtenci6n de suero o plasma resulta complicado y requiere tiempo, su uso en el entorno clfnico real resulta diffcil. En concreto, en la medici6n por los propios pacientes en casa, se utiliza como muestra una cantidad traza, tal como no mas de varias decenas de 1l de sangre recogida utilizando un dispositivo de lanceta y un dispositivo de recogida de muestras. Por lo tanto, para la obtenci6n de suero no pueden emplearse procedimientos de medici6n que utilicen una centrffuga. De esta manera, se esta a la espera de un procedimiento para medir 1,5-anhidroglucitol que utilice como muestra sangre completa tal cual.

55 Medios para la soluci6n de los problemas

Los inventores de la presente invenci6n llevaron a cabo diversas investigaciones con el fin de resolver los problemas anteriormente indicados. Como resultado, descubrieron un procedimiento para medir electroqufmicamente 1,5-anhidroglucitol en sangre utilizando como muestra sangre completa tal cual, y lograron la presente invenci6n.

Esto es, la presente invenci6n se refiere a lo siguiente.

(1) Un procedimiento para medir 1,5-anhidroglucitol en sangre completa, que comprende la etapa de eliminaci6n o conversi6n de la glucosa y/o un derivado de la misma que interfiere con la medici6n y la etapa posterior de medici6n

65 del 1,5-anhidroglucitol, en el que se utiliza sangre completa tal cual, sin separar las celulas sangufneas, eliminando o convirtiendo la glucosa y/o un derivado de la misma, y ademas se deja actuar una enzima para medir 1,5-anhidroglucitol, sin separar las celulas sangufneas, para medir electroqufmicamente 1,5-anhidroglucitol.

(2) El procedimiento para medir 1,5-anhidroglucitol de acuerdo con el punto (1) anteriormente indicado, en el que la

enzima para medir 1,5-anhidroglucitol es una oxidorreductasa. 5

(3)

El procedimiento para medir 1,5-anhidroglucitol de acuerdo con el punto (2) anteriormente indicado, en el que la oxidorreductasa es piranosa oxidasa, L-sorbosa oxidasa, o 1,5-anhidroglucitol deshidrogenasa.

(4)

El procedimiento para medir 1,5-anhidroglucitol de acuerdo con el punto (3) anteriormente indicado, en el que la oxidorreductasa se deriva de los generos Pseudomonas o Agrobacterium.

(5)

El procedimiento para medir 1,5-anhidroglucitol de acuerdo con cualquiera de los puntos (1) a (4) anteriormente indicados, en el que el 1,5-anhidroglucitol se mide electroqufmicamente en presencia de un mediador redox.

15 (6) El procedimiento para medir 1,5-anhidroglucitol de acuerdo con el punto (5) anteriormente indicado, en el que el mediador redox es un complejo de osmio, un compuesto de quinona, un compuesto de ferroceno, un compuesto de fenotiacina, un compuesto de fenoxacina, un compuesto de fenacina, un compuesto de indofenol, un compuesto difenilamina, o un compuesto fen6lico.

(7) El procedimiento para medir 1,5-anhidroglucitol de acuerdo con cualquiera de los puntos (1) a (6) anteriormente indicados, en el que la glucosa y/o un derivado de la misma se elimina o se convierte con una enzima a partir de sangre completa tal cual, sin separar las celulas sangufneas.

(8) El procedimiento para medir 1,5-anhidroglucitol de acuerdo con cualquiera de los puntos (1) a (7) anteriormente 25 indicados, en el que el 1,5-anhidroglucitol se mide electroqufmicamente en presencia de un estabilizador.

(9)

El procedimiento para medir 1,5-anhidroglucitol de acuerdo con el punto (8) anteriormente indicado, en el que el estabilizador es acido 2-sulfobenz6ico o acido 3-sulfobenz6ico.

(10)

El procedimiento para medir 1,5-anhidroglucitol de acuerdo con cualquiera de los puntos (1) a (9) anteriormente indicados, en el que el 1,5-anhidroglucitol se mide electroqufmicamente mediante amperometrfa, coulometrfa, o voltametrfa cfclica.

(11)

El procedimiento para medir 1,5-anhidroglucitol de acuerdo con cualquiera de los puntos (1) a (10)

35 anteriormente indicados, en el que el 1,5-anhidroglucitol se mide electroqufmicamente utilizando un electrodo que tiene un electrodo de trabajo para medir 1,5-anhidroglucitol que contiene una oxidorreductasa para medir 1,5-anhidroglucitol y un mediador redox, y un contraelectrodo.

(12)

El procedimiento para medir 1,5-anhidroglucitol de acuerdo con el punto (11) anteriormente indicado, en el que el 1,5-anhidroglucitol se mide electroqufmicamente utilizando un electrodo diferencial.

(13)

El procedimiento para medir 1,5-anhidroglucitol de acuerdo con el punto (12) anteriormente indicado, en el que el electrodo diferencial es un electrodo que tiene un electrodo de trabajo para medir 1,5-anhidroglucitol que contiene una oxidorreductasa para medir 1,5-anhidroglucitol y un mediador redox, un electrodo de trabajo para medir un

45 blanco que contiene un mediador redox pero no contiene una oxidorreductasa para medir 1,5-anhidroglucitol, y un contraelectrodo.

Efecto ventajoso de la invenci6n

De acuerdo con la presente invenci6n, puesto que el 1,5-anhidroglucitol puede medirse electroqufmicamente utilizando como muestra sangre completa, y no es necesario separar las celulas sangufneas, la medici6n se simplifica sin requerir el uso de una centrffuga o similar, permitiendo que los propios pacientes realicen las mediciones en el hogar.

55 Mejor modo de llevar a cabo la invencian

En lo sucesivo, la presente invenci6n se explicara en detalle. La presente invenci6n es un procedimiento para medir electroqufmicamente 1,5-anhidroglucitol en sangre que esta sujeto a interferencia por glucosa, caracterizado por que en la medici6n de 1,5-anhidroglucitol en sangre se utiliza como muestra sangre completa sin necesidad de separar las celulas sangufneas. Concretamente, el procedimiento para medir 1,5-anhidroglucitol de la presente invenci6n se caracteriza por que, para medir electroqufmicamente el 1,5-anhidroglucitol, se convierte o se elimina la glucosa y/o un derivado de la misma de la sangre completa tal cual, sin separar las celulas sangufneas, y ademas se deja actuar una enzima para medir 1,5-anhidroglucitol, sin separar las celulas sangufneas. Puesto que una enzima para medir 1,5-anhidroglucitol tambien actua sobre la glucosa como sustrato como se ha descrito anteriormente, la glucosa y/o 65 el derivado de la misma tiene que ser eliminando o convertido para evitar la interferencia de la glucosa. La etapa de eliminaci6n o conversi6n de la glucosa y/o un derivado de la misma y la etapa de medici6n del 1,5-anhidroglucitol en

el procedimiento de medici6n de la presente invenci6n pueden llevarse a cabo sucesivamente o secuencialmente con otra etapa entre las mismas.

La sangre completa utilizada en la presente invenci6n es sangre en un estado tal como se recoge cuyas celulas

5 sangufneas no se separan, y puede contener un anticoagulante, un inhibidor glucolftico, y/o similar contenidos en un recipiente para la recogida sangre para recoger la sangre, tal como heparina, fluoruro de sodio, y acido monoiodoacetico. Cuando se utiliza sangre almacenada, la sangre se recoge preferentemente mediante un recipiente para la recogida de sangre que contiene fluoruro de sodio y heparina. Ademas, la sangre completa de la presente invenci6n tambien incluye la sangre recogida con un dispositivo de lanceta o similar utilizado para la automedici6n de los niveles de azucar en sangre sin un recipiente para la recogida de sangre o similar. Los sitios de recogida de sangre no estan especialmente limitados, e incluyen una punta de un dedo asf como la parte exterior del antebrazo, la pared abdominal, o el exterior de la parte superior del brazo. La cantidad de sangre recogida es, por ejemplo, 50 1l o menos, preferentemente de 0,1 a 30 1l. Mas preferentemente es suficiente de 3 a 201l.

15 La etapa de eliminaci6n o conversi6n de la glucosa y/o un derivado de la misma en una sustancia que no interfiera con la medici6n en la presente invenci6n no esta especialmente limitada mientras no afecte a la medici6n del 1,5-anhidroglucitol diana en sangre. Ejemplos de la misma incluyen los procedimientos de eliminaci6n o conversi6n de la glucosa y/o un derivado de la misma en una sustancia que no interfiera con la medici6n descrita en los DOCUMENTOS DE PANTENTE 1 a 9. Resultan mas preferentes los procedimientos que utilizan enzimas, y ejemplos de los mismos incluyen los procedimientos de oxidaci6n enzimatica o fosforilaci6n enzimatica de la glucosa. La eliminaci6n o conversi6n de la glucosa en sangre completa con enzimas ha avanzado sin ningun problema al contrario de la expectativa anteriormente mencionada, y esto ha permitido la medici6n de 1,5-anhidroglucitol en sangre completa como se muestra en los ejemplos descritos mas adelante.

25 Los ejemplos del procedimiento para la oxidaci6n enzimatica de la glucosa incluyen un procedimiento que comprende la oxidaci6n de la glucosa con glucosa oxidasa, un procedimiento que comprende la oxidaci6n de la glucosa con glucosa deshidrogenasa en presencia de una coenzima nicotinamida adenina dinucle6tido (NAD) o acido fosf6rico de la nicotinamida adenina dinucle6tido (NADP). Los ejemplos del procedimiento para la fosforilaci6n enzimatica de la glucosa incluyen un procedimiento que comprende la fosforilaci6n de la glucosa con hexoquinasa o glucoquinasa para convertirla en glucosa-6-fosfato. Dependiendo de los tipos de enzimas utilizadas para medir 1,5-anhidroglucitol, puede ser necesario convertir adicionalmente la glucosa-6-fosfato producida por la fosforilaci6n de la glucosa. En este caso, ejemplos de ello incluyen un procedimiento que comprende la oxidaci6n de la glucosa a gluconolactona-6-fosfato con glucosa-6-fosfato deshidrogenasa en presencia de una coenzima NAD+ o NADP+, un procedimiento que comprende permitir que la hexoquinasa, la fosfohexosa isomerasa, y la 6-fosfofructoquinasa

35 actuen en presencia de adenosina-5'-difosfato (ADP) y adenosina-5'-trifosfato (ATP) para convertir la glucosa en fructosa-1,6-difosfato, y un procedimiento que comprende premitir que la glucosa isomerasa, la fructoquinasa, y la 6-fosfofructoquinasa actuen en presencia de nucle6sido difosfato (NDP) y nucle6sido trifosfato (NTP) para convertir la glucosa en la fructosa-1,6-difosfato.

Sobre todo, resulta mas preferente el procedimiento de fosforilaci6n de la glucosa con hexoquinasa o glucoquinasa. Por ejemplo, resulta especialmente preferente un procedimiento de fosforilaci6n de la glucosa mediante el procedimiento de ciclaci6n enzimatica con hexoquinasa o glucoquinasa en presencia de iones magnesio, ATP, fosfoenolpiruvato (PEP) y piruvato quinasa (PK).

45 Las enzimas utilizadas para las conversiones anteriormente mencionadas no estan especialmente limitadas mientras no requieran 1,5-anhidroglucitol como sustrato, y ejemplos de las mismas incluyen enzimas clasificadas como glucosa oxidasa (EC1.1.3.4), glucosa deshidrogenasas (EC1.1.1.47, EC1.1.1.118, EC1.1.1.119, y EC1.1.99.10), hexoquinasa (EC2.7.1.1), glucoquinasa (EC2.7.1.2), glucosa-6-fosfato quetol isomerasa (EC5.3.1.9) como fosfohexosa isomerasa, glucosa isomerasa (EC5.3.1.18), fructoquinasa (EC2.7.1.4), y fosfohexoquinasa (EC2.7.1.11) como 6-fosfofructoquinasa de acuerdo con la nomenclatura de la IUPAC-IUB. Tambien pueden utilizarse las que estan disponibles en el mercado. No hay ningun problema para utilizar como hexoquinasa una hexoquinasa ADP-dependiente, tal como la hexoquinasa ADP-dependiente en concreto.

Ademas, en el procedimiento que comprende la oxidaci6n de la glucosa con glucosa oxidasa y glucosa

55 deshidrogenasa, tambien puede utilizarse gluconolactonasa (EC3.1.1.17) para convertir completamente la glucono-1,5-lactona generada en acido gluc6nico, y puede utilizarse mutarotasa (EC5.1.3.3) en combinaci6n, en caso necesario.

En el procedimiento de medici6n de la presente invenci6n, tambien puede utilizarse hexoquinasa o glucoquinasa que fosforila tanto la glucosa como el 1,5-anhidroglucitol en el procedimiento que comprende la conversi6n de 1,5-anhidroglucitol en 1,5-anhidroglucitol-6-fosfato y la medici6n utilizando una enzima que actua sobre el 1,5-anhidroglucitol-6-fosfato.

En la presente invenci6n, la conversi6n de la glucosa y/o un derivado de la misma en una sustancia que no interfiere

65 con la medici6n se lleva a cabo, por ejemplo, poniendo en contacto entre sf un reactivo de conversi6n y la sangre completa. Concretamente, estas sustancias pueden mezclarse con antelaci6n en un recipiente, o el reactivo de conversi6n puede llevarse en una microplaca detectora que se describe mas adelante. Ejemplos del reactivo de conversi6n incluyen una soluci6n que consiste en hexoquinasa (HK) y/o glucoquinasa (GK), piruvato quinasa (PK), adenosina-5'-trifosfato (ATP), fosfoenolpiruvato (PEP), cloruro de magnesio o sulfato de magnesio, y cloruro de potasio, y un agente seco de la soluci6n. La hexoquinasa se deriva preferentemente de levaduras, y la glucoquinasa

5 se deriva preferentemente de Bacillus stearothermophilus. El reactivo de conversi6n puede contener hexoquinasa y glucoquinasa, o bien una de ellas. La concentraci6n de hexoquinasa y/o de glucoquinasa en la soluci6n reactiva de conversi6n es de 1 a 500 u/ml, preferentemente de 20 a 300 u/ml. La concentraci6n de piruvato quinasa en la soluci6n reactiva de conversi6n es de 1 a 500 u/ml, preferentemente de 20 a 300 u/ml. La concentraci6n de ATP es de 1 a 200 mM, preferentemente de 10 a 80 mM. La concentraci6n de fosfoenolpiruvato es de 10 a 1.500 mM, preferentemente de 100 a 500 mM. La concentraci6n de cloruro de magnesio o sulfato de magnesio es de 1 a 200 mM, preferentemente de 5 a 50 mM. La concentraci6n de cloruro de potasio es de 1 a 200 mM, preferentemente de 5 a 50 mM.

Ademas, la adici6n a un reactivo de conversi6n de una enzima que actua sobre cada sustancia de interferencia, tal

15 como una oxidasa del acido asc6rbico, una oxidasa del acido urico, o una oxidasa de la bilirrubina, resulta eficaz para evitar la interferencia de la medici6n por interferencia de sustancias aparte de la glucosa. Por ejemplo, la concentraci6n de una ascorbato oxidasa en la soluci6n reactiva de conversi6n es de 1 a 1.000 u/ml, preferentemente de 5 a 500 u/ml.

Mas adelante se explicara la etapa de medici6n electroqufmica del 1,5-anhidroglucitol en sangre completa utilizando enzimas. Ejemplos de procedimientos para la medici6n incluyen un procedimiento que comprende medir directamente el per6xido de hidr6geno generado por una reacci6n de oxidaci6n-reducci6n con una enzima y un procedimiento que utiliza un mediador redox que interviene en la transferencia de electrones implicada en una reacci6n de oxidaci6n-reducci6n. Ejemplos de enzimas incluyen enzimas que oxidan el 1,5-anhidroglucitol, y resultan

25 mas preferentes las oxidorreductasas. Ejemplos de las mismas incluyen enzimas clasificadas como piranosa oxidasa (EC1.1.3.10), L-sorbosa oxidasa (EC1.1.3.11), L-sorbosa deshidrogenasa (EC1.1.99.12), 1,5-anhidroglucitol deshidrogenasa (EC1.1.99.13) de acuerdo con la nomenclatura de la IUPAC-IUB.

Ejemplos de oxidorreductasas incluyen piranosa oxidasa producida por el hongo Basidiomycetes nO 52 (Depositario de Organismos Internacionales de Patentes, Instituto Nacional de Ciencia y Tecnologfa Industrial Avanzada: numero de acceso FERM P-10106) descrito en el DOCUMENTO DE PATENTE 12, Polyporus obtusus ATCC26733 descrito en el DOCUMENTO DE PATENTE 7, y similares, L-sorbosa oxidasas producidas por Trametes sanguinea IFO4923, L-sorbosa deshidrogenasa producida por Gluconobacter oxidans UV-10 (Depositario de Organismos Internacionales de Patentes, Instituto Nacional de Ciencia y Tecnologfa Industrial Avanzada: numero de acceso FERM P-8422) 35 descrito en el DOCUMENTO DE PATENTE 13 y similares, 1,5-anhidroglucitol deshidrogenasa producida por Pseudomonas sp. NK-85001 (Depositario de Organismos Internacionales de Patentes, Instituto Nacional de Ciencia y Tecnologfa Industrial Avanzada: numero de acceso FERM BP-1037) descrito en el DOCUMENTO DE PATENTE 11 y similares, 1,5-anhidroglucitol deshidrogenasa producida por hongos tales como Eupenicillium crustaceum IFO-8938 descrito en el DOCUMENTO DE PATENTE 14 y similares; 1,5-anhidroglucitol deshidrogenasa producida por Trichoderma longibrachiatum KDK3003 (Depositario de Organismos Internacionales de Patentes, Instituto Nacional de Ciencia y Tecnologfa Industrial Avanzada: numero de acceso FERM BP-6458) descrito en el DOCUMENTO DE PATENTE 15 y similares, 1,5-anhidroglucitol deshidrogenasa producida por Rahnella aquatilis 474 (Depositario de Organismos Internacionales de Patentes, Instituto Nacional de Ciencia y Tecnologfa Industrial Avanzada: numero de acceso FERM P-16158), Enterobacter cloacae 340 (Depositario de Organismos 45 Internacionales de Patentes, Instituto Nacional de Ciencia y Tecnologfa Industrial Avanzada: numero de acceso FERM P-16157) y Serratia marcescens 825 (Depositario de Organismos Internacionales de Patentes, Instituto Nacional de Ciencia y Tecnologfa Industrial Avanzada: numero de acceso FERM P-16159) descritos en el DOCUMENTO DE PATENTE 16 y similares, 1,5-anhidroglucitol deshidrogenasa producida por Agrobacterium tumefaciens cepa NT1130 (Depositario de Organismos Internacionales de Patentes, Instituto Nacional de Ciencia y Tecnologfa Industrial Avanzada: numero de acceso FERM BP-5997) descrito en el DOCUMENTO DE PATENTE 6, que puede deshidrogenar el 1,5-anhidroglucitol sin requerir un aceptor de electrones, D-gluc6sido-3-deshidrogenasa producida por Cytophaga marinoflava ATCC19326 descrito en el DOCUMENTO DE PATENTE 10 y similares, y las enzimas descritas en los DOCUMENTOS DE PATENTE, 17, 18 y 12. Ademas, tambien pueden utilizarse otras oxidorreductasas que oxidan el 1,5-anhidroglucitol disponibles en el mercado. De ellas, resultan mas preferentes 55 piranosa oxidasa, L-sorbosa oxidasa y 1,5-anhidroglucitol deshidrogenasa. Ademas, despues de identificar y mejorar

o modificar los genes de estas enzimas mediante tecnicas habituales de manipulaci6n genetica, tambien pueden utilizarse, a continuaci6n, en el procedimiento de medici6n de la presente invenci6n, enzimas producidas utilizando Escherichia coli recombinante o similar mientras sean oxidorreductasas que requieran 1,5-anhidroglucitol como sustrato.

Ejemplos de procedimientos de medici6n electroqufmica incluyen amperometrfa (procedimiento que comprende la medici6n de una corriente electrica), coulometrfa (procedimiento que comprende la medici6n de una cantidad de electricidad), un procedimiento de barrido de potencial, y voltametrfa cfclica. De ellos, resultan mas preferentes la amperometrfa y la coulometrfa.

65 Puede formarse un electrodo utilizado en procedimientos de medici6n electroqufmica en una placa aislante, utilizando oro, platino, carbono, paladio, plata, o cloruro de plata-plata. Ejemplos de materiales de la placa aislante incluyen plastico, tal como tereftalato de polietileno, policarbonato y carbonato de polivinilo y vidrio, y resulta mas preferente el tereftalato de polietileno. Puede formarse un electrodo en esta placa por serigraffa, deposici6n al vacfo, pulverizaci6n i6nica, o similares. De estos procedimientos, resulta mas preferente la serigraffa. Concretamente, es

5 preferible formar un electrodo por serigraffa con una tinta de carbono conductora o cloruro de plata-plata en una placa hecha de tereftalato de polietileno utilizando y enfriando la placa de 100 a 150OC.

Como electrodo utilizado en la medici6n electroqufmica de 1,5-anhidroglucitol de la presente invenci6n, puede utilizarse un montaje con tres electrodos que forman un electrodo de trabajo, un contraelectrodo y un electrodo de referencia, o un montaje con dos electrodos que forman un electrodo de trabajo y un contraelectrodo. En general, en la medici6n utilizando un montaje con tres electrodos, se aplica un potencial a un electrodo de trabajo utilizando como referencia un electrodo de referencia, y se mide una corriente electrica que fluye entre el electrodo de trabajo y un contraelectrodo. En la medici6n utilizando un montaje con dos electrodos, se utiliza un contraelectrodo como electrodo de referencia, se aplica un potencial predeterminado a un electrodo de trabajo utilizando el contraelectrodo

15 de referencia, y se mide una corriente electrica que fluye entre el electrodo de trabajo y el contraelectrodo.

Existen diversos procedimientos para la medici6n electroqufmica, y los ejemplos en la presente invenci6n incluyen procedimientos de medici6n que comprenden la medici6n del per6xido de hidr6geno generado utilizando directamente un electrodo de per6xido de hidr6geno y un procedimiento de medici6n utilizando un mediador redox que interviene en la transferencia de electrones implicada en una reacci6n de oxidaci6n-reducci6n. Ejemplos de mediador redox incluyen mediadores de la oxidaci6n y mediadores de la reducci6n, y resultan mas preferentes los mediadores de la oxidaci6n. De ellos, resultan mas preferentes los complejos de osmio, compuestos de quinona, compuestos de ferroceno, compuestos de fenotiacina, compuestos de fenoxacina, compuestos de fenacina, compuestos de indofenol, compuestos de difenilamina, compuestos fen6licos, y similares. Ejemplos de complejos de 25 osmio incluyen [Os(III)(bipiridil)2 (imidazoil)Cl]Cl 2 y sus polfmeros. Ejemplos de compuestos de quinona incluyen benzoquinona, 2-metilbenzoquinona, 2,6-dimetilbenzoquinona, 2,6-diclorobenzoquinona, 2,5-dihidroxibenzoquinona, 2-hidroxi-1,4-naftoquinona, 2-metil-1,4-naftoquinona, 2,3-dimetoxi-5-metil-1,4-benzoquinona, quinona de pirroloquinolina (PQQ), y ubiquinona. Ejemplos de compuestos de ferroceno incluyen PEG ferrocenil, TMA ferrocenil, N,N-dimetilaminometil ferroceno, y ferroceno metanol. Ejemplos de compuestos de fenotiacina incluyen tionina, azul de metileno, verde de metileno, sales de sodio de 10-(carboximetilaminocarbonil)-3,7'-bis(dimetilamino) fenotiacina, azul de toluidina O, azul I, azul C, azul A, nuevo azul de metileno, y azul de leucometileno de benzoilo. Ejemplos de compuestos de fenoxacina incluyen azul de Meldola. Ejemplos de compuestos de fenacina incluyen metosulfato de fenacina, metosulfato de 1-metoxifenacina, safranina y fenosafranina. Ejemplos de compuestos de indofenol incluyen 2-diclorofenol-indofenol (DCIP). Ejemplos de compuestos de difenilamina incluyen

35 4,4'-bis(dimetilamino)difenilamina, sal de sodio de N-(carboximetilaminocarbonil)-4,4'-bis(dimetilamino)difenilamina, clorhidrato de N-metil-N-fenil-1,4-fenilendiamina, y clorhidrato de N-metil-N-(3-metoxifenil)-1,4-fenilendiamina. Ejemplos de compuestos fen6licos incluyen p-aminofenol.

Ademas, ejemplos de mediadores que pueden utilizarse en la presente invenci6n incluyen compuestos de ferricianina (ferricianuro potasico, etc.), complejos de rutenio o sus polfmeros, compuestos de bipiridina (metil viol6geno, etc.), compuestos de trifenilmetano (verde malaquita, TPM-PS, etc.), compuestos de benzotiazolina (2-hidrazono-2,3-dihidro-3-metil-6-benzotiazol, sulfonatos del mismo, etc.), compuestos de cianina (gallocianina, ftalocianina, ficocianina, etc.), compuestos azo (magenta J-3GL, Amarillo C-Y9, Negro C-BK4, etc.), compuestos de bipiridilazo (5-Br-PSAA, 5-Br-PAPS, TAMSMB, etc.), anilina y sus derivados (DAPS, HALPS, ADPS, ALPS, TOOS,

45 ALOS, etc.), polianilina y sus derivados, compuestos fen6licos (p-aminofenol, etc.), compuestos de fenileno diamina (azul de Baliamina B, 2,3,5,6-tetrametil-p-fenilendiamina, etc.), compuestos de rodamina (rodamina B, etc.), compuestos de xanteno (pironina Y, pironina B, fluorescefna s6dica, etc.), compuestos de isoalloxacina (riboflavina, FAD, etc.), compuestos de fndigo (acido trisulf6nico fndigo, carmfn de fndigo, etc.), compuestos de fenantrolina (sulfonato de sodio batocuprofna, sulfonato de sodio batofenantrolina, etc.), compuestos de sulfoftalefna (azul de metiltimol, etc.), compuestos de bencidina (TMBZ, TMBZ·PS, DAB, azul de anisidina, etc.), compuestos de tetrazolio (WST-1, MTT, Nitro-TB, XTT, etc.), citocromo C, lumicromo, ferredoxinas, EDTAs, NAD y NADP.

Los compuestos tales como los mediadores redox y las enzimas anteriormente mencionadas, llevados por el electrodo en la medici6n electroqufmica de 1,5-anhidroglucitol de la presente invenci6n, se disuelven en agua 55 purificada o en una soluci6n tamp6n adecuada como reactivo para electrodo y se aplican a un electrodo como soluci6n reactiva para electrodo. La concentraci6n del mediador redox mencionado anteriormente contenido en el reactivo para electrodo es, por ejemplo, aproximadamente de 0,01 1M a 1 M, preferentemente de 0,1 1M a 200 mM como concentraci6n en la soluci6n reactiva para electrodo obtenida por disoluci6n en agua purificada o en una soluci6n tamp6n adecuada a aplicar al electrodo. La concentraci6n de la enzima anteriormente mencionada es, por ejemplo, aproximadamente de 0,1 a 5.000 u/ml, preferentemente de 1 a 2.000 u/ml como concentraci6n en la soluci6n reactiva para electrodo obtenida por disoluci6n en agua purificada o en una soluci6n tamp6n adecuada a aplicar a un electrodo. Como soluci6n tamp6n, pueden utilizarse tampones utilizados en las reacciones qufmicas habituales, y ejemplos de las mismas incluyen tamp6n acido 2-morfolinoetansulf6nico (MES), tamp6n acido 2-[4(2hidroxietil)-1-piperacinil]etanosulf6nico (HEPES), tamp6n acido N-tris(hidroximetil)metil-3-aminopropanosulf6nico

65 (TAPS), tamp6n tris y tamp6n fosfato. El pH es de 3 a 10, preferentemente de 5 a 9. La concentraci6n de la soluci6n tamp6n es de 1 mM a 1 M, preferentemente de 5 a 500 mM.

La soluci6n reactiva para electrodo contiene preferentemente compuestos de bajo peso molecular tales como acido sulfobenzoico, azucar y alcohol de azucar, protefnas tales como albumina, o compuestos macromoleculares hidr6filos tales como carboximetilcelulosa, polietilenglicol, alcohol de polivinilo, y polivinilpirrolidona como

5 estabilizadores que aumentan la estabilidad de las enzimas y de los mediadores redox, que da como resultado una medici6n estable de 1,5-anhidroglucitol durante un largo perfodo y una medici6n de 1,5-anhidroglucitol en sangre con una buena precisi6n. Ejemplos preferentes de acido sulfobenzoico incluyen acido 2-sulfobenzoico y acido 3-sulfobenzoico. Cuando se utiliza como estabilizador un compuesto de bajo peso molecular tal como el acido sulfobenzoico, la concentraci6n del mismo es aproximadamente de 0,1 a 500 mM, preferentemente aproximadamente de 1 a 100 mM como concentraci6n en la soluci6n reactiva para electrodo a aplicar sobre el electrodo. Cuando se utiliza como estabilizador un compuesto macromolecular hidr6filo tal como la albumina, la concentraci6n del mismo es, por ejemplo, aproximadamente del 0,01 al 20�, preferentemente aproximadamente del 0,02 al 10� como concentraci6n en la soluci6n reactiva para electrodo a aplicar sobre el electrodo.

15 Preferentemente se permite al electrodo mencionado anteriormente llevar el reactivo para electrodo mencionado anteriormente. Esto puede lograrse mediante un procedimiento conocido. Por ejemplo, una cantidad predeterminada del reactivo para electrodo mencionado anteriormente se aplica sobre un electrodo mediante recubrimiento por rotaci6n, por goteo, o por inmersi6n, y se seca. Ademas, complementariamente a tal adsorci6n ffsica, el reactivo para electrodo mencionado anteriormente puede unirse qufmicamente a un electrodo. Para ser llevado en un electrodo, se anade a la soluci6n reactiva para electrodo mencionada anteriormente el estabilizador mencionado anteriormente y a continuaci6n se aplica y se seca o se lamina sobre una capa en la que se lleva una enzima o similar.

A continuaci6n se explicara el electrodo diferencial. Un electrodo diferencial es, por ejemplo, un electrodo que tiene

25 un electrodo de trabajo que lleva una enzima de oxidaci6n-reducci6n y un reactivo mediador redox (por ejemplo, un electrodo de trabajo para medir 1,5-anhidroglucitol), un electrodo de trabajo que lleva un reactivo mediador redox pero no contiene una enzima de oxidaci6n-reducci6n (por ejemplo, un electrodo de trabajo para medir un blanco), y un contraelectrodo, que mide simultaneamente una muestra que contiene una substancia interferente relacionada con el mediador redox o similar utilizando el electrodo de trabajo que lleva una enzima oxidaci6n-reducci6n y un reactivo mediador redox y el electrodo de trabajo que lleva un reactivo mediador redox pero no contiene una enzima de oxidaci6n-reducci6n, y elimina el efecto de la sustancia interferente restando una parte de senal debida a la interferencia, y la estructura de la misma no queda limitada mientras lleve a cabo una acci6n de este tipo. Ejemplos de los mismos incluyen los electrodos diferenciales que tienen un electrodo de trabajo para medir 1,5-anhidroglucitol que contiene una oxidorreductasa y un mediador redox para medir 1,5-anhidroglucitol, un electrodo de trabajo para

35 medir un blanco que contiene un mediador redox, y un contraelectrodo de los ejemplos que se describen mas adelante.

Este procedimiento de medici6n electroqufmica que utiliza un electrodo diferencial se denomina procedimiento diferencial, y es conocida la medici6n de la glucosa como diana. En este caso, las sustancias interferentes son acido urico y acido asc6rbico. La concentraci6n en sangre de acido urico es de 120 a 770 1mol/l y la del acido asc6rbico es de 11 a 210 1mol/l en base a 5.500 a 33.000 1mol/l de glucosa. Estas concentraciones son mucho menores que la de glucosa. Mientras, la concentraci6n de 1,5-anhidroglucitol en sangre es de 6 a 300 1mol/l, que es mucho menor que la de glucosa. En la medici6n electroqufmica de 1,5-anhidroglucitol en sangre, el acido urico y el acido asc6rbico son sustancias similarmente interferentes. Sin embargo, la concentraci6n de estas sustancias es mayor o casi igual

45 que la de 1,5-anhidroglucitol. Es decir, se conocen procedimientos diferenciales empleados cuando la concentraci6n de una sustancia interferente es significativamente menor que la de una sustancia a medir, pero hasta ahora no se ha descrito ningun procedimiento diferencial empleado cuando la concentraci6n de una sustancia interferente es igual o mayor que la de una sustancia a medir. Por lo tanto, se desconoce si el procedimiento diferencial es eficaz, y si pueden obtenerse resultados correctos de la medici6n incluso cuando existe una sustancia interferente (acido urico, acido asc6rbico) con una concentraci6n igual o mayor que la del 1,5-anhidroglucitol (sustancia a medir).

La microplaca detectora para medir 1,5 -anhidroglucitol se compone del electrodo mencionado anteriormente formado en una placa aislante, una parte de uni6n para ser conectada a un dispositivo de medici6n, una parte de uni6n que conecta el electrodo y la parte de uni6n, adicionalmente un material protector (parte aislante) para hacer el

55 area del electrodo constate para aislar la parte conductora, y similares, que incluye adicionalmente una abertura para recoger la sangre de muestra, un espacio en el que entra la sangre, un canal de fluido, y similares. Esta estructura se forma con un material tipo pelfcula tal como una pelfcula de polietileno o una pelfcula de poliamida, un adhesivo tal como una cola termoplastica, un agente de pegado, tal como una cinta adhesiva de doble cara, y similares.

El 1,5-anhidroglucitol tambien puede medirse utilizando una microplaca detectora en la que un reactivo para electrodo no es llevado por un electrodo, y una muestra y el reactivo se mezclan con antelaci6n y se anaden. Sin embargo, es preferible una microplaca detectora que incluya un electrodo que tiene un electrodo de trabajo para medir 1,5-anhidroglucitol que contiene una oxidorreductasa para medir 1,5-anhidroglucitol y un mediador redox y un 65 contraelectrodo, y resulta mas preferente una microplaca detectora que incluya un electrodo diferencial que tiene un electrodo de trabajo para medir 1,5-anhidroglucitol que contiene una oxidorreductasa para medir 1,5-anhidroglucitol

y un mediador redox, un electrodo de trabajo para medir un blanco que contiene un mediador redox pero no contiene una oxidorreductasa, y un contraelectrodo. El contraelectrodo puede llevar el reactivo para electrodo mencionado anteriormente, en caso necesario. Ademas, puede utilizarse una microplaca detectora con una parte de pretratamiento que contiene un reactivo que lleva a cabo la etapa de conversi6n de la glucosa y/o un derivado de la

5 misma en una sustancia que no interfiere con la medici6n. En las Figs. 1 a 3 se muestran diagramas simplificados de un ejemplo de la microplaca detectora utilizada en la presente invenci6n.

Se describe adicionalmente un kit para medir 1,5-anhidroglucitol en sangre completa compuesto por al menos la microplaca detectora mencionada anteriormente, un dispositivo de lanceta utilizado para recoger la sangre, y un dispositivo de medici6n para 1,5-anhidroglucitol. El dispositivo de lanceta puede ser similar a un dispositivo de lanceta unido a un dispositivo para la auto-monitorizaci6n de los niveles de azucar en sangre. Este kit puede incluir adicionalmente un reactivo utilizado en la etapa de conversi6n de la glucosa y/o un derivado de la misma en una sustancia que no interfiere con la medici6n.

15 Ademas, este kit para medir 1,5-anhidroglucitol puede tener un dispositivo para recoger una muestra, un reactivo para el pretratamiento, un calibrador, y similares. El dispositivo para recoger una muestra no esta especialmente limitado mientras puedan recogerse aproximadamente varias decenas de 1l o menos de sangre completa, y puede ser similar a un capilar utilizado en la medici6n del hematocrito.

En lo sucesivo, la presente invenci6n se explicara mas especfficamente con respecto a los siguientes ejemplos y Ejemplos de Referencia. Sin embargo, estos ejemplos s6lo muestran un aspecto de la presente invenci6n y no limitan el alcance de la presente invenci6n. En los ejemplos se utilizaron enzimas que se obtuvieron mediante procedimientos conocidos o que se encontraban disponibles el mercado.

25 El detector electroqufmico utilizado en todos los ejemplos y en los Ejemplos de Referencia 9, 10 y 11 fue un multipotenciostato de 8 canales modelo PS-08 equipado con GPIB y RS232C fabricado por Toho Giken, y el detector electroqufmico utilizado en los Ejemplos de Referencia 7 y 8 fue un multipotenciostato de 8 canales modelo PS-08 equipado con un generador de funciones FG-02 fabricado por Toho Giken. El termino 1,5AG en las figuras indica 1,5-anhidroglucitol.

Ejemplo 1

1) Reactivo de conversi6n de la glucosa

35 Para preparar un reactivo de conversi6n de la glucosa, se disolvieron, en tamp6n MES, 10,0 mM, MgCl2 17,6mM, KCl 17,6mM, fosfoenolpiruvato (PEP) 175,7 mM, ATP 17,6mM, 123u/ml de piruvato quinasa, 75u/ml de glucoquinasa, 200 u/ml de acido asc6rbico oxidasa, cloruro s6dico 100 mM, NaN3 al 0,1�, EDTA 0,1 mM, y seroalbumina bovina (BSA) al 0,06�, como composici6n, despues de ajustar el pH a 7,0 utilizando hidr6xido s6dico acuoso 1 N.

2) Soluci6n reactiva para electrodo

Para preparar una soluci6n reactiva para electrodo, se disolvieron, en agua purificada, complejo de osmio (III) ([Os(III)(bipiridil)2(imidazoil)Cl]Cl2) 23,6 mM descrito en la patente japonesa nO 3713049, 930 u/ml de piranosa

45 oxidasa (derivada del hongo Basidiomycetes nO 52), y acido 3-sulfobenzoico 50 mM, en esta composici6n.

3) Microplaca detectora

Se serigrafi6, un grosor de 10 1m, una placa de base hecha de tereftalato de polietileno con una tinta de carbono (nombre del producto, pasta de carbono TU15ST: Asahi Chemical Research Laboratory Co. Ltd.) y se enfri6 a 150°C durante 40 minutos para formar un electrodo de trabajo y una parte conductora y un contraelectrodo y una parte conductora. A continuaci6n, se serigrafi6, un grosor de 20 1m, una parte, excepto la parte de electrodo y una uni6n con un dispositivo de medici6n, con una tinta protectora (nombre del producto, CR18G-KF: Asahi Chemical Research Laboratory Co. Ltd.) y se enfri6 a 130°C durante 15 minutos. De esta manera se prepar6 el electrodo 11

55 mostrado en la Fig. 1. Para preparar una microplaca detectora, se recubri6 el electrodo 11 con 4 1l de la soluci6n reactiva para electrodo obtenida en el punto 2) anteriormente indicado, en una posici6n 1 en la que se aplic6 la muestra, y se sec6 a 50°C durante 13 minutos.

4) Creaci6n de la curva de calibrado

Para crear una curva de calibrado del 1,5-anhidroglucitol, se mezclaron, en tubos Eppendorf, 5 muestras obtenidas anadiendo a plasma 20 1l de cada una de las preparaciones de 1,5-anhidroglucitol a concentraciones conocidas (las concentraciones de 1,5-anhidroglucitol en las muestras obtenidas mediante el procedimiento del Ejemplo de Referencia 1 que se describe mas adelante, excepto el procedimiento de separaci6n de las celulas sangufneas, 65 fueron 3,8, 7,8, 15,8, 31,4, y 63,9 1g/ml) y 10 1l del reactivo de conversi6n de la glucosa y se dejaron reposar durante 5 minutos. A continuaci6n, se aplicaron, gota a gota, 10 1l de cada una de las mezclas de reacci6n sobre el

electrodo 11 en la posici6n 1 en la que se aplic6 la muestra. 80 segundos mas tarde, se aplicaron 0,15 V al electrodo de trabajo con respecto al contraelectrodo durante 10 segundos, y se midieron los valores de corriente despues de los siguientes 5 segundos con un detector electroqufmico (multipotenciostato de 8 canales modelo PS-08 equipado con GPIB y RS232C: Toho Giken). Se cre6 una curva de calibrado a partir de las diferencias entre los niveles de

5 Coulomb obtenidos de la microplaca detectora para medir el 1,5-anhidroglucitol y los obtenidos de la microplaca detectora para medir un blanco, y las concentraciones de 1,5-anhidroglucitol.

5) Procedimiento de medici6n del 1,5-anhidroglucitol

10 Se mezclaron, en tubos Eppendorf, 20 1l de sangre completa de cada uno de 3 sujetos normales con niveles de acido urico casi iguales a los de las muestras obtenidas en el punto 4) anteriormente indicado o con bajos niveles de acido urico en las muestras medidas, con 10 1l del reactivo de conversi6n de la glucosa y se dejaron reposar durante 5 minutos. A continuaci6n, se aplicaron, gota a gota, 10 1l de cada una de las mezclas de reacci6n sobre el electrodo 11 en la posici6n 1 en la que se aplic6 la muestra. 80 segundos mas tarde, se aplicaron 0,15 V al electrodo

15 de trabajo con respecto al contraelectrodo, durante 10 segundos, y se midieron los valores de corriente despues de los siguientes 5 segundos con un detector electroqufmico. Se obtuvieron las cantidades de 1,5-anhidroglucitol en sangre completa de las 3 muestras utilizando la curva de calibrado creada en el punto 4) anteriormente indicado. Los resultados se muestran en la Tabla 1. Se utilizaron los valores medios de 4 mediciones para las muestras para la creaci6n de la curva de calibrado, y se utiliz6 el valor de 1 medici6n para las muestras.

Ejemplo de Referencia 1.

Se centrifugaron las mismas muestras de sangre completa de los 3 sujetos normales utilizados para la medici6n en

25 el punto 5) del Ejemplo 1, a 3.000 rpm durante 10 minutos, y se midi6 el sobrenadante (plasma) para el 1,5-anhidroglucitol utilizando un reactivo de medici6n de 1,5-anhidroglucitol (Lana 1,5AG Auto Liquid: Nippon Kayaku Co., Ltd.) y una analizador automatizado Hitachi 7150 (Hitachi, Ltd.) con los siguientes parametros. Los resultados se muestran en la Tabla 1.

Procedimiento analftico 2 puntos Punto de lectura 24-50 Volumen de la muestra 8 1l Reactivo de pretratamiento (R1) de Lana 1,5AG Auto Liquid 240 1l Reactivo de color (R2) de Lana 1,5AG Auto Liquid 120 1l Temperatura 37OC Longitud de onda de la medici6n (secundaria/principal) 700/546 nm

30 [Tabla 1]

Tabla 1

Concentraci6n de 1,5-anhidroglucitol (1g/ml) Ejemplo de Ejemplo 1 referencia 1

Muestra de sangre completa 1 9,8 10,4 Muestra de sangre completa 2 15,6 16,8 Muestra de sangre completa 3 17,2 17,2

35 Cuando se dej6 actuar el reactivo de conversi6n de la glucosa sobre sangre completa para convertir la glucosa en una substancia que no interfiere con la medici6n y se hizo reaccionar con un reactivo para electrodo, sin separar las celulas sangufneas, los valores medidos de 1,5-anhidroglucitol en las muestras de sangre completa (Ejemplo 1) estuvieron en buena consonancia con los obtenidos mediante un procedimiento de medici6n conocido en el Ejemplo de Referencia 1 (coeficiente de correlaci6n, 0,9881), lo que sugiere que el 1,5-anhidroglucitol en sangre completa

40 puede medirse mediante la presente invenci6n.

Ejemplo 2

1) Reactivo de conversi6n de la glucosa

45 Para preparar un reactivo de conversi6n de la glucosa, se disolvieron, en tamp6n MES, 10,0 mM, MgCl2 17,6 mM, KC1 17,6 mM, fosfoenolpiruvato (PEP) 175,7 mM, ATP 17,6 mM, 123 u/ml de piruvato quinasa (PK), 97 u/ml de hexoquinasa, y 20 u/ml de acido asc6rbico oxidasa, como composici6n, despues de ajustar el pH a 7,0 utilizando hidr6xido s6dico acuoso 1 N.

50 2) Soluci6n reactiva para electrodo

(i) Para medir el 1,5-anhidroglucitol

5 Para preparar una soluci6n reactiva para electrodo, se disolvieron, en agua purificada, complejo de osmio (III) ([Os(III)(bipiridil)2(imidazoil)Cl]Cl2) 23,6 mM y 465,2 u/ml de piranosa oxidasa (derivada del hongo Basidiomycetes nO 52), en esta composici6n.

(ii) Para medir el blanco

10 Para preparar una soluci6n reactiva para electrodo, se disolvi6, en agua purificada, complejo de osmio (III) ([Os(III)(bipiridil)2(imidazoil)Cl]Cl2) 23,6 mM, en esta composici6n.

3) Microplaca detectora

15 Para medir el 1,5-anhidroglucitol y un blanco, se prepararon dos electrodos 11 de la misma manera que en el punto 3) del Ejemplo 1, y se aplicaron 4 1l de cada una de las soluciones reactivas para electrodo para medir 1,5-anhidroglucitol o un blanco del punto 2) anteriormente indicado, sobre cada uno de los electrodos en la posici6n 1 en la que se aplic6 la muestra y se secaron a 50°C durante 13 minutos para preparar las microplacas detectoras.

20 4) Creaci6n de la curva de calibrado

Para crear una curva de calibrado del 1,5-anhidroglucitol, se mezclaron, en tubos Eppendorf, 20 1l de cada una de las 5 muestras obtenidas anadiendo a plasma preparaciones de 1,5-anhidroglucitol con concentraciones conocidas (las concentraciones de 1,5-anhidroglucitol en las muestras obtenidas mediante el procedimiento del Ejemplo de 25 Referencia 1 excepto el procedimiento de separaci6n de las celulas sangufneas fueron 9,4, 18,8, 37,5, 75,0, y 150,0 1g/ml) con 10 1l del reactivo de conversi6n de la glucosa y se dejaron reposar durante 5 minutos. A continuaci6n, se aplicaron, gota a gota, 10 1l de cada una de las mezclas de reacci6n sobre cada uno de los electrodos 11 para medir 1,5-anhidroglucitol y un blanco en la posici6n 1 en la que se aplic6 la muestra. 80 segundos mas tarde, se aplicaron 0,15 V, durante 10 segundos, al electrodo de trabajo con respecto al

30 contraelectrodo y los se midieron valores de corriente despues de los siguientes 5 segundos con un detector electroqufmico. Se cre6 una curva de calibrado a partir de las diferencias entre los valores de corriente obtenidos de la microplaca detectora para medir el 1,5-anhidroglucitol y los obtenidos de la microplaca detectora para medir un blanco y las concentraciones de 1,5-anhidroglucitol.

35 5) Medici6n del 1,5-anhidroglucitol

Se mezclaron, en tubos Eppendorf, 20 1l de sangre completa de cada uno de 6 sujetos normales para medir el 1,5-anhidroglucitol, con 10 1l de un reactivo de conversi6n de la glucosa y se dejaron reposar durante 5 minutos. A continuaci6n, se aplicaron, gota a gota, 10 1l de cada mezcla de reacci6n sobre cada uno de los electrodos 11 para 40 medir 1,5-anhidroglucitol y un blanco, en la posici6n 1 en la que se aplic6 la muestra. 80 segundos mas tarde, se aplicaron 0,15 V al electrodo de trabajo con respecto al contraelectrodo, durante 10 segundos, y se midieron los valores de corriente despues de los siguientes 5 segundos con un detector electroqufmico. Para obtener las cantidades de 1,5-anhidroglucitol en sangre completa de las 6 muestras, se compararon las diferencias entre los valores de corriente obtenidos de la microplaca detectora para medir el 1,5-anhidroglucitol y los valores de corriente

45 obtenidos de la microplaca detectora para medir un blanco, con la curva de calibrado. Los resultados se muestran en la Tabla 2. Se utilizaron los valores medios de 4 mediciones para las muestras para crear la curva de calibrado, y se utiliz6 el valor de 1 medici6n para las muestras.

Ejemplo de Referencia 2

50 Las mismas muestras de sangre completa tal como se midieron en el punto 5) del Ejemplo 2 se midieron para el 1,5-anhidroglucitol de la misma manera que en el Ejemplo de Referencia 1. Los resultados se muestran en la Tabla

2.

55 [Tabla 2]

Tabla 2

Concentraci6n de 1,5-anhidroglucitol

(1g/ml)

Ejemplo de referencia 2 Ejemplo 2 Muestra de sangre completa 4 16,4 16,7 Muestra de sangre completa 5 17,5 14,2 Muestra de sangre completa 6 26,2 23,5 Muestra de sangre completa 7 31,5 26,9 Muestra de sangre completa 8 27,2 24,4 Muestra de sangre completa 9 31,4 36,7 Cuando se dej6 actuar el reactivo de conversi6n de la glucosa sobre la sangre completa para convertir la glucosa en una sustancia que no interfiere con la medici6n, y se hizo reaccionar la sangre completa con el reactivo para electrodo, sin separar las celulas sangufneas, los valores medidos de 1,5-anhidroglucitol en sangre completa

5 obtenidos mediante el procedimiento diferencial se correlacionaron bien con los obtenidos mediante la medici6n en el Ejemplo de Referencia 2 (coeficiente de correlaci6n, 0,8943), lo que sugiere que el 1,5-anhidroglucitol en sangre completa puede medirse mediante la presente invenci6n.

Ejemplo 3

1) Reactivo de conversi6n de la glucosa

Se utiliz6 el reactivo de conversi6n de la glucosa obtenido en el punto 1) del Ejemplo 1.

15 2) Soluci6n reactiva para electrodo

(i)

Para medir el 1,5-anhidroglucitol

Para preparar una soluci6n reactiva para electrodo, se disolvieron, en agua purificada, complejo de osmio (III) ([Os(III)(bipiridil)2(imidazoil)Cl]Cl2) 23,6 mM, 930 u/ml de piranosa oxidasa (derivada del hongo Basidiomycetes nO 52), y acido 3-sulfobenzoico 50 mM, en esta composici6n.

(ii)

Para medir el blanco

25 Para preparar una soluci6n reactiva para electrodo, se disolvieron, en agua purificada, complejo de osmio (III) ([Os(III)(bipiridil)2(imidazoil)Cl]Cl2) 23,6 mM y acido 3-sulfobenzoico 50 mM, en esta composici6n.

3) Microplaca detectora

Se prepararon, de la misma manera que en el punto 3) anteriormente indicado del Ejemplo 2, una microplaca detectora para medir 1,5-anhidroglucitol y una microplaca detectora para medir un blanco.

4) Creaci6n de la curva de calibrado

35 Para crear una curva de calibrado del 1,5-anhidroglucitol, se mezclaron, en tubos Eppendorf, 201l de cada una de 5 muestras obtenidas anadiendo a plasma preparaciones de 1,5-anhidroglucitol con concentraciones conocidas (las concentraciones de 1,5-anhidroglucitol de las muestras obtenidas mediante el procedimiento del Ejemplo de Referencia 1 excepto el procedimiento de separaci6n de las celulas sangufneas fueron 9,5, 19,6, 39,6, 78,5, y 159,8 1g/ml) con 10 1l del reactivo de conversi6n de la glucosa y se dejaron reposar durante 5 minutos. A continuaci6n, se aplicaron, gota a gota, 10 1l de cada una de las mezclas de reacci6n sobre cada uno de los electrodos 11 para medir 1,5-anhidroglucitol y para medir un blanco, en la posici6n 1 en la que seaplic6 la muestra. 80 segundos mas tarde, se aplicaron 0,15 V al electrodo de trabajo con respecto al contraelectrodo, durante 10 segundos, y se midieron los valores de corriente despues de los siguientes 5 segundos con un detector electroqufmico. Se cre6 una curva de calibrado a partir de las diferencias entre los valores de corriente obtenidos de

45 la microplaca detectora para medir el 1,5-anhidroglucitol y los obtenidos de la microplaca detectora para medir un blanco y las concentraciones de 1,5-anhidroglucitol.

5) Medici6n del 1,5-anhidroglucitol

Se mezclaron, en tubos Eppendorf, 20 1l de sangre completa de cada uno de 6 sujetos normales para medir el 1,5-anhidroglucitol con 10 1l de reactivo de conversi6n de la glucosa y se dej6 reposar la mezcla durante 5 minutos. A continuaci6n, se aplicaron, gota a gota, 10 1l de cada mezcla de reacci6n en la posici6n 1 en la que se aplic6 la muestra de los electrodos 11 para medir 1,5-anhidroglucitol y para medir un blanco. 80 segundos mas tarde, se aplicaron 0,15 V al electrodo de trabajo con respecto al contraelectrodo, durante 10 segundos, y se midieron los

55 valores de corriente despues de los siguientes 5 segundos con un detector electroqufmico. Para obtener las cantidades de 1,5-anhidroglucitol en las 6 muestras de sangre completa, se compararon las diferencias entre los valores de corriente obtenidos de la microplaca detectora para medir el 1,5-anhidroglucitol y los valores de corriente obtenidos de la microplaca detectora para medir un blanco con la curva de calibrado Los resultados se muestran en la Tabla 3. Se utilizaron los valores medios de 4 mediciones para las muestras para crear la curva de calibrado, y se utiliz6 el valor de 1 medici6n para las muestras.

Ejemplo de Referencia 3

Las mismas muestras de sangre completa tal como se midieron en el punto 5) del Ejemplo 3 se midieron para el 65 1,5-anhidroglucitol de la misma manera que en el Ejemplo de Referencia 1. Los resultados se muestran en la Tabla

3.

[Tabla 3]

Tabla 3

Concentraci6n de 1,5-anhidroglucitol (1g/ml) Ejemplo de referencia 3 Ejemplo 3

Muestra de sangre completa 10 9,8 9,7

Muestra de sangre completa 11 15,6 15,5

Muestra de sangre completa 12 17,2 17,3

Muestra de sangre completa 13 24,6 25,1

Muestra de sangre completa 14 30,1 32,8

Muestra de sangre completa 15 29,0 30,8

5 Cuando se dej6 actuar el reactivo de conversi6n de la glucosa sobre la sangre completa para convertir la glucosa en una sustancia que no interfiere con la medici6n, y se hizo reaccionar la sangre completa con el reactivo para electrodo, sin separar las celulas sangufneas, los valores de 1,5-anhidroglucitol en sangre completa medidos mediante el procedimiento diferencial (Ejemplo 3) se correlacionaron bien con los medidos mediante un procedimiento de medici6n conocido en el Ejemplo de Referencia 3 (coeficiente de correlaci6n, 0,9982), lo que

10 sugiere que el 1,5-anhidroglucitol en sangre completa puede medirse mediante la presente invenci6n. Ademas, los resultados mostraron claramente una mejor correlaci6n que la del Ejemplo 2 anteriormente indicado (coeficiente de correlaci6n, 0,8943). Es decir, se ha demostrado que el 1,5-anhidroglucitol en sangre completa se mide con una mayor precisi6n utilizando, en combinaci6n, un estabilizador y un procedimiento diferencial.

15 Ejemplo 4

1) Reactivo de conversi6n de la glucosa

Se utiliz6 el reactivo de conversi6n de la glucosa del punto 1) en el Ejemplo 1.

20 2) Soluci6n reactiva para electrodo

(i) Para medir el 1,5-anhidroglucitol

25 Para preparar una soluci6n reactiva para electrodo, se disolvieron, en agua purificada, complejo de osmio (III) ([Os(III)(bipiridil)2(imidazoil)Cl]Cl2) 11,8 mM y 111,0 u/ml de 1,5-anhidroglucitol deshidrogenasa (derivada de Pseudomonas sp. NK-85001), en esta composici6n.

(ii) Para medir el blanco

30 Para preparar una soluci6n reactiva para electrodo, se disolvi6 el componente en agua purificada de manera que la composici6n fuese complejo de osmio (III) ([Os(III)(bipiridil)2 (imidazoil)Cl]Cl2) 11,8 mM.

3) Microplacas detectoras

35 Se prepararon dos de los electrodos 11, preparados de la misma manera que en el punto 3) del Ejemplo 1, se aplicaron 4 1l de cada una de las soluciones reactivas para electrodo para medir 1,5-anhidroglucitol y para medir un blanco obtenidas en el punto 2) anteriormente indicado, sobre cada uno de los electrodos en la posici6n 1 en la que se aplic6 la muestra y se secaron a 50OC durante 8 minutos para preparar las microplacas detectoras para medir

40 1,5-anhidroglucitol y para medir un blanco.

4) Creaci6n de la curva de calibrado

Para crear una curva de calibrado del 1,5-anhidroglucitol, se mezclaron, en tubos Eppendorf, 201l de cada una de 3

45 muestras obtenidas anadiendo a plasma preparaciones de 1,5-anhidroglucitol con concentraciones conocidas (las concentraciones de 1,5-anhidroglucitol en las muestras obtenidas mediante el procedimiento del Ejemplo de Referencia 1 excepto el procedimiento de separaci6n de las celulas sangufneas fueron 24,2, 49,3, y 98,8 1g/ml) con 10 1l del reactivo de conversi6n de la glucosa y se dejaron reposar durante 5 minutos. A continuaci6n, se aplicaron, gota a gota, 10 1l de cada una de las mezclas de reacci6n sobre cada uno de los electrodos 11 para medir

50 1,5-anhidroglucitol y para medir un blanco en la posici6n 1 en la que se aplic6 la muestra. 80 segundos mas tarde, se aplicaron 0,15 V al electrodo de trabajo con respecto al contraelectrodo, durante 10 segundos, y se midieron los valores de corriente despues de los siguientes 5 segundos con un detector electroqufmico. Se cre6 una curva de calibrado a partir de las diferencias entre los valores de corriente obtenidos de la microplaca detectora para medir el 1,5-anhidroglucitol y los obtenidos de la microplaca detectora para medir un blanco y las concentraciones de

55 1,5-anhidroglucitol.

5) Procedimiento de medici6n del 1,5-anhidroglucitol Se mezclaron, en tubos Eppendorf, 20 1l de sangre completa de cada uno de 4 sujetos normales para medir el 1,5-anhidroglucitol con 10 1l de reactivo de conversi6n de la glucosa, y se dejaron reposar durante 5 minutos. A continuaci6n, se aplicaron, gota a gota, 10 1l de cada una de las mezclas de reacci6n sobre cada uno de los electrodos 11 para medir 1,5-anhidroglucitol y para medir un blanco en la posici6n 1 en la que se aplic6 la muestra.

5 80 segundos mas tarde, se aplicaron 0,15 V al electrodo de trabajo con respecto al contraelectrodo, durante 10 segundos, y se midieron los valores de corriente despues de los siguientes 5 segundos con un detector electroqufmico. Para obtener las cantidades de 1,5-anhidroglucitol en las 4 muestras de sangre completa, se compararon las diferencias entre los valores de corriente obtenidos de la microplaca detectora para medir el 1,5-anhidroglucitol y los obtenidos de la microplaca detectora para medir un blanco con la curva de calibrado. Los resultados se muestran en la Tabla 4. Se utilizaron los valores medios de 4 mediciones para las muestras para crear la curva de calibrado, y se utiliz6 el valor de 1 medici6n para las muestras.

Ejemplo de Referencia 4

15 Las mismas muestras de sangre completa tal como se midieron en el Ejemplo 4 se midieron para el 1,5-anhidroglucitol mediante el procedimiento del Ejemplo de Referencia 1. Los resultados se muestran en la Tabla

4.

[Tabla 4]

Tabla 4

Concentraci6n de 1,5-anhidroglucitol (1g/ml)

Ejemplo de referencia 4 Ejemplo 4

Muestra de sangre completa 16 9,4 10,0

Muestra de sangre completa 17 14,0 13,8

Muestra de sangre completa 18 27,8 26,2

Muestra de sangre completa 19 32,7 32,6

Cuando se dej6 actuar el reactivo de conversi6n de la glucosa sobre la sangre completa para convertir la glucosa en una sustancia que no interfiere con la medici6n y se hizo reaccionar con el reactivo para electrodo que contenfa

25 1,5-anhidroglucitol deshidrogenasa, sin separar las celulas sangufneas, los valores de 1,5-anhidroglucitol en sangre completa medidos mediante el procedimiento diferencial (Ejemplo 4) se correlacionaron bien con los medidos en el Ejemplo de Referencia 4 (coeficiente de correlaci6n, 0,9974), lo que sugiere que el 1,5-anhidroglucitol en sangre completa puede medirse mediante la presente invenci6n.

Ejemplo de Referencia 5

1) Reactivo de conversi6n de la glucosa

Para preparar un reactivo de conversi6n de la glucosa, se anadieron, a tamp6n MES 10,0mM, MgCl2 17,6 mM, KCl

35 17,6mM, fosfoenolpiruvato (PEP) 175,7 mM, ATP 17,6mM, 123u/ml de piruvato quinasa (PK) y 97u/ml de hexoquinasa, como composici6n, despues de ajustar el pH a 7,0 utilizando hidr6xido s6dico acuoso 1 N.

2) Soluci6n reactiva para electrodo

Para preparar las soluciones reactivas para electrodo con dos tipos de composiciones, se disolvieron, en agua purificada, complejo de osmio (III) ([Os(III)(bipiridil)2(imidazoil)Cl]Cl2) 11,8 mM, 930 u/ml de piranosa oxidasa (derivada del hongo Basidiomycetes nO 52), y acido 2-sulfobenzoico 50 mM (Ejemplo de Referencia 5-1) 6 acido 3-sulfobenzoico 50 mM (Ejemplo de Referencia 5-2), en esta composici6n. La preparaci6n de la soluci6n reactiva para electrodo sin anadir acido sulfobenzoico se denomin6 Ejemplo de Referencia 5-3.

45 3) Microplaca detectora

Se prepar6 una microplaca detectora para medir 1,5-anhidroglucitol de la misma manera que en el punto 3) anteriormente indicado del Ejemplo 1.

4) Procedimiento de medici6n

Utilizando la microplaca detectora preparada en el punto 3) anteriormente indicado el dfa 0 (inmediatamente despues de la preparaci6n) y despues de almacenarse durante 5 dfas a temperatura ambiente y una humedad de 55 aproximadamente el 20�, se mezclaron, en tubos Eppendorf, 20 1l de cada una de las muestras que contenfan 0 1g/ml y 50 1g/ml de 1,5-anhidroglucitol con 10 1l del reactivo de conversi6n de la glucosa y se dejaron reposar durante 5 minutos. A continuaci6n, se aplicaron, gota a gota, 10 1l de cada una de las mezclas de reacci6n sobre cada uno de los electrodos 11 en la posici6n 1 en la que se aplic6 la muestra. 80 segundos mas tarde, se aplicaron 0,15 V al electrodo de trabajo con respecto al contraelectrodo, durante 10 segundos, y se midieron los valores de corriente despues de los siguientes 5 segundos con un detector electroqufmico. Los valores medios y la desviaci6n

estandar de 4 mediciones y las velocidades de cambio se muestran en las Tablas 5-1 y 5-2. [Tabla 5-1]

Tabla 5-1

0 1g/ml de 1,5-anhidroglucitol Dfa 1 Dfa 5 Velocidad de cambio

Media D.E. Media D.E. Dfa 5/Dfa 1

(1A) (1A) Ejemplo de Referencia 5-1 0,77 0,06 0,96 0,03 1,24 Ejemplo de Referencia 5-2 0,74 0,02 1,04 0,04 1,41 Ejemplo de Referencia 5-3 1,35 0,06 3,58 0,18 2,66

[Tabla 5-2]

Tabla 5-2

50 1g/ml de 1,5-anhidroglucitol Dfa 1 Dfa 5 Velocidad de cambio

Media D.E. Media D.E. Dfa 5/Dfa 1

(1A) (1A) Ejemplo de Referencia 5-1 1,99 0,06 2,16 0,08 1,08 Ejemplo de Referencia 5-2 1,89 0,02 2,21 0,04 1,17 Ejemplo de Referencia 5-3 2,68 0,13 4,73 0,22 1,76

10 En los Ejemplos de Referencia 5-1y5-2, las velocidades de cambio (valor medio de corriente el dfa 5/valor medio de corriente el dfa 1) fueron menores que en el Ejemplo de Referencia 5-3, lo que demuestra que se suprimfa el incremento de los valores de corriente a lo largo del tiempo. Ademas, la desviaci6n estandar era pequena, lo que sugiere la fiabilidad de la medici6n, es decir, se mejoraba la precisi6n. Estos resultados demuestran el efecto de la adici6n de un estabilizador al reactivo para electrodo, que puede aplicarse a la medici6n electroqufmica de

15 1,5-anhidroglucitol en sangre completa.

Ejemplo 5

1) Reactivo de conversi6n de la glucosa 20 Se utiliz6 el reactivo de conversi6n de la glucosa preparado en el punto 1) del Ejemplo 1.

2) Procedimiento de pretratamiento (medici6n comun para el 1,5-anhidroglucitol y el blanco)

25 Para crear una curva de calibrado del 1,5-anhidroglucitol, se mezclaron, en tubos Eppendorf, 101l de cada una de 4 muestras obtenidas anadiendo a plasma preparaciones de 1,5-anhidroglucitol con concentraciones conocidas (las concentraciones de 1,5-anhidroglucitol en las muestras obtenidas mediante el procedimiento del Ejemplo de Referencia 1 excepto el procedimiento de separaci6n de las celulas sangufneas fueron 3,8, 7,8, 15,8, y 31,41g/ml) 6 4 muestras de sangre completa humana con 10 1l del reactivo de conversi6n de la glucosa y se dejaron reposar

30 durante 5 minutos.

3) Procedimiento antes de la medici6n con el electrodo

(i) Procedimiento de medici6n del 1,5-anhidroglucitol

35 A la soluci6n despues del procedimiento de pretratamiento anteriormente mencionado, se anadieron sucesivamente 5 1l de tamp6n fosfato 100 mM (pH 7,0) en el que se encontraba disuelta 2,6-dimetilbenzoquinona 22,0 mM y 5 1l de tamp6n fosfato 100 mM (pH 7,0) en el que se encontraban disueltas 200 u/ml de piranosa oxidasa (derivada del hongo Basidiomycetes nO 52), se mezclaron, y se dejaron reposar durante 5 minutos.

(ii) Procedimiento de medici6n del blanco

A la soluci6n despues del procedimiento de pretratamiento anteriormente mencionado, se anadieron sucesivamente 5 1l de tamp6n fosfato 100 mM (pH 7,0) en el que se encontraba disuelta 2,6-dimetilbenzoquinona 22,0 mM y 5 1l de 45 tamp6n fosfato 100 mM (pH 7,0), se mezclaron, y se dejaron reposar durante 5 minutos.

4) Procedimiento de medici6n utilizando una microplaca detectora

Se serigrafi6, un grosor de 10 1m, una placa de base hecha de tereftalato de polietileno con una tinta de carbono

(nombre del producto, pasta de carbono TU15ST: Asahi Chemical Research Laboratory Co. Ltd.) como electrodo de trabajo y una parte conductora, un contraelectrodo y una parte conductora, y un electrodo de referencia y una parte conductora, y se enfri6 a 150°C durante 40 minutos. A continuaci6n, se serigrafi6, un grosor de 20 1m, con una tinta protectora (nombre del producto, CR18G-KF: Asahi Chemical Research Laboratory Co. Ltd.), excepto una parte de 5 uni6n entre la parte de electrodo y un dispositivo de medici6n y se enfri6 a 130°C durante 15 minutos para preparar un electrodo 12 mostrado en la Fig. 2. Se aplicaron, gota a gota, 15 1l de cada una de las mezclas de reacci6n obtenidas en el punto 3) anteriormente indicado sobre el electrodo 12 en la posici6n 1 en la que se aplic6 la muestra, se aplicaron 0,15 V durante 10 segundos utilizando como referencia el electrodo de referencia, y despues de 5 segundos se midieron los valores de corriente de la microplaca detectora para medir el 1,5-anhidroglucitol y de la

10 microplaca detectora para medir un blanco con un detector electroqufmico.

5) Calculo de las cantidades de 1,5-anhidroglucitol

Se cre6 una curva de calibrado a partir de las los valores de corriente obtenidos restando los obtenidos de la

15 microplaca detectora para medir un blanco de los obtenidos de la microplaca detectora para medir el 1,5-anhidroglucitol mediante el procedimiento mencionado anteriormente utilizando muestras para crear una curva de calibrado del 1,5-anhidroglucitol y las concentraciones de 1,5-anhidroglucitol. Para las 4 muestras de sangre completa humana, se compararon similarmente los valores de corriente obtenidos restando los obtenidos de la microplaca detectora para medir un blanco de los obtenidos de la microplaca detectora para medir el

20 1,5-anhidroglucitol con la curva de calibrado para obtener las cantidades de 1,5-anhidroglucitol en sangre completa. Los resultados se muestran en Tabla 6. Se utilizaron los valores medios de las 4 mediciones tanto para las muestras para la creaci6n de la curva de calibrado como para las muestras.

Ejemplo de Referencia 6

25 Las mismas muestras de sangre completa tal como se midieron en el Ejemplo 5 se midieron para el 1,5-anhidroglucitol mediante el mismo procedimiento que en el Ejemplo de Referencia 1. Los resultados se muestran en la Tabla 6.

30 [Tabla 6] Tabla 6 Concentraci6n de 1,5-anhidroglucitol (1g/ml) Ejemplo de referencia 6 Ejemplo 5 Muestra de sangre completa 20 16,7 17,0 Muestra de sangre completa 21 29,8 28,0 Muestra de sangre completa 22 28,9 28,6 Muestra de sangre completa 23 31,7 31,2

Cuando se dej6 actuar el reactivo de conversi6n de la glucosa sobre la sangre completa para convertir la glucosa en una sustancia que no interfiere con la medici6n, y se hizo reaccionar con el reactivo para electrodo que no estaba

35 soportado sobre un electrodo, sin separar las celulas sangufneas, los valores medidos de 1,5-anhidroglucitol en sangre completa (Ejemplo 5) estuvieron en buena consonancia con los medidos mediante un procedimiento de medici6n conocido en el Ejemplo de Referencia 6 (coeficiente de correlaci6n, 0,9941), lo que sugiere que el 1,5-anhidroglucitol en sangre completa puede medirse mediante la presente invenci6n.

40 Ejemplo de Referencia 7

De acuerdo con el procedimiento para evaluar las velocidades de reacci6n de las enzimas y los mediadores descritos en Denki Kagaku Vol. 63, nO 10, p. 906-913 (1995), se examinaron las reacciones de la piranosa oxidasa derivada del hongo Basidiomycetes nO 52 mencionada anteriormente y los mediadores redox enumerados en la

45 Tabla 7 con 1,5-anhidroglucitol.

Se serigrafi6, un grosor de 10 1m, una placa de base hecha de tereftalato de polietileno con una tinta de carbono (nombre del producto, pasta de carbono TU15ST: Asahi Chemical Research Laboratory Co. Ltd.) como electrodo de trabajo y una parte conductora y un contraelectrodo y una parte conductora, se serigrafi6, un grosor de10 1m, con 50 una tinta de cloruro de plata-plata (nombre del producto, Electrodag PE-409: Acheson) como electrodo de referencia y una parte conductora, y se enfriaron a 150°C durante 40 minutos. A continuaci6n, se serigrafi6, un grosor de 20 1m, una parte, excepto una parte de uni6n de la parte de electrodo y el dispositivo de medici6n, con una tinta protectora (nombre del producto, CR18G-KF: Asahi Chemical Research Laboratory Co. Ltd.) y se enfri6 a 130°C durante 15 minutos para preparar un electrodo 13 mostrado en la Fig. 3. Se llev6 a cabo la medici6n electroqufmica

55 utilizando un detector electroqufmico (multipotenciostato de 8 canales equipado con un generador de funciones FG-02 modelo PS-08: Toho Giken.

Se colocaron 10 1l de una soluci6n acuosa que contenfa 20 u/ml de piranosa oxidasa y 60 1M de un mediador redox enumerado en la Tabla 7 sobre el electrodo 13 conectado a un detector electroqufmico en la posici6n 1 en la que se

aplic6 la muestra, se hizo un barrido de potencial de -0,5 V a +1 V a 1 mV/s utilizando como referencia el electrodo de referencia del electrodo 13, y se midi6 un valor de corriente de oxidaci6n Id por voltametrfa cfclica. A continuaci6n, se colocaron 10 1l de una soluci6n acuosa que contenfa 20 u/ml de piranosa oxidasa, un sustrato (500 1g/ml de 1,5-anhidroglucitol), y 60 1M de un mediador redox enumerado en la Tabla 7 sobre el electrodo 13 en 5 la posici6n 1 en la que se aplic6 la muestra, se hizo un barrido de potencial de -0,5 V a +1 V a 1 mV/s utilizando como referencia el electrodo de referencia del electrodo 13, y se midi6 un valor de corriente catalftica Ik por voltametrfa cfclica. Se compararon las velocidades de reacci6n de los mediadores redox con la enzima mediante el valor Ik/Id obtenido dividiendo el valor de corriente catalftica Ik por el valor de corriente de oxidaci6n Id con un mediador redox en solitario. En la Tabla 7 se muestran los resultados de Ik/Id para cada mediador redox. 10 [Tabla 7]

Tabla 7

Mediador redox

Ik/Id

Ferrocianuro de potasio

1,7

[Os(III)(bipiridil)2(imidazoil)Cl]Cl2

14,0

2,6-dimetil-p-benzoquinona

6,9

2-metil-1,4-naftoquinona

2,3

2,3-dimetoxi-5-metil-1,4-benzoquinona

3,3

N,N-dimetilaminometil ferroceno

5,1

Ferroceno metanol

3,4

Acetato de tionina

10,0

Azul de metileno

5,3

Azul de toluidina O

4,1

Azur I

16,4

Azur C

5,8

Azul de Meldola

1,8

Metilsulfato de 1-metoxi-5-metilfenazio

2,8

Sal s6dica dihidrato de 2-diclorofenol-indofenol

2,8

4,4'-bis(dimetilamino)difenilamina

3,3

Clorhidrato de N-metil-N-(3-metoxifenil)-1,4-fenilendiamina

2,6

Clorhidrato de N-metil-N-fenil-1,4-fenilendiamina

2,5

Nitro-TB*

1,9

2,2'-azino-bis(acido 3-etilbenzotiazolin-6 sulf6nico) diamonio

1,5

Acido 2-hidrazono-2,3-dihidro-3-metil-6-benzotiazol sulf6nico

1,2

Bis-{4-[N-3'-sulfo-n-propil-N-n-butil]amino-2, 6-dimetilfenil}metano

1,5

Bis-{4-[N-3'-sulfo-n-propil-N-etil]amino-2, 6-dimetilfenil}metano

1,0

P-aminofenol

3,5

Sal s6dica de N-(3-sulfopropil)-3,3',5,5'-tetrametilbencidina

1,5

15 * Nitro-TB: 3,3'-[3,3'-dimetoxi-(1-1'-bifenil)-4,4'-dil]-bis[cloruro de 2-(4-nitrofenil)-5-fenil-2H-tetrazolio]

La Tabla 7 muestra que una piranosa oxidasa reacciona rapidamente con diversos mediadores redox tales como complejos de osmio, compuestos de ferroceno, compuestos de quinona, compuestos de fenotiacina, compuestos de fenoxacina, compuestos de fenacina, compuestos de difenilamina, compuestos de indofenol, y compuestos 20 fen6licos. Estos resultados sugieren que el 1,5-anhidroglucitol en sangre completa puede medirse electroqufmicamente mediante procedimientos que utilizan estos mediadores redox y una piranosa oxidasa, por ejemplo, los procedimientos de los Ejemplos 1 a 3.

Ejemplo de Referencia 8

25 Se examinaron las reacciones de la 1,5-anhidroglucitol deshidrogenasa anteriormente mencionada y los mediadores redox enumerados en la Tabla 8 de la misma manera que en el Ejemplo de Referencia 7. Se prepar6 un electrodo 13 de la misma manera que en el Ejemplo de Referencia 7.

30 Se colocaron 10 1l de una soluci6n acuosa que contenfa 20 u/ml de 1,5-anhidroglucitol deshidrogenasa (derivada de Pseudomonas sp. NK-85001) y 60 1M de un mediador redox enumerado en la Tabla 8, sobre el electrodo 13 conectado a un detector electroqufmico en la posici6n 1 en la que se aplic6 la muestra, se hizo un barrido de potencial de -0,5 V a +1 V a 1 mV/s utilizando como referencia el electrodo de referencia del electrodo 13, y se midi6 un valor de corriente de oxidaci6n Id por voltametrfa cfclica. A continuaci6n, se colocaron 10 1l de una soluci6n 35 acuosa que contenfa 20 u/ml de 1,5-anhidroglucitol deshidrogenasa, un sustrato (500 1g/ml de 1,5-anhidroglucitol), y 60 1M de un mediador redox enumerado en la Tabla 8, sobre el electrodo 13 en la posici6n 1 en la que se aplic6 la muestra, se hizo un barrido de potencial de -0,5 V a +1 V a 1 mV/s utilizando como referencia el electrodo de referencia del electrodo 13, y se midi6 un valor de corriente catalftica Ik por voltametrfa cfclica. Se compararon las

velocidades de reacciones de mediadores redox con la enzima por el valor Ik/Id obtenido dividiendo el valor de corriente catalftica Ik entre el valor de corriente de oxidaci6n Id cuando un mediador redox en solitario estaba incluido sin sustrato. En la Tabla 8 se muestran los resultados de Ik/Id obtenidos para cada mediador redox.

[Tabla 8

Mediador redox

Ik/Id

Ferrocianuro de potasio

3,4

[Os(III)(bipiridil)2(imidazoil)Cl]Cl2

18,0

2,6-dimetil-p-benzoquinona

8,9

2-metil-1,4-naftoquinona

64,4

2,3-dimetoxi-5-metil-1,4-benzoquinona

11,2

N,N-dimetilaminometil ferroceno

5,0

Ferroceno metanol

4,9

Acetato de tionina

58,8

Azul de metileno

10,9

Azul de toluidina O

21,1

Azur I

18,3

Azur C

25,4

Nuevo azul de metileno

4,3

Metilsulfato de 1-metoxi-5-metilfenazio

1,6

Sal s6dica dihidrato de 2-diclorofenol-indofenol

10,3

4,4'-bis(dimetilamino)difenilamina

3,6

Clorhidrato de N-metil-N-(3-metoxifenil)-1,4-fenilendiamina

1,4

Clorhidrato de N-metil-N-fenil-1,4-fenilendiamina

2,2

Bis-{4-[N-3'-sulfo-n-propil-N-n-butil]amino-2, 6-dimetilfenil}metano

1,3

P-aminofenol

3,2

Sal s6dica de N-(3-sulfopropil)-3,3',5,5'-tetrametilbencidina

2,2

Verde malaquita

2,1

La Tabla 8 muestra que la 1,5-anhidroglucitol deshidrogenasa reacciona rapidamente con diversos mediadores redox tales como complejos de osmio, compuestos de ferroceno, compuestos de quinona, compuestos de

10 fenotiacina, compuestos de fenoxacina, compuestos de fenacina, compuestos de difenilamina, compuestos de indofenol, y compuestos fen6licos. Estos resultados sugieren que el 1,5-anhidroglucitol en sangre completa puede medirse electroqufmicamente mediante procedimientos que utilizan estos mediadores redox y 1,5-anhidroglucitol deshidrogenasa, por ejemplo, el procedimiento del Ejemplo 4.

15 Ejemplo de Referencia 9

1) Reactivo de conversi6n de la glucosa

Para preparar un reactivo de conversi6n de la glucosa, se anadieron, a tamp6n MES 50,0 mM, MgCl2 14,8 mM, KC1

20 99,2mM, fosfoenolpiruvato (PEP) 48mM, ATP 2mM, 20u/ml de piruvato quinasa (PK), 16u/ml de glucoquinasa, 10 u/ml de acido asc6rbico oxidasa, cloruro s6dico 200 mM, EDTA.2Na 0,2 mM, y 1,2 g/l de BSA, como composici6n, despues de ajustar el pH a 7,0 utilizando hidr6xido s6dico acuoso 1N.

2) Soluciones reactivas para electrodo

25 Para preparar las soluciones reactivas para electrodo (a), (b), y (c), se disolvieron, en tamp6n MES 100 mM (pH 7,0),

(a)

ferrocenil PEG 0,54 mM (Dojindo Laboratories);

(b)

6,25 u/ml de peroxidasa de rabano (Toyobo Co., Ltd.); o

(c) 50 u/ml de piranosa oxidasa (derivada del hongo Basidiomycetes nO 52), 30 en esta composici6n.

3) Microplaca detectora

En primer lugar, se aplicaron 10 1l de carboximetilcelulosa acuosa al 0,5� al sitio de electrodo de trabajo del

35 electrodo 13 preparado en el Ejemplo de Referencia 7 y se sec6 a 50°C durante 10 minutos, para hacer la superficie del electrodo hidr6fila. A continuaci6n, se aplicaron, gota a gota, 3 1l de la soluci6n reactiva para electrodo (a) obtenida en el punto 2) anteriormente indicado, sobre la parte hidr6fila y se sec6, se aplicaron, gota a gota, 31l de la soluci6n reactiva para electrodo (b), sobre la misma y se sec6, y a continuaci6n, se aplicaron adicionalmente, gota a gota, 3 1l de la soluci6n reactiva para electrodo (c) y se sec6 para preparar una microplaca detectora.

40 4) Creaci6n de la curva de calibrado Para crear una curva de calibrado del 1,5-anhidroglucitol, se mezclaron, en tubos Eppendorf, 20 1l de cada una de 3

muestras obtenidas anadiendo a soluci6n salina fisiol6gica preparaciones de 1,5-anhidroglucitol con concentraciones conocidas (las concentraciones de 1,5-anhidroglucitol en las muestras obtenidas mediante el procedimiento del Ejemplo de Referencia 1 excepto el procedimiento de separaci6n de las celulas sangufneas fueron 0, 10, y 501g/ml) y 10 1l del reactivo de conversi6n de la glucosa y se dejaron reposar durante 5 minutos. A continuaci6n, se 5 aplicaron, gota a gota, 15 1l de cada una de las mezclas de reacci6n sobre el electrodo 13 de la microplaca detectora del punto 3) en la posici6n 1 en la que se aplic6 la muestra y se dejaron reaccionar durante 5 minutos, a continuaci6n se aplicaron 0 V utilizando como referencia el electrodo de referencia (cloruro de plata-plata), y se midieron los valores de corriente despues de 5 segundos con un detector electroqufmico. Se cre6 una curva de calibrado a partir de los valores de corriente y las concentraciones de 1,5-anhidroglucitol como se muestra en la Fig.

10 4. En la figura, 1,5AG indica 1,5-anhidroglucitol.

La curva de calibrado obtenida muestra una curva de calibrado con una buena dependencia de la concentraci6n. Estos resultados sugieren que el 1,5-anhidroglucitol en sangre completa puede medirse electroqufmicamente mediante procedimientos que utilizan ferrocenil PEG y piranosa oxidasa, por ejemplo, los procedimientos de los

15 Ejemplos 1 a 3.

Ejemplo de Referencia 10

1) Reactivo de conversi6n de la glucosa 20 Se utiliz6 el reactivo de conversi6n de la glucosa del punto 1) del Ejemplo 1.

2) Soluciones reactivas para electrodo

25 Para preparar una soluci6n reactiva para electrodo, se disolvieron, en agua purificada, mediadores redox con las concentraciones de la Tabla 9 y 1,5-anhidroglucitol deshidrogenasa (derivada de Pseudomonas sp. NK-85001) con las concentraciones de la Tabla 9, en cada composici6n.

3) Microplaca detectora

30 Para preparar una microplaca detectora, se aplicaron 2 1l de una soluci6n reactiva para electrodo obtenida en el punto 2) anteriormente indicado sobre electrodo de trabajo del electrodo 13 preparado en el Ejemplo de Referencia 7 y se sec6 a 50°C durante 5 minutos.

35 4) Creaci6n de curvas de calibrado

Para crear una curva de calibrado del 1,5-anhidroglucitol, se mezclaron, en tubos Eppendorf, 101l de cada una de 5 muestras obtenidas anadiendo a una soluci6n de citrato s6dico al 0,38� preparaciones de 1,5-anhidroglucitol con concentraciones conocidas (las concentraciones de 1,5-anhidroglucitol en las muestras obtenidas mediante el 40 procedimiento del Ejemplo de Referencia 1 excepto el procedimiento de separaci6n de las celulas sangufneas fueron 0, 2,5, 11,9, 24,2, y 49,3 1g/ml) y 5 1l del reactivo de conversi6n de la glucosa y se dejaron reposar durante 5 minutos. A continuaci6n, se aplicaron, gota a gota, 101l de cada una de las mezclas de reacci6n sobre el electrodo 13 en la posici6n 1 en la que se aplic6 la muestra, se aplic6 cada uno de los potenciales enumerados en la Tabla 9 utilizando como referencia el electrodo de referencia (cloruro de plata-plata), se midieron los valores de corriente

45 despues de 5 segundos con un detector electroqufmico y se cre6 una curva de calibrado a partir de los valores de corriente y las concentraciones de 1,5-anhidroglucitol. Estas curvas de calibrado se muestra en las Figs. 5 a 13.

[Tabla 9]

50 Tabla 9

NO de ensayo

Mediador Redox Concentraci6n del mediador en la soluci6n reactiva para electrodo (1M) Concentraci6n de AGDH* en la soluci6n reactiva para electrodo (u/ml) Potencial

NO 1

2,6-dimetil-p-benzoquinona 150 50 0,5

NO 2

2-metil-1,4-naftoquinona 150 50 0,1

NO 3

Cloruro de tionina 75 50 -0,1

NO 4

Azul de metileno 200 100 -0,2

NO 5

Azul de toluidina O 12,5 50 -0,1

NO 6

Azur C 75 50 0

NO 7

4,4'-bis(dimetilamino)difenilamina 75 50 0

NO 8

Sal s6dica dihidrato de 2-diclorofenol-indofenol 75 50 0,1

NO 9

Metilsulfato de 1-metoxi-5-metilfenazio 150 50 0

* AGDH, 1,5-anhidroglucitol deshidrogenasa

5 Todas las curvas de calibrado obtenidas son curvas de calibrado uniformes dependientes de la concentraci6n. Estos resultados sugieren que el 1,5-anhidroglucitol en sangre completa puede medirse electroqufmicamente por amperometrfa utilizando estos mediadores y 1,5-anhidroglucitol deshidrogenasa.

Ejemplo de Referencia 11

10 1) Reactivo de conversi6n de la glucosa

Se utiliz6 el reactivo de conversi6n de la glucosa obtenido en el punto 1) del Ejemplo 1.

15 2) Soluci6n reactiva para electrodo

Para preparar una soluci6n reactiva para electrodo, se disolvieron, en agua purificada, mediadores redox con las concentraciones enumeradas en la Tabla 10 y 1,5-anhidroglucitol deshidrogenasa con las concentraciones enumeradas en la Tabla 10 (derivada de Pseudomonas sp. NK-85001), en cada composici6n.

20 3) Microplaca detectora

Para preparar una microplaca detectora, se aplicaron 2 1l de una soluci6n reactiva para electrodo del punto 2) anteriormente indicado al electrodo de trabajo del electrodo 13 preparado en el Ejemplo de Referencia 7 y se sec6 a

25 50°C durante 5 minutos.

4) Creaci6n de la curva de calibrado

Para crear una curva de calibrado del 1,5-anhidroglucitol, se mezclaron, en tubos Eppendorf, 101l de cada una de 6

30 muestras obtenidas anadiendo a una soluci6n de citrato s6dico al 0,38� preparaciones de 1,5-anhidroglucitol a concentraciones conocidas (las concentraciones de 1,5-anhidroglucitol en las muestras obtenidas mediante el procedimiento del Ejemplo de Referencia 1 excepto el procedimiento de separaci6n de las celulas sangufneas fueron 0, 2,5, 5,0, 11,9, 24,2, y 49,3 1g/ml) y 5 1l del reactivo de conversi6n de la glucosa y se dejaron reposar durante 5 minutos. A continuaci6n, se aplicaron, gota a gota, 10 1l de cada una de las mezclas de reacci6n sobre el

35 electrodo 13 en la posici6n 1 en la que se aplic6 la muestra, se aplic6 cada uno de los primeros potenciales de la Tabla 10 durante 10 segundos utilizando como referencia el electrodo de referencia (cloruro de plata-plata), y a continuaci6n se aplic6 el segundo potencial durante 110 segundos utilizando como referencia el electrodo de referencia (cloruro de plata-plata). Se midieron los niveles de Coulomb durante 100 segundos desde el inicio de la aplicaci6n del segundo potencial con un detector electroqufmico para coulometrfa, y se cre6 una curva de calibrado

40 a partir de los niveles de Coulomb y las concentraciones de 1,5-anhidroglucitol. Las curvas de calibrado se muestran en las Figs. 14 a 27. [Tabla 10]

Tabla 10 * AGDH, 1,5-anhidroglucitol deshidrogenasa

NOdeensayo

MediadorRedox Concentraci6ndel mediadoren lasoluci6nreactiva paraelectrodo(1M) Concentraci6nde AGDH*en la soluci6nreactiva paraelectrodo(1M) Primerpotencial Segundopotencial

NO1

[Os(III)(bipiridil)2 (imidazoil)Cl]Cl2 ) 300 25 0,15 0,25

NO2

2,6-dimetil-p-benzoquinona 150 50 0,5 0,6

NO3

2,3-dimetoxi-5-metil-1,4-benzoquinona 150 50 0,5 0,6

NO4

2-metil-1,4-naftoquinona 150 50 0,1 0,2

NO5

Acetato de tionina 5 50 -0,1 0

NO6

Cloruro de tionina 75 50 -0,1 0

NO7

Azul de metileno 200 100 -0,2 -0,1

NO8

Azul de toluidina O 12,5 50 -0,1 0

NO9

Azur I 120 40 0,2 0,3

NO10

Azur C 75 50 0 0,1

NO11

Azul de Meldola 150 50 0 0,1

NO12

4,4'-bis(dimetilamino)difenilamina 75 50 0 0,1

NO13

Sal s6dica dihidrato de 2-diclorofenol-indofenol 75 50 0,1 0,2

NO14

Metilsulfato de 1-metoxi-5-metilfenazio 150 50 0 0,1

Todas las curvas de calibrado obtenidas son curvas de calibrado uniformes dependientes de la concentraci6n. Estos resultados sugieren que el 1,5-anhidroglucitol en sangre completa puede medirse electroqufmicamente por coulometrfa utilizando estos mediadores y 1,5-anhidroglucitol deshidrogenasa.

5 Ejemplo 6

1) Reactivo de conversi6n de la glucosa

Se utiliz6 el reactivo de conversi6n de la glucosa obtenido en el punto 1) del Ejemplo 1.

10 2) Soluci6n reactiva para electrodo

Para preparar una soluci6n reactiva para electrodo, se disolvieron, en agua purificada, acetato de tionina 120 1M (Sigma-Aldrich Jap6n K.K.) y 40 u/ml de 1,5-anhidroglucitol deshidrogenasa (derivada de Pseudomonas sp.

15 NK-85001), en esta composici6n.

3) Microplaca detectora

Para preparar la microplaca detectora, se aplicaron 2 1l de la soluci6n reactiva para electrodo obtenida en el punto

20 2) anteriormente indicado al electrodo de trabajo del electrodo 13 preparado en el Ejemplo de Referencia 7 y se sec6 a 50°C durante 5 minutos.

4) Creaci6n de la curva de calibrado

25 Para crear una curva de calibrado del 1,5-anhidroglucitol, se mezclaron, en tubos Eppendorf, 101l de cada una de 7 muestras obtenidas anadiendo a una soluci6n de citrato s6dico al 0,38� preparaciones de 1,5-anhidroglucitol a concentraciones conocidas (las concentraciones de 1,5-anhidroglucitol en las muestras obtenidas mediante el procedimiento del Ejemplo de Referencia 1 excepto el procedimiento de separaci6n de las celulas sangufneas fueron 0, 2,5, 5,0, 11,9, 24,2, 49,3, y 98,8 1g/ml) y 5 1l del reactivo de conversi6n de la glucosa y se dejaron reposar

30 durante 5 minutos. A continuaci6n, se aplicaron, gota a gota, 10 1l de cada una de las mezclas de reacci6n sobre el electrodo 13 en la posici6n 1 en la que se aplic6 la muestra, y se aplicaron -0,1 V durante 10 segundos, seguido de 0 V durante 110 segundos, utilizando como referencia el electrodo de referencia (cloruro de plata-plata). Se midieron los niveles de Coulomb con un detector electroqufmico durante 100 segundos desde el inicio de la aplicaci6n de 0 V, y se cre6 una curva de calibrado a partir de los niveles de Coulomb y las concentraciones de 1,5-anhidroglucitol. En

35 al Fig. 28 se muestra una curva de calibrado que presenta una buena linealidad.

5) Procedimiento de medici6n del 1,5-anhidroglucitol

Se mezclaron, en tubos Eppendorf, 10 1l de cada una de las muestras de sangre completa humana de 7 sujetos

40 para medir 1,5-anhidroglucitol y 51l del reactivo de conversi6n de la glucosa y se dejaron reposar durante 5 minutos. A continuaci6n, se aplicaron, gota a gota, 10 1l de cada una de las mezclas de reacci6n sobre el electrodo 13 en la posici6n 1 en la que se aplic6 la muestra, y se aplicaron -0,1 V durante 10 segundos, seguido de 0 V durante 110 segundos, utilizando como referencia el electrodo de referencia (cloruro de plata-plata). Se midieron los niveles de Coulomb con un detector electroqufmico durante 100 segundos desde el inicio de la aplicaci6n de 0V y se

45 compararon con la curva de calibrado para obtener las cantidades de 1,5-anhidroglucitol en las 7 muestras de sangre completa. Los resultados se muestran en la Tabla 11. Los resultados son los valores medios de 4 mediciones.

Ejemplo de Referencia 12

50 Para la comparaci6n, se midieron las mismas muestras de sangre completa que las medidas en el punto 5) del Ejemplo 6 para 1,5-anhidroglucitol mediante el procedimiento del Ejemplo de Referencia 1. Los resultados se muestran en la Tabla 11.

55 [Tabla 11] Tabla 11

Concentraci6n de 1,5-anhidroglucitol (1g/ml)

Ejemplo de referencia 12

Ejemplo 6

Muestra de sangre completa 24

8,5 10,1

Muestra de sangre completa 25

15,70 15,2

Muestra de sangre completa 26

12,9 12,1

Muestra de sangre completa 27

22,7 19,0

Muestra de sangre completa 28

25,6 24,5

Muestra de sangre completa 29

26,8 21,5

Muestra de sangre completa 30

28,5 26,3

Cuando se dej6 actuar el reactivo de conversi6n de la glucosa sobre la sangre completa para convertir la glucosa en una substancia que no interfiere con la medici6n y se hizo reaccionar con el reactivo para electrodo que contenfa acetato de tionina, sin separar las celulas sangufneas, los valores medidos de 1,5-anhidroglucitol en sangre completa (Ejemplo 6) estuvieron en buena consonancia con los medidos en el Ejemplo de Referencia 12 mediante

5 un procedimiento de medici6n conocido (coeficiente de correlaci6n, 0,9711), lo que sugiere que el 1,5-anhidroglucitol en sangre completa puede medirse electroqufmicamente mediante la presente invenci6n.

Ejemplo 7

10 1) Reactivo de conversi6n de la glucosa

Se utiliz6 el reactivo de conversi6n de la glucosa obtenido en el punto 1) del Ejemplo 1.

2) Soluciones reactivas para electrodo 15

(i) Para medir el 1,5-anhidroglucitol

Para preparar una soluci6n reactiva para electrodo, se disolvieron, en agua purificada, azul de metileno 50 1M (Yoneyama Yakuhin Kogyo Co., Ltd.) y 100 u/ml de 1,5-anhidroglucitol deshidrogenasa (derivada de Pseudomonas

20 sp. NK-85001), en esta composici6n.

(ii) Para medir el blanco

Para preparar una soluci6n reactiva para electrodo, se disolvieron, en agua purificada, azul de metileno 50 1M 25 (Yoneyama Yakuhin Kogyo Co., Ltd.), en esta composici6n.

3) Microplacas de detecci6n

Se aplicaron 2 1l de la soluci6n reactiva para electrodo para medir 1,5-anhidroglucitol o para medir un blanco

30 obtenida en el punto 2) anteriormente indicado, al electrodo de trabajo de los dos electrodos 13 mostrados en la Fig. 3 preparados en el Ejemplo de Referencia 7 y se secaron a 50°C durante 5 minutos para preparar una microplaca detectora para medir 1,5-anhidroglucitol o para medir un blanco.

4) Creaci6n de la curva de calibrado

35 Para crear una curva de calibrado del 1,5-anhidroglucitol, se mezclaron, en tubos Eppendorf, 201l de cada una de 6 muestras obtenidas anadiendo a suero de oveja (Nippon Bio Test Lab.), que se sabe que practicamente no contiene 1,5-anhidroglucitol, preparaciones de 1,5-anhidroglucitol a concentraciones conocidas (las concentraciones de 1,5-anhidroglucitol en las muestras obtenidas mediante el procedimiento del Ejemplo de Referencia 1 excepto el

40 procedimiento de separaci6n de celulas sangufneas fueron 0,6, 2,8, 5,0, 10,0, 24,7, y 50,21g/ml) y 101l del reactivo de conversi6n de la glucosa y se dejaron reposar durante 5 minutos. A continuaci6n, se aplicaron, gota a gota, 101l de cada una de las mezclas de reacci6n sobre el electrodo 13 de la microplaca detectora para medir 1,5-anhidroglucitol o para medir un blanco en la posici6n 1 en la que se aplic6 la muestra, y se aplicaron -0,2 V durante 10 segundos, seguido de -0,1 V durante 110 segundos utilizando como referencia el electrodo de referencia

45 (cloruro de plata-plata) de cada microplaca detectora. Se midieron los niveles de Coulomb con un detector electroqufmico durante 100 segundos desde el inicio de la aplicaci6n de -0,1 V. Se cre6 una curva de calibrado a partir de los niveles de Coulomb obtenidos restando los de la microplaca detectora para medir un blanco de los de la microplaca detectora para medir 1,5-anhidroglucitol y las concentraciones de 1,5-anhidroglucitol. En al Fig. 29 se muestra una curva de calibrado que presenta una buena linealidad.

50 5) Procedimiento de medici6n del 1,5-anhidroglucitol

Se mezclaron, en tubos Eppendorf, 20 1l de cada una de las muestras de sangre completa de 7 sujetos del Ejemplo 6 y 10 1l del reactivo de conversi6n de la glucosa y se dejaron reposar durante 5 minutos. A continuaci6n, se 55 aplicaron, gota a gota, 10 1l cada una de las mezclas de reacci6n sobre el electrodo 13 de la microplaca detectora para medir 1,5-anhidroglucitol o para medir un blanco en la posici6n 1 en la que se aplic6 la muestra, y se aplicaron -0,2 V durante 10 segundos, seguido de -0,1 V durante 110 segundos, utilizando como referencia el electrodo de referencia (cloruro de plata-plata) de cada microplaca detectora. Se midieron los niveles de Coulomb durante 100 segundos desde el inicio de la aplicaci6n de -0,1 V con un detector electroqufmico (multipotenciostato de 8 canales

60 modelo PS-08 equipado con GPIB y RS232C: Toho Giken), y se compararon los niveles de Coulomb obtenidos restando los de la microplaca detectora para medir un blanco de los de la microplaca detectora para medir 1,5-anhidroglucitol con la curva de calibrado para obtener las cantidades de 1,5-anhidroglucitol en las 7 muestras de sangre completa. Los resultados se muestran en la Tabla 12. Los resultados son los valores medios de 4 mediciones.

Ejemplo de Referencia 12

Puesto que las muestras utilizadas en el Ejemplo 7 fueron las mismas muestras de sangre completa que en el Ejemplo 6, en la Tabla 12 se muestran los resultados del Ejemplo 6 como Ejemplo de Referencia 12. [Tabla 12] Tabla 12

Concentraci6n de 1,5-anhidroglucitol (1g/ml)

Ejemplo de Referencia 12 Ejemplo 7 Muestra de sangre completa 24 8,5 9,6 Muestra de sangre completa 25 15,7 14,5 Muestra de sangre completa 26 12,9 12,9 Muestra de sangre completa 27 22,7 23,7 Muestra de sangre completa 28 25,6 20,9 Muestra de sangre completa 29 26,8 23,9 Muestra de sangre completa 30 28,5 24,1

10 Cuando se dej6 actuar el reactivo de conversi6n de la glucosa sobre la sangre completa para convertir la glucosa en una substancia que no interfiere con la medici6n y se hizo reaccionar con el reactivo para electrodo que contenfa azul de metileno, sin separar las celulas sangufneas, los valores medidos de 1,5-anhidroglucitol en sangre completa (Ejemplo 7) estuvieron en buena consonancia con los medidos en el Ejemplo de Referencia 12 mediante un

15 procedimiento de medici6n conocido (coeficiente de correlaci6n, 0,9658), lo que sugiere que el 1,5-anhidroglucitol en sangre completa puede medirse electroqufmicamente mediante la presente invenci6n.

Ejemplo 8

20 1) Reactivo de conversi6n de la glucosa

Se utiliz6 el reactivo de conversi6n de la glucosa obtenido en el punto 1) del Ejemplo 1.

2) Soluci6n reactiva para electrodo

25 Para preparar una soluci6n reactiva para electrodo, se disolvieron, en agua purificada, acetato de tionina 1201M (Sigma-Aldrich Jap6n K.K.) y 40 u/ml de 1,5-anhidroglucitol deshidrogenasa (derivada de Pseudomonas sp. NK-85001), en esta composici6n.

30 3) Microplaca detectora

Se aplicaron 2 1l de la soluci6n reactiva para electrodo obtenida en el punto 2) anteriormente indicado, al electrodo al electrodo de trabajo del electrodo 13 preparado en el Ejemplo de Referencia 7 y se sec6 a 50°C durante 5 minutos para preparar la microplaca detectora.

35 4) Creaci6n de la curva de calibrado

Para crear una curva de calibrado del 1,5-anhidroglucitol, se mezclaron, en tubos Eppendorf, 101l de cada una de 7 muestras obtenidas anadiendo a suero de oveja (Nippon Bio Test Lab.) preparaciones de 1,5-anhidroglucitol a 40 concentraciones conocidas (las concentraciones de 1,5-anhidroglucitol en las muestras obtenidas mediante el procedimiento del Ejemplo de Referencia 1 excepto el procedimiento de separaci6n de celulas sangufneas fueron 0,6, 2,8, 5,0, 10,0, 24,7, 50,2 y 103,9 1g/ml) y 5 1l del reactivo de conversi6n de la glucosa y se dejaron reposar durante 5 minutos. A continuaci6n, se aplicaron, gota a gota, 10 1l cada una de las mezclas de reacci6n sobre el electrodo 13 en la posici6n 1 en la que se aplic6 la muestra, y se aplicaron -0,1 V utilizando como referencia el

45 electrodo de referencia (cloruro de plata-plata), se midieron los valores de corriente despues de 5 segundos con un detector electroqufmico, y se cre6 una curva de calibrado a partir de los valores de corriente y las concentraciones de 1,5-anhidroglucitol. En al Fig. 30 se muestra una curva de calibrado que presenta una buena linealidad.

5) Procedimiento de medici6n del 1,5-anhidroglucitol

50 Se mezclaron, en tubos Eppendorf, 10 1l de cada una de las muestras de sangre completa de los 7 sujetos del Ejemplo 6 y 5 1l del reactivo de conversi6n de la glucosa y se dejaron reposar durante 5 minutos. A continuaci6n, se aplicaron, gota a gota, 10 1l cada una de las mezclas de reacci6n sobre el electrodo 13 en la posici6n 1 en la que se aplic6 la muestra, aplicaron -0,1 V utilizando como referencia el electrodo de referencia (cloruro de plata-plata), se

55 midieron los valores de corriente despues de 5 segundos con un detector electroqufmico, y se compararon los valores de corriente obtenidos con la curva de calibrado para obtener las cantidades de 1,5-anhidroglucitol en las 7 muestras de sangre completa. Los resultados se muestran en la Tabla 13. Los resultados son los valores medios de 4 mediciones.

Ejemplo de Referencia 12

5 Puesto que las muestras utilizadas en el Ejemplo 8 fueron las mismas muestras de sangre completa que en el Ejemplo 6, en la Tabla 13 se muestran los resultados de medici6n del Ejemplo 6 como Ejemplo de Referencia 12.

[Tabla 13] 10 Tabla 13 Concentraci6n de 1,5-anhidroglucitol (1g/ml)

Ejemplo de referencia 12 Ejemplo 8

Muestra de sangre completa 24 8,5 10,0

Muestra de sangre completa 25 15,7 14,7

Muestra de sangre completa 26 12,9 11,7

Muestra de sangre completa 27 22,7 19,5

Muestra de sangre completa 28 25,6 25,4

Muestra de sangre completa 29 26,8 21,6

Muestra de sangre completa 30 28,5 27,0

Cuando se dej6 actuar el reactivo de conversi6n de la glucosa sobre la sangre completa para convertir la glucosa en una sustancia que no interfiere con la medici6n y se hizo reaccionar con el reactivo para electrodo que contenfa

15 acetato de tionina, sin separar las celulas sangufneas, los valores medidos de 1,5-anhidroglucitol en sangre completa (Ejemplo 8) estuvieron en buena consonancia con los medidos en el Ejemplo de Referencia 12 mediante un procedimiento de medici6n conocido (coeficiente de correlaci6n, 0,9700), lo que sugiere que el 1,5-anhidroglucitol en sangre completa puede medirse electroqufmicamente mediante la presente invenci6n.

20 Ejemplo 9

1) Reactivo de conversi6n de la glucosa

Se utiliz6 el reactivo de conversi6n de la glucosa obtenido en el punto 1) del Ejemplo 1.

25 2) Soluci6n reactiva para electrodo

Para preparar una soluci6n reactiva para electrodo, se disolvieron, en agua purificada, acetato de tionina 1201M (Sigma-Aldrich Jap6n K.K.) y 40 u/ml de 1,5-anhidroglucitol deshidrogenasa (derivada de Pseudomonas sp.

30 NK-85001), en esta composici6n.

3) Microplaca detectora

Para preparar una microplaca detectora, se aplicaron 2 1l de la soluci6n reactiva para electrodo obtenida en el punto

35 2) anteriormente indicado, al electrodo de trabajo del electrodo 13 que se prepar6 en el Ejemplo de Referencia 7 y se trat6 de la misma manera que en el Ejemplo de Referencia 9 y se sec6 a 50°C durante 5 minutos.

4) Creaci6n de la curva de calibrado

40 Para crear una curva de calibrado del 1,5-anhidroglucitol, se mezclaron, en tubos Eppendorf, 101l de cada una de 4 muestras obtenidas anadiendo a una soluci6n de citrato s6dico al 0,38� preparaciones de 1,5-anhidroglucitol a concentraciones conocidas (las concentraciones de 1,5-anhidroglucitol en las muestras obtenidas mediante el procedimiento del Ejemplo de Referencia 1 excepto el procedimiento de separaci6n de celulas sangufneas fueron 0, 5,0, 11,9 y 24,2 1g/ml) y 5 1l del reactivo de conversi6n de la glucosa y se dejaron reposar durante 5 minutos. A

45 continuaci6n, se aplicaron, gota a gota, 10 1l de cada una de las mezclas de reacci6n sobre el electrodo 13 en la posici6n 1 en la que se aplic6 la muestra, se aplicaron 0V durante 110 segundos utilizando como referencia el electrodo de referencia (cloruro de plata-plata), se midieron los niveles de Coulomb con un detector electroqufmico durante 100 segundos desde el inicio de la aplicaci6n, y se cre6 una curva de calibrado a partir de los niveles de Coulomb de la microplaca detectora y las concentraciones de 1,5-anhidroglucitol. En al Fig. 31 se muestra la curva

50 de calibrado que presenta una buena linealidad.

5) Procedimiento de medici6n del 1,5-anhidroglucitol

Se mezclaron, en tubos Eppendorf, 10 1l de cada una de las muestras de sangre completa humana de 6 sujetos

55 para medir 1,5-anhydroglucitol y 5 1l del reactivo de conversi6n de la glucosa y se dejaron reposar durante 5 minutos. A continuaci6n, se aplicaron, gota a gota, 101l de cada una de las mezclas de reacci6n sobre el electrodo 13 en la posici6n 1 en la que se aplic6 la muestra, se aplicaron 0 V durante 110 segundos utilizando como referencia el electrodo de referencia (cloruro de plata-plata), se midieron los niveles de Coulomb con un detector electroqufmico durante 100 segundos desde el inicio de la aplicaci6n, y se compararon los niveles de Coulomb obtenidos con la curva de calibrado para obtener las cantidades de 1,5-anhidroglucitol en las 6 muestras de sangre completa. Los

5 resultados se muestran en la Tabla 14. Los resultados son los valores medios de 4 mediciones.

Ejemplo de Referencia 13

Para la comparaci6n, se midieron las mismas muestras de sangre completa que las medidas en el punto 5) del

10 Ejemplo 9 para 1,5-anhidroglucitol mediante el procedimiento del Ejemplo de Referencia 1. Los resultados se muestran en la Tabla 14.

[Tabla 14]

15 Tabla 14

Concentraci6n de 1,5-anhidroglucitol (1g/ml) Ejemplo de referencia 13 Ejemplo 9

Muestra de sangre completa 31 8,9 10,6

Muestra de sangre completa 32 16,2 15,2

Muestra de sangre completa 33 14,1 14,0

Muestra de sangre completa 34 23,3 21,3

Muestra de sangre completa 35 25,9 23,1

Muestra de sangre completa 36 32,1 24,7

Cuando se dej6 actuar el reactivo de conversi6n de la glucosa sobre la sangre completa para convertir la glucosa en una sustancia que no interfiere con la medici6n y se hizo reaccionar con el reactivo para electrodo que contenfa acetato de tionina, sin separar las celulas sangufneas, los valores medidos de 1,5-anhidroglucitol en sangre

20 completa (Ejemplo 9) estuvieron en buena consonancia con los valores medidos en el Ejemplo de Referencia 13 mediante un procedimiento de medici6n conocido (coeficiente de correlaci6n, 0,9855), lo que sugiere que el 1,5-anhidroglucitol en sangre completa puede medirse electroqufmicamente mediante la presente invenci6n.

Ejemplo 10

25 1) Reactivo de conversi6n de la glucosa

Se utiliz6 el reactivo de conversi6n de la glucosa obtenido en el punto 1) del Ejemplo 1.

30 2) Soluciones reactivas para electrodo

(i) Para medir el 1,5-anhidroglucitol

Para preparar una soluci6n reactiva para electrodo, se disolvieron, en agua purificada, azul de metileno 100 1M

35 (Tokyo Kasei Kogyo) y 50 u/ml de 1,5-anhidroglucitol deshidrogenasa (derivada de Pseudomonas sp. NK-85001), en esta composici6n.

(ii) Para medir el blanco

40 Para preparar una soluci6n reactiva para electrodo, se disolvi6, en agua purificada, azul de metileno 100 1M (Tokyo Kasei Kogyo), en esta composici6n.

3) Microplacas detectoras

45 Se prepararon los dos electrodos 13 preparados en el Ejemplo de Referencia 7 y mostrados en la Fig. 3, se aplicaron 2 1l de la soluci6n reactiva para electrodo para medir 1,5-anhidroglucitol o para medir un blanco obtenida en el punto 2) anteriormente indicado al electrodo de trabajo del electrodo y se sec6 a 50°C durante 5 minutos para preparar una microplaca detectora para medir 1,5-anhidroglucitol o para medir un blanco.

50 4) Creaci6n de la curva de calibrado

Para crear una curva de calibrado del 1,5-anhidroglucitol, se mezclaron, en tubos Eppendorf, 201l de cada una de 4 muestras obtenidas anadiendo a suero de oveja (Nippon Bio Test Lab.) preparaciones de 1,5-anhidroglucitol a concentraciones conocidas (las concentraciones de 1,5-anhidroglucitol en las muestras obtenidas mediante el 55 procedimiento del Ejemplo de Referencia 1 excepto el procedimiento de separaci6n de celulas sangufneas fueron 0,6, 10,0, 50,2, y 103,9 1g/ml) y 10 1l del reactivo de conversi6n de la glucosa y se dejaron reposar durante 5 minutos. A continuaci6n, se aplicaron, gota a gota, 101l de cada una de las mezclas de reacci6n sobre el electrodo

13 de la microplaca detectora para medir 1,5-anhidroglucitol o para medir un blanco en la posici6n 1 en la que se aplic6 la muestra, y se aplicaron -0,1 V durante 110 segundos utilizando como referencia el electrodo de referencia (cloruro de plata-plata) de la microplaca detectora , y se midieron los niveles de Coulomb con un detector electroqufmico durante 100 segundos desde el inicio de la aplicaci6n de -0,1 V. Se cre6 una curva de calibrado a

5 partir de las diferencias entre los niveles de Coulomb obtenidos de la microplaca detectora para medir 1,5-anhidroglucitoland y los obtenidos de la microplaca detectora para medir un blanco, y las concentraciones de 1,5-anhidroglucitol. En al Fig. 32 se muestra la curva de calibrado que presenta una buena linealidad

5) Procedimiento de medici6n del 1,5-anhidroglucitol

10 Se mezclaron, en tubos Eppendorf, 20 1l de cada una de las muestras de sangre completa de los 6 sujetos del Ejemplo 9 y 10 1l del reactivo de conversi6n de la glucosa y se dejaron reposar durante 5 minutos. A continuaci6n, se aplicaron, gota a gota, 10 1l de cada una de las mezclas de reacci6n sobre el electrodo 13 de la microplaca detectora para medir 1,5-anhidroglucitol o para medir un blanco en la posici6n 1 en la que se aplic6 la muestra, y se

15 aplicaron -0,1 V durante 110 segundos utilizando como referencia el electrodo de referencia (cloruro de plata-plata) de la microplaca detectora, se midieron los niveles de Coulomb con un detector electroqufmico durante 100 segundos desde el inicio de la aplicaci6n de -0,1 V, y se compararon los niveles de Coulomb obtenidos restando los de la microplaca detectora para medir un blanco de los de la microplaca detectora para medir 1,5-anhidroglucitol con la curva de calibrado para obtener las cantidades de 1,5-anhidroglucitol en las 6 muestras de sangre completa. Los

20 resultados se muestran en la Tabla 15. Los resultados son los valores medios de 4 mediciones.

Ejemplo de Referencia 13

Puesto que las muestras utilizadas en el Ejemplo 10 fueron las mismas muestras de sangre completa que las

25 utilizadas en el Ejemplo 9, en la Tabla 15 se muestran los resultados de las mediciones del Ejemplo 9 como Ejemplo de Referencia 13.

[Tabla 15] Tabla 15 Concentraci6n de 1,5-anhidroglucitol (1g/ml)

Ejemplo de referencia 13 Ejemplo 10

Muestra de sangre completa 31 8,9 11,0

Muestra de sangre completa 32 16,2 17,2

Muestra de sangre completa 33 14,1 15,0

Muestra de sangre completa 34 23,3 24,0

Muestra de sangre completa 35 25,9 24,5

Muestra de sangre completa 36 32,1 31,4

30 Cuando se dej6 actuar el reactivo de conversi6n de la glucosa sobre la sangre completa para convertir la glucosa en una sustancia que no interfiere con la medici6n y se hizo reaccionar con el reactivo para electrodo que contenfa azul de metileno, sin separar las celulas sangufneas, los valores medidos de 1,5-anhidroglucitol en sangre completa (Ejemplo 10) tal como se midieron mediante un procedimiento diferencial estuvieron en buena consonancia con los

35 medidos en el Ejemplo de Referencia 13 mediante un procedimiento de medici6n conocido (coeficiente de correlaci6n, 0,9964), lo que sugiere que el 1,5-anhidroglucitol en sangre completa puede medirse electroqufmicamente mediante la presente invenci6n.

Aplicabilidad industrial

40 Puede medirse el 1,5-anhidroglucitol en una cantidad traza de sangre completa mediante el procedimiento para medir 1,5-anhidroglucitol de la presente invenci6n que mide electroqufmicamente el 1,5-anhidroglucitol sin utilizar una centrffuga o similar. Por lo tanto, el procedimiento de medici6n de la presente invenci6n puede aplicarse a la medici6n rapida de 1,5-anhidroglucitol a pie de cama o en un centro de atenci6n al paciente y a la medici6n por los

45 propios pacientes en casa.

Breve descripcian de los dibujos

[FIG. 1] 50 La Fig. 1 es un diagrama simplificado que muestra un electrodo 11 utilizado en la presente invenci6n;

[FIG. 2]

La Fig. 2 es un diagrama simplificado que muestra un electrodo 12 utilizado en la presente invenci6n;

55 [FIG. 3] La Fig. 3 es un diagrama simplificado que muestra un electrodo 13 utilizado en la presente invenci6n; [FIG. 4]

La Fig. 4 es una curva de calibrado creada en el Ejemplo de Referencia 9;

5 [FIG. 5] La Fig. 5 es una curva de calibrado del Ensayo NO 1 de la Tabla 9 del Ejemplo de Referencia 10;

[FIG. 6]

La Fig. 6 es una curva de calibrado del Ensayo NO 2 de la Tabla 9 del Ejemplo de Referencia 10;

[FIG. 7]

La Fig. 7 es una curva de calibrado del Ensayo N° 3 de la Tabla 9 del Ejemplo de Referencia 10;

[FIG. 8] 15 La Fig. 8 es una curva de calibrado del Ensayo NO 4 de la Tabla 9 del Ejemplo de Referencia 10;

[FIG. 9]

La Fig. 9 es una curva de calibrado del Ensayo NO 5 de la Tabla 9 del Ejemplo de Referencia 10;

[FIG. 10]

La Fig. 10 es una curva de calibrado del Ensayo NO 6 de la Tabla 9 del Ejemplo de Referencia 10;

[FIG. 11]

25 La Fig. 11 es una curva de calibrado del Ensayo NO 7 de la Tabla 9 del Ejemplo de Referencia 10;

[FIG. 12]

La Fig. 12 es una curva de calibrado del Ensayo NO 8 de la Tabla 9 del Ejemplo de Referencia 10;

[FIG. 13]

La Fig. 13 es una curva de calibrado del Ensayo NO 9 de la Tabla 9 del Ejemplo de Referencia 10;

[FIG. 14]

La Fig. 14 es una curva de calibrado del Ensayo NO 1 de la Tabla 10 del Ejemplo de Referencia 11;

35 [FIG. 15] La Fig. 15 es una curva de calibrado del Ensayo NO 2 de la Tabla 10 del Ejemplo de Referencia 11;

[FIG. 16]

La Fig. 16 es una curva de calibrado del Ensayo NO 3 de la Tabla 10 del Ejemplo de Referencia 11;

[FIG. 17]

La Fig. 17 es una curva de calibrado del Ensayo NO 4 de la Tabla del 10 Ejemplo de Referencia 11;

[FIG. 18] 45 La Fig. 18 es una curva de calibrado del Ensayo NO 5 de la Tabla 10 del Ejemplo de Referencia 11;

[FIG. 19]

La Fig. 19 es una curva de calibrado del Ensayo NO 6 de la Tabla 10 del Ejemplo de Referencia 11;

[FIG. 20]

La Fig. 20 es una curva de calibrado del Ensayo NO 7 de la Tabla 10 del Ejemplo de Referencia 11;

[FIG. 21]

La Fig. 21 es una curva de calibrado del Ensayo NO 8 de la Tabla 10 del Ejemplo de Referencia 11; 55

[FIG. 22]

La Fig. 22 es una curva de calibrado del Ensayo NO 9 de la Tabla 10 del Ejemplo de Referencia 11;

[FIG. 23] La Fig. 23 es una curva de calibrado del Ensayo NO 10 de la Tabla 10 del Ejemplo de Referencia 11;

[FIG. 24] La Fig. 24 es una curva de calibrado del Ensayo NO 11 de la Tabla 10 del Ejemplo de Referencia 11;

65 [FIG. 25] La Fig. 25 es una curva de calibrado del Ensayo NO 12 de la Tabla 10 del Ejemplo de Referencia 11;

[FIG. 26] La Fig. 26 es una curva de calibrado del Ensayo NO 13 de la Tabla 10 del Ejemplo de Referencia 11;

5 [FIG. 27] La Fig. 27 es una curva de calibrado del Ensayo NO 14 de la Tabla 10 del Ejemplo de Referencia 11;

[FIG. 28] La Fig. 28 es una curva de calibrado creada en el Ejemplo 6;

10 [FIG. 29] La Fig. 29 es una curva de calibrado creada en el Ejemplo 7;

[FIG. 30] 15 La Fig. 30 es una curva de calibrado creada en el Ejemplo 8;

[FIG. 31] La Fig. 31 es una curva de calibrado creada en el Ejemplo 9; y

20 [FIG. 32] La Fig. 32 es una curva de calibrado creada en el Ejemplo 10.

Descripcian de los n�meros de referencia

25 1. Posici6n en la que se aplica la muestra

2. Soporte

3. Electrodo de trabajo 30

4.

Contraelectrodo

5.

Material protector

35 6. Electrodo de referencia (tinta de carbono) 6a. Electrodo de referencia (tinta de cloruro de plata-plata)

11. Electrodo 40

12.

Electrodo

13.

Electrodo

Claims (11)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento para medir electroqufmicamente 1,5-anhidroglucitol en una muestra de sangre completa, que comprende las etapas de:

   5 eliminaci6n o conversi6n de la glucosa y/o un derivado de la misma en la muestra de sangre completa que interfiere con la medici6n, sin separar las celulas sangufneas en la muestra de sangre completa, permitir que actue una enzima para medir 1,5-anhidroglucitol sobre el 1,5-anhidroglucitol de la muestra de sangre completa, sin separar las celulas sangufneas; y medici6n electroqufmica del 1,5-anhidroglucitol.
2. 2. El procedimiento para medir 1,5-anhidroglucitol segun la reivindicaci6n 1, en el que la enzima para medir 1,5-anhidroglucitol es una oxidorreductasa.
3. 3. El procedimiento para medir 1,5-anhidroglucitol segun la reivindicaci6n 2, en el que la oxidorreductasa es piranosa 15 oxidasa, L-sorbosa oxidasa, o 1,5-anhidroglucitol deshidrogenasa.
4. 4. El procedimiento para medir 1,5-anhidroglucitol segun la reivindicaci6n 3, en el que la oxidorreductasa se deriva de los generos Pseudomonas o Agrobacterium.

   20 5. El procedimiento para medir 1,5-anhidroglucitol segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el 1,5-anhidroglucitol se mide electroqufmicamente en presencia de un mediador redox.
5. 6. El procedimiento para medir 1,5-anhidroglucitol segun la reivindicaci6n 5, en el que el mediador redox es una complejo de osmio, un compuesto de quinona, un compuesto de ferroceno, un compuesto de fenotiacina, un

   25 compuesto de fenoxacina, un compuesto de fenacina, un compuesto de indofenol, un compuesto de difenilamina, o un compuesto fen6lico.
6. 7. El procedimiento para medir 1,5-anhidroglucitol segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la

   glucosa y/o un derivado de la misma se convierte o se elimina de la muestra de sangre completa a medida que 30 utiliza una enzima, sin separar las celulas sangufneas.
7. 8. El procedimiento para medir 1,5-anhidroglucitol segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el 1,5-anhidroglucitol se mide electroqufmicamente en presencia de un estabilizador.

   35 9. El procedimiento para medir 1,5-anhidroglucitol segun la reivindicaci6n 8, en el que el estabilizador es acido 2-sulfobenzoico o acido 3-sulfobenzoico.
8. 10. El procedimiento para medir 1,5-anhidroglucitol segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el

   1,5-anhidroglucitol se mide electroqufmicamente por amperometrfa, coulometrfa, o voltametrfa cfclica. 40
9. 11. El procedimiento para medir 1,5-anhidroglucitol segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el 1,5-anhidroglucitol se mide electroqufmicamente utilizando un electrodo que tiene un electrodo de trabajo para medir 1,5-anhidroglucitol que contiene una oxidorreductasa para medir 1,5-anhidroglucitol y un mediador redox, y un contraelectrodo.

10. 12.

    El procedimiento para medir 1,5-anhidroglucitol segun la reivindicaci6n 11, en el que el 1,5-anhidroglucitol se mide electroqufmicamente utilizando un electrodo diferencial.

11. 13.

    El procedimiento para medir 1,5-anhidroglucitol segun la reivindicaci6n 12, en el que el electrodo diferencial es

    50 un electrodo que tiene un electrodo de trabajo para medir 1,5-anhidroglucitol que contiene una oxidorreductasa para medir 1,5-anhidroglucitol y un mediador redox, un electrodo de trabajo para medir un blanco que contiene un mediador redox pero que no contiene una oxidorreductasa para medir 1,5-anhidroglucitol, y un contraelectrodo.